专利名称：：具有集成生物传感器芯片的生物识别系统的制作方法
技术领域：
：本发明总体上涉及感测或检测不同的靶分析物，包括离子(例如铁、铬、铅、铜、钙、或者是钾)以及大分子(例如DNA、RNA或蛋白质)的设备及方法，特别是生物传感器、使用生物传感器的方法及制造生物传感器的方法。
背景技术：
：许多生物传感器已被发展用于检测生物材料，例如致病菌。传统检测病菌的方法通常涉及有机体的形态学评估或仰赖于(通常是必须的)培养进行这种评估所需数目的有机体；此种方法通常耗时而且不适用于野外应用。快速检测的需求及便携性促成了将病菌识别与信号传导结合的系统的发展。光学及电化学的细菌检测皆有文献报导(Ivnitski，et.al.，1999，T.Wang，et.al.，2000)(文献引用详细列于此叙述后)，然而发明人认为电化学方法在微型化上具有相对的优势。理想的传感器标准包括高精确性、高灵敏度及可在相对短时间内完成的方案。并且，可被微型化及自动化的系统与现有技术相比有明显的优势，特别是当检测需要在野外进行时。电化学方法使用电路完成的原理。为完成此电路，一反电极(Counterelectrode)被用于提供回到样品溶液或者试剂的返回路径；一个参考电极被用作确定其他电极(通常为工作电极或测量电极)电位的参考点。此种接触必须由电化学方法提供，即浸入化学溶液或试剂中的金属电极，因此电极上所产生的串联电位无法避免。传统的电化方法学理论要求参考电极电位非常稳定而且不受溶液中化学变化影响。因此可提供非常稳定参考电位的银/氯化银参考电极，是目前最常被使用的参考电极。在图1中，一个传统的银/氯化银参考电极10包括一个氯化银导线1(银导线包着一层氯化银)浸在用氯化银(AgCl)饱和的氯化钾(3.5MKCL)溶液5中。此内部填充液5经由一多孔的陶瓷接头20缓慢渗出电极，作为参考元件1及样品的电流连接。氯化钾因其低成本及不影响测量而被使用。此溶液5还包含氯化银，以防止参考元件1的涂层溶解。因此，由一溶液填充孔40来维持电极10中溶液5的水平。然而发明人认为，坚固及精确的生物检测可用电化学方法完成，更精确的说，是使用氧化还原(Reduction-Oxidation)方法检测，而不用具有上述已知的参考电极电位的双层参考电极结构(一层氯化银涂在一层银上)。图2中，电化学方法还需要一个专用稳压器(Potentiostat)50，此仪器是将检测元件置于所述回路上的控制放大器。此方法的目的是藉由放大通过第三个辅助电极(反电极)的电流，以控制测试电极(工作电极)和参考电极之间的电位差异。实际上，用极少的元件即可制造出一相当好的稳压器。据图所示电路中，90A和90B为1.22伏特能阶的参考二极管，用于连接正极和负极电源线。电位计100是用于设定所需的电池的极性，以连接于主控制放大器110的非反向输入端。工作电极60连接到电路的地线上，而参考电极70接到主控制放大器110的反向输入端。为了提高输出容量(多数操作放大器受限于约20MA且不能很好地承受电容负载)，所以一个整体增益缓冲放大器120被使用于此电路中。增益缓冲放大器120优选具有比主控制器放大器110高的频宽，不然线路会因驱动电容元件而产生振荡。放大器120的输出端经由一电流测量电阻140连接到辅助电极80上。差异放大器130用于测量此电阻140的电压降，以转换成地线的参考输出电压。微电子机械系统(MEMS)技术提供了适用在各种不同工程领域中检测及致动的换能器。MEMS技术的重要性在于，使微米级的机械元件能整合于电子元件上，并能大批量生产。MEMS装置是由显微机械加工方法制造出来的，此批量制造方法运用了平版印刷术(Lithography)。显微机械加工主要依赖于使用此平版印刷方法，通过事先设计的图样(掩模)来制造三维空间的结构(HoandTai，1996，1998)。MEMS技术适用于显微制造的元件或其相关方面。显微制造的装置通常被定义为使用MEMS和/或集成电路(IC)技术制造的装置。集成电路(IC)被定义为在它上面蚀刻或印制了复杂的电子元件及连接线的一极小的基质材料芯片。发明人认为电化学方法所固有的微型化及携带性使此方法成为整合到MEMS装置上的最佳候选者，而且将MEMS技术与生物检测方式结合将更有利于检测不同的离子及大分子(DNA、RNA或蛋白质)。发明人认为，在细菌的生物检测领域中，提高专一性最有效的方法为检测细菌的遗传材料(例如rRNA、mRNA、变性DNA)。通过选择其序列只互补于靶细菌rRNA或ssDNA的单链DNA探针，监测杂交事件，可以选择性地检测靶细胞。为提高灵敏度，将杂交事件与酶促反应关联来作信号放大，因为每一种底物与产物的转换会对总的信号作出贡献。本发明中运用酶促反应来放大DNA杂交的生物检测过程，以在合理的短时间内完成。因此，业已根据以上测定和技术开发出了用于大肠杆菌(E.coli)的原型电流检测仪(Chen，etal.，2000，Gau，etal.，2000)。MEMS、自我组装的单层(SAMs)、DNA杂交、和扩增都导致了微型化、专一性和灵敏的大肠杆菌检测仪的设计。早先业已报导了DNA电化学探头(Wang，etal.，1997，Marrazza，etal.，1999)，该探头采用了石墨或碳电极。还可以获得用于检测来自大肠杆菌DNA的电流的商用装置，该装置采用了在一次性检测条上通过丝网印刷形成的碳电极。丝网印刷的优点是成本低；不过，不容易获得高度的尺寸精确性。因此，发明人认为，需要开发一种使用平板印刷术的方法，以便用诸如金属(例如，金和银)和碳的材料印刷出微米级大小的精确的图案。不过，使用表面改性，如生物素-DAD-C12-SH十二烷酰胺的自我组装的单层(SAM)是一种选择性地将分子固定在MEMS表面上的优选方法。业已深入研究过在金、银和其他金属上形成SAMs(Revell等，1998，Motesharei等，1998，Xia等，1998，Lahiri等，1999)，并且可以通过SAMS将蛋白质和其他生物分子方便地固定在诸如金的表面上(Ostuni等，1999，Kane等，1999，Spinke等，1993，Haussling等，1991)。业已证实了将SAMs用在电极上的电流测定方法的成功检测靶分析物的能力(Sun等，1998，Hou等，1998，Murthy等，1998)。在该大肠杆菌检测系统中，本发明确定并利用了每一种方法所固有的某些优点。采用DNA杂交和酶扩增，本发明获得了所需要的专一性和灵敏度。发明人使用MEMS和SAMs生产出了一种可以发展成便携式仪器的微型化系统。最后，本发明证实，本发明的检测系统可应用于多种致病菌。例如，适用于检测尿路致病性大肠杆菌，并且鉴定能导致中耳炎的微生物。因此，本发明的目的是提供新型生物传感器，使用该生物传感器的新方法，以及生产该生物传感器的新方法。这一目的是通过披露了本发明的进一步的优选实施方案的独立权利要求和从属权利要求的特征的组合而实现的。发明概述本发明的概述不一定披露在说明书中详细说明的所有必要特征，并且，本发明还可存在于这里所披露的以及本说明书其他部分所披露的特征的次级组合中。本发明的第一方面提供了一种利用整合在单一基质(硅、玻璃、塑料等)上的生物传感器感测或检测特别是包括大分子(例如DNA、RNA或蛋白质)以及离子分子(例如铁、铬、铅、铜、钙或钾)在内的各种靶分析物装置和方法。所述基质化的生物传感器系统包括至少两个电极，这两个电极通常是通过单一的系列显微制造工艺步骤，一起在所述基质上生产的。不过，还可以用连续的显微制造步骤来生产所述系统。在一种优选实施方案中，所述电极都是由纯金属制成的(例如，与现有技术中的银/氯化银电极不同)。在另一种优选实施方案中，所述基质化的生物传感器系统包括一个工作电极、一个参考电极和一个反电极(辅助电极)。所述基质化的生物传感器系统优选具有与常规电化学生物传感器相同的电化学性能。另外，所述基质化的生物传感器系统应当与集成电路(IC)和/或MEMS生产方法兼容，并且能够在一个小的面积上制造。本发明的第二方面提供了一种利用表面张力以小的规模将试剂和/或溶液限制在生物传感器中的装置和方法。所述试剂和/或溶液还有进行生物学检测所需要的电解质和/或分析物。在一种优选实施方案中，本发明的装置和方法在需要电解质和/或分析物时，通过利用可控制的表面特性和小规模的表面张力可以让用于感测和检测各种离子分子(例如，铁、铬、铅、铜、钙、或钾)和大分子(例如、DNA、RNA或蛋白质)的每一个电极选择性地接触所述试剂和/或溶液。在另一种优选实施方案中，利用表面张力限制试剂和/或溶液(并因此限制所述试剂和/或溶液中的电解质和/或分析物)的装置和方法与一种便携式或手持式装置整合在一起，并且能抗对该装置的振荡。另外，即使在生物传感器被翻转颠倒时，也能通过表面张力将所述试剂和/或溶液稳定地保持在原位。本发明的第三方面提供了一种利用集成电路(IC)技术将电化学传感器(例如电极)的元件和其他需要的电子电路元件(例如放大器)集成在一个电化学传感器上的装置和方法。所有的传感器系统可以整合在单一的IC基质或芯片上，如单一的半导体元件(例如，硅或砷化镓)基质或芯片。优选不需要或者需要很少的外部元件或仪器来完成该系统。该传感器优选用IC技术制造。在用于大分子电化学检测的任何实施方案中，本发明的一个优选特征是对至少一个电极的表面进行改性。优选对所述表面进行改性，以便将大分子固定在该表面上。优选用诸如生物素-链亲和素的自我组装的单层(SAM)对所述表面进行改性。优选将SAM放置在电化学传感器的工作电极的表面上。可以选择性地用诸如溶胶和/或碳糊的材料对所述表面进行改性(用于取代SAM或与SAM组合)。上面的“发明概述”提供的只是例子而不是限定。通过下面的对本发明的详细说明，可以了解本发明的其他实施方案以及亚组合、改进、改变和改良。在附图中，在若干幅附图中的相同的编号表示相同的部件图1是传统参考电极的一种实施方案的示意图。图2是用于本发明电化学方法中的稳压器的一种实施方案的示意图。图3是本发明的存在于一个圆形基质芯片上的多个电化学生物传感器的实施方案的示意图。图4是本发明的存在于一个方形基质芯片上的多个电化学生物传感器的另一种实施方案的示意图。图5是本发明基质上的电化学生物传感器的另一种实施方案的示意图。图6是随时间而进行的周期性伏安测定(CV)扫描电位的曲线图。图7是用本发明的生物传感器获得的一个周期的周期性伏安测定(电流对偏电位)。图8是用本发明的生物传感器以不同的扫描速度获得的周期性伏安测定(电流对偏电位)。图9是通过本发明的生物传感器获得的扫描速度对峰值电流的平方根的曲线图。图10是用本发明的生物传感器以稳定的扫描速度进行的多轮周期性伏安测定(电流对偏电位)。图11(A)，(B)，和(C)是表示通过表面张力以及本发明处理限制的试剂和/或溶液的示意图。图12是仅在本发明的生物传感器的工作电极上选择地进行试剂和/或溶液限制的示意图。图13是表示在本发明生物传感器的所有电极上进行试剂和/或溶液限制的示意图。图14是表示生产本发明生物传感器的一种实施方案第一步骤的侧视图。图15是表示生产所述生物传感器的第二步骤的示意图。图16是表示生产所述生物传感器的第三步骤的示意图。图17是表示生产所述生物传感器的第四步骤的示意图。图18是表示生产所述生物传感器的第五步骤的示意图。图19是表示生产所述生物传感器的第六步骤的示意图。图20表示如何对本发明生物传感器的实施方案的表面进行改性以便避免非专一性结合的示意图。图21是表示图20中的对生物传感器表面进行改性的最终结果的示意图。