专利名称：用氢代谢甲烷细菌生产维生素b的制作方法
技术领域：
本发明涉及维生素B12的制造方法。
众所周知，钴胺素即维生素B12的类似物化学合成困难，是由细菌或放线菌经生物合成而得，不能由酵母、霉菌、植物、动物进行生物合成而得。目前工业上是从以甲醇为基质的丙酸菌菌体中提取的。这样的维生素B12主要用来制造药品，但近年来，将维生素B12添加入食品中开发功能性食品或用于保健食品的需求量日渐增加，迫切需要降低成本。
背景技术：
以往由丙酸菌制造维生素B12是以甲醇为基质的，同时由于这种菌是兼性厌氧菌，所以繁殖非常慢，而且因丙酸转换成乙酸而由乙酸引起繁殖阻碍，导致发酵液中菌体密度不高，只能从菌体中提取大约1mg/L维生素B12，生产效率低。其后，永久史郎等人(生物工学会志、76(6)、447-455、1998)使用以甲醇作基质的甲烷细菌固定床生物反应器，甲烷细菌和丙酸菌的维生素B12的生成量相比，获得量达到约10倍，主要成分为类钴啉，但其中以钴胺素的形式存在的很少，这种情况下和甲醇很难分离，维生素B12的收率无法提高，维生素B12的含量低，因而未能解决生产成本降低的问题。
本发明的研究课题有鉴于此，本发明致力于解决如上所述的以往技术中的问题，提供一种可以高效率制造含量高、收率高的维生素B12的新方法。
附图的简要说明
图1举例表示甲烷细菌体密度的增加。
图2举例表示菌体内维生素B12和菌体外维生素B12的比率。
图3举例表示Co/Fe比和氰钴胺密度的关系。
图4表示1例生物反应器的结构。
图5表示另1例生物反应器的结构。
图6表示固定床发酵槽中甲烷细菌活性和维生素B12含量之间的关系。
其中，图4和图5中的符号表示如下1.多孔性陶瓷2.反应器3.载体充填槽4.阴极5.散气喷嘴6.电磁阀7.储气罐8.生物气体或煤气送气管9.释氧部10.阳极11.电磁阀12.电磁阀13.压力检测控制设备14.止逆阀15.泄出阀16.泄出阀17.电解槽18.超滤膜装置19.压力控制电磁阀20.气体温度检测控制设备21.培养基用液供液喷嘴本发明的最佳实施方案本发明完成了上述课题，第1，提供维生素B12的制造方法，其特征在于将由消化污泥中得到的中温甲烷细菌以H2/CO2作为培养基进行驯化，将驯化甲烷细菌在含有微量金属元素的无机营养盐的载体上经固定床生物反应器增殖，在煤气和生物气体的至少一种气体中加入氢气后得到混合气体，用驯化甲烷细菌使其代谢并改性成为甲烷，同时将作为菌体外生成物、存在于发酵液中的钴胺素用氰化钾使其形成氰钴胺后予以回收。
第2，提供维生素B12的制造方法，其特征在于将由消化污泥得到的中温甲烷细菌以H2/CO2作为培养基进行驯化，将驯化甲烷细菌用含有微量金属元素的使用超滤膜的悬浮培养反应器增殖，超滤膜的过滤液中所含细胞外钴胺素用氰化钾使其形成氰钴胺后回收，使甲烷细菌经超滤膜再回到培养液中进行培养以使煤气和生物气体的至少一种气体中加入氢气所得的混合气体发生代谢。
第3，上述方法中微量金属浓度为标准组成的10～1000倍；第4，氢代谢甲烷细菌的培养基的微量元素盐的浓度中，Co/Fe比是标准组成的10～100倍。
另外，第5，本发明提供甲烷的发酵方法，在煤气或生物气体加入氢气的方法就是在固定床或悬浮型生物反应器的底部插入多孔性陶瓷，阴极在上、阳极在下，通直流电，使培养液中的水发生电解，将产生的氢气用于微量元素强化载体固定床或膜复合型甲烷发酵生物反应器，氧气释放到大气中去。第6，本发明提供气体的改性方法，其特征在于，将菌体外产物——钴胺素用氰化钾使其形成氰钴胺并提取出来，对残留液通直流电使其电解，由此得到的氢气提供给含有一氧化碳或二氧化碳的煤气或生物气体，利用膜复合生物反应器或固定床反应器进行甲烷化反应。
