专利名称：一种用于酒精发酵的自絮凝酵母菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，特别涉及到一种新的、用于酒精发酵的、可以自絮凝形成颗粒的酵母菌株。
背景技术：
迄今为止，酒精发酵主要使用游离酵母细胞，微米级大小、含水80％左右的游离酵母细胞在发酵过程中悬浮于发酵醪中，在连续发酵过程中随发酵醪的流动不断流出发酵罐，致使发酵罐中酵母细胞密度低，通常仅为1.0×108个/mL左右，酒精发酵的平均发酵时间长，对淀粉质原料，当发酵终点酒精浓度达到11～13％(v)时，平均发酵时间长达50～60小时。
利用吸附、包埋、交联等手段可以制备各种固定化酵母。虽然这种固定化技术可以使发酵罐中酵母细胞密度提高，酒精发酵的平均发酵时间相应缩短，但需要使用载体材料，相应增加了酒精发酵的生产成本。
发明内容
本发明的目的在于通过原生质体融合技术选育一株酒精发酵性能优良且具有强自絮凝能力的酵母菌株。
本发明的技术方案是以具有自絮凝能力的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Lindner 2.1461)和酒精发酵性能优良的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 2.607)为双亲株，通过常规酵母细胞原生质体融合技术得到融合株，该融合株综合了双亲株的优良性能，可以自絮凝形成颗粒，且酒精发酵性能优良。进一步在小型发酵罐中以淀粉质原料双酶法制备的糖化液为底物，进行酒精连续发酵，对该融合株进行驯化，使其性能稳定。该融合株的名称根据双亲株来源暂定名为SPSC01，保藏在本申请人所在实验室，同时还保藏在国家知识产权局指定的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记号为0587。
本发明的效果和益处是利用该菌株能够自絮凝形成毫米级颗粒的特征，在发酵罐中实现细胞固定化。这一新的细胞固定化技术方法简单，不使用任何载体材料，没有附加费用，发酵罐中酵母细胞密度能够达到50g(d.w)/L以上，在发酵终点酒精浓度13％(v)条件下，平均酒精发酵时间可以由目前的50～60小时缩短到20～25小时，而且该自絮凝酵母颗粒置于100mL量筒内时，可以在数秒钟内自由沉降，工业生产上勿需使用离心机分离菌体。
附图1为自絮凝菌株SPSC01的电镜照片。
附图2是自絮凝菌株SPSC01酒精发酵的小型发酵罐结构示意图，图中1、上部沉降区外筒体，Dg100，高度100。
2、沉降区环形挡板，Dg80，高度100。
3、缓冲区过渡节，锥角为60°。
4、主发酵区筒体，Dg50，高度400。
5、颗粒悬浮导流筒，Dg20，高度480。
6、底部封头，锥角为60°。
a、发酵液出口接管，位于沉降区外筒体中间。
b、驱动气进口，为内径φ1的喷嘴。
c、酵母乳液排放口，为φ6短接管。
d、接种及流加口，为φ10短接管。
e、为期排放口，为φ6短接管。
f、温度计插口，与温度计安装尺寸匹配。
g、pH电极插口，与电极安装尺寸匹配。
该发酵罐使用有机玻璃制造，使用前化学法灭菌，并用无菌水冲洗二次。
具体实施例方式
以下结合附图详细叙述本发明具体实施方式
及最佳实施例。
该菌株的培养特征如下在保藏培养基平板上，该菌株菌落呈圆形，湿润，表面有褶皱，乳白色。液体摇瓶培养4～8小时内可以观察到细胞自絮凝形成毫米级大小的颗粒，如附图1所示，并在后续扩大培养过程中始终以颗粒形态生长。无性繁殖为出芽繁殖，培养液镜检，可以观察到少量游离细胞，呈椭圆形。
该菌株的生理特性如下能发酵与同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖及淀粉质原料双酶法制备糖化液中的各种其他还原性糖。