图22是具有与集成电路元件整合在一起的生物传感器的本发明的生物传感器系统的一种实施方案的剖视图。图23是本发明的将多个生物传感器整合在集成电路元件上的一种实施方案的示意图。图24是一个生物传感器单元的剖视图，该单元与其他类似单元一起组成了与图24中的集成电路元件整合的多个生物传感器。图25是通过集成电路(IC)技术生产本发明的(传感器-芯片)的一种实施方案的第一个步骤的示意图，将CMOS元件集成到所述生物传感器(传感器-芯片)本身上面。图26是表示通过集成电路(IC)技术生产所述生物传感器(传感器-芯片)的第二步骤的示意图。图27是通过集成电路(IC)技术生产所述生物传感器(传感器-芯片)的第三步骤的示意图。图28是通过集成电路(IC)技术生产所述生物传感器(传感器-芯片)的第四步骤的示意图。图29是通过集成电路(IC)技术生产所述生物传感器(传感器-芯片)的第五步骤的示意图。图30是通过集成电路(IC)技术生产所述生物传感器(传感器-芯片)的第六步骤的示意图。图31是表示如何利用本发明的生物传感器的一种实施方案检测离子分析物(或分子)的示意图。图32是用图31的传感器获得的周期性伏安测定(电流对偏电位)的曲线图。图33是将本发明的生物传感器的一种实施方案用于检测大分子(例如DNS、RNA、蛋白质)的第一步骤的示意图。图34是表示检测所述大分子(DNA、RNA、蛋白质)的第二步骤的示意图。图35是表示检测大分子(DNA、RNA、蛋白质)的第三步骤的示意图。优选实施方案详述尽管下面将要结合附图介绍本发明的特定实施方案，但应当理解的是，在不超出本发明的精神、范围和构思的前提下，可以进行各种改变和改进。实际上，这里所提供的视图和说明是举例形式的，而不是限定形式的。本发明第一方面涉及利用电化学检测原理检测各种靶分析物，特别是离子分子(例如，铁、铬、铅、铜、钙或钾)以及大分子(例如，DNA、RNA或蛋白质)。电化学检测原理需要使用氧化还原电池以及在该电池中的电化学反应。氧化还原电池是这样一种装置当该电池中发生化学反应时，能将化学能量转换为电能或者相反。通常，所述电池包括浸入含水液体(电解质)中的三个电极，电极反应发生在电极-溶液表面上。所述电池由两个导电相组成(例如，固体或液体金属、半导体等)，这两个相通过导离子相连接(例如，水溶液或非水溶液、熔化的盐、导离子固体)。在电流通过时，它必须将电流模式转换成离子流模式，并且再返回成离子流模式。这种导流模式的变化伴随着还原-氧化反应。每一种模式转换反应被称为半电池。每一种电化学反应是发生在氧化还原电池中的还原-氧化(还原氧化反应)。例如，在由氧将氢氧化成水期间发生的自发的“化学反应”中，电子从氢直接转移到氧。相反，在所述氧化还原电池中的自发电化学反应中，两个独立的电极反应基本上同时进行或者依次进行。氧化还原电池的一个重要特征是同时进行的氧化还原反应在空间上是隔离的。例如，氢气是在阳极通过将电子转移到阳极电极而被氧化的，而氧气是在阴极通过获得来自阴极的电子而被还原的。总的电化学反应是这两个电极反应的总和。在所述电极反应中所产生的离子——在这里是正的氢离子和负的氢氧根离子——在溶液中重新结合，形成反应的最终产物水。在这一过程中，所述电子从阳极通过一个外部电路导向阴极，在所述外部电路上可以测定所述电流。还可以逆转所述反应；通过施加所述电解电池中的电力将水分解成氢气和氧气。本发明的三电极系统是包括工作电极，反电极(或辅助电极)和参考电极的电化学电池。电流可以在工作电极和反电极之间流动，同时测定工作电极相对参考电极的电位。该装置可于基础研究中，研究发生在工作电极表面上的电极反应的动力学和机制，或者用于电分析目的。用于本发明的优选实施方案中的检测组件是以三电极系统为基础的。利用所述反电极与所述电解质形成电连接，以便可以将电流施加在所述工作电极上。反电极通常是用惰性材料(贵金属或碳/石墨)制成的，以避免其分解。在本发明中业已发现在大的电流通过反电极时，所述反电极的一个小的特征或小的横截面会将周围的溶液加热。如果电流连续过流的话，就会产生气泡，并最终分解所述电极。因此，通过控制电流和/或电极的尺寸可以避免气泡的形成。在本发明的一种优选实施方案中，所述反电极的宽度大到足以避免甚至是在有大的电流的情况下出现加热问题。将参考电极用作参考点，通过它可以测定电化学电池中其他电极的电位(通常是工作电极或测定电极的电位)。少数的常用(并且通常通过商业渠道获得)电极组件都具有独立于在该电池中所使用的电解质的电极电位，如银/氯化银电极、甘汞电极或氢电极。不过，发明人业已确定，单层电极，如单层金电极能够满足参考电极的要求。另外，诸如银、铅、铂、铬、铝、钛、镍的其他材料在正确的条件下也可用于单层参考电极。所述工作电极在本发明的电化学生物传感器中起着中心作用。发生在工作电极上的反应可被用于对电解质溶液进行电化学分析。它可以起着阳极或阴极的作用，这要取决于所采用的极性。某些“传统双电极”电池中的一个电极还可以被认为是“工作”(测定、指示或检测)电极，例如，在电位测定电分析装置上，测定电极的电位(相对参考电极的电位)是有关溶液中一种成分浓度的指标。在优选的三电极实施方案中，将反电极和参考电极设计成大体上延伸到生物传感器的工作电极周围。例如，在图3，4，5，12，13和23中可以看到合适的设计。在一种优选实施方案中，所述电化学生物传感器是用微电子机械系统(MEMS)技术生产的。参见图3，在裸露的硅晶片200(一级，p型(100)，厚度500-550微米)上沉积一层二氧化硅(SiO2，1000埃)，并用作氮化硅(Si3N4，1000埃)的底层，以便消除张力并改善粘附。用各种尺寸的工作电极(例如工作电极220)生产多种MEMS生物传感器(例如生物传感器210)。优选对每一个工作电极进行蚀刻，以便形成深度最高达350微米的孔。在氮化硅所覆盖的硅晶片上印刷图案，并且用氢氧化钾沿着[111]和[100]晶体平面进行蚀刻，通过氢氧化钾蚀刻时间和温度控制孔的深度。宽度为100微米的辅助电极(如辅助电极230)和参考电极(如参考电极240)与相应的工作电极220分开200微米。图3表示用于产生MEMS生物传感器(例如生物传感器210)图案的示意图。通过氟化氢蚀刻除去氮化物和氧化物以便释放内部张力，并且沉积另一个氧化物层(5000埃)，以便形成电隔离。PR5214光阻影像反转技术及Au(2000埃)/Cr(200埃)的电子束沉积lift-off技术被用来形成电极的图案。最后，将晶片200放在150℃的六甲基二硅胺烷(HMDS)中浸泡10分钟，然后在其蒸汽中沐浴3分钟，以便在硅部位周围产生疏水性表面。所述周围部位的疏水特性以及工作电极(如工作电极220)的三维特征，使得能够在将溶液中的感兴趣的分子固定到工作电极上起始的检测步骤中，在工作电极220上包含一个液滴。这种设计有效减少了生物分子与MEMS排列的其他部位的非专一性结合。用于所有电化学电极的材料优选是金(Au)。将在MEMS技术中所使用的若干种导电材料通过lift-off方法印刷在硅基质上，并通过用铁氰化物溶液进行周期性伏安测定，测定该三电极系统的特征。试验金、铂、钛和铝电极的不同组合，并且，金/金/金三电极系统能产生最佳的C-V曲线和氧化还原特性。图4表示在一个方形基质300(如硅、砷化镓、塑料和/或玻璃)上生产的生物传感器的实施方案，它具有多个圆形生物传感器，如生物传感器310。生物传感器310包括一个工作电极320，一个参考电极330和一个反(辅助)电极340。正如上面所提到的，所述电极优选是由可以从MEMS技术中获得的单层导电材料制成。另外，所有电极都优选由金制成。图5表示本发明的另一种优选实施方案。生物传感器410包括在所述基质上制造的一个工作电极420，一个参考电极430和一个反(辅助)电极440。所述电极优选是用金制成的。工作电极420是在所述基质上内置的深度达350微米的孔450中形成的。孔450被设计成用于将需要的试剂限制在该孔所形成的空间内。如图5所示，通过本文所披露的显微制造方法生产的孔450在氢氧化钾蚀刻之后以(111)硅平面为边界。通过上述显微制造方法形成的工作电极420覆盖整个孔450表面。在工作时，上述实施方案具有容易生产的优点，并可以作为单一系列的显微制造方法步骤在所述基质上一起生产。不过，还可以用连续的显微制造步骤进行生产。另外，正如下面的分析和实验所证实，这种低成本并且容易制造的生物传感器是可以再利用的，并且具有与传统生物传感器相同的稳定性和可逆转的电化学性能。在一种实施方案中，使用周期性伏安测定(CV)分析技术。CV是用于研究电活性物质和鉴定生物传感器的用途最广泛的分析技术之一。它被广泛用作工业和学术研究工具，用于电化学系统的基础鉴定。在周期性伏安测定中，电位以受控制的(通常是固定的)扫描速度(V/秒)由起始电位(E0)提高到最大电位(Em)。图6表示这种概念。分析物还原和氧化的反复循环导致了交替的阳性和阴性电流流入和流出工作电极。由于没有搅动溶液和/或试剂，在不同分析物浓度和不同扫描速度下观察到了扩散效应。阴极(ipa)和阳极(ipc)峰值电流的分离可被用于预测参与氧化还原反应的电子数量。所述峰值电流还直接与分析物浓度C和扫描速度v成正比。实验结果通常以电流与电位的形式进行作图，类似于图7所示的曲线图。在图7所示的CV扫描中，电位是沿X轴作图的，更正一些的(或氧化性)的电位在右侧作图，更负一些的(或还原性的)的电位在左侧作图。电流沿Y轴作图，阴极(还原性)电流沿负方向向下作图，阳性(即氧化性)电流沿正方向作图。用于以下对照实验中的分析物是铁氰化钾K3Fe(CN)6(329.26g/mol)它含有存在于硝酸钾的缓冲溶液中的+3氧化状态的铁原子(FeIII)(101.11g/mol))。在工作电极表面，可以将一个电子添加到铁氰化物阴离子上。这样会导致将它还原成铁氰化物离子FeII(CN)64-，它含有+2氧化态的铁离子(FeII)。在分析物和电极之间的这种一个电子的交换是一种常见的可逆的反应。这意味着所述分析物能够方便地还原成FeII(CN)64-，并且能容易地再氧化成FeIII(CN)63-。氧化还原偶是一对仅仅在氧化状态方面存在差别的分析物。FeIII(CN)63-/FeII(CN)64-氧化还原偶的电化学半反应如下.(1)图8所示的伏安图表示两个不对称的峰，一个是阴极峰(ipc)，另一个是阳极峰(ipa)。使用诸如普通氢电极(NHE)的标准参考电极，与该半反应相关的表观电位接近为+358mV。如果将所述工作电极保持在比400mV电极更正一些的电位上，所述分析物倾向于被氧化成FeIII(CN)63-形式。发生在工作电极上的这种氧化反应会导致电子从所述溶液进入所述电极，从而产生阳极电流。在比400mV更负一些的电位下，所述分析物倾向于被还原成FeII(CN)64-。发生在工作电极上的这种还原反应会导致电子从所述电极上流出的电子进入所述溶液，从而产生阴极电流。由于本发明的优选传感器设计实施方案不采用诸如NHE、银/氯化银或饱和甘汞电极(SCE)的标准参考电极，并且由于所有三个电极都是金(Au)，在该实验中的静止(非偏压)电位接近零伏。周期性伏安图的重要参数是阴极和阳极峰值电流的大小(分别为ipc和ipa)，以及在上述电流下出现的电位(分别为Epc和Epa)。使用上述参数，可计算出表观还原电位(E0--它是Epc和Epa的平均值)，以及在电荷转移反应中转移的电子的数量(n)。