专利名称：给受试者送递干扰素的系统和方法
技术领域：
和背景本发明涉及给受试者提供补充干扰素的系统和方法，更具体地说，涉及通过可食植物施用干扰素的系统和方法。本发明还涉及给受试者提供口服生物有效性蛋白质的一般方法。
在最近十年中，使用植物病毒作为载体用于多数蛋白质的基因表达受到极大的重视且已经开发了一些RNA病毒载体(Takamatsu等，1987；Chapman等，1992；Dolja等，1992；Kumagai等，1993；Rommens等，1995；Porta和Lomonossoff，1996；Scholthof等，1996；Arazi等，2001)。这些载体已经成功地用于植物基因(Hammond-Kosack等，1995；Sablowski等，1995；Kumagai等，2000)和异源性基因(Hamamoto等，1993；Hendy等，1999；McCormick等，1999；Gopinath等，2000；Zhang等，2000)在植物中的表达。遗憾的是，由于大多数已知植物病毒引起宿主植物显著的产量减少，因此使用这些植物病毒载体用于生产具有改进农学性状或者具有增加营养或药用价值的商业作物尚不可行。
另外，病毒通过其野外的天然载体传染给其它植物(Matthews，1991)。这一后果引起对在野外使用植物病毒载体的严重忧虑。
绿皮密生西葫芦黄色花叶病毒(ZYMV)是在诸如黄瓜，南瓜，甜瓜和西瓜的全世界葫芦种类中最具毁灭性的疾病之一(Desbiez和Lecoq，1997)。ZYMV是ptyviridae科，即植物感染性病毒的最大群体中的一个成员(Shukla等，1994)。与所有马铃薯Y病毒组一样，ZYMV基因组由大约10kb的单个信使极性RNA分子组成，被多拷贝的单一外壳蛋白(CP)包裹形成一个弯曲的丝状颗粒(Gal-On等，1992 J.Gen.Virol.732183-2187)。病毒RNA翻译成大型多蛋白，该多蛋白被3个病毒编码的蛋白酶PI，HC-Pro和NIa经蛋白酶解加工成8-9个功能蛋白(Riechmann等，1992，Revers等，1999)。PI(Verchot等，1991)和HC-Pro(Carrington等，1989)蛋白酶是位于多蛋白N’-端区域的第一和第二个蛋白质且催化在其自身C’-末端的自我蛋白酶解。Nia蛋白酶负责顺式和反式蛋白酶解剩下的病毒多蛋白(Carrington等，1988；Riechmann等，1992)。
理论上，马铃薯Y病毒组是有希望的表达载体，因为其基因表达的蛋白酶解加工策略需要与所有病毒蛋白以等摩尔量产生作为病毒多蛋白一部分合成的外源蛋白(Riechmann等，1992；Revers等，1999)。另外，考虑到病毒颗粒的螺旋型形态，期望对于相当大型的基因组插入没有包装限制(Dolja等，1992；Scholthof等，1996)。在烟草蚀刻病毒(TEV)(DoLja等，1992)，李子痘病毒(PPV)(Guo等，1998)，莴苣花叶病毒(LMV)(Choi等，2000；German-Retana等，2000)中已经证实了马铃薯Y病毒组表达外源基因。在这些研究中，外源基因在P1和HC-Pro基因之间插入，且作为与HC-Pro基因N-末端的插入融合体表达。作为选择，通过在外源基因序列的末端加入合适的蛋白酶解位点建立了非融合型外源基因表达(Dolja等，1997；Guo等，1998；Choi等，2000；Masuta等，2000)。然而，在这些现有技术的研究中，由于迅速剔除外源序列的RNA重组事件导致构建体的遗传不稳定性限制了实用性(Dolja等，1993；Guo等，1998；Choi等，2000)。这似乎是该系统的严重内在缺陷。
最近，Masuta等证实了在豆类中通过三叶草黄色叶脉病毒表达的外源基因在遗传上是稳定的(Masuta等，2000)。然而，正如Masuta所承认的，“…CIYVV载体的目前形式是它保留了其诱导宿主植物的致死性枯斑的能力”。该缺陷实际上提供了对于在可食豆类作物中商业生产蛋白质Masuta的教导无用。这一问题是至今产生的现有技术的马铃薯Y病毒组载体的典型问题。
由于其治疗性能，干扰素作为治疗许多医疗状况的药物具有相当大潜力。干扰素是天然存在的具有免疫调节和抗病毒特性的蛋白质，作为药品它在培养的人细胞或大肠杆菌中生产(见Walter等，1998的综述)。干扰素-α或干扰素-β都是I型干扰素。I型干扰素是一大类天然存在的细胞因子，它包括IFN-α，加上IFN-β和IFN-ω的超过16个亚类。I型干扰素与单个细胞表面受体结合，且刺激复杂连续的信号转导事件，最终导致抗病毒，抗增生和其它免疫调节效应，细胞因子诱导，和HLA I型和II型调节(Pestka等，Annu.Rev.Biochem.，1987 56727)。α-干扰素广泛用于治疗各种血液恶性肿瘤，包括毛细胞白血病，慢性骨髓白血病，低级淋巴瘤，皮肤T-细胞淋巴瘤，和实体肿瘤，例如肾细胞癌，黑素瘤，类癌肿瘤和AIDS-相关性卡波西肉瘤(Gutterman，J.U.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994 911198-1205)。抗肿瘤效应通常在经肠胃外注射给药干扰素α的高剂量水平，常常是千万单位的级别时可见。干扰素-β批准临床用于治疗复发-减轻型多发性硬化和慢性病毒性乙肝和丙肝。
