专利名称：表达多角体和几丁质酶融合蛋白的重组棉铃虫单核衣壳核多角体病毒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种能够防治棉铃虫和烟青虫的基因重组棉铃虫单核衣壳核多角体病毒；本发明还涉及该重组棉铃虫单核衣壳核多角体病毒株的制备方法。
本发明是按下述方案实现的利用PCR技术扩增病毒的多角体基因和几丁质酶基因(已申请专利，专利号01106469.2)克隆至通用载体pUC19，构建融合基因；将融合基因插入含有egt基因上下游序列标记基因LacZ的真核转移载体pHaWHL5，构建真核转移载体pHaWD6。将pHaWD6与野生型病毒DNA共转染昆虫细胞，通过同源重组用融合的多角体和几丁质酶基因置换基因组中的egt基因，构建出缺失egt基因并表达多角体几丁质酶融合蛋白的新型重组病毒Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus WD6CCTCC-V200115。多角体与几丁质酶融合基因的核苷酸序列如下，核酸序列中起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)以黑体标明。两基因在BamH I位点处融合，并以下划线标明。ATGTATACTCGTTACAGTTACAGCCCTACTTTGGGCAAAACCTATGTGTACGACAACAAATACTTTAAGAATTTAGGTGCTGTTATTAAAATGCCAACGCAAGAGCATTTAGAGGAGCACGAACATGAAGAACGCAACTTGGATTCGCTCGACAAATACTTGGTGGCGGAAGATCCTTTTTTGGGACCTGGCAAAAATCAAAAACTAACTTTGTTTAAAGAGATTCGCAGCGTTAAGCCCGACACAATGAAGCTTGTAGTTAACTGGAGCGGTCGCGAATTTCTTCGCGAAACTTGGACGCGTTTCATGGAAGACAGTTTTCCCATTGTAAACGACCAAGAAATTATGGACGTGTTTCTGTCTGTTAATATGCGACCAACCAAACCGAACCGTTGTTACCGATTCTTAGCGCAACACGCTCTGCGTTGTGATCCCGACTATATTCCTCACGAAGTCATTCGTATTGTAGAACCTTCCTATGTAGGCAGTAACAACGAGTACAGAATTAGTTTAGCCAAAAAATACGGCGGTTGTCCCGTTATGAACTTGCACGCTGAATACACTAATTCCTTTGAAGATTTCATTACCAACGTAATTTGGGAGAACTTTTACAAACCAATTGTTTACGTAGGCACTGATTCTGCCGAAGAAGAGGAAATACTCCTAGAAGTTTCTTTGATATTTAAGATCAAAGAATTTGCACCTGACGCTCCGCTATACACTGGTCCTGCATATGGATCCGCTCCACCCGGCGTTCCCACATTAGACTGGGCCGATCACAGTTACGCTTTAGTGCAAATAAATCATCAAGCCACCGCTTACGAATCATTAGTAAACTCTCAACCGTTTGTAACTATCAAAGTATCATGGAGCGTATGGTCGGGCGAACAAGGCGAAATCGCTCAAGTGTATCTAGAAAATAAACTAGACTGCAAAGTAATCAACGTTTGGACTGGTCCGACGCAAGATCGTTTTGCTACTTTTGATTACAATACGAGCGGTCGTTATTCGATGTATGTAAAACTGTGCAATGCCGACGGCTGTTCGGCTAGTCAAACCGTAGAAGTCGTGATCGCAGACACCGATGGTAAACATTTAAAACCGTTACAATACACGTGGCAAGAAAACAATAAACCGTATACGTACAACACTGATCACACCGTAGCGGCCTATTTTGTCGAATGGGGCGTTTACGGTCGATCTTTTCCCGTGGACAAAGTGCCCACGCCGAACCTTTCGCACATTTTATACGGATTTATACCGATTTGCGGCGGTGACGGTATAAACGACAGTTTAAAATCTATCACGGGGAGTTTTGAAGCGTTGCAAAGATCGTGCGCTGGCAGGGACAATTTTAAAGTTTCCATACACGATCCGTGGGCGGCGCTCCAAAAACCACAAACAGGCGTTAGCGCATGGAACGAACCCTACAAAGGCAATTTTGGTCAATTAATGGCAGCAAAATTGGCCAATCCCAATCTAAAAGTGTTGGCATCAATCGGCGGTTGGACACTGTCCGATCCCTTCTATCATATGCACGATGCGCGAACGCGACAAATTTTTGTCGAATCCGTGCGTGAATTTGTGTTGACATGGAAATTTTTCGACGGCATCGATATTGATTGGGAATTTCCGGGCGGCAAAGGCGCCAATCCAAACGTTGGCGATGTGGAACGCGACAATAACACGTATATCGCTTTATTGGGCGAATTGCGCGCCATGCTCGATCAAGTTCAAATACAAACGAATCGTACTTTAGAACTCACCACAGCGATTAGCGCTGGCATAGACAAGATCGCCGCGGTTAATTACGACCGAGCACAACAGTATTTAGATAAAATTTTCGTGATGAGTTATGATTTCAAAGGAGCTTGGTCTAATACCGATCTCGGTCATCAGACGGCACTGTACGGTTCCGCGTGGAAACCTAACGAACCGTACACCGCCAACGTGGCCGTGGACGCTTTGCTCGCGCAACGAGTGAATCCAAAAAAACTCGTGTTGGGCGTAGCAATGTACGGCCGCGGTTGGACGGGCGTCCACAACTACAACAGTGACAATCCATTCAGTGGCGTAGCCGTCGGACCGATCACGGGTACATGGGAAAACGGCGTGGTCGACTACAGACAGATTGCTAAAAACATTTCGCGTTACGAATACGCATTCGACGACGTGGCCAAGGCTGCGTACGTATTCGACCGCGCCTCTGGCGACTTAATATCGTATGACAGCGAAAGATCGGTACTGGCCAAAGGCGAATACGTGCTTCAGCGTAGACTCGGCGGATTATTCGCATGGGAAATCGATGCGGACAACGGCGATTTGCTCAACGCTATGCATATTGGCTTGATGAAAACAGGTACAAACAGTAGATTGATTCATAACGAATTGTAA该融合基因编码的氨基酸序列如下，氨基酸序列中G和S为两基因融合处BamH I位点编码的氨基酸。几丁质酶催化活性区(FDGIDIDWE)以下划线标明。MYTRYSYSPTLGKTYVYDNKYFKNLGAVIKMPTQEHLEEHEHEERNLDSLDKYLVAEDPFLGPGKNQKLTLFKEIRSVKPDTMKLVVNWSGREFLRETWTRFMEDSFPIVNDQEIMDVFLSVNMRPTKPNRCYRFLAQHALRCDPDYIPHEVIRIVEPSYVGSNNEYRISLAKKYGGCPVMNLHAEYTNSFEDFITNVIWENFYKPIVYVGTDSAEEEEILLEVSLIFKIKEFAPDAPLYTGPAYGSAPPGVPTLDWADHSYALVQINHQATAYESLVNSQPFVTIKVSWSVWSGEQGEIAQVYLENKLDCKVINVWTGPTQDRFATFDYNTSGRYSMYVKLCNADGCSASQTVEVVIADTDGKHLKPLQYTWQENNKPYTYNTDHTVAAYFVEWGVYGRSFPVDKVPTPNLSHILYGFIPICGGDGINDSLKSITGSFEALQRSCAGRDNFKVSIHDPWAALQKPQTGVSAWNEPYKGNFGQLMAAKLANPNLKVLASIGGWTLSDPFYHMHDARTRGIFVESVREFVLTWKFFDGIDIDWEFPGGKGANPNVGDVERDNNTYIALLGELRAMLDQVQIQTNRTLELTTAISAGIDKIAAVNYDRAQQYLDKIFVMSYDFKGAWSNTDLGHQTALYGSAWKPNEPYTANVAVDALLAQRVNPKKLVLGVAMYGRGWTGVHNYNSDNPFSGVAVGPITGTWENGVVDYRQIAKNISRYEYAFDDVAKAAYVFDRASGDLISYDSERSVLAKGEYVLQRRLGGLFAWEIDADNGDLLNAMHIGLMKTGTNSRLI.