峰值电流(ipa或ipc)可以用Randles-Sevcik公式表示如下ip=0.4463nFAC(nFvDRT)12---(2)]]>其中，n＝在氧化还原偶的半反应中出现的电子数量F＝法拉第常数(96,485C/mol)A＝电极面积(cm2)v＝电位扫描速度(V/sec)D＝分析物扩散系数(cm2/sec)R＝通用气体常数(8.314J/molK)T＝绝对温度(K)在25℃时，Randles-Sevcik公式可被简化为ip＝(2.687×105)n3/2v1/2D1/2AC(3)其中，有关常数的单位是2.687×105Cmol-1V-1/2。根据Randles-Sevcik公式可以预测，当伏安图是以不同的扫描速度获得的时候，峰值电流应当与扫描速度的平方根成正比。如图9所示，用峰值电流与扫描速度的平方根作图，绘出一条直线。Randles-Sevcik公式可被修改以计算此直线的斜率如下斜率＝(2.687×105Cmol-1V-1/2)n3/2D1/2AC(4)峰值电位和峰值电流对扫描速度的依赖性可被用于评估参与氧化还原的电子的数量，并且提供总体反应的可逆性程度的定性量。根据峰值电位之间的距离(ΔEp＝Epa-Epc)确定可逆性氧化还原偶的电极反应中所转移的电子的数量(n)。对于可逆的(快速的)氧化还原偶来说，阳极和阴极峰电流的比例应当等于1。用本发明的优选传感器设计进行实验的结果仅仅略微偏离1。大的偏差可能表示干扰了与电极加工相关的化学反应，而小的偏差仅仅意味着是一种非理想系统。图10所示12个连续周期的CV扫描，与第一个周期相比只有微小的偏差。以上结果清楚地表明，这是一种高度可逆的系统并具有稳定的电池设计。本发明除了低成本、易制造同时具有与传统传感器相同的性能之外，本发明的上述实施方案还具有与集成电路(IC)和MEMS生产方法兼容的优点。另外，如图3和图4所示，所述实施方案可以在小的面积上以一系列生物传感器的形式制造。本发明的第二方面涉及利用表面张力将少量试剂和/或溶液限制在生物传感器中。所述试剂和/或溶液含有生物检测所需要的靶分析物和/或化合物。生物传感器的性能主要由它的精确度和灵敏度所决定。将所述试剂限制在诸如硅的基质上的概念是在与本发明相关的研究中发现的，该试剂是一种用于降低高水平的检测干扰的溶液，所述干扰是由于分析物或其他试剂或溶液成分，如辣根过氧化物酶(HRP)非专一性结合在工作电极周围的区域所导致的，并且会导致高的检测干扰以及产生高的假阳性比例。在实施例中HRP被用作信号酶。为了证实所述干扰不是由于在所述表面残留的HRP所导致的，进行一个简单的测试，以便评估这种不需要的结合的作用。将HRP导入裸露的硅芯片，然后进行若干个洗涤步骤，然后添加所述底物溶液。在添加所述底物溶液之后，马上会出现很高水平的酶促反应。正如所预料的，与其他蛋白一样，HRP很容易粘附在硅表面上并且粘附力非常强。对若干种商业化洗涤溶液和隔离蛋白进行了实验，但对于降低非专一性结合没有明显的改善。因此认为，避免不需要的结合的影响的最佳方式是首先预防发生这种情况的发生。本发明生物传感器的工作电极外的区域并不需要与HRP溶液接触，以便完成生物学检测。不过，在现有技术中，一直将所有三个电极浸入含水溶液中，并且所有试剂都会通过所有的表面流动。发明人发现，将某种试剂限制在由孔限定的空间内的最简单的方法是在生物传感器上形成一个孔。如图5所示，通过氢氧化钾蚀刻所形成的显微制造的孔，其周围是硅晶体平面400。通过LIFT-OFF技术形成的工作电极420覆盖整个孔的表面。因此，首先将含有能够非专一性结合的成分(例如HRP)的试剂或溶液限制在所述孔部位，以便在该孔中实现所需要的与电极的结合(优选为工作电极)。同时避免与生物传感器周围区域的非专一性结合。然后可以将所述试剂或溶液从生物传感器上洗掉，并且随后添加其他的试剂或溶液，以便完成检测过程。在设计生物传感器时，不能低估表面和材料科学的重要性。在所述洗涤过程中仍然会出现不可接受的程度的非专一性结合，同时被稀释会流到芯片表面周围。例如，含有HRP的清洗溶液留在所述周围区域的时间远远大于结合时间常数。因此，除了制造所述孔结构外，优选通过其他方式对周围区域的表面进行保护。因此，避免所述表面接触不需要的试剂或结合成分的另一种方法是使其变成疏水性。硅表面的硅烷化被广泛用于防止悬吊结构通过表面张力与底物粘接。在本发明中，该方法被用于防止生物分子与所述硅基质周围区域直接接触。业已将具有各种功能端基的硅烷基分子用于改变硅晶片、氮化硅芯片和原子力显微镜(AFM)头的表面特性。由于水解末端Si(Cl)n或SiO-C2H5基团的结果，用于表面改性的硅烷化合物形成了与氧化硅表面化学结合的坚固的单层。通过两种材料的表面相互作用确定与生物学系统接触的人工材料的性能。由于表面相互作用会导致干扰的增强和结构的破坏，表面改性是避免这一问题的一条途径。改变所示结构表面特性的最简单的方法是使用塑料材料。为了将所示表面转化成生物兼容的或生物惰性的表面，需要将非专一性相互作用降低到最低限度。通过生成一个与所示表面牢固结合的分析层而将这种非专一性相互作用消除。最常使用的方法是使用来自硫醇分子的自我组装的单层(SAM)，按照在80年代主要由C.D.Bain和G.M.Whitesides所开发的业已完善的方法通过化学吸附将它吸附到金表面和硅烷分子上，以便在氧化硅表面上形成SAM。还可将诸如溶胶和碳糊的其他材料用于改变所述表面。参见图11(a)，在操作中，通过亲水性工作电极使所述试剂成型，并且在金工作电极表面很好地形成一个液滴。图11(b)表明，随着所述试剂体积的增加，由所述试剂覆盖的面积逐渐扩大，并且随后覆盖其他两个电极。图11(c)表示当通过移液使用了过量的试剂时，将会形成一个试剂球465，而不是在疏水性硅基质上扩散开。参见图12和13，只有在需要的时候通过利用可控制的表面特性和表面张力使每一个独立的电极与电解质和/或分析物和其他成分509小规模接触。参见图13，为了进行电化学检测，只有在进行检测时才将所有电极浸泡在电解质和/或分析物509中。如图12所示，对于大多数用途来说，大部分时间被花费在制备样品上，以便将电解质和/或分析物509固定在工作电极510上。在图12和13所示的实施方案中，通过表面特性和试剂体积520控制覆盖在所述电极上的电解质和/或分析物509的覆盖面。因此，上述实施方案利用了小规模的表面张力来限制电解质和/或分析物以及其他成分。另外，上述实施方案需要少得多的试剂(pL至mL级)；并消除了对本体溶液的需要。另外，由于使用少量试剂，上述实施方案具有使分析物接近电极的优点(pm到mm)。因此，仅通过扩散作用本身就能够实现分析物适当接触所述电极，因此没有必要搅拌或以其他方式混合。上述实施方案的另一个优点是便于控制和/或改变覆盖在所述电极上的电解质或/或分析物覆盖面。另外，上述试剂和/或溶液限制实施方案通过大大减少非专一性结合，从而减少了靶分析物的损失，并且提高了该生物传感器的灵敏度。另外，上述实施方案比较抗对所述生物传感器的振荡，因此适用作为便携式或手持式系统。最后，由于表面张力限制作用，即使当传感器被翻转颠倒时，也能通过表面张力稳定保持所述试剂。如图12和图13所示，所述生物传感器实施方案可以选择性地装配反应孔530，以便帮助将试剂520保持在原位，并且控制试剂520的形状。不过，这样的孔530是不需要的，并且通过一个简单的平面实现对试剂520的限制。参见图14，它表示本发明生物传感器(传感器-芯片)的一种优选生产实施方案的第一个步骤。如图14所示，首先在裸露的硅晶片610(一级或测试级，p-型或n-型(100)，厚度为500-550微米)上沉积一层二氧化硅(SiO2，1000埃)620，二氧化硅620起着氮化硅630(Si3N4，1000埃)的底层的作用，以便释放张力并提高粘性。下面参见图15和16，通过掩模640，并用氢氧化钾沿[111]和[100]晶体平面进行整体蚀刻，在氮化物晶片600(图15)上形成图案(图16)。所述蚀刻产生了孔650，并且通过氢氧化钾蚀刻时间和温度，控制孔650的深度(最高达350微米)。参见图17，然后通过氟化氢蚀刻去掉氮化物630和氧化物620，以便释放内部张力，沉积另一个氧化物660层(5000埃)用于电隔离。图18和18表示生产必需电极的Lift-Off方法。通过使用二氧化硅层660上的PR5214光阻层670，在基质610上印刷用于生物检测的电极670。然后通过逆成像方法用掩模671将需要的图案转移到光阻层670上(包括去掉不需要的光阻层670)。通过电子束沉积将一层金(2000埃)680沉积在具有需要的光阻图案层670的二氧化硅层660上。在沉积金(2000埃)680之前，先沉积诸如铬(Cr200埃)的粘接剂690，以便提高将金粘接在二氧化硅层660上的粘性。另外，还可以将诸如钛或胶水的其他材料用作粘接剂。最后，参见图19，通过溶解光阻图案层670除去任何电阻层670和不需要的金680和铬690。最后，将晶片600浸泡在150℃的热溶液中10分钟，然后在六甲基二硅胺烷(HMDS)蒸汽中沐浴3分钟，以便在硅部位周围形成一个疏水性表面。优选通过表面改性步骤将所述生物传感器(传感器-芯片)的表面改性，以便抑制非专一性结合。举例20来说，可以通过以下步骤对大分子生物传感器表面进行改性首先用浓缩的“Piranha”溶液(70vol％H2SO4，30vol％H2O2)清洗金表面680，并用去离子水(dH2O)彻底漂洗。下面参见图20，沉积表面改性材料，如生物素-DAD-C12-SH(12-巯基(8-生物素酰胺-3，6-二恶辛基)十二烷酰胺)的SAM，RocheGmBH，德国。为了沉积生物素-DAD-C12-SH的SAM，使用Spinke等(1993)的方法，其中将样品放在用4.5×10-4M11-巯基-1-十一醇(AldrichChemicalCo.，44，752-8)的乙醇制备的50mM生物素-DAD-C12-SH溶液中培养大约18小时，并且用乙醇和水漂洗。最后，参见图21，让用生物素包衣的金表面700接触1.0mg/ml的链亲和素溶液大约10分钟，并且再次用去离子水漂洗，以便形成链亲和素包衣的金表面710。本发明的第三方面涉及将完整的电化学(氧化还原)生物传感器整合在单一的集成电路(IC)芯片上。集成电路(IC)被定义为在它上面蚀刻或印刷了复杂的电子元件及其连接线的小基质材料晶片。由于小的原因，MEMS元件具有独特的特性，不过由基于MEMS传感器所发出的信号水平与传统传感器相比较低。通过使用无芯片(off-chip)放大组件能够提高灵敏度，但这也会增加干扰和系统的体积。因此，发明人设计了一种基于芯片的的放大电路(结合在生物传感器芯片上的放大电路)和检测电路(如提供偏电位，电流测定，顺序控制和信号处理)以便降低芯片之间的相互干扰。通过采用双极性转换器(BJT)和/或互补的金属氧化物半导体(CMOS)装置，可以提供所述检测电路和放大电路。在本实施方案中，将一个连接在芯片上的放大装置安装在所述工作电极下面，这里通常是电化学传感器电池的最大的部位。与开放基础的双极性(BJT)光学传感器相似，所述基础部分接受来自换能器的电流，电流增加量量β在80-150范围内。有两种类型的BJT可以采用电化学电池垂直的BJT和水平的BJT。电流增加量是通过基础部分的长度测定的。在垂直BJT中，该长度受离子注入能量和掺杂剂浓度影响。在水平BJT中，所述长度受平板印刷术的分辨率，离子注入角和热扩散的影响。由于上述原因，在芯片与芯片之间或芯片内的增加量的一致性而言，垂直式BJT更为可靠。图22表示芯片内放大电路的一种实施方案的剖视图，它优选包括一个生物传感器，该传感器包括三个用于电化学检测的金属电极。