专利名称：抗人血红蛋白单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于潜血检测的抗人血红蛋白单克隆抗体。
背景技术：
粪便潜血试验是消化道出血和肿瘤的主要诊断指标。目前临床上，粪便潜血试验常用的一类过筛试验方法，是利用血液的主要成份血红蛋白(Hb)中的亚铁血红素，具有类似过氧化物酶作用而设计的简易化学检查法。这类方法的氧化显色剂较多，如联苯胺、邻-甲苯胺、邻联甲苯胺、愈创木、还原酚酞、氨基吡啉、无色孔雀绿、四甲基联苯胺、二苯胺、二甲基联苯胺等；因而方法众多。上述方法虽然简便易行，但特异性较低、干扰因素较多。动物血、肉、肝脏及富含叶绿素食物、铁剂、维生素C、中药等均可引起假阳性。
为便于精确检测潜血，避免假阳性、特异性差的特点，生产高特异性的的抗人血单克隆抗体具有很强的实用价值。
本发明的公开本发明的主要目的是为了提供一种特异性高的抗人血红蛋白单克隆抗体。
本发明的次要目的是为了提供一种产生特异性高的抗人血红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其制备方法。
本发明的主要目的可通过如下措施来实现一种抗人血红蛋白单克隆抗体。
本发明的次要目的还可通过如下措施来实现一种产生抗人血红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
一种制备产生抗人血红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法包括下述步骤(1)制备免疫脾细胞；取纯化人血红蛋白(Hb)与等量佐剂充分混匀，分别注入小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为20-80μg，间隔2-4周，同法重复注入至少1次；第一次免疫用弗氏完全佐剂、第二次改用弗氏不完全佐剂、第三次不用佐剂；最后一次免疫后两周，测小鼠血清中抗人血红蛋白抗体滴度，将显示有足够高抗体滴度的小鼠作为免疫脾细胞的来源。
测定抗体滴度的方法，可用放射免疫测定RIA或酶联免疫吸附ELISA测定法等；在本发明中通常采用ELISA法。
(2)制备骨髓瘤细胞；骨髓瘤细胞通常使用从小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0细胞系；在进行细胞融合前，将其在常规培养液中培养3-4天，以便在融合时可以得到2×107或更多的融合细胞。本发明通常选用SP2/0骨髓瘤细胞。
(3)细胞融合；将20-80μg的纯化人血红蛋白向已按步骤(1)的方式免疫接种的小鼠腹腔或静脉接种免疫，并且在3-4天后去小鼠的脾脏获得脾细胞；分散脾细胞，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液得脾细胞沉淀物。将上述(2)中培养的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0离心去上清液得骨髓瘤细胞沉淀。用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按数量比(5-10)∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG，再静置1-2分钟后离心去上清液，并缓慢加入沉淀物体积的25-35倍的HAT培养液(在常规培养液中含有次黄嘌呤(10-6至10-3M)，氨基喋呤(10-8至10-7M)与胸苷(10-6至10-4M))悬浮融合细胞，最后补加HAT液至沉淀物体积的140-160倍；再将融合细胞按100μl/孔的加入至96孔培养板中，每孔中再加100μlHAT液小鼠腹水细胞(约1-2×105M/孔)作为饲养细胞。将上述培养孔置于浓度为3-7％的二氧化碳培养箱中，在温度为35-38℃条件下培养10-14小时，从第3天开始，每隔2-3天用每孔半量HAT液换液一次。
当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，再在每孔加半量HA培养液，取培养上清液，用ELISA测抗人血红蛋白抗体及抗体滴度。
将上述抗人血红蛋白抗体阳性、滴度高的杂交瘤转移到另一块96孔板中进行克隆。可以通过一种经有限稀释该杂交瘤使一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法。或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法。或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法。或一种采用细胞分选仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法。本发明优选简单或易于操作的有限稀释方法来进行克隆。克隆过程中采用1640培养液，并用ELISA检测克隆细胞孔上清培养液中抗体及滴度。对抗体阳性、滴度高的孔继续进行克隆3-4次，直至再次克隆时，所有克隆孔均呈抗体阳性，筛选具有一个稳定抗体滴度的克隆作为产生抗人Hb抗体的杂交瘤细胞系。
(4)制备单克隆抗体；用常规培养液培养上述(3)中得的杂交瘤。大量生产单克隆抗体，可采用大瓶旋转培养法。或同系小鼠体内诱生法。其中大瓶培养法可通过培养上述(3)杂交瘤纯化得到抗人将上述(3)Hb单克隆抗体。同系鼠(本发明用Balb/c小鼠)体内诱生法可通过将上述(3)得到的产生抗人Hb抗体的杂交瘤细胞(5×105-106)注入经降植烷处理的雌性小鼠(4至8周龄)腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成份，其上清液即含有抗人Hb单克隆抗体。如果需要进一步纯化，可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析方法纯化。