不能发酵乳糖、木糖不能同化鼠李糖、山梨糖、淀粉絮凝性强絮凝性，摇瓶培养4～8h即可絮凝成毫米级颗粒，培养液澄清，显微镜下检查游离细胞很少。
耐酒精度以双酶法制备的淀粉糖化液为培养基，摇瓶间歇发酵时可以耐受的最高酒精浓度为21％(v/v)。
最适温度菌体生长和酒精发酵的最适温度分别为30～32℃和34～36℃。
将斜面试管保藏的菌种接种到YMPG液体培养基中，培养基组成为(g/L)葡萄糖10，酵母浸膏5，蛋白胨3。在30～32℃的摇床中培养，摇床转速150rpm，4～8h之内可以观察到自絮凝颗粒形成。摇床停止后，该自絮凝颗粒在数秒内沉降，培养液澄清透明。培养24h后静置沉降，弃去上清液，保留自絮凝颗粒，并更换新鲜培养基，继续培养，仍然使用YMPG培养基，但葡萄糖浓度提高到30g/L，其他组成不变，培养24h后可以分瓶扩大培养，摇瓶种子量视发酵罐接种要求而定。
本发明的最佳实施例为该自絮凝酵母颗粒在附图2所示小型发酵罐中以淀粉质原料糖化液为底物的酒精发酵。
以粒度为1mm(过φ1mm的分级筛)的脱皮脱坯玉米粉为原料，双酶法制糖，操作步骤如下以料水比1∶2.5配制粉浆，升温到55～60℃，按每克原料10u加入α-淀粉酶，升温到95℃液化90分钟后，冷却到62℃，使用硫酸调节pH值为4.5，按每克原料150u加入糖化酶糖化，糖化时间10h，糖化醪DE值达到90以上。
液化和糖化可以在小型搅拌槽中进行，充分搅拌，防止颗粒物料沉降。
糖化结束后以过滤的方式去除残渣，得到糖化液，供自絮凝酵母颗粒在发酵罐中培养和酒精连续发酵使用。
将糖化液稀释到10～12Bx，分别添加(g/L)(NH4)2SO4，3；KH2PO4，1。得到1#培养基，用于接种后的种子扩大培养。
将糖化液调节到20～22Bx，分别添加(g/L)(NH4)SO4，1；KH2PO4，0.3。得到2#培养基，用于酒精连续发酵。
发酵罐中盛装灭菌后的1#培养基，接种摇瓶培养的自絮凝酵母颗粒后，在通风条件下进行扩大培养。间歇培养和流加培养结合，接种后先间歇培养到发酵罐中残糖降至0.1％(w/v)后开始流加1#培养基进行流加培养，培养基流加速率根据菌体生长情况及时调节，保持发酵罐中残糖水平为0.1％(w/v)，并检测发酵罐中菌体浓度，当发酵罐中菌体浓度达到30g(d.w)/L时，使用2#培养基进行酒精连续发酵。酒精发酵时发酵罐中自絮凝酵母颗粒的浓度控制在30～50g(d.w)/L。
在发酵罐四级串联操作的条件下(自絮凝酵母颗粒培养时各发酵罐并联操作)，平均发酵时间20h，发酵终点酒精浓度可以达到13％(v)以上，自絮凝酵母颗粒在发酵罐中实现完全固定化。当发酵罐中自絮凝酵母颗粒的浓度超过50g(d.w)/L时，需排放酵母乳液，自絮凝酵母颗粒可以从乳液中自行沉降分离，勿需使用离心机分离菌体。
权利要求
1.在生物学上采用原生质体融合技术选育、纯人工培养的、用于酒精发酵的自絮凝酵母菌株，其主要特征为a)该菌株接种到摇瓶内培养时，可在4～8小时内自絮凝形成毫米级颗粒，并在后续扩大培养过程中始终以颗粒形态生长；b)该自絮凝酵母颗粒可以在发酵罐中实现固定化；c)该自絮凝酵母颗粒置于100mL量筒内时，在数秒钟内自由沉降。
全文摘要
本发明属于微生物工程技术领域,特别涉及到一种新的、用于酒精发酵的、可以自絮凝形成颗粒的酵母菌株。本发明的技术特征在于该菌株接种到摇瓶内培养时能够在4～8小时内自絮凝形成毫米级颗粒,并在后续扩大培养过程中始终以颗粒形态生长。本发明的作用在于这种自絮凝酵母颗粒可以在发酵罐中实现固定化,达到高密度培养和酒精发酵的目的,使酒精发酵的平均发酵时间缩短,同时该自絮凝酵母颗粒置于100mL量筒内时,可以在数秒钟内自由沉降,工业生产上勿需使用离心机分离菌体。
文档编号C12N1/16GK1352241SQ01138778
公开日2002年6月5日 申请日期2001年12月4日 优先权日2001年12月4日
发明者白凤武, 赵心清, 谢健, 任剑刚, 袁文杰 申请人:大连理工大学