以上三个电极优选是用集成电路方法生产的，并且具有用于相互连接和隔离的较大的区域。将整个生物传感器-芯片700堆成两个平台(电化学传感平台730和双极换能器(BJT)放大平台720)，并且，金工作电极710可以起着BJT装置720的电磁屏障的作用。工作电极的触点(如触点733、734、735、736、737和738)与接触界面740接触，并同时增加了工作电极710的表面积以便产生更强的信号。所有触点和电极表面可以用诸如金的金属单层制成。另外，生物传感器-芯片700包括一个硅基质744。硅基质744包括一个底部743，一个集电器742和发射器741。基础部分743接受来自工作电极710的电子流。集电器742与一个电源连接，并在特定的基础条件下提供电流增加量，以便用于放大。然后在发射器741上测定所产生的来自基础部分743和集电器742的电流。参见图22，金属连接头750与信号输出端(未示出)和发射器741连接。金工作电极710通过第一层二氧化硅760与底部743连接，该底部是通过蚀刻形成的。第二层二氧化硅770隔离BJT720和信号传输线，而第一层760隔离三个电极(工作电极710，参考电极780，和反电极790)。工作电极710上的触点(如触点733、734、735、736、737和738)能增加其表面积，并且还能形成与BJT720的固定接触。所述触点的尺寸(分别为大约几十微米)远远大于工作电极710上选择性蛋白质SAM的尺寸(大约几十埃)，以便不会影响蛋白的吸附。图24表示生物传感器装置800的另一种优选实施方案的剖视图，它表现的是在图23所示的基质805上具有多个生物传感器的优选实施方案。如图24所示，生物传感器装置800包括一个CMOS和/或BJT层830，一个电化学层840和一个试剂容纳层850，并且总体上类似于上面所披露的图22的实施方案。因此，如图22、23和24所示，本发明的第三方面涉及一种生物检测系统，它可以在不进行芯片与芯片连接的前提下直接将传感器上的元件与生物学检测其他元件直接集成在一起。该系统不需要外部元件(仪器)或者只需要少量的外部元件来构成完整的系统。另外，这种一体化的生物传感系统降低了生物学检测的成本和干扰水平，并且简化了所述检测的过程。参见图25，它表示优选通过集成电路(IC)技术用CMOS装置生产本发明的生物传感器(传感器-芯片)的实施例的例子。另外，还可以包括BJT装置(未示出)。如图25所示，在具有一层二氧化硅层905的半导体基质900上制造集成电路，在主动孔部位909上面具有一个聚硅开关907。聚硅开关907是用非晶态硅制成的，并且被用于开、关包括低电阻源917和排泄管919的换能器。参见图26，然后在基质900上沉积一个氧化物层(5000埃)920，以便形成电隔离。参见图27，然后选择性地通过平板印刷术和蚀刻方法对二氧化硅层920进行蚀刻，以便形成一个电连接孔940。参见图28，然后将一个导电塞950安装在接触孔940中。导电塞950在导电电极960与低电阻源917和/或排泄管919之间起着相互连接作用。图29表示用于生产所述必需电极的Lift-Off方法。通过使用二氧化硅层920上面的PR5214光组层970，在基质900上印刷用于生物检测的电极。然后，利用掩模921通过逆成像方法将需要的图案转移到光阻层970上(该方法包括除掉不需要的光阻层970)。通过电子束沉积将一层金(2000埃)960和/或铬(200埃)沉积在具有需要的光阻层970的二氧化硅层920上。最后，参见图30，通过溶解电阻图案层970去掉所有电阻层970和不需要的金/铬960。参见图30，它显示如何将本发明中的生物传感器的一种实施方案(传感器-芯片)优选用于检测离子分子，如铁(Fe)的例子。在本实施方案中，传感器表面1010没有进行过改性，并且在进行了如上文所述的生产实施方案中的生产后清洗之后马上就可以使用。本实施方案中所使用的分析物是铁氰化钾K3Fe(CN)6(329.26g/mol)，它在硝酸钾KNO3缓冲液(101.11g/mol)中含有三价氧化态的铁离子(FeIII)。如图31所示，将含有分析物的混合溶液1020(或含有电解质的试剂)涂在所有电极上(工作电极1030，参考电极1040，和反电极1050)。调整溶液1020的体积，以便通过表面张力将液滴限制在所有三个电极上。参见图32，使用具有微微安加强器和法拉第盒的CH仪器660A电化学工作站测定周期性伏安测定(CV)电流和偏电位。所述电位在0.1伏至-0.4伏之间摆动，并且通过工作电极1030测定电流。在所述测定之后，如果要再次使用传感器1000的话，用丙酮、酒精和浓缩Piranha溶液(70vol％H2SO4，30vol％H2O2)清洗金表面，并且用去离子水(dH2O)彻底漂洗。图33表示用于大分子(DNA、RNA和蛋白质)检测的实施方案。大分子(DNA、RNA和蛋白质)浓度的检测包括生物素/链亲和素层的传感器表面改性。用合适的生物化学溶液对传感器表面进行改性，以便在经过生产后清洗以后形成链亲和素层，如在上文所述的表面改性方法中所述。在对生物传感器的表面1100进行改性之后，对病原体进行电流测定生物检测首先将50ml裂解试剂(0.4MNaOH)添加到250ml细菌样品溶液中，并在室温下培养5分钟。然后添加100mL探针溶液(固定探针和信号探针)，并且在65℃下培养10分钟。然后将5微升裂解的大肠杆菌/探针溶液混合物1120放在生物传感器1100的用链亲和素包衣的工作电极1130上，并在室温下培养10分钟。参见图34，随后用生物素洗涤溶液(KirkegaardandPerryLaboratories，50-63-06)洗涤生物传感器1100。接着，将用稀释剂(PBS/0.5％酪蛋白)稀释到0.75U/ml或0.15U/ml的5微升抗-F1-POD1140(抗荧光素过氧化物酶，150U，RocheInc.，1426346)放置在工作电极1130上，并在室温下培养10分钟。参见图35，再次用洗涤溶液洗涤所述生物传感器。在洗涤之后，将10微升K-blue底物1160(NeogenCorp.，300176)放置在生物传感器上，使所有三个电极(工作电极1130，参考电极1140，反电极1150)都被所述底物溶液1160覆盖。最后，马上进行电化学(更具体地讲是氧化还原)测定。用具有微微安加强器和法拉第盒的CH仪器660A电化学工作站电流测定安培电流与时间。然后依次测定生物传感器上的样品。将电压固定在-0.1伏(相对参考电极)，阴极的电流(安培信号)读数应当在20秒内完成，因为在20秒时电流值就会达到稳态。通过使用系列稀释液和培养平板计数确定细胞浓度(细胞数量)。在所述测定之后，如果要再次使用传感器1000的话，用丙酮、酒精和浓缩Piranha溶液(70vol％H2SO4，30vol％H2O2)清洗金表面，并且用去离子水(DH2O)彻底漂洗。在上述任何生物传感器实施方案中，在实际进行样品检测之前，优选对生物传感器进行校正。优选用含有已知量的靶分析物的校正溶液和含有无法检测量的(例如为零)靶分析物的另一种校正缓冲液进行校正。还可以选择性地用多种校正溶液校正所述生物传感器。所述多种校正溶液的每一种分别含有已知量的靶分析物。所述校正溶液优选含有不同浓度水平的靶分析物。通过上述检测方法测定生物传感器上的校正溶液，以便获得参考信号。然后将该参考信号与用样品溶液测定的信号加以比较，以便确定样品试剂中分析物的存在和含量。可以通过传统生物学插补方法测定，确定分析物的存在和含量(例如浓度和绝对含量)。附录A提供了用于进一步说明本发明的其他材料。在除本文之外的所有参考文献，包括在本申请附录中所提到的参考文献被以能补充、解释，提供背景的程度作为本说明所采用的方法、技术和/或组合物的参考文献。另外，在下面所列举的参考文献也被以能补充、解释，提供背景的程度作为本说明所采用的方法、技术和/或组合物的参考文献。参考文献“USAFPAMPHLETONTHEMEDICALDEFENSEAGAINSTBIOLOGICALMATERIAL-MedicalDefenseAgainstBiologicalMaterial”DefenseTechnicalInformationCenter，releasedon11Feb1997Abbott，N.L.；Gorman，C.B.；Whitesides，G.M.“Activecontrolofwettingusingappliedelectricalpotentialsandself-assembledmonolayers”Langmuir，11，Issue1，January1995，16-18Abbott，N.L.；Rolison，D.R.Whitesides，G.M.，“Combiningmicromachiningandmolecularself-assemblytofabricatemicroelectrodes”Langmuir，10，Issue8，August1994，2672-2682Abdel-Hamid，I.Ivnitski，D.，Atanasov，P.，Wilkins，E.，1998.FastAmperometricAssayforE.coli0157H7usingpartiallyimmersedimmunoelectrodes.Electroanalysis10(11)，758-763.Abdel-Hamid，I.，Ivnitski，D.，Atanasov，P.，Wilkins，E.，1999.Flow-throughimmunofiltrationassaysystemforrapiddetectionofE.coli0157H7.Biosens.Bioelect.14，309-316.Andrade，J.D.，“SurfaceandInterfaceAspectsofBiomedicalPolymersProteinAdsorption”Plenum，NewYork，1985Bain，C.D.；Troughton，E.B.；Tao，Y.T.；Evall，J.；Whitesides，G.M.；Nuzzo，R.G.，J.Am.Chem.Soc.1989，111，321Baxter，Ian；Cother，LisaD.；Dupuy，Carole；Lickiss，PaulD.；White，AndrewJ.P.；andWilliams，DavidJ.“HydrogenBondingtoSilanols”DepartmentofChemistry，ImperialCollegeofScience，TechnologyandMedicine，LondonSW72AY，UKBeam，K.E.″AnisotropicEtchingofSilicon，″IEEETransactionsonElectronDevices，October，1978Becker，E.W.；Betz，H.；Ehrfeld，W.；Glashauser，W.；Heuberger，A.；Michel，H.J.；Munchmeyer，D.；Pongratz，S.；andSiemens，R.V.″ProductionofSeparationNozzleSystemsforUraniumEnrichmentbyaCombinationofX-RayLithographyandGalvano-plastics，″Naturwissenschaften，69，(1982)，520to523.Blake，C.，Gould，B.J.