商品干扰素α 2a(Roferon-A；见http//www.rocheusa.com/products/roferon)声称在患有慢性丙肝的病人中正常化血清ALT，改进肝脏组织学并降低病毒负荷。该产品还指出可用于在18岁以上的病人中治疗慢性丙肝，毛细胞白血病和AIDS-相关性卡波西肉瘤。另外，它指出用于接受最小预治疗的慢性情况，费城染色体阳性慢性骨髓白血病(CML)的病人(诊断1年内)。尽管厂商的声明可用于建立对干扰素α的需要，但是他们没有提供生产干扰素的方法，也没有提供无需昂贵和复杂的药品纯化就能安全送递IFN的方法。
尽管包括静脉内，皮下，肌肉内，局部，和病灶内注射的许多给药途经通常用于I型干扰素的给药，但是一般没有使用口服途经，因为干扰素是认为会被蛋白水解酶灭活的蛋白质。
普遍认为为了获得最大治疗效果，应使用最高可能剂量的干扰素。尽管重组材料的有效性意味着极高的剂量水平是可行的，但是在实际中发现干扰素给药的副作用严重限制了可使用的干扰素剂量和治疗持续时间。这些副作用包括严重不适和抑郁，在某些病例中甚至导致自杀。最近Hoofnagle在新英格兰医学杂志中的评论总结了这些问题(Hoofnagle，J.H.，和Lau，D.，New Eng.J.Medicine 1996，334，1470-1471)。在患有慢性乙肝的病人中对干扰素α治疗效果的中间分析(Meta-analysis)表明每天用5百万国际单位(IU)或者每周三次1千万IU治疗3到6个月的典型慢性乙肝病人有25％到40％的缓解率。然而，这些结果达不到治愈，因为大多数病人保持肝炎表面抗原阳性且当通过聚合酶链式反应检测时含有病毒DNA。而且，这些干扰素剂量难以耐受，由于无法忍受的副作用10％到40％的病人需要减小剂量。然而，以每天1百万IU的耐受良好的剂量时，缓解率仅17％(Perrillo等，New Eng.J.Medicine，1990，323，295-301)。慢性丙肝病人证实有长期的改善与HCV RNA的丢失相关，它在只有10到20％的每周以3百万IU三次的剂量治疗6个月的病人中发生(Hoofnagle和Lau，op.cit.)。在癌症病人中，通常仅在最高耐受剂量的干扰素α下可见明显的反应率。因此，例如，在多发性骨髓瘤病人中，每天用20到30百万IU治疗的病人反应率为50％，用3百万IU治疗的病人中仅为15到20％。然而，很少有病人能够耐受超过短期时间的高剂量疗法(Ahre等，Eur.J.Hematol.，1988，41，123-130)。因此，很明显在本领域需要能够施用高剂量干扰素而不诱导严重副作用的方法。
在治疗各种病毒性情况，特别是流感中作为鼻腔喷雾或作为口服液配制品施用低剂量的干扰素的功效已有许多道听途说的报道。以相当高剂量的鼻内干扰素治疗鼻病毒感染的安慰剂对照试验表明治疗是有效的，但是有大量的副作用发生率(Hayden等，J.Infect.Dis.，1983 148914-921；Douglas等，New Engl.J.Med.，1986 31465-80；Hayden等，New Engl.J.Med.，1986 31471-75)。
最近一系列专利说明书描述了使用低剂量的口服给药异源物种来源的干扰素用于治疗牛传染性鼻气管炎(“运输热(shippingfever)”)和猫白血病，还有用于增强疫苗效力；提高食品利用效率和预防牛泰勒式梨浆虫病的其它情况的治疗。分别参见美国专利号4,462,985，澳大利亚专利号608519，澳大利亚专利号583332和美国专利号5,215,741。另外，美国专利号5,017,371公开了以这种方式使用干扰素用于治疗癌症化疗或放疗的副作用。在这些说明书中，使用的干扰素是以Cantell的方法制备的人干扰素-α，在磷酸盐缓冲液中以每磅体重0.01到5IU的剂量给药。尽管这些说明书建议该低剂量的干扰素施用到口咽粘膜，优选以适用于与口腔粘膜长时间接触的形式给药可能对于包括癌症的各种情况的治疗有效，但是对于除了运输热，猫白血病，犬细小病毒和泰勒式梨浆虫病外的情况的实验证据大多是道听途说。具体地说，没有提供该治疗在人类癌症的任何动物模型中的适当对照试验。
对于通过口腔或口咽粘膜施用极低剂量干扰素的效果的最近研究已有综述(Bocci，Clin.Pharmacokinet.，1991 21411-417；Critic.Rev.Therap.Drug Carrier Systems，1992 991-133；Cummins和Georgiades，Archivum Immun.Therap.Exp.，1993 41169-172)。已有建议这一类型的治疗对于HIV感染的治疗特别有用且至少可以提高AIDS患者的生活质量(Kaiser等，AIDS，1992 6563-569；Koech等，Mol.Biol.Ther.，1990 291-95)。然而，其它报道表明该治疗没有提供临床益处。使用含有低剂量干扰素的口服锭剂治疗乙肝的I期研究也有报道(Zielinska等，Archiv.Immunol.Therap.Exp.，1993 41241-252)。