本发明相比现有技术具有如下优点本发明的抗人血蛋白单克隆抗体具有高度特异性。
本发明的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述一种抗人血红蛋白单克隆抗体。
一种产生抗人血红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
一种制备产生抗人血红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法包括下述步骤(1)制备免疫脾细胞取纯化人血红蛋白(Hb)与等量佐剂充分混匀，分别注入小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次剂量为20-80μg，间隔2-4周，同法重复注入至少1次第一次免疫用弗氏完全佐剂、第二次改用弗氏不完全佐剂、第三次不用佐剂；最后一次免疫后两周，测小鼠血清中抗人血红蛋白抗体滴度，将显示有足够高抗体滴度的小鼠作为免疫脾细胞的来源。
测定抗体滴度的方法，可用放射免疫测定RIA或酶联免疫吸附ELISA测定法等；在本发明中通常采用ELISA法。
(2)制备骨髓瘤细胞；骨髓瘤细胞通常使用从小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0细胞系；在进行细胞融合前，将其在常规培养液中培养3-4天，以便在融合时可以得到2×107或更多的融合细胞。本发明通常选用SP2/0骨髓瘤细胞。
(3)细胞融合；将60μg的纯化人血红蛋白向已按步骤(1)的方式免疫接种的小鼠腹腔或静脉接种免疫，并且在3-4天后去小鼠的脾脏获得脾细胞；分散脾细胞，然后按体积比1∶30加入1640培养液，轻轻吸打数次，再将脾细胞离心去上清液得脾细胞沉淀物。将上述(2)中培养的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0离心去上清液得骨髓瘤细胞沉淀。用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞与骨髓瘤细胞按数量比8∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG，再静置1-2分钟后离心去上清液，并缓慢加入沉淀物体积的30倍的HAT培养液(在常规培养液中含有次黄嘌呤(10-6至10-3M)，氨基喋呤(10-8至10-7M)与胸苷(10-6至10-4M))悬浮融合细胞，最后补加HAT液至沉淀物体积的150倍；再将融合细胞按100ml/孔的加入至96孔培养板中，每孔中再加100mlHAT液小鼠腹水细胞(约1×105M/孔)作为饲养细胞。将上述培养孔置于浓度为6％的二氧化碳培养箱中，在温度为35-38℃条件下培养12小时，从第3天开始，每隔2-3天用每孔半量HAT液换液一次。
当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，再在每孔加半量HA培养液，取培养上清液，用ELISA测抗人血红蛋白抗体及抗体滴度。
将上述抗人血红蛋白抗体阳性、滴度高的杂交瘤转移到另一块96孔板中进行克隆。可以通过一种经有限稀释该杂交瘤使一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法。或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法。或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法。或一种采用细胞分选仪分离单一的杂交瘤细胞的“分选仪克隆”方法。本发明优选简单或易于操作的有限稀释方法来进行克隆。克隆过程中采用1640培养液，并用ELISA检测克隆细胞孔上清培养液中抗体及滴度。对抗体阳性、滴度高的孔继续进行克隆3-4次，直至再次克隆时，所有克隆孔均呈抗体阳性，筛选具有一个稳定抗体滴度的克隆作为产生抗人Hb抗体的杂交瘤细胞系。
(4)制备单克隆抗体；用常规培养液培养上述(3)中得的杂交瘤。大量生产单克隆抗体，可采用大瓶旋转培养法。或同系小鼠体内诱生法。其中大瓶培养法可通过培养上述(3)杂交瘤纯化得到抗人将上述(3)Hb单克隆抗体。同系鼠(本发明用Balb/c小鼠)体内诱生法可通过将上述(3)得到的产生抗人Hb抗体的杂交瘤细胞(5×105-106)注入经降值烷处理的雌性小鼠(4至8周龄)腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成份，其上清液即含有抗人Hb单克隆抗体。如果需要进一步纯化，可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析方法纯化。
权利要求
1.一种抗人血红蛋白单克隆抗体。
2.一种产生权利要求1所述的抗人血红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
3.一种制备权利要求2所述的杂交瘤细胞系的方法，其特征在于采用常规技术将源自于已用纯化抗人血红蛋白免疫接种的鼠的脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择产生所需抗人血红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
全文摘要
本发明涉及一种抗人血红蛋白单克隆抗体，其特异性高，制备方法简便。
文档编号C12P21/08GK1428353SQ01138108
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月25日 优先权日2001年12月25日
发明者李克生, 杜惠芬, 施岺, 何晓东, 王永昌, 王兰, 刘元强 申请人:甘肃省医学科学研究院