，1984.Useofenzymesinimmunoassaytechniques.Areview.Analyst109，533-547.Brody，J.P.；Yager，P.；Goldstein，R.E.andAustin，R.H.“BiotechnologyatlowReynoldsnumbers”J.Biophys.71，1996，3430-3441Chen，Y.F.，Yang，J.M.，Gau，J.J.，Ho，C.M.，Tai，Y.C.，2000.MicrofluidicSystemforBiologicalAgentDetection.Proceedingsofthe3rdInternationalconferenceontheinteractionofartandfluidmechanics，Zurich，Switzerland.Chen，Y.F.；Yang，J.M.；Gau，J.J.；Ho，C.M.；andTai，Y.C.，″MicrofluidicSystemforBiologicalAgentDetection″The3rdInternationalconferenceontheinteractionofArtandFluidMechanics，Zurich，Switzerland，2000.Cooper，N.″TheHumanGenomeProject，″LosAlamosLab，Science，20，1-338.1992.Cussler，E.L.，Diffusion-masstransferinfluidsystems，2ndeditio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菌的高度专一的和灵敏的检测器。将利用电化学检测的生物学鉴定成功地整合到了硅晶片上，其灵敏度可以检测低于1000大肠杆菌细胞。参考文献1.Y.F.Chen，J.MYang，J.J.Gau，C.M.HoandY.C.Tai.″MicrofluidicSystemforBiologicalAgentDetection″The3rdInternationalconferenceontheinteractionofArtandFluidMechanics，Zurich，Switzcrland，2000.2.D.Ivnitski，I.Abdel-Hamid，P.Atanasov，E.Wilkins，″ReviewBiosensorsforDetectionofPathogenicBacteria″，Biosensors&Bioelectronics14(1999)，599-624.3.G.Marrazza，I.Chianella，M.Mascini，″DisposableDNAElectrochemicalBiosensorsforEnvironmentalMonitoring″，AnalyticaChimicaActa387(t999)，297-307.4.J.Wang，et.al.，″DNAElectrochemicalBiosensorsforEnvironmentalMonitoring″，AReview″，AnalyticaChimicaActa347(1997)，1-8.5.T.Ruzgas，E.Cs_regi，J.Emnéus，LGorton，G.Marko-Varga，″Peroxidase-modifiedelectrodesFundamentalsandapplication″，AnalyticaChimicaActa330(1996)，123-138.6.S.A.Darst，M.Ahlers，P.H.Meller，E.W.Kubalek，R.Blankenburg，H.O.Ribi，H.Ringsdorf，R.Komberg，“Two-DimensionalCrystalsofStreptavidinonBiotinylatedLipidLayers，”Biophys.J.59(1991)387-396.7.P.Wagner，M.Hegner，H-JGuntherodt，G.Semenza，“FormationandinSituModificationofMonolayersChemisorbedonUltraflatTemplate-StrippedGoldSurfaces，″Langmuir11(1995)3867-75.ASME论文用于生物学检测的DNA微型传感器阵列的优化i.摘要本论文披露了在前面的文献中所开发的用于快速生物学制剂检测的可再利用的DNA微型传感器阵列的鉴定和优化(图1)[1-3]。这种基于MEMS的DNA传感器采用了标准的三电极电池结构，它具有新的显微制造的结构设计，以便减少非专一性结合。所述传感器组件能方便地适用于各种方案，并可用于来自诸如尿液中的尿道致病性大肠杆菌和导致中耳炎的微生物的靶分析物的大分子(DNA，RNA)的快速检测。可以检测出来自患有尿路感染的患者的尿液样品中的低于105的大肠杆菌细胞。通过合适的传感器特性化和表面改性可以提高其灵敏度。通过使用POD结合的寡核苷酸可以将包括样品制备在内的总的检测时间降低到25分钟。ii.前言由于系统要求和结构，传统的电化学检测与MEMS技术和制造工艺不十分兼容。电化学电池必须包括至少两个电极(工作电极，参考电极)和电解质。电化学电极是在它上面发生电子转运和离子转运之间的电荷转移变化基质的界面[4]。电解质是一种介质，在它里面通过离子转移可以发生电荷转移。电化学检测需要由构成一个半电池的参考电极提供的第二个不变的电位。典型的参考电极是银/氯化银。目前，在硅基质上制造这种参考电极是困难的。大多数基于MEMS的电化学传感器都致力于仅仅显微镜制造工作电极。本研究探讨了通过标准MEMS方法在硅上面制造的基于MEMS的电化学传感器的特征和用途。在所述电化学传感器上通过DNA杂交临床尿液样品表明，硅上面的基于MEMS的传感器可用于生物医学检测。iii.检测方法在存在细胞碎片的条件下让来自化学裂解的靶细胞的核酸分子(RNA/DNA)与锚定ssDNA探针(与生物素结合)和标准ssDNA探针(与荧光素结合)杂交(图2a)。这两种探针能识别两种不同的保守序列，因此，只能与来自靶生物制剂的特定遗传学片段形成杂合体。通过生物素-链亲和素结合将寡核苷酸杂合体固定到工作电极上，并且将未结合的成分洗掉(图2b)。然后将过氧化物酶(POD)连接的抗荧光素抗体加载到每一种杂合体上(图2c)。在添加了具有一种介体(四氧基联苯胺，TMB)的底物之后，酶促反应产生了一个电流信号，该信号是通过氧化还原反应通过电流测定测定的，如图3所示。整个方案可以在40分钟内完成，并且在经过清洗之后所述传感器可以再次活化。iv.传感器特征分析大多数生物传感器芯片采用无芯片光学检测。我们的研究致力于有芯片的电化学检测，通过传感器优化和表面改性以便改善信-噪比。MEMS技术能够开发出微型化的电化学电池，因为小尺寸的导电性金属电极能够精确地沉积和印刷在硅基质上。通过我们的研究，金是所有三个电极的合适的候选材料(工作电极、辅助电极和参考电极)，并且采用诸如二茂铁的众所周知的一电子系统鉴定金/金/金电极电池证实了，获得了传统的可恢复的一电子转移实现的。v.周期性伏安测定二茂铁的可恢复的单电子转移的周期性伏安测定的特征是在阳极和阴极峰之间具有大约57mV的峰间隔，具有相同的最大峰值，并且在峰电流与[扫描速度]1/2存在一种线性关系[4]。如图4所示，用基于MEMS电化学传感器以不同的扫描速度获得的二茂铁的伏安图表现出预期的特征，并且在最大峰值上的峰电流与[扫描速度]1/2的关系图是线性的。用过氧化物酶进一步鉴定所述电化学电池证实，酶促电流测定也是可行的。对所述介体进行的周期性伏安测定表明，发生了正如在TMB上所预期的双电子氧化还原转移(图5)，并且添加过氧化物酶会导致电流减弱的增强，并且能够在-0.1V偏电位下明显检测到。vi.减少非专一性结合通过原子力显微分析(AFM)和表面质子共振(SPR)对具有将靶RNA/DNA捕捉在工作电极上的蛋白自我组装的单层的传感器表面和SAMs进行了特征分析[2]。通过适当的表面改性来减少非专一性结合，可以明显改善信-噪比。第一种方法是引入一种表面封闭蛋白，以便消除非专一性结合的潜在结合位点(图6)。第二种方法是通过硅烷化处理或Teflon_或聚酰亚胺的薄膜涂层增加周边部位的疏水性改性。由于由蛋白覆盖的氢工作电极的亲水特性，试剂将只能被限制在工作电极上，减少了酶在周围部分和其他两个电极上的沉积(图7，8)，在这两种情况下，都降低了由于非专一性结合所产生的干扰。通常，将第二种方法(疏水性改性)用于MEMS制造，而将第一种方法整合到探针试剂中。vii.方法的简化对于大多数生物传感器来说，样品制备是花费时间最多的步骤。增加任何额外的方法步骤都需要更多的流体装置和更长的检测时间。在图9中示出了一种简化的方法，该方法取消了通过POD结合将酶加载到检测DNA探针上的步骤。控制杂交条件，以便在加热到65℃之后能保持POD的酶促活性。该方法能将时间从40分钟缩短到25分钟，同时减少了所需要的试剂用量。viii.结果以前的研究业已证实，微型DNA传感器的灵敏度为大约103个大肠杆菌细胞。最新的资料表明，通过核糖体RNA含量它能够检测来自处于稳定期的细胞培养物的低于10个大肠杆菌细胞。然后用所述传感器检测来自位于UCLA的传染病机构的临床尿液样品。如图10所示，根据我们的初步结果，在没有分析的情况下，尿液样品中可检测的最低细胞数量为105。通过进一步优化可以提高尿液样品的灵敏度。用另一种类型的细胞Bordetella作为负对照，并且包括稀释液在内的所有大肠杆菌样品都比所述负对照具有更强的信号。在不采用传统参考电极的情况下，可以将微型DNA传感器用于电化学检测，因为偏电位相当低(0.1V)，并且检测时间足够短(20秒)，从而避免了电荷在辅助电极上的积累。二茂铁和POD溶液的伏安图证实了上述结论。我们业已证实，微型DNA传感器可用于诸如大肠杆菌的病原体的电化学检测。通过MEMS技术印刷在硅上的金/金/金三电极电池被成功应用于酶促反应的电流测定。这种传感器展现出了可整合到微型全分析系统(μTAS)或“芯片上的实验室”中的前景。ix.结论制造了一种能通过安培测定检测酶促反应的微型DNA传感器，并且用二茂铁和POD通过周期性伏安测定进行了特征分析，以便证实在没有传统的银/氯化银电极的情况下进行电化学检测的能力。干扰的降低是通过表面改性和引入封闭蛋白实现的。工作电极上孔的结构设计以及对硅基质进行的表面处理，使得能够将制剂限制在工作电极上。可以控制试剂-电极接触，以便减少非专一性结合，这一目的用传统的烧杯装置是无法实现的。尿液样品检测表明，该DNA传感器适用于临床诊断，它具有短的检测时间和较小的系统体积。x.参考文献1.Chen，Y.F.，Yang，J.M.，Gau，J.J.，Ho，C.M.，Tai，Y.C.，2000.“MicrofluidicSystemforBiologicalAgentDetection”Proceedingsofthe3rdInternationalconferenceontheinteractionofartandfluidmechanics，Zurich，Switzerland，2000.2.Gan，J.J.，Lan，E.H.，Dunn，B.，Ho，C.M.，2000.