Tovey的美国专利6,207,145教导了高剂量的干扰素口腔粘膜给药。该专利的教导不包括生产干扰素的方法，也没有从，例如，大肠杆菌培养物中纯化干扰素的方法。
一系列美国专利申请(5,817307；5,824,300；5,830,456；5,846,526；5,882,640；5,910,304和6,036,949)涉及口服施用干扰素的各种用途。美国专利5,817,307的教导局限于干扰素的唾液可溶性固体剂型。美国专利5,824,300；5,830,456；5,846,526和5,882,640的教导有相似的局限。这是因为现有技术教导了哺乳动物消化道中的环境引起干扰素失活。因此，这些专利教导了对抗干扰素在消化道中的送递，例如，作为在植物细胞纤维素壁内含有干扰素的唾液不溶性植物细胞。美国专利5,910,304的教导要求施用溶液中的干扰素。美国专利6,036,949的教导要求干扰素以“药用上可接受的”固体或液体形式给药。同样教导了唾液可溶性。这些专利中没有一篇教导施用无需纯化药物且无需以约束方式“配制”它的干扰素。因此，所有这些教导都需要昂贵的工业生产方法，与本文声明的本发明截然相反。
目前的生产技术不适合于满足治疗这些流行病对干扰素的要求。另外，从培养的细胞中纯化干扰素使得干扰素治疗的花费较高。而且，大量目前可得到的商品可用干扰素是注射剂型。Carrington等的美国专利5,766,885教导了用于表达外源基因的马铃薯Y病毒组载体。Carrington具体教导了“一种在植物或植物细胞中表达至少一种蛋白质的方法，所述的方法包括用所述的马铃薯Y病毒组感染对产生多蛋白的马铃薯Y病毒组易感的植物或植物细胞，表达所述的马铃薯Y病毒组以产生所述的多蛋白，其中所述的马铃薯Y病毒组编码至少一个对于马铃薯Y病毒组为非天然的蛋白质，且其中所述的非天然蛋白质通过蛋白酶解加工从所述的多蛋白中释放”。然而，这些教导没有包含这样的暗示或者建议，即该非天然蛋白质可以是口服生物有效的。
另外，Carrington的教导包括假定生产胰岛素，hGH，白介素，EPO，G-CSF，GM-CSF，hPG-CSF，M-CSF，因子VIII，因子IX，和tPA，尽管在其说明书中没有提供能够实施的支持。由于这些化合物的潜在生物学活性，从Carrington使用的报道基因的实施例根本不清楚在植物中生产药物是否可行。Carrington自己(实施例3)限定其对胰岛素生产的要求为“预期”。该教导构成了发明人承认在申请日时尚未掌握。
目前在开发口服施用干扰素的其它用途上有很大的兴趣(Bocci1999；Cummins等，1999；Fleischmann等，1999；Ship等，1999和Tompkins，1999)。这一兴趣增强了公开的本发明在提供生产和供应口服生物学有效的干扰素的有效方法中的重要性。
因此对于给受试者提供补充干扰素和其它口服生物学有效的蛋白质而避免上述限制的系统和方法存在公认的需求且极为有利。
发明概述根据本发明的一个方面，提供了给受试者提供补充干扰素的一个系统。该系统包括(a)病毒载体，该载体设计并构建成能够感染植物并在其中表达干扰素基因的至少一部分，和(b)植物，该植物的至少一部分是受试者可食用的。干扰素基因的至少一部分的基因产物对于消费所述植物的至少一部分的受试者是生物学有效的。
根据本发明的另一方面，提供了给受试者提供补充干扰素的一个系统。该系统包括(a)设计并构建成能够在植物中表达干扰素基因的至少一部分的DNA序列；和(b)植物，该植物的至少一部分是受试者可食用的且该植物对于该DNA序列的转化易感。干扰素基因的至少一部分的基因产物对于消费所述植物的至少一部分的受试者是生物学有效的。
根据本发明的另一方面，提供了一种给受试者供应补充干扰素的方法。该方法包括步骤(a)引发植物在其至少一些细胞中表达干扰素基因的至少一部分；和(b)给受试者食用该植物的至少一部分。
根据本发明的另一方面，提供了给受试者供应口服生物学有效的蛋白质的方法。该方法包括步骤(a)引发植物在其至少一些细胞中表达口服生物学有效的蛋白质的至少一部分；和(b)给受试者食用该植物的至少一部分。
根据下面所述的本发明的优选实施方案中的另一特征，该病毒载体是马铃薯Y病毒组载体。
根据所述优选实施方案中的另一特征，该马铃薯Y病毒组是绿皮密生西葫芦黄色花叶病毒(ZYMV)。
根据所述优选实施方案中的另一特征，ZYMV是一种含有SEQ IDNOs.7和8中所列突变的减毒株。
根据所述优选实施方案中的另一特征，干扰素基因的至少一部分包含哺乳动物干扰素基因序列。
根据所述优选实施方案中的另一特征，该哺乳动物干扰素基因序列包含人干扰素基因序列的至少一部分。
根据所述优选实施方案中的另一特征，人干扰素基因序列是选自由干扰素α 2a(SEQ ID NO.1)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一基因组成的组。FASTA程序家族(FastA，TFastA，FastX，TFastX，和SSearch)由弗吉尼亚大学生化系教授WilliamPearson编写(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85；2444-2448(1988))。在与Pearson博士的合作中，Mary Schultz和Irv Edelman将该程序修改并以GCG分布Version 6.1存档，Sue 0lson以Versions 8到10存档。本文使用的“以FastA程序分析”表示使用通常指定的该程序的默认参数进行的分析。
