专利名称：测定多基因表达的信使核糖核酸特异性单一标记探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于基因分析的标记探针，特别是一种测定多基因表达的信使核糖核酸特异性单一标记探针及其制备方法。
此外，现有的多基因分析方法，大都采用离体反向转录成cDNA和PCR放大。而以胸腺嘧啶寡核甘酸作为引物的离体反向转录，其效率严格依赖于核糖核酸分子末端的Poly A结构。对那些已经部份降解和不含Poly A结构的核糖核酸分子，以及那些Poly A结构较短的核糖核酸分子，则是那些采用离体反向转录和PCR放大所无法分析的。这是所有间接多基因分析方法的一大致命缺陷。
本发明的技术方案是测定多基因表达的信使核糖核酸特异性单一标记探针，其特征在于探针分子具有下列化学通式R1-[X]n-R2；其中R1为含有可以检测到的标记基团包括放射标记与非放射性标记基团；X为具有与硷基A特异配对功能的胸腺嘧啶核甘酸残基和尿嘧啶残基的硷基残基，n代表该分子结构中胸腺嘧啶核甘酸残基及与其他具有同样杂交功能的核甘酸残基的总数目和，为10至200间的任何自然数；R2为含有可以检测到的标记基团包括放射标记与非放射性标记基团。
本发明标记胸腺嘧啶寡核甘酸探针分子可以采用化学法合成。合成所用底物预先标记。标记方法为放射标记或为非放射标记放射标记所用同位素以半衰期较长者为宜；非放射标记采用萤光标记，酶联标记，和特定抗原标记，如硷性磷酸酶，生物素，地高辛原等。
本发明标记胸腺嘧啶寡核甘酸探针分子还可以采用化学法合成。合成所用底物未预先标记，待合成后再进行末端标记。标记方法为放射标记或为非放射标记放射标记所用同位素以半衰期较长者为宜；非放射标记采用萤光标记，酶联标记，和特定抗原标记，如硷性磷酸酶，生物素，地高辛原等。
本发明标记胸腺嘧啶寡核甘酸探针分子也可以采用生物法合成。合成所用底物预先标记。标记方法为放射标记或为非放射标记放射标记所用同位素以半衰期较长者为宜；非放射标记采用萤光标记，酶联标记，和特定抗原标记，如硷性磷酸酶，生物素，地高辛原等。
在采用生物法合成中可以采用a)单向引物延伸反应先合成模板Poly A，该模板的三末端含有与单向引物互补的其他硷基；或采用b)双向引物延伸反应先合成模板Poly A，该模板的三末端和五末端分别含有与引物对互补的其他硷基序列。
采用本发明进行基因分析时待定量样本需预先与非标记的基因特异性探针进行第一次杂交，然后与标记的Poly T分子进行第二次杂交。当信号分离采用电泳时，这种杂交反应在液相中进行；当信号分离采用芯片技术时，杂交反应在固相液相交界面进行。
需要指出的是，当多基因分析的重点包括了部份3末端降解的核糖核酸分子或短尾及无尾的核糖核酸分子时，其与标记的胸腺嘧啶寡核甘酸分子进行第二次杂交前，必须进行尾端结构加尾反应或一体化的处理。加尾反应通过Poly A聚合酶进行；加尾之后即可与信使核糖核酸特异性多用途单一探针进行最后的杂交反应。
而一体化处理的目的则是使所有待测mRNA分子都带有一个长度相等的Poly A尾。这一效果通过三种方式所达到即对超过设定长度的Poly A尾，予以切短；对不够设定长度的Poly A尾，予以补齐；对缺乏Poly A尾的，予以加上设定长度的Poly A尾。这种设定长度的Poly A尾，由制备单链反义cDNA探针时的反义引物上特定限制性内切酶之前所附加带有的常规的胸腺嘧啶寡核甘酸的长度决定。这一附加带有的胸腺嘧啶寡核甘酸的长度通常在20-100硷基之间，以不超过200个硷基为上限。
待测标本中的mRNA先与带胸腺嘧啶寡核甘酸结构的单链基因特异性探针杂交，然后进行mRNA尾的延长反应；这一反应与简单的引物延伸反应相同。之后对杂交复合物进行单链酶处理，以使各种mRNA含有相同长度的Poly A尾。在第一次杂交和尾长度一体化之后，再与小分子的单一探测标记胸腺嘧啶寡核甘酸杂交，以形成标记胸腺嘧啶寡核甘酸与核糖核酸尾Poly A的复合体。
未与Poly A形成复合体的标记胸腺嘧啶寡核甘酸分子的分离，其必要性视所用方法决定。当应用电泳时，由于未形成复合体的标记胸腺嘧啶寡核甘酸分子的迁移速度远大于由基因特异性探针/mRNA/单一标记胸腺嘧啶寡核甘酸等三种成分形成的殊结构，因而无须单独的分离过程。当使用芯片技术时，未形成复合体的标记胸腺嘧啶寡核甘酸分子，以漂洗的方法进行分离。
对于同一样本中不同种类的mRNA的比较的另一种更为直接的方法，是采用基因特异性探针3‘末端含有特定长度的Poly A附加定标成份。如这内在定标成份加在持家基因上，其长度可为标记探针分子长度的0.5倍，1倍，2倍。在定量分析时，该持家基因表达的实际多少，可由含有与不含有附加定标成份探针所显示的标记量的比较，得出天然长度的Poly A持家基因与定长Poly A持家基因的信号强弱，达到准确定量的目的。