“Enzyme-basedelectrochemicalbiosensorwithDNAarraychip”ProceedingsofthefourthInternationalSymposiumonMicroTotalAnalysisSystems(μTAS)，Enschede，TheNetherlands.3.Gau，J.J.，Lan，E.H.，Dunn，B.，Ho，C.M.，2000.“AMEMSBasedAmperometricDetectorforE.ColiBacteria-UsingSelf-AssembledMonolaycrs”ProceedingsofthesixthWorldCongressonBiosensors，SanDiego，USA4.Eggins，B.，1996Biosensor，JohnWileyandSons，NewYork.5.Hall，E.A.H.，Biosensors，PrenticeHall，EaglewoodCliffs，NJ，pp.97-139，1991.图1DNA微型传感器阵列芯片(a)4个传感器，具有提高表面-体积比的表面特征(b)在1cm2上有14个传感器图2传感器和方法示意图(a)杂交(b)固定(c)POD负荷图3辣根过氧化物酶酶反应的电子转移图4通过周期性伏安测定对传感器进行特征分析图5通过HRP酶促反应对传感器进行特征分析图6通过添加封闭蛋白消除非专一性结合降低干扰图7(a)传统和(b)微型DNA传感器之间电极-试剂接触的比较图8限制在微型DNA电极上的电解质的图像图9用POD结合的标记探针的简化方法，(a)杂交(b)固定图10用尿液样品检验微型DNA传感器的灵敏度利用自我组装的单层检测大肠杆菌细菌的基于MEMS的电流测定检测仪摘要我们开发了一种基于微电子机械系统(MEMS)、自我组装的单层(SAMS)，DNA杂交和酶扩增的整合的用于大肠杆菌的电流检测的系统。利用MEMS技术制造了一种检测仪阵列，它具有沉积在硅晶片上的多个电极，并且是完全可以再利用的。通过SAMs，将蛋白链亲和素单层固定在工作电极(金)表面上，用于捕捉来自大肠杆菌的rRNA。可以用三种不同方法将链亲和素固定在金上直接将蛋白吸附在裸露的金上，将所述蛋白结合在金上面的生物素化的硫醇SAM上，以及将所述蛋白结合在金上面的生物素化的二硫化物单层上。生物素化的硫醇方法获得了最佳结果。通过ssDNA-rRNA杂交获得了对大肠杆菌的高度专一性，通过用过氧化物酶作酶的酶促扩增获得了高度灵敏度。该分析方法可以对体积为几微升的溶液进行分析，并且能在40分钟内完成。在不进行聚合酶链式反应的情况下，该检测系统能够检测1000个大肠杆菌细胞，与细菌Bordetellabronchiseptica相比，对大肠杆菌具有高度专一性。关键词微电子机械系统(MEMS)，自我组装的单层(SAMs)，电流检测，大肠杆菌细菌，DNA杂交1.前言业已开发出了用于检测病原菌的多种生物传感器，包括光学和电化学生物传感器(Ivnitski等，1999，2000)。尽管用于检测细菌的传统方法通常包括对相关生物进行形态学评估并检测其生长能力，但这样的方法非常耗费时间，并且不适应在野外条件下使用。对快速检测和便携性的需求业已导致了将病原体识别与信号传导联系在一起的系统的开发。细菌的光学和电化学检测都已经报导过，不过，电化学方法的优点是更适合小型化(Ivnitski等，1999，T.Wang等，2000)。理想检测仪的标准包括高专一性和高灵敏度，采用一种能在较短时间内完成的方法。另外，可以小型化和自动化的系统与现有技术相比具有明显优点，特别是需要在野外进行检测的情况下尤其如此。微电子机械系统(MEMS)技术提供了能够在各种工程用途中进行传感和致动的换能器。MEMS技术的价值在于，它能够生产出可以与电子元件整合的微米级机械部件，并且可以大批量生产。MEMS装置可以通过显微机械加工方法生产，这是一种采用平板印刷术的批量生产方法。显微机械加工在很大程度上依赖于平板印刷方法的使用，利用预先设计的阻挡图案(或掩模)产生三维结构，然后将不需要的部分选择性地蚀刻消除(Ho和Tai，1996，1998)。MEMS是用于生产微型化装置的有效方法，并且在本研究中，我们将MEMS技术与生物传感方法整合在一起来检测大肠杆菌。获得高专一性的最有效的方法之一是检测细菌的遗传材料(例如，rRNA，mRNA，变性的DNA)。通过选择其序列仅互补于靶细菌rRNA或ssDNA的单链DNA(ssDNA)探针，监测杂交事件，可以选择性地检测靶细胞。为了提高灵敏度，杂交事件与酶促反应的结合，导致了信号的放大，因为每一次底物向产物的转变都会对总的信号作出贡献。通过酶促反应放大的为了检测DNA杂交而进行的生物测定仍然可以在合理短的时间内完成。最后，电化学探头所固有的微型化和便携性使它成为用于整合到MEMS装置上的出色的候选者。基于若干业已完善的技术与一种检测系统的组合，我们开发出了一种用于大肠杆菌检测的原型电流测定检测仪(Chen等，2000，Gau等，2000)。MEMS技术、自我组装的单层(SAMs)、DNA杂交和酶放大都能对微型化、专一性、和灵敏的大肠杆菌检测仪的设计有贡献。以前业已报导过DNA电化学探头(Wang等，1997，Marrazza等，1999)，通常采用石墨或碳电极。还可以获得利用在一次性检测条上通过丝网印刷的碳电极对来自大肠杆菌的DNA进行电流检测的商业化装置(AndcareInc.，Durham，NC)。丝网印刷的优点是成本低，但不容易获得很高的尺寸精度。采用平板印刷术，可以使包括金属(金，银)和碳在内的多种材料的薄膜以微米级的尺寸精确成型。另外，SAMs是将分子选择性地固定在MEMS表面上的巧妙方法。业已充分研究了SAMs与金、银和其他金属的结合(Revell等，1998)，Motesharei，1998，Xia等，1998，Lahiri等，1999)，并且，通过SAMs可以将蛋白和其他生物分子轻松地固定在诸如金的表面上(Ostuni等，1999，Kane等，1999，Spinke等，1993，Haussling等，1991)。另外，利用电极上的SAMs进行电流测定的方法业已表现出能成功地检测靶分析物的能力(Sun等，1998，Hou等，1998，Murthy等，1998)。在我们的大肠杆菌检测系统中，我们利用了每一种技术所固有的优点。利用DNA杂交和酶放大，我们获得了所需的专一性和灵敏度。利用MEMS和SAMs，我们制造出了可以生产出便携式仪器的微型化系统。最后，我们证实，该检测系统可应用于多种致病菌。例如，该检测组件和分析方法可应用于检测尿路致病大肠杆菌，并用于鉴定导致中耳炎的微生物。2.实验2.1MEMS检测仪阵列将二氧化硅单层(1000埃)沉积在裸露的硅晶片(一级，p-型(100)，厚度500-550微米)，并用作氮化硅下面的垫层(1000埃)，以便释放张力并改善黏附性。所制造的MEMS阵列具有3.6×3.6毫米的工作电极，在它上面蚀刻形成了深度为350微米的孔。使氮化物晶片形成图案，并且用氢氧化钾烟[111]和[100]晶片平面进行总体蚀刻，通过氢氧化钾蚀刻时间和温度控制孔的深度。使100微米宽的辅助电极和参考电极与相应的工作电极间隔200微米。图1表示用于产生MEMS阵列的图案的示意图。通过HF蚀刻去掉氮化物和氧化物，以便释放内部张力，并且沉积另外一个氧化物层(500埃)用于电隔离。通过PR5214光阻逆成像和lift-out方法利用电子束沉积的金(2000埃)镉(200埃)在电极上印刷图案。最后，在将所述晶片在150℃的热溶液中浸泡10分钟之后在六甲基二硅胺烷(HMDS)蒸汽中沐浴3分钟，以便在硅部位周围形成一个疏水性表面。所述周围部分的疏水性特性和工作电极的三维特征使得它能够将一个液滴容纳在工作电极内。这种设计有效减少了生物分子与MEMS阵列其他部位的非专一性结合。2.2链亲和素SAMs左金上的沉积用三种不同方法将链亲和素单层沉积在金上1)将链亲和素直接吸附在裸露的金上，2)沉积生物素化的硫醇生物素-DAD-C12-SH的SAM，然后再与链亲和素结合，3)沉积生物素化的二硫化物-生物素-HPDA的SAM，然后再与链亲和素结合。在所有场合下，都用浓缩的“Piranha”溶液(70vol％H2SO4，30vol％H2O2)清洗金表面，并用去离子水彻底漂洗。为了将链亲和素沉积在金上，将用0，02M磷酸钠缓冲液，0.15M氯化钠，pH7.2配制的1.0毫克/毫升链亲和素(SigmaChemicalCo.S0677)溶液放置在所述表面上，静置10分钟，并用去离子水漂洗。为了沉积生物素-DAD--DAD-C12-SH(12-巯基(8-生物素酰胺-3，6-二恶辛基)十二烷酰胺，RocheGmBH，德国)的SAM，采用Spinke等(1993)的方法，其中将样品放在用乙醇配制的含有4.5×10-4M11-巯基-1-十一醇(AldrichChemicalCo.，44，752-8)的50mM生物素-DAD-C12-SH溶液中培养大约18小时，并且用乙醇和水漂洗。然后用生物素包衣的金表面接触1.0mg/ml的链亲和素溶液大约10分钟，并且再次用水漂洗。为了沉积生物素-HPDP(N-[6-(生物素酰胺)己基]-3’-(2’-吡啶基二硫基)丙胺酰胺，PierceInc.，21341)的SAM，将样品放在用乙醇配制的50mM生物素-HPDP溶液(含或不含4.5×10-4M巯基乙醇)中培养大约18小时，并且用乙醇和水漂洗。然后让所述表面接触1.0mg/ml的链亲和素溶液大约10分钟，并且再次用水漂洗。2.3用于大肠杆菌电流检测的测定方法该测定方法是按以下方式进行的1)将50微升裂解试剂(AndcareInc.，4002-11)添加到培养基中的250微升细菌样品中，并且在室温下培养5分钟，2)将100微升探针溶液(AndcareInc.，4002-13)添加到所述混合物中，并且在65℃下培养10分钟，将5微升裂解的大肠杆菌/探针溶液混合物放置在用链亲和素包衣的MEMS检测仪阵列的工作电极上，并且在室温下培养10分钟，4)用生物素洗涤溶液(Kirkegaard和Perry实验室，50-63-06)洗涤所述MEMS检测仪阵列，5)将用稀释剂(AndcareInc.，4002-14)稀释到0.75或0.15U/ml的5微升抗F1-POD(抗荧光素过氧化物酶，150A，RocheInc.1426346)放置在工作电极上，并且在室温下培养10分钟，6)再次用洗涤溶液洗涤MEMS阵列芯片，7)以这样的方式将10微升K-blue底物(NeogenCorp.，300176)放置在检测仪阵列上，使所有三个电极(工作电极、辅助电极、参考电极)都被该底物溶液所覆盖，和8)马上进行电化学测定。整个方法是在40分钟内完成的。用具有皮安加强器和法拉第盒的CH仪器660A电化学工作台测定安培电流和时间。依次测定MEMS检测仪阵列上的样品。将电压固定在-0.1V(相对参考电极)，而阴极电流是在第20秒以安培信号形式获得的。在第20秒，电流值得到稳态。通过系列稀释和培养平板记数测定细胞浓度(细胞数量)。2.4自我组装的单层的特征分析所述检测仪的性能在很大程度上取决于固定化的链亲和素单层的特性。我们进行了表面质子共振(SPR，BiacoreX系统，Biacore，Inc.)和原子粒显微分析(AFM)，以便对所述单层进行特征分析。为了对结合于裸露的金上的链亲和素进行SPR研究，使用裸露的金芯片(J1传感器芯片)。为了研究结合于生物素-DAD-C12-SH/Au或生物素-HPDP/Au上的链亲和素，在SPR实验之前，按以前披露的方法将生物素SAM沉积在裸露的金芯片上。