根据所述优选实施方案中的另一特征，该载体表达选自由干扰素α 2a基因产物(SEQ ID NO.2)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
根据所述优选实施方案中的另一特征，病毒载体从该植物向第二植物中的传染性被病毒载体中的一个突变阻止。
根据所述优选实施方案中的另一特征，该系统还包括将DNA序列导入植物的至少一个细胞，从而转化该细胞的方法。
根据所述优选实施方案中的另一特征，该DNA序列包含土壤杆菌T-DNA左侧边界和右侧边界。
根据所述优选实施方案中的另一特征，引发步骤由选自如下的行为来完成(i)用病毒载体感染该植物的至少一个细胞，该病毒载体设计并构建成能够在其中表达干扰素基因的至少一部分；和(ii)用设计并构建成能够在其中表达干扰素基因的至少一部分的DNA序列转化该植物的至少一个细胞。
根据所述优选实施方案中的另一特征，引发步骤由选自如下的行为来完成(i)用病毒载体感染该植物的至少一个细胞，该病毒载体设计并构建成能够在其中表达编码口服生物学有效的蛋白质的基因的至少一部分；和(ii)用设计并构建成能够在其中表达编码口服生物学有效的蛋白质的基因的至少一部分的DNA序列转化该植物的至少一个细胞。
根据所述优选实施方案中的另一特征，人干扰素基因序列选自由干扰素β(SEQ ID NO.11)，干扰素γ(SEQ ID NO.13)和以FastA程序分析与两干扰素基因之一有至少85％同源性的任一基因组成的组中。
根据所述优选实施方案中的另一特征，该载体表达选自由干扰素β基因产物(SEQ ID NO.12)，干扰素γ基因产物(SEQ ID NO.14)和以FastA程序分析与两干扰素基因产物之一有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
本发明通过提供给受试者供应补充干扰素，或其它口服生物学有效的蛋白质的系统和方法成功克服了目前已知配置的缺点。
附图简要描述本文参照附图和照片仅仅以举例的方式描述了本发明。现在具体参照详细附图，强调了所示的细节是以举例的方式且仅仅用于对本发明的优选实施方案的解说性讨论的目的，且由于相信它们是最有用的和容易理解的对本发明的原理和概念方面的描述而被提供。在这点上，没有打算显示比对本发明的基本理解所需更详细的本发明的结构细节，用附图进行的描述使得在实践中如何实施本发明的一些形式对本领域的技术人员是显而易见的。
图1A和B描绘了与根据本发明的系统结合使用的病毒载体；图2A和B借助于免疫印迹和直方图显示了重组AGII在植物中的稳定性和累积；图3A-D借助于照片，直方图和RT PCR分析显示了AGII-干扰素α-2a(AGII-IFN)不影响黄瓜发育或产量，且在植物中稳定；图4A-C借助于直方图和免疫印迹显示了在南瓜和黄瓜叶片中AGII-IFN-介导的IFN合成；图5A-D以直方图显示了在南瓜和黄瓜果实和果实局部中AGII-IFN介导的IFN合成；和图6A-H显示了外源蛋白通过AGII载体在各植物部分中的表达。
优洗实施方案的描述本发明涉及给受试者提供补充干扰素的系统和方法。具体地说，本发明可用于作为可食植物的一部分，例如诸如黄瓜，南瓜或甜瓜的葫芦果实通过口腔送递干扰素。本发明还涉及给受试者提供口服生物学有效的蛋白质的一般方法。
根据本发明提供补充干扰素(和其它口服生物学有效的蛋白质)的系统和方法的原理和操作参照附图和所附说明更好理解。
在详细解释本发明的至少一种实施方案前，应理解本发明在其应用中不限于下文描述中提出的或附图中显示的成分的构建和排列细节。本发明可以是其它实施方案或者以各种方式被实施或实现。另外，应明白本文采用的措辞和术语是用于描述的目的而不应认为是限制。
本发明部分体现在一种用于给受试者提供补充干扰素的系统。现在参照附图，图1A和B显示了用作根据本发明的系统的一部分的病毒载体。具体地说，显示了IFN基因插入其基因组的ZYMV的AGII株。图1A是AGII基因组的示意图。显示了AGII非编码区(划上阴影)，和包括插入的外源基因(FG)的编码区(空心框)。箭头表示参与外源基因产物蛋白酶解的NIa蛋白酶。NIa裂解位点以/表示。显示了用于亚克隆的限制性酶位点。插入指定限制性核酸内切酶识别位点的核苷酸以产生多接头且其编码的氨基酸残基在图1B中以黑体字表示。干扰素基因的插入发生在NIb和CP基因之间。氨基酸序列以斜体字表示。
该系统的病毒载体设计并构建成能够感染植物，在其中表达干扰素基因的至少一部分。因此，干扰素基因的至少一部分的基因产物对于消费所述植物的至少一部分的受试者是生物学有效的。送递可使用例如，本领域的普通技术人员通常所称的“基因枪”实现。优选的是，病毒载体是马铃薯Y病毒组载体，更优选的是马铃薯Y病毒组是绿皮密生西葫芦黄色花叶病毒(ZYMV)，更优选的是ZYMV是减毒株，例如含有SEQ ID NOs.7和8所列突变的减毒株，ZYMV-AGII改造的减毒株。