本发明所提提供的重组病毒及其构建策略将为新型病毒杀虫剂的研制奠定基础。该重组病毒可在昆虫食入多角体后第一时间发挥作用，解决了现有重组病毒杀虫外源蛋白表达时间晚，起效慢的缺点。有效地提高了病毒感染中肠的效率，从而提高杀虫速度。
该图是重组病毒HaSNPV-WD6的构建过程，说明如下载体pCXW99和pCXW125分别含有完整的HaSNPV多角体基因和几丁质酶基因。中间载体pUC19-fusion含有多角体和几丁质酶融合基因。中间载体pHaWHL5含有egt基因的5’端及基因的上游序列(即egt3’)、3’端及基因的下游序列(即egt5’)、HaSNPV多角体蛋白基因启动子HaPph，以及标记基因LacZ，即β-半乳糖苷酶基因。转移载体pHaWD6为插入融合基因的pHaWHL5。egt为蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因。
上述的几丁质酶基因还可以由其它有相同效果的基因如杆状病毒的组织蛋白酶基因v-cath、gp37基因、昆虫痘病毒的纺锤体蛋白基因fusolin、苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白(IAP)基因等替换。融合基因的插入位点可以在egt位点，也可在病毒基因组中的其它位点。标记基因还可以用绿色荧光蛋白GFP基因等替换，也可以在重组病毒构建好后删除标记基因。
2、所述本发明的棉铃虫单核衣壳核多角体病毒HaSNPV-WD6的构建方法，含以下步骤(1)设计引物，利用PCR技术从pCXW99和pCXW125分别获得HaSNPV完整的多角体基因编码框和除去了编码N端信号肽和C端内质网定位肽部分的几丁质酶基因编码框。多角体基因片断以EcoR I和BamH I酶切，几丁质酶基因片断以BamH I和Pst I酶切；将两个基因片断克隆至通用载体pUC19，使两个基因片断融合为一个开放阅读框，得到中间载体pUC19-fusion。利用EcoR I和Pst I酶切pUC19-fusion，获得双粘端的融合基因片断。将融合基因片断平端化处理后克隆至载体pWHL5的多角体启动子下游，获得真核转移载体pWD6。
(2)将野生型HaSNPV基因组DNA和pWD6共转染昆虫细胞，利用同源重组技术，缺失基因组上的蜕皮激素尿昔二磷酸葡萄糖基转酶基因，并在缺失的位置插入融合基因。经多轮空斑纯化，得到纯的双重重组病毒HaSNPV-WD6。
权利要求
1.一种表达多角体和几丁质酶融合蛋白的重组棉铃虫单核衣壳核多角体病毒，Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus WD6，CCTCC No.V200115，在缺失蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因位点处，插入由病毒多角体蛋白基因启动子启动的多角体和几丁质酶融合基因，以及由热休克蛋白基因启动子控制的标记基因β-半乳糖苷酶基因。
2.一种实施权利要求1所述的表达多角体和几丁质酶融合蛋白的重组棉铃虫单核衣壳核多角体病毒的制备方法，包括以下步骤(1)设计引物，利用PCR技术获得HaSNPV多角体基因编码框和几丁质酶基因编码框除去了编码N端信号肽和C端内质网定位肽的，多角体基因片断以EcoR I和BamH I酶切，几丁质酶基因片断以BamH I和Pst I酶切；将两个基因片断克隆至通用载体pUC19，使两个基因片断融合为一个开放阅读框，得到中间载体；利用EcoRI和PstI酶切中间载体，获得双粘端的融合基因片断；将融合基因片断平端化处理后克隆至载体pWHL5的多角体启动子下游，获得真核转移载体pWD6；(2)将野生型HaSNPV基因组DNA和pWD6共转染昆虫细胞，利用同源重组技术，缺失基因组上的蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，并在缺失的位置插入融合基因，经多轮空斑纯化，得到纯的双重重组病毒。
全文摘要
本发明公开了一种表达多角体和几丁质酶融合蛋白的重组棉铃虫单核衣壳核多角体病毒及其制备方法利用PCR技术扩增HaSNPV多角体基因和几丁质酶基因，克隆至载体pUC19构建融合基因；将融合基因插入真核载体pHaWHL5，获得真核转移载体pHaWD6。该转移载体与野生型病毒DNA共转染昆虫细胞，通过同源重组将融合基因插入病毒基因组，并缺失egt基因。构建出重组病毒HaSNPV－WD6。融合表达的几丁质酶被包埋于多角体中。该重组病毒可在昆虫食入病毒多角体后第一时间发挥作用。
文档编号C12N15/62GK1429902SQ0113837
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者吴东, 陈新文, 胡志红 申请人:中国科学院武汉病毒研究所