为了获得最佳结果，在用裸露的金进行SPR或沉积生物素SAM之前，用稀释的硫酸/过氧化氢溶液清洗芯片大约2分钟。在所有场合下，使用用0.02M磷酸钠，0.15M氯化钠，pH7.2缓冲液配制的1.0毫克/毫升链亲和素。在用吸附到裸露的金上的链亲和素进行的吸附实验中，流量为1-5微升/分钟。在用链亲和素和生物素-DAD-C12-SH/Au进行的实验中，流量为10-25微升/分钟。在用链亲和素和生物素-HPDP/Au进行的实验中，流量为5-10微升/分钟。在吸附实验中，以25微升/分钟的流量使25微升的下列溶液依次流过所述通道(总接触时间为1分钟)，1.0M氯化钾，8M尿素，0.5％SDS，0.1M氯化氢，0.1M氢氧化钠，和40vol％甲酰胺。利用超级杠杆头以5.0nN的力通过接触方式进行AFM(AutoProbeCP，Thermomicroscopes，Inc.)。为了确保获得平的金表面，采用Wagner等的方法(1995)，其中，首先通过电子束蒸发将金沉积在云母上，然后再转移到硅上。在我们的研究中，将云母裂解，以便将它完全从金中消除，而不使用溶剂。3.结果3.1微电子机械系统(MEMS)图2表示MEMS检测仪阵列的照片。16个工作电极及其相应的辅助电极和参考电极在2.8×2.8厘米的范围内形成图案。该检测仪阵列是完全可以再利用的，因为其表面可以用硫酸/过氧化氢溶液清洗。通过适当清洗表面并且在工作电极上重新沉积SAMs，我们业已多次再利用了相同的MEMS检测仪阵列。3.2利用DNA检测大肠杆菌在我们的MEMS系统中，大肠杆菌检测是基于DNA杂交，随后进行酶促反应。在图3中示出了所述电极表面的图示说明。将链亲和素单层固定在金工作电极表面上，以便捕捉来自大肠杆菌的rRNA。在本系统中使用两种ssDNA片段。用于结合链亲和素的与生物素结合的捕捉ssDNA能够与所述大肠杆菌rRNA的一端杂交。用于结合与过氧化物酶(POD)连接的抗荧光素的与荧光素结合的检测ssDNA能够与所述大肠杆菌rRNA的另一端杂交。捕捉和检测ssDNA能识别两种不同的保守序列，因此，只能与来自大肠杆菌的特定基因片段形成杂合体。通过生物素-链亲和素结合，将寡核酸杂合体固定在金工作电极上，并且将未结合的成分洗掉。链亲和素以异常高的亲和力(Kd大约10-15M)结合生物素(Weber等，1989)。在将POD加载到所述杂合体上(通过抗F1荧光素结合)之后，添加底物，并且通过电流测定检测酶促反应。所述底物溶液含有底物H2O2和介体3，3’，5，5’-四氧基联苯胺(TMB)。在图4中示出了所述酶和电极反应。3.3用于rRNA捕捉的链亲和素自我组装的单层如图5所示，我们采用三种不同的方法将链亲和素单层固定在所述电极表面上。在第一种方法种，通过蛋白吸附将链亲和素单层沉积在裸露的金上。在第二种方法中，利用生物素化的硫醇将生物素的SAM沉积在金上，然后将链亲和素结合在所述生物素上。在第三种方法中，利用生物素化的二硫化物将生物素的SAM沉积在金上，然后将链亲和素结合在所述生物素上。3.4链亲和素单层的特征分析通过表面质子共振(SPR)和原子力显微分析(AFM)对链亲和素单层进行特征分析。业已证实SPR是一种用于监测分子与位于溶液-金属界面上的金属(金，银)薄膜之间的相互作用的可靠的技术。该技术可用于评估沉积层的厚度，以及用于测定结合和解离的动力学(Haussling等，1991(Spinke等，1993，Sigal等，1996，Rao等，1999，Jung等，1999)。我们采用所有三种方法进行SPR，以便监测链亲和素在金上的沉积。SPR结果如图6所示。根据生产商(Boacore)的校正，SPR信号的1000共振单位(RU)相当于表面蛋白浓度的大约1纳克/平方毫米的变化。链亲和素的尺寸大约为55×45×50埃(Darst等，1991)。根据二维结晶单层技术，链亲和素的完整单层所具有的预期密度为大约2.8纳克/平方毫米(Jung等，1999，Darst等，1991)。参见图6，在生物素化的硫醇SAM/Au上沉积了基本上完整的链亲和素单层(大约3000RU)，通过沉积在裸露的金上的链亲和素(大约2400RU)获得了大约80％的“覆盖率”，通过将链亲和素沉积在生物素化的二硫化物SAM/Au(大约1550RU)获得了大约52％的“覆盖率”。对于生物素化的二硫化物来说，巯基丙醇在所述溶液中的存在对表面覆盖率具有可以忽略的影响，因为SPR信号只提高了大约10％(大约1700RU，数据未发表)。在所有场合下，在第二次注入蛋白溶液时，额外蛋白沉积很少。另外，流量对蛋白沉积速度或数量的影响也可忽略不计。SPR结果表明，在所有三种方法中，在金上只沉积了一个链亲和素单层，而不是多层。最后，以上结果证实，大多数链亲和素-生物素结合和链亲和素在裸露的金上的吸附是在几秒钟内进行的，并且可以在几分钟时间内完成。我们进行了实验，以便确定链亲和素是否能够解吸，即链亲和素是否能从裸露的金上解离或者从与生物素的结合中解离，以便再生所述表面。表1列举了在用各种试剂处理之后SPR信号(RU)的减少，已知所述试剂能解离蛋白-配体结合和/或使蛋白变性。参见表1，只有8M的尿素，0.5％的SDS和0.1M氢氧化钠对链亲和素从所述表面上的解吸有某些作用。1.0M氯化钾、0.1M氯化氢和40％甲酰胺没有作用。上述任何试剂都不能使链亲和素完成解吸，某些蛋白在用所有试剂对所述表面进行处理之后仍然能保留下来。以上结果表明，链亲和素对生物素SAM和裸露的金的结合相当好，并且链亲和素单层是相当稳定的。使用AFM使得我们能够通过将直接吸附在裸露的金上的链亲和素显像对所述表面作进一步的特征分析。裸露的金所具有的拓扑特征小于10埃，而“部分”单层上的蛋白沉积物的拓扑特征大约为45埃，与链亲和素的尺寸吻合(图7)。AFM结果证实了SPR发现，即在金上只沉积了一个单层。“完整”蛋白单层的接触方式的AFM表现出一种无特征的表面，提供了蛋白吸附的证据(数据未发表)，因此，没有提供有关表面覆盖率的任何其他信息。正如以前所报导的，在使用生物素化的SAMs，然后再结合链亲和素时同样获得了单层沉积(Spinke等，1993，Jung等，1999)。3.5用MEMS检测仪阵列进行的电化学测定在我们的MEMS检测仪阵列中，我们采用了三电极系统，所有三个电极，即工作电极、辅助电极和参考电极都使用金。通常，将银/氯化银或饱和的甘汞电极(SCE)用作参考电极，以便在参考电极上以固定的电位进行可恢复的氧化/还原。不过，在我们的MEMS检测仪阵列中，我们用金作参考电极来简化制造工艺，并且提供一种完全可以再利用的阵列。通过使用三电极系统(与二电极系统比较)可以保持稳定的电位。在我们的具体应用中，监测TMB的还原，可以将金成功地用作参考电极，因为在短时间内(小于1分钟)维持了低的电压差(-0.1V)。我们通过两个独立的实验对用于电化学检测的金/金/金电极系统进行了特征分析。在第一个实验中，在将二茂铁薄膜覆盖在所述电极上，并且进行周期性伏安测定，以便监测氧化还原反应。典型的可恢复单电子转移的周期性伏安测定的特征是在阳极峰和阴极峰之间的峰的间隔大约为57mV，在最大峰值下具有相同的峰电流，并且在峰电流与[扫描速度]1/2之间成线性关系(Hall，1991)。图8表示用二茂铁以不同的扫描速度获得的伏安图。如图8所示，观察到了典型的氧化还原行为，并且峰电流与[扫描速度]1/2之间的图是直线(图9)。在用金/金/金电极系统进行的第二个实验中，仅用底物溶液(H2O2+TMB)进行周期性伏安测定，然后再用含有POD酶的相同溶液进行伏安测定。以10mV/秒的扫描速度在-0.2到+0.50伏之间循环，所述底物溶液表现出TMB的双电子氧化还原行为(图10)。向所述底物溶液中添加POD，导致了还原电流的增强。然后选择-0.10伏(相对参考电极)的稳定电位测定POD酶促活性。在该电位下，电流背景接近于0，并且不发生底物氧化作用。该电位是用于酶促活性测定的最佳电位，其中，在存在高浓度底物的情况下对少量产物(氧化的TMB)进行测定。3.6检测大肠杆菌为了对大肠杆菌rRNA进行电流检测，我们首先比较了三种不同链亲和素单层表面的性能。利用前面所披露的三种不同方法将链亲和素固定在金上，并且对大肠杆菌和Bordetellabronchiseptica(Bordetella)进行了所述测定方法。由于所述ssDNA探针对大肠杆菌专一，用Bordetella细菌作为负对照样品。本实验的目的是比较固定化的链亲和素捕捉生物素-rRNA-POD杂合体的效力。使用两种浓度的大肠杆菌，一种样品的浓度为另一种样品的10倍。不过，来自Bordetella的信号表明了非专一性结合或可以达到的“本底”的水平。来自该实验的结果如图11所示。由于使用了相同的细菌溶液(大肠杆菌或Bordetella)，可以对不同的表面进行直接比较。如图11所示，通过生物素化的硫醇固定在金上的链亲和素是用于大肠杆菌检测的最佳条件。使用生物素-硫醇SAM，我们获得了大肠杆菌的良好信号，同时获得了来自Bordetella的很低的本底信号。对于通过生物素-二硫化物固定在金上的链亲和素来说，大肠杆菌的电流信号(两种浓度的)明显较低，而其本底与生物素-硫醇/链亲和素的相同。在将链亲和素直接吸附到金上时，来自Bordetella的信号要高的多，这表明POD与所述表面的非专一性结合水平较高。在确认金/生物素-SH/链亲和素是最佳链亲和素表面之后，我们用大肠杆菌和Bordetella重复进行以上方法，以便确定我们的系统的灵敏度。我们通过生物素-SHSAM固定链亲和素，并且对一系列大肠杆菌稀释液进行测定，同时以Bordetella作负对照。结果如图12所示。数据表明，使用我们的MEMS系统可以检测出少到1000个大肠杆菌细胞。正如所预料的，随着样品溶液中大肠杆菌细胞数量的增加会使电流信号增强。另外，通过降低在所述测定方法中所使用的POD的浓度(从0.75降至0.15U/ml)，我们在较低的大肠杆菌细胞数量下获得了较好的信号分辨率(图13)。如图13所示，1000个大肠杆菌细胞的电流信号超过2.5×105细胞的电流信号2倍以上。使用我们的MEMS结果证实通过电流测定和用SAMs捕捉细菌rRNA能成功地检测大肠杆菌。4.讨论我们的结果表明，将MEMS技术与SAMs、DNA杂交和酶促电流测定组合在一起，能够产生一种用于诸如大肠杆菌的细菌检测的高专一性和高灵敏度的电化学检测仪。每一个因素的作用对该系统的总体上的成功是关键的。MEMS技术可以将多个三电极“电池”的阵列沉积在一个硅晶片上，并且我们所披露的MEMS检测仪阵列是完全可以再利用的，因为可以通过适当的清洗除掉SAMs，并使金表面再生。另外，通过显微机械加工的通道，阀门、泵和集成化的电子元件，可以使样品制备和测定过程完全自动化。SAMs提供了一种使金工作电极功能化，以便固定诸如链亲和素的捕捉生物分子的有效方法。DNA杂交对病原菌具有高度专一性，因为可以认真挑选ssDNA探针的序列，以便仅与靶序列互补。将杂交事件与酶促反应联系在一起，提供信号放大并提高灵敏度。最后，通过采用电化学转导，可以开发出一种能耗很低的微型化的便携式系统。快速检测和便携式仪器是病原体检测所需要的。我们业已证实，采用该系统检测可以在大约40分钟内完成。由于具有小的尺寸和小的样品体积，还可以通过缩短DNA杂交和酶结合通常所使用的培养时间(10分钟)，可以进一步缩短测定时间。