干扰素基因的至少一部分可包括哺乳动物干扰素基因序列或天然存在的干扰素基因组合产生的重组干扰素基因。哺乳动物干扰素基因序列可包括，例如，包括但不限于干扰素α 2a(SEQ ID NO.1)的人干扰素基因序列的至少一部分。作为选择，或者另外，哺乳动物干扰素基因可包括以FastA程序分析与干扰素2α基因具有至少85％同源性的基因的至少一部分。
作为选择，或者另外，人干扰素基因序列可以是干扰素β，例如SEQ ID NO.11或者干扰素γ，例如SEQ ID NO.13或者以FastA程序分析与这些干扰素基因的任一种具有至少85％同源性的任一基因。
作为选择，或者另外，该载体可表达干扰素β基因产物，例如，SEQ ID NO.12，或干扰素γ基因产物，例如，SEQ ID NO.14或者以FastA程序分析与这些干扰素基因产物的任一种具有至少85％同源性的任一蛋白质的至少一部分。
一旦将它送递到植物，该载体表达蛋白质的至少一部分，该蛋白质包括，但不限于，干扰素α 2a基因产物(SEQ ID NO.2)或以FastA程序分析与其具有至少85％同源性的任一蛋白质。例如，FastA可作为BLAST或GCG程序包的部分被执行。BLAST和FastA是由国家卫生研究所的国家医学实验室NCBI提供的服务。两者都可从国际互联网获得，分子生物学领域的普通技术人员对于其进入和使用都是熟悉的。
由于环境因素，优选该病毒载体从该植物向第二植物的传染性被其中的突变所阻止。
本发明的系统还包括该植物，其至少一部分可被受试者食用。
本发明还体现在一种给受试者提供补充干扰素的系统，该系统包括设计并构建成能够在植物中表达干扰素基因的至少一部分的DNA序列。干扰素基因如上文所述。该系统还包括该植物，其至少一部分可被受试者食用。根据该系统，该植物对于该DNA序列的转化易感。优选的是，该系统还包括将该DNA序列导入植物的至少一个细胞，从而转化该细胞的方法。这些方法可包括，例如，通常称为永久或瞬时“土壤杆菌介导的转化”的方法或者使用植物转化领域的普通技术人员通常称为“基因枪”的方法。
另外，该DNA序列本身可包含设计成有利于植物细胞遗传转化的部分序列。这些部分序列可包括，例如土壤杆菌T质粒的左侧边界和右侧边界。
本发明还体现在给受试者提供补充干扰素的方法。该方法包括引发植物在其至少一些细胞中表达干扰素基因的至少一部分的步骤。为了本说明书和所附权利要求书的目的，短语“其至少一些细胞”是指在植物，其种子，和从其产生的组织培养细胞中发现的细胞。该方法还包括给受试者食用该植物的至少一部分的步骤。该干扰素如上文所述。可预料到该引发步骤可通过各种方式实现。
例如，“引发”可包括用病毒载体感染植物的至少一个细胞。在这种情况下，病毒载体设计并构建成能够在感染细胞内表达干扰素基因的至少一部分。优选的是载体设计并构建成引发病毒体的装配，该病毒体感染相邻细胞。更优选的是，送递给植物的单个细胞导致植物的系统感染。
作为选择，“引发”可包括用设计并构建成能够在其中表达干扰素基因的至少一部分的DNA序列转化该植物的至少一个细胞。该转化可以是体细胞转化或生殖细胞系转化。
本发明还体现在一种给受试者提供口服生物学有效的蛋白质的方法。该方法包括引发植物在其至少一些细胞中表达口服生物学有效的蛋白质的至少一部分的步骤。该方法还包括给受试者食用该植物的至少一部分的步骤。该引发步骤可用各种方式实现，正如上文对作为口服生物学有效的蛋白质例子的干扰素所述。
本文公开的方法表现出相对于现有技术的显著进步，因为它们不需从该植物中纯化干扰素或其它口服生物学有效的蛋白质。
在本说明书和所附权利要求书中所用的短语“食用该植物的至少一部分”应以其尽可能最宽的含义来解释。食用可包括，例如，给予新鲜的植物部分，干植物部分，冻干植物部分，研磨的植物部分，粉碎的植物部分，从植物部分提取的汁液，防腐(例如，盐渍或凝胶化)的植物部分或经受包括这些加工之一的任何组合加工的植物部分。
本发明的其它目的，优势，和新特征在审查下面实施例时对本领域的普通技术人员将是显而易见的，这些实施例并非打算用作限制。另外，上文所述的和下面权利要求书部分所要求的本发明的各种实施方案和方面中的每一种在下面实施例中均能得到实验支持。
在下文实施例部分详细描述的结果提供了AGII在可食葫芦果实和叶片中可介导有生物学活性的干扰素-α 2a合成的证据。具体地说，在黄瓜和南瓜叶片中测量到最高活性的干扰素-α 2a(430,000IU/gFW)。该活性类似于当CaMV用作DNA病毒载体时在芜菁中获得的干扰素2δ活性(De Zoeten等，1989)，且相当于大约2μg/gFW的活性蛋白。
由于AGII病毒是不致病的，AGII-干扰素α 2a(AGII-IFN)感染的黄瓜植物产生的果实量和品质比得上无病毒植物的果实(图3A)。与在果实中GFP的表达一致，在南瓜和黄瓜中测量的IFN-2a活性主要集中在果实的胚胎组织。果实中AGII-IFN病毒体的累积是病毒复制和传播介导的外源基因表达的结果。