也就是说，发明人在含有微量元素的无机营养盐的载体(专利申请平9-140181，专利公告平10-327850)的开发中尝试往生物气体中的CO2(约40％)中加入H2发生甲烷化(methanation)，结果发现，以前的报告结果是如果用甲烷生成菌以外的菌，那么大部分维生素B12存在于菌体中，而甲烷化实验中通过计算维生素B12的质量平衡发现培养液中全部维生素B12的70％发生菌体外溶出，甲烷细菌体中只含有30％，而且将中温甲烷细菌以氢气和二氧化碳的混合气体作为基质、用驯化培养来进行选择培养得到的甲烷细菌，能够从发酵液中以氰钴胺的形式提取高浓度的钴胺素(维生素B12的类似化合物)，依据这些事实，完成了本发明。
首先，本发明方法的基本要点为1)用H2/CO2作为培养基驯化消化污泥中得来的中温甲烷细菌；2)使驯化甲烷细菌在含有微量金属元素无机营养盐的载体上通过固定床生物反应器发生增殖；3)在煤气、生物气体中加入氢气后形成混合气体，使混合气体代谢并改性成为甲烷；4)同时将发酵液中存在的菌体外生成物——钴胺素通过氰化钾使其形成氰钴胺、即维生素B12并加以回收。
此方法中，对上述载体而言，将微量金属浓度提高到以前的10-1000倍是有效的。
还有，对于同时使用超滤膜的膜复合型生物反应器中进行的悬浮培养等，将微量金属盐浓度和营养盐浓度提高比到以往的方法10～1000倍是有效的。所谓同时使用超滤膜的悬浮培养，具体而言，本发明提供了这样一种维生素B12的制造方法，如前所述，将由消化污泥而来的中温甲烷细菌用H2/CO2作为培养基进行驯化，用含有微量金属元素的同时使用超滤膜的悬浮培养反应器使驯化甲烷细菌增殖，超滤膜过滤液中所含细胞外钴胺素用氰化钾使其形成氰钴胺并加以回收，并使甲烷细菌通过超滤膜回到培养液中进行培养以使煤气和生物气体的至少一种气体中加入氢气后得到的混合气体发生代谢。
以上不管何种方法，在本发明中只要稍微改变一下培养基，尤其是将培养基中的Co/Fe比提高10～100倍，就可以提高培养盐中钴胺素的浓度。因此，本发明中，通过使含有CO2和CO的煤气或生物气体100％CH4化的甲烷化反应实现煤气或生物气体成分的改性，同时此培养液用氰化钾形成氰钴胺(维生素B12)，这种维生素B12的回收与以往的从菌体回收的方法相比非常简单，维生素B12的浓度与丙酸菌相比也要高50～100倍，相当于由甲醇代谢甲烷细菌(永井史郎1996，生物工学会志74(6)，447-455)的回收方法的2-10倍，可大幅降低维生素B12的制造成本。
下面结合附图，对本发明作进一步说明。
图1中，将中温甲烷细菌以氢气80％、二氧化碳20％组成的混合气体为基质并用液态标准合成培养基进行充分驯化得到甲烷细菌、然后在同样中温(35℃～36℃)下用营养盐或含微量金属盐浓度比以往高10～1000倍的无机营养盐的载体(专利申请平9-140181，专利公开平10-327850，微量元素·无机营养盐类扩散型菌体培养载体)连续培养，此时的甲烷细菌菌体密度的增加用图1表示。甲烷细菌菌体密度达到26g-dry/L时维生素B12的浓度达到了185mg/L。这个结果相当于用丙酸菌来制备的方法的50～100倍。
图2中，微量金属浓度是以往的方法的10倍，此合成培养基中通入氢气80％、二氧化碳20％作为基质，观察悬浮培养液中的菌体内V.B12和菌体外V.B12的比率。结果表明分别达到了30％和70％，由此可知，用含有微量元素·营养盐的载体分离菌体外溶出V.B12，是可以实现高效率的制造的。