MEMS的独特优点是，使用非常小的体积(几微升)和电极表面积(工作电极通常为0.13平方厘米，辅助电极和参考电极小于0.02平方厘米)的能力。我们的结果证实，在不进行聚合酶链式反应(PCR)的前提下，使用该系统可以检测出少到大约103个细胞。由于MEMS系统具有小的体积和工作电极表面积，以绝对细胞数量形式表示检测极限比以细胞浓度(细胞/毫升)形式表示检测极限更合适。不过，业已报导了通常采用102-103细胞/毫升数量级上的检测极限，样品体积为大约1.0毫升，工作电极表面积大约为1平方厘米(Abdel-Hamid等，1998，1999)。在电流测定酶免疫过滤测定中，使用0.1毫升样品的信号强度比使用1.0毫升样品的信号强度低1个数量级(Abdel-Hamid，1999)。来自检测大肠杆菌rRNA的电流测定实验的结果业已证实，通过生物素化的硫醇SAM方法固定的链亲和素单层产生了最佳结果。这一发现并不意外，因为SPR数据表明在使用生物素化的硫醇时具有最高的链亲和素表面密度或“覆盖率”。很可能只能用生物素化的硫醇形成排列整齐的自我组装的单层，从而产生最高的链亲和素表面密度。在使用生物素化的二硫化物时，尽管生物素与金表面的结合是通过金-S键进行的，其他的有机基团有可能抑制密集的紧凑的单层的形成。通过直接吸附固定在金上的链亲和素会导致明显较高的POD酶与工作电极的非专一性结合。吸附在金上的蛋白是众所周知的，因为可以通过商业渠道获得(Nanoprobes，Inc.，Yaphank，NY)获得与各种蛋白(例如，链亲和素，免疫球蛋白)结合的胶体状金颗粒。链亲和素不含有半胱氨酸或甲硫氨酸残基(Weber等，1989)，因此，不能通过金-S键与金结合。金对蛋白的吸附可以通过羧基基团与金之间的相互作用完成(Ooka等，1999)，并且这很可能是链亲和素-金结合的基质。无论自我组装或分子有序化是否发生，链亲和素单层都可以通过直接吸附与金结合。SPR吸附实验表明，链亲和素-金结合与链亲和素-生物素结合一样牢固，即与结合在生物素上的链亲和素相比，通过尿素SDS和氢氧化钠的作用除去的链亲和素的量与直接吸附在金上的链亲和素的量相似。不过，在我们用大肠杆菌实施所述测定方法时，样品溶液含有来自裂解的大肠杆菌的寡核苷酸和细胞碎片。我们的数据表明，其他蛋白和生物分子的存在改变了链亲和素从金上的解吸作用，导致POD酶与所述表面非专一性结合的增强。5.结论通过将MEMS和SAMs、DNA杂交和酶扩增结合在一起，成功地检测了大肠杆菌。我们证实，基于MEMS的检测系统对大肠杆菌是专一的，并且能够在不进行PCR的情况下检测1000个细胞。该方法的时间可以为40分钟或更少。另外，该测定可以用几微升的溶液体积进行。SAMs、DNA杂交和酶扩增方法与MEMS技术的整合可以提供用于病原体检测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的S-CDWT-M值所示。所有由6或8毫米合成纤维组成的基材在SSB分子量较低时是可分散的。随着分子量增加，8毫米Lyocell基材开始在浸泡于二价阳离子溶液1小时后保留一些强度；然而这种基材可分散在DI水中。在施用粘合剂前将干燥的织物压实也会影响含合成纤维的基材(代号3015和3016)的可分散性。代号3015和3016在DI水中能完全分散。通过选择较低分子量的SSB与合成纤维结合使用并使干燥的织物压实能够控制片材的可分散性。实施例30制备表25中列出的基材，用4％NaCl溶液润湿，并根据实施例29中所述的方法进行试验。每种基材都由表25指出的纤维混合物和含有SSB/辅助粘合剂混合物的20％的粘合剂组成。在表25中所列的所有样品中都用了辅助粘合剂Dur-O-SetRB。除了最后一个，即代号2813含有15％的PET纤维(6毫米、卷曲的纤维，来自KoSa)之外，所有代号都使用了100％的软木纤维。通常将单位重量保持不变，为约60图6图7图8图9图10图11图12权利要求1.一种检测样品试剂中靶分析物的存在或测定其数量的方法，包括以下步骤让显微制造的电化学生物传感器与样品试剂接触，所述显微制造的电化学生物传感器包括(a)基质(b)至少两个通过集成电路技术制造在基质上的导电电极，每一个导电电极由单层导电材料组成；让样品试剂与导电电极接触；测定显微制造的生物传感器的电信号输出；并且由输出的信号确定样品试剂中靶分析物的存在和/或数量。2.权利要求1的方法，其中电化学生物传感器还包括在每一个电极下面的粘接剂，该粘接剂使得电极与基质的粘附更好。3.权利要求2的方法，其中样品试剂是含有大分子的生物流体。4.权利要求2的方法，其中样品试剂是含有离子分子或原子的生物流体。5.权利要求2的方法，其中基质选自硅、砷化镓、塑料和玻璃。6.权利要求2的方法，其中基质包括由硅制造的材料。7.权利要求2的方法，其中导电材料选自金、铝、铬、铜、铂、钛、镍和钛。8.权利要求2的方法，其中导电材料为金。9.权利要求2的方法，其中粘接剂选自铬、钛和胶水。10.权利要求2的方法，其中粘接剂为铬。11.权利要求2的方法，其中基质还包括含有至少一个电极的孔结构。12.权利要求2的方法，其中电化学生物传感器包括至少三个导电电极。13.权利要求12的方法，其中各个导电电极均由一层金组成。14.权利要求2的方法，其中由输出的信号确定样品中存在靶分析物和/或其量的步骤进一步包括以下步骤用含有已知量的待测定靶分析物的第一校正溶液和含有未测定量的待测定靶分析物的第二校正溶液校正电化学传感器；得到参考输出信号；并且比较参考信号与测定的信号以确定样品试剂中该分子的存在和/或数量。15.权利要求14的方法，其中基质选自硅、砷化镓、塑料和玻璃。16.权利要求14的方法，其中导电材料选自金、铝、铬、铜、铂、镍和钛。17.权利要求14的方法，其中导电材料为金。18.权利要求14的方法，其中粘接剂选自铬、钛和胶水。19.权利要求14的方法，其中基质还包括在至少一个电极下面的孔结构。20.权利要求14的方法，其中至少一个电极的表面经表面改性以锚定大分子。21.检测样品试剂中至少一种分子的存在或测定其数量的方法，包括以下步骤让显微制造的电化学生物传感器与样品试剂接触，所述显微制造的电化学生物传感器包括(a)硅基质；和(b)三个通过集成电路技术制造在基质上的导电电极，每一个导电电极由单层金组成；让样品试剂与导电电极接触；测定显微制造的电化学生物传感器的电信号输出；并且由输出的信号确定样品试剂中所述分子的存在和/或数量。22.一种显微制造的电化学生物传感器，包括硅基质；和三个通过集成电路技术制造在基质上以测定氧化还原的导电电极，每一个导电电极由单层金组成。23.检测靶分析物的方法，包括以下步骤提供一种生物传感器和至少一种试剂，该生物传感器包括(a)具有固定试剂中所含的靶分析物的第一表面特性的第一区；和(b)具有与第一表面特性不同的第二表面特性的第二区，使得试剂样品由于第一区和第二区之间的表面张力而被限制，该第二区包括检测靶分析物的成分；将一定体积的试剂涂在生物传感器上，其中试剂在生物传感器上的覆盖面由试剂体积和表面张力决定；并且通过生物传感器测定靶分析物的存在和/或数量。24.权利要求23的方法，其中所述成分包括至少一个选自反电极和参考电极的电极。25.权利要求23的方法，其中至少一种试剂包括第一试剂和第二试剂。26.权利要求25的方法，其中将试剂涂在生物传感器上的步骤包括将第一试剂覆盖于第一区上；并且将第二试剂覆盖于第二区上。27.权利要求26的方法，其中第一区的外形取第一几何形状，该形状将第一试剂限制于第一区内。28.权利要求27的方法，其中第二区的外形取第二几何形状，该形状将第二试剂限制于第二区内。29.权利要求25的方法，其中第一试剂是含有靶分析物的生物流体，第二试剂是适于靶分析物的生物测定的化学溶液。30.权利要求23的方法，其中靶分析物选自离子分子和大分子。31.权利要求23的方法，其中测定靶分析物的存在和/或其量的步骤还包括用含有已知量的待测定分析物的第一校正溶液和含有未测定量的待测定分析物的第二校正溶液校正生物传感器；运用校正结果以确定样品试剂中该分子的存在和/或数量。32.权利要求23的方法，其中第一区和第二区的表面特性是在将试剂涂在生物传感器之前进行表面改性。33.权利要求23的方法，其中第一区和第二区的表面特性由外加力场控制。34.测定液体试剂中至少一种分析物的氧化还原事件的装置，包括通过使用集成电路(IC)和微电子机械系统(MEMS)技术中至少一种制造在半导体上的氧化还原传感器，氧化还原传感器包括至少两个用于信号输出和偏压控制的导电电极；电极和半导体之间的隔离层；在半导体上和隔离层下的集成电路(IC)，该集成电路包括检测电路和向检测电路提供偏压的偏压电路；并且其中隔离层具有将电极与集成电路(IC)电连接的导电触点部分。35.权利要求34的装置，其中导电电极选自金、铝、铬、铜、铂、镍和钛。36.权利要求34的装置，其中导电电极由金制成。37.权利要求34的装置，其中半导体选自硅和砷化镓。38.权利要求34的装置，其中半导体是硅。39.权利要求34的装置，其中检测电路包括电流测定装置，以通过相应导电电极测定氧化还原事件的电流信号。40.权利要求39的装置，其中偏压是使得电流测定中的电子转移的至少两个不同电极之间的电位差。41.测定液体试剂中至少一种分析物的氧化还原事件的装置，包括在半导体上的氧化还原传感器，该氧化还原传感器包括参考电极、工作电极和反电极；氧化还原传感器和半导体之间的隔离层；在半导体之上和隔离层之下的集成电路(IC)，该集成电路包括检测电路和向检测电路提供偏电压的偏压电路；并且其中隔离层具有将电极与集成电路(IC)电连接的导电触点部分。42.权利要求41的装置，其中各个电极均由导电材料单层组成。43.权利要求42的装置，其中导电材料是金。44.权利要求43的装置，其中半导体是硅。45.权利要求44的装置，其中检测电路包括电流测定装置，以通过相应导电电极测定氧化还原事件的电流信号。46.权利要求45的装置，其中偏压是使得电流测定中的电子转移的至少两个不同电极之间的电位差。47.权利要求41的装置，其中半导体选自硅和砷化镓。48.权利要求41的装置，其中半导体是硅。49.权利要求41的装置，其中检测电路包括电流测定装置，以通过相应导电电极测定氧化还原事件的电流信号。50.权利要求49的装置，其中偏压是使得电流测定中的电子转移的至少两个不同电极之间的电位差。全文摘要一基于微电子机械系统(MEMS)及集成电路(IC)的生物传感器可被用于感测或检测不同的离子及大分子(DNA、RNA或蛋白质)。基于微电子机械系统(MEMS)的生物传感器可以利用杂交、酶扩增方法及一电化学检测方法，以提高灵敏度及缩小系统体积。所述生物传感器整合于单一基质上。所述生物传感器系统包含至少两个电极。这些电极包括一工作电极，一参考电极和一反电极(辅助电极)。此生物传感器还提供了利用表面张力将试剂和/或溶液小规模限制在所述生物传感器上的装置和方法。该试剂限制系统利用可控制的表面特性及表面张力，使试剂和/或溶液可控制性地与传感器元件(例如电极)接触。该试剂限制系统也可以将生物传感器整合在便携式或手持式装置上，并且不怕振荡及翻转。本发明还提供了与集成电路技术整合的生物传感器。优选将整个传感器系统制造于单一IC基质或芯片上而无需外接元件及/或仪器以构成完整的系统。该系统优选利用IC方法制造在硅基质上。文档编号C12Q1/68GK1440454SQ01812275公开日2003年9月3日申请日期2001年5月2日优先权日2000年5月3日发明者高振智申请人:高振智