黄瓜叶片中IFN-2a的活性随叶片发育阶段而变化。在称量超过10g的充分伸展的叶片中，IFN-2a活性下降而病毒累积保持稳定。这种AGII-IFN病毒体累积与外源基因表达水平之间不相关可能是由于在成熟组织中病毒复制减少，以及与病毒体的稳定性相比干扰素α-2a的周转率相对较高。在AGII表达系统中在IFN-2a的羧基末端添加7个氨基酸不影响其活性，这证实了Petska的早期观察结果，即在干扰素末端添加氨基酸残基不影响其活性(Pestka等，1987)。值得注意的是冻干植物组织时不损失IFN活性。
由于最近显示口服给药的干扰素是一种在动物(Marcus等，1999)和人类(Cummins等，1999)中有效的药物，在葫芦果实中表达的干扰素可口服给药以治疗患者。
总之，本发明证实了使用马铃薯Y病毒组，例如ZYMV的改造减毒AGII株作为葫芦中的表达载体的可行性。
因此，参照现有技术，本发明的主要优势在于该公开的发明通过排除纯化要求使得干扰素的生产成本显著减小。尽管在某些情况下可食植物部分可能经受诸如研磨和干燥的简单加工以产生，例如，冻干的果实粉末，但是本发明最简单的实施方案包括给受试者食用新鲜产品。事实上，将植物分配给患者在本发明所要求保护的范围内。因此，根据其最简单的实施方案，本发明不仅消除了纯化成本，而且也极大地减小了分配，贮存，运输和包装成本。
另外，本发明的系统和方法可用于大幅度消除干扰素制备中关于有毒污染的忧虑。防止该事实是由于干扰素不在细菌中制备，因此不可能在生产过程中导入细菌毒素。同样，在生产过程中没有导入人类病原体的危险，因为没有使用人细胞培养物。因此，本发明的实施也消除了关于残留抗生素，人工防腐剂和细胞培养添加剂的忧虑。
本发明具有现有技术中口服给药方法的所有内在优势，包括给药轻松和舒适。这些因素使得自己用药对于患者更易于接受。另外，植物细胞壁可在体内提供缓释效果(Walmsley和Arntzen，2000)，可能使得本发明更适合于用于某些临床应用，例如丙肝。植物细胞壁使得本发明具有“唾液不溶性”，从而区别于现有技术。据信本发明的干扰素防止消化系统中的蛋白酶活性。因此，干扰素对于随后的肠壁吸收有效，即一般被现有技术的教导所排除的一种可能性。
另外，冻干的植物材料在室温下应是稳定的，不会降解其中所含的干扰素。这便于打断运输和贮存的“冷链”，进一步减小送递干扰素每个单位的最终成本。另外，这种不需冷藏的分配能力使得本发明的实施在世界的不发达地区更为可行。这一因素在，例如HCV和HIV的治疗中是决定性的。
已证实现有技术中在植物病毒系统中表达的许多蛋白质是不稳定的。相反，已经证实干扰素α-2a异常稳定。
本发明提供了相对于已知植物生物反应器系统的一些另外的优势。由于该载体对于宿主植物是良性的，因此产量较好。不被天然蚜虫载体传播容易实现。该外源基因由于没有掺入植物生殖细胞系中，因此不会在感染植物的种子或花粉中传播。另外，由于筛选和繁殖的需要，转基因植物需要较长的开发时间。而本发明不受这一限制。另外，本发明不需要送递病毒RNA，作为代替依赖于送递cDNA载体。这便于显著减少意外送递给植物的机会，因为cDNA表达载体不是传染性病毒。
实施例现在提供下列实施例，它与上面的描述一起以非限制性方式举例说明本发明。
一般来说，本文使用的命名法和本发明利用的实验室操作包括分子，生物化学，微生物学和重组DNA技术。该技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，“分子克隆实验室手册”，Sambrook等，(1989)；“现代分子生物学方法”，第I-III卷，Ausubel，R.M.，编(1994)；Ausubel等，“现代分子生物学方法”，John Wiley和Sons，马里兰州巴尔的摩(1989)；Perbal，“分子克隆实用指南”，John Wiley & Sons，纽约(1988)；Watson等，“重组DNA”，美国科学书籍，纽约；Birren等(编)，“基因组分析实验室手册系列”，第1-4卷，纽约冷泉港实验室出版(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中提出的方法；“细胞生物学实验室手册”，第I-III卷，Cellis，J.E.编(1994)；Freshney，Wiley-Liss的“动物细胞培养-基础技术手册”，纽约(1994)，第三版；“现代免疫学方法”，第I-III卷，Coligan J.E.编(1994)；Sites等(编)，“基础和临床免疫学”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，“细胞免疫学精选方法”，W.H.Freeman和Co.，纽约(1980)；可用的免疫测定法在专利和科技文献中被广泛描述，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“寡核苷酸合成”，Gait，M.J.编(1984)；“核酸杂交”，Hames，B.D.和Higgins S.J.编(1985)；“转录和翻译”，Hames，B.D.和Higgins S.J.编(1984)；“动物细胞培养”，Freshney，R.I.编(1986)；“固定化细胞和酶”，IRL出版社(1986)；“分子克隆实用指南”，Perbal，B.，(1984)和“酶学方法”，第1-317卷，学院出版社；“PCR方法方法和应用指南”，学院出版社，圣地亚哥，CA(1990)；Marshak等，“蛋白质纯化和鉴定策略-实验室教程手册”，CSHL出版社(1996)；“使用抗体实验室手册”(EdHarlow，David Lane编，冷泉港实验室出版(1999))，引用所有这些文献以供参考，如同本文充分描述一样。其它一般参考文献在本文件的各处提供。其中的方法相信是本领域熟知的且为方便读者而提供。其中所包含的所有信息在本文中引用以供参考。