另外，图3中，以二氧化碳浓度为40％～60％、氢气浓度为60％组成的混合气体作为基质，以含微量元素·营养盐的载体中的微量元素钴和铁的比率为参数运行生物反应器，氰钴胺的浓度如图3所示。可见，钴胺素是维生素B12的类似化合物，对钴的要求很高。
如图4，在二氧化碳或生物气体中不断加入氢气是采用如下方法，在生物气体反应器中将多孔性陶瓷1置于反应器2底部，其下和反应器2最下面的液体中放置相当于阳极10的金属电极(钛、铁)，在多孔性陶瓷1的正上方的散气喷嘴正上方放置铂或钛制的阴极4电极板，加电压20～100V。这样氢气在阴极4的板上产生，氧气在阳极10的电极板上产生，而由于设有氧气排放部分9因此氧气可通过鼓风机B2扩散至大气中。如果多孔性陶瓷1的间隙大小保持在只相当于产生的氧气的气泡直径的1/20～1/100，由于鼓风机的作用压力一直保持高于大气压，那么电解产生的氧气就不会通过多孔性陶瓷1进入反应器2，从而可以保证生物反应器内的绝对厌氧性。载体充填槽3结合在反应器2中从而使含有微量元素的载体形成固定床。其容积充填至有效容积的30～60％。煤气或生物气体根据压力检测控制器13的指示，由煤气或生物气体送气管8进入，而通过打开电磁阀11和12不断启动鼓风机B1，使得二氧化碳浓度降低和甲烷浓度升高，此时电磁阀6得到气体浓度检测控制器20的指示而打开，往储气罐7中输送甲烷气体。而当生物反应器2内压力降低时电磁阀6和12关闭，新的气体就从生物气体或煤气送气管8输送进来。
如图5，将含有钴胺素的发酵液用电解装置17分解，仅向生物反应器2送氢气，利用繁殖在载体充填槽3的固定床上的甲烷细菌发生甲烷化过程，由生物气体或煤气送气管8送入的二氧化碳因电解装置17送来的氢气反应产生甲烷。生物反应器内甲烷浓度升高，当浓度接近100％时气体检测控制装置20就打开阀6，向储气罐7输送甲烷。一旦生物反应器内的压力降低时，电磁阀6和12就关闭，电磁阀11打开，就可以由生物气体或煤气送气管8再送入新气体。如此图4、5就都形成了以气体为基质的半连续操作。另一方面，液体中钴胺素浓度升高，所以用泄出阀15和16随时检测浓度，一旦达到最大浓度就引流出一定量的液体并由此液体来回收维生素B12。一边由8供应新的气体一边用泄出阀15和16引流出液体、这样的操作过程可防止氧气进入生物反应器2内。然后通过图4、5所示的培养基用液供液喷嘴21用泵供应培养基溶液。
图4和图5中举出的这些方法、装置对本发明的第1到第4项中任何一种方案的实施都是很有用的。
以下就本发明的实施例加以说明。实施例<1>微量元素浓度为以往方法的10倍，进行使其中的氯化钴浓度升高的间歇式悬浮培养实验，以20％CO2和80％H2组成的合成气体为基质，这种情况下培养液中维生素B12的浓度经过48小时后为25.2mg/L。以往文献中从丙酸菌得到的维生素B12的浓度值为0.5～1mg/L，因此使用本发明的方法，确实可以得到高收率的维生素B12且氰钴胺很容易溶出到菌体外再由培养液中回收。
<2>溶液的浓度是以往方法的1000倍，将其和封闭在含有微量元素·营养盐的固定载体中的物质充填入容积为5L的固定床生物反应器，在CO240％、CH460％的生物气体中用电解法连续供氢气给培养液，连续进行生物气体的改性，从而可以改性成为98～99％的CH4。而且同时培养液中的维生素B12的浓度达到了180mg/L。这个结果是由丙酸菌生产的方法的50～100倍，生产速度也达到了它的25-50倍。
由此，实施例的具体作用和特定效果汇总如下1.由强化微量元素的培养液中回收维生素B12，不是由菌体本身中回收维生素B12，所以可以保持高密度的菌体，回收菌体外产物钴胺素的量大大超过了以往的方法，维生素B12的收率得以提高。