本发明的有益效果是本发明利用mRNA分子中特有的多聚腺嘌呤(Poly A)尾端结构，以胸腺嘧啶寡核甘酸为中心进行化学改构而制造mRNA分子特异性的单一标记探针，解决多基因分析时因标记所造成的误差。对于比较不同样本中同一类别的mRNA较其他方法有许多明显的优势，该方法简便，可靠，重复性好，所得数据为其相对含量的直接比较。更为重要的是，对于同一样本中不同种类的mRNA的比较，本技术通过对mRNA进行尾端结构的一体化处理，使现有多基因间接测定技术无法分析的短尾和无尾mRNA也能达到严格的一对一的数量关系。本发明的对天然mRNA测定时所具有的简单，直接分析的特征，开创了多基因分析的新方向。
图中mRNA在芯片上的位置或其在电泳时的位置，由其与特异探针的关系所确定。在这里，Poly T仅仅起到对不同mRNA分子进行数目的清点，或者说有多少“尾”mRNA。
图2是具体应用举例地高辛原标记Poly T用于脱氧核糖核酸的固相定量技术。
图中1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12为不同浓度的脱氧核糖核酸点样在尼龙膜上，然后通过加热交联，与生物素标记Poly T杂交，漂洗，然后与预先交联硷性磷酸酶结合，最后通过酶促化学反应的显色原理，进行定量分析。其中1，2，3分别为20，2，0.2ng人胎盘肝脏脱氧核糖核酸；4，5，6分别为20，2，0.2ng人类胚胎肾脏脱氧核糖核酸；7，8，9分别为20，2，0.2ng人胎盘脱氧核糖核酸；10，11，12分别为20，2，0.2ng人胚胎脑脱氧核糖核酸。
以下为几种测试过的标记胸腺嘧啶寡核甘酸探针分子1)5’R1-[X]n-R2其中R1为生物素；[X]为T残基n＝39；R2为T；2)5’R1-[X]n-R2其中R1为生物素；[X]为T残基n＝40；R2为生物素；3)5’R1-[X]n-R2其中R1为地高辛原；[X]为T残基n＝29；R2为T；4)5’R1-[X]n-R2-其中R1为地高辛原；[X]为T残基n＝29；R2为地高辛原；5)5’R1-[X]n-R2其中R1为GGGGGGTGGGGGGTTTT，[X]为第7位3H标记的T，n＝50；R2为GCGGCG；6)5’R1-[X]n-R2其中R1为GGGGGGTGGGGGGTTTT；[X]为T与U的混合物，其U/T为1/5，U为地高辛原-11-dUTP，n＝29；R2可为T(机会为5/6)也可为U(机会为1/6)；7)5’R1-[X]n-R2其中R1为GGGGGGTGGGGGGTTTT；[X]为32P标记的T与非标记的T以1∶10的比例随机组合，n＝30；R2为GCGGCG。
权利要求
1一种测定多基因表达的信使核糖核酸特异性单一标记探针，其特征在于所说的探针分子具有下列化学通式R1-[X]n-R2；其中R1为含有可以检测到的标记基团包括放射标记与非放射性标记基团；X为具有与硷基A特异配对功能的胸腺嘧啶核甘酸残基和尿嘧啶残基的硷基残基，n代表该分子结构中胸腺嘧啶核甘酸残基及与其他具有同样杂交功能的核甘酸残基的总数目和，为10至200间的任何自然数；R2为含有可以检测到的标记基团包括放射标记与非放射性标记基团。
2按照权利要求1所述的标记探针，其特征在于X是没有改构的天然胸腺嘧啶核甘酸残基是放射标记。
3按照权利要求1所述的标记探针，其特征在于X是改构的具有放射标记的胸腺嘧啶核甘酸残基。
4按照权利要求1所述的标记探针，其特征在于X是具有与胸腺嘧啶核甘酸残基相同杂交功能的其他核甘酸残基。
全文摘要
本发明是一种测定多基因表达的信使核糖核酸特异性单一标记探针。其特征在于探针分子具有下列化学通式R1－[X]n－R2；其中R1、R2为含有可以检测到的标记基团包括放射标记与非放射性标记基团；X为具有与硷基A特异配对功能的胸腺嘧啶核甘酸残基和尿嘧啶残基的硷基残基，n代表该分子结构中胸腺嘧啶核甘酸残基及与其他具有同样杂交功能的核甘酸残基的总数目和，为10至200间的任何自然数。本发明对于比较不同样本中同一类别的mRNA较其他方法有许多明显的优势，该方法简便，可靠，重复性好，所得数据为其相对含量的直接比较，开创了多基因分析的新方向。
文档编号C12Q1/68GK1430062SQ0113864
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月29日 优先权日2001年12月29日
发明者李凯, 张佳, 张旭 申请人:张旭