另外，在下文提供的实施例中描述的实验操作中采用如下方法蚜虫不可传播型AG的构建在两个步骤中导入蚜虫不可传播型突变。首先，通过用部分克隆pKS？sacI22(7515-9591)作模板，对AG(Gal-On，2000)定点诱变，在NIb基因内的NIa蛋白酶基序(DTVMLQ)中的Leu和Glu(LQ)编码序列之间导入一个PstI位点。所得的突变克隆命名为pKS？SacI-PstI。然后通过用含有核苷酸替换(黑体字)的合适有义寡核苷酸5’ATGCTGCAGTCAGGCACTCAGCCAACTGTGGCAGATACTGGAGCT-3’对作为模板的pKS？SacI-PstI进行PCR导入将外壳蛋白(CP)残基Ala9改变成Thr的核苷酸替换。然后将突变的pKS？SacI-PstI SacI-MluI片断导入AG的SacI-MluI位点以产生AGI。
NIb和CP之间的基因插入序列盒的构建通过用寡核苷酸5’CAGCTGCAGAGTACTAGTGCTAGCGTCGACACTGTGATGCTCCAA-3’在用作模板的pKS？SacI-PstI上进行PCR克隆含有限制性位点(PstI，ScaI，SpeI，NheI和SalI)且带有NIa蛋白酶序列(黑体字)的多接头。用PstI和XbaI(位置9461)消化PCR产物并导入pKS？SacI-PstI克隆内的合适位点上以产生pKS？SacI-PstI-poly。然后将pKS？SacI-PstI-poly的SacI-MluI片断导入AGI的Sacl-Mul位点以产生AGII。
水母绿色荧光蛋白(GFP)，uidA(β-葡萄糖醛酸酶；GUS)基因插入AGII基因组使用两者侧翼均为PstI位点的有义和反义寡核苷酸(SEQ IDNos.；17和18)通过PCR扩增GFP的编码区(SEQ ID NO.15)。用PstI消化该扩增片断并克隆进部分克隆pKSΔSacI-PstI-poly中。除了反义引物含有侧翼SalI位点代替PstI外，使用有义和反义寡核苷酸(SEQ ID Nos.；19和20)对uidA(SEQ ID NO.16)使用相似的克隆策略。然后用PstI和SalI消化扩增的PCR片断并克隆进pKSΔSacI-PstI-poly中。对于所有基因，用SacI/MluI双重消化pKSΔSacI-PstI-poly克隆，将所得的含有外源基因的片断克隆进AGII基因组以产生AGII-GFP和AGII-GUS。
将人干扰素-α 2a(IFN-2a)基因插入AGII基因组使用两者侧翼均为SalI位点的有义和反义寡核苷酸(SEQ IDNos.3和4)通过PCR扩增IFN(SEQ ID NO.1)和CMV-CP的编码区。用SalI消化该扩增片断并克隆进部分克隆pKS？SacI-SalI-poly中。然后用SalI消化扩增的PCR片断并克隆进pKS？SacI-SalI-poly中。
对于所有基因，用SacI/MluI双重消化pKS？SacI-SalI-poly克隆，将所得的含有IFN基因的片断克隆进AGII基因组以产生AGII-IFN。
植物生长，接种和症状评估南瓜(Cucurbita pepo L.cv.Ma’ayan)和黄瓜(Cucumis sativusL.cv.Delila和cv.Muhasan)植物的商业品种在23℃连续光照下在生长室中生长。至于工业条件下的试验，植物在带有自动灌溉和施肥的20-l桶中在有防虫网的房间内生长。当子叶完全伸展时选择幼苗用于实验用途。粒子轰击接种用带有包含在花椰菜花叶病毒35S启动子(Gal-On等，1997)控制下的病毒cDNA的质粒的手握装置，手枪进行。由于AGII病毒在其它葫芦科植物中是无症状的，仅在南瓜中可观察到轻微的病毒症状，因此，选择它试验各种病毒构建体的传染性。轰击或机械接种后，生长南瓜幼苗且每天检查症状发展，记录症状的第一表象。
重组病毒后代的RT-PCR分析病毒后代的RT-PCR用从Sellner等(1992)改良的一管单步法进行。使用的50微升体积含有多接头侧翼引物5’-AGCTCCATACATAGCTGAGACA-3’和5’-TGGTTGAACCAAGAGGCGAA-3’(SEQ ID NOs.5和6)，该引物在如下混合物中1.5mM MgCl2；125μMdNTPs；1X Sellner缓冲液[10X Sellner缓冲液含有670mMTris-HCl；170mM (NH4)2SO4；10mM β-巯基-乙醇；2mg/ml明胶(Aldrich，小牛皮225中块)；60μM EDTA pH8.0(Sellner等，1992)]；特异性引物各100ng；2单位的Taq聚合酶；5单位的AMV-RT(Chimerex USA)；2-5μg总RNA。RT-PCR循环如下46℃30分钟；94℃2分钟，接着进行33个循环的94℃，60℃和72℃，各30秒，以及最后一个循环的72℃5分钟。