2.氢气能够通过电解生物反应器中的溶液本身来供气，从而得以实现生物气体或煤气的改性以及高能量化。
3.维生素B12可以用氰化钾直接以氰钴胺的形式来回收，进一步降低了维生素B12的制备成本。
<3>微量元素浓度为以往方法的1000倍的溶液封闭在包含营养盐的载体中，充填入如图5所示的容积5L的固定床生物反应器中，浓度为以往方法的100倍的溶液作为培养基，平均停留时间(HRT)设定为3天和6天这两个条件，进行连续加液实验。此时在CO240％、CH460％组成的生物气体中，电解流出物一侧的培养基，产生的氢气不断供给，连续进行生物气体的改性30天，结果如图6所示。最初9天就是启动时必须的HRT的3倍时间。因这个时期很不稳定，故测定了9～30天内的甲烷产生速度和氰钴胺维生素B12(完全型)。结果显示，HRT6天的情况下，完全型维生素B12的浓度保持在约37.5mg/L，甲烷产生速度为11.5L/Lh。完全型维生素B12的生成速度按HRT来看，是由丙酸菌制备的速度的110-160倍，和以甲醇为基质的TAPPAN等人(1987Applied Microbiology and Biotechnology，26511-516)的结果相比，如图6结果显示完全型维生素B12的生成速度是其20倍。
另外，如图6所示的实验中，可以看到甲烷细菌的密度达到40g/L，完全型维生素B12由甲烷细菌中大量溶出，因此肯定可以以低廉的成本实现维生素B12的稳定的工业化生产。
工业应用可能性综上所述，利用本发明，可以高收率、高含量、比以往的方法高效率地生产维生素B12。
权利要求
1.一种维生素B12的制造方法，其特征在于由消化污泥而来的中温甲烷细菌用H2/CO2作为培养基进行驯化，将驯化甲烷细菌在含有微量金属元素无机营养盐的载体上经固定床生物反应器增殖，在煤气和生物气体的至少一种气体中加入氢气后得到的混合气体经此驯化甲烷细菌代谢而改性成为甲烷，同时作为菌体外生成物存在于发酵液中的钴胺素用氰化钾使其形成氢钴胺，并予以回收。
2.一种维生素B12的制造方法，其特征在于由消化污泥而来的中温甲烷细菌用H2/CO2作为培养基进行驯化，通过含有微量元素、合并使用超滤膜的悬浮培养反应器使驯化甲烷细菌发生增殖，将超滤膜过滤液中所含细胞外钴胺素用氰化钾形成氰钴胺后加以回收，并将甲烷细菌通过超滤膜回到培养液中进行培养以便使煤气或生物气体的至少一种气体中加入氢气后得到的混合气体进行代谢。
3.如权利要求1或2记载的方法，其中微量金属浓度为标准组成的10～1000倍。
4.如权利要求1或2记载的方法，其中氢代谢甲烷细菌的培养基的微量金属盐的浓度中Co/Fe比为标准组成比的10～100倍。
5.一种甲烷的发酵方法，其特征在于在固定床和悬浮型生物反应器的底部插入多孔性陶瓷，阴极在上，阳极在下，施加直流电压，通过电解培养液中的水，将产生的氢气用于微量元素强化型载体固定床或膜复合型甲烷发酵生物反应器，并将氧气释放入大气中去。
6.一种气体的改性方法，其特征在于将作为菌体外生成物的钴胺素用氰化钾使其形成氰钴胺后提取出来，再对残留的溶液施加直流电压，使其电解，所得氢气供给含有一氧化碳和二氧化碳的煤气或生物气体，通过膜复合生物反应器或固定床反应器发生甲烷化反应。
全文摘要
由消化污泥而来的中温甲烷细菌用H
文档编号C12M1/40GK1396956SQ01804425
公开日2003年2月12日 申请日期2001年2月1日 优先权日2000年2月1日
发明者前川孝昭, 张振亚 申请人:科学技术振兴事业团