评价病毒滴度的ELISA试验按Antignus等(1989)以前所述用抗-ZYMV CP多克隆抗体对感染的植物材料进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。通过在ELISA平板上核对已知量的纯化AGII病毒体来评估AGII-IFN的数量。
IFN活性测定和免疫印迹分析收集植物组织，在液氮中冷冻并冻干24小时。冻干的组织用研棒和研钵研磨并以1∶1-1.5(干重组织/每单位体积的PBS)的比率在PBS中提取。1毫升的匀浆在Eppendorf minifuge中以10,000g离心10分钟，上清用于ELISA，免疫印迹分析和干扰素活性测定。按以前所述(Rubinstein等，1981)通过抑制疱疹性口腔炎病毒对人Wish(ATCC CCL-25)细胞的细胞病变影响在96孔微量滴定板中测定IFN活性。在每个平板中包含IFN的校准标准。IFN活性以每毫升的国际单位数(IU/ml)表示，2×108IU相当于1mg IFN。对于免疫印迹(ECL，Amersham-Pharmacia Biotech，UK)，将提取物在15％SDS-PAGE上分离并用以1∶1000稀释的抗-IFN多克隆抗体进行免疫印迹。
试验施用治疗剂对小鼠模型中的结肠炎的影响已建立的小鼠结肠炎模型(Gotsman等，2001)用于评估口腔施用来自根据本发明制备的可食植物部分的IFN的效果。
用于口服给药的含有干扰素的植物部分的制备南瓜植物(cv.Guliver)在幼苗阶段(发芽4天后)用ZYMV-AGII-IFN cDNA接种。感染两周后用特异性抗-ZYMV抗体通过DAS-ELISA测定各植物证实感染。感染3周后通过标准干扰素α测定法检测各植物的干扰素α的生物学活性。种植38天后从AGII-IFN感染的植物和作为阴性对照的AGII感染的植物收集果实。仔细清洗采摘的果实，切片，冻干，并研磨成均匀的粉末。然后用磷酸盐缓冲液以1/7.6(w/v)的比例提取粉末，收集可溶部分并检测其干扰素α的生物学活性。获得了120,000IU/ml干扰素α的活性。对于阴性对照果实实施相同的方法。所有干扰素测定采用国家卫生研究所的干扰素α作为活性标准。
小鼠实验组试验了5组小鼠(n＝10)。B，C，和D组小鼠每天口服接受从表达人干扰素α 2a(1.875×106IFN IU/kg/剂)的南瓜果实制备的提取物或阴性对照南瓜(0 IFN IU/kg/剂)果实提取物共14天。
结肠炎的临床评估和结肠炎的目视等级试验期间每天跟踪小鼠的腹泻。结肠炎诱导10天后使用标准参数进行结肠炎评估。即，处死小鼠并取出结肠。记录出现损伤的总结肠壁百分数和结肠重量。另外，评估结肠溃疡程度；肠与腹膜的粘连；壁厚；和粘膜水肿程度(Ilan等，2000)。各参数由两个有经验的检验员盲目地分级成从0(完全正常)到4(最严重)的等级。
组织学损伤分级对于炎症的组织学评估，取出末梢结肠组织(最后10cm)并在10％甲醛中固定。然后按照标准技术用苏木精-曙红染色每只小鼠的5张石蜡切片。对结肠显微横切面上的炎症程度从0到4进行半定量分级(Ilan等，2000)(0级无炎症迹象的正常情况；1级极低水平的白细胞浸润；2级低水平的白细胞浸润；3级具有高血管密度的高水平浸润，肠壁增厚；和4级杯状细胞丢失的透壁浸润，高血管密度，肠壁增厚，且正常的肠结构破坏)。分级由两个有经验的病理学家盲目地进行。
细胞因子使用Genzyme诊断试剂盒(Genzyme Diagnostics，Boston，MA，USA)按照厂商说明书通过对IL4，IL10，IL12，和IFNγ的ELISA在血清中测量细胞因子。开始口服给药14天后在所有组的所有小鼠中测量血清水平。
实施例1将AG改造成蚜虫不传播型病毒与其它马铃薯Y病毒组一样，ZYMV由蚜虫以非持久性方式自然传播(Desbiez和Lecoq，1997)。已表明CP Asp8Ala9Gly10(DAG)基序与蚜虫传播ZYMV相关，丙氨酸突变成苏氨酸可消除蚜虫传播ZYMV(Gal-On等，1992)。进行定点诱变将AG CP的DAC基序中Ala9残基转换成Thr(SEQ ID NOs.9和10)，所得的突变体病毒命名为AGI。将AGI cDNA接种进南瓜植物产生与AG引起的感染不可区分的感染。通过RT-PCR和测序证实了AGI后代病毒中Ala变更成Thr。蚜虫传播试验(Antignus等，1989)证实了AGI不能由蚜虫传播，且该特征在长期的增殖和一些植物到植物的机械传代中保持稳定。基于这些令人鼓舞的结果，AGI成为了上文详细描述的进一步操作的基础且在实施例2中使用。
实施例2在包括可食水果的各种葫芦组织中通过AGII载体表达报道基因为了研究AGII传播和定位在不同器官中表达的外源基因，将细菌uidA和水母GFP基因插入NIb-CP位点(图1B)。用相应于AGII-GFP和AGII-GUS的重组cDNA经粒子轰击接种的南瓜植物基本上100％被感染。感染后5-7天在AGII-GFP感染的南瓜中出现典型脉露病和轻微的花叶症状。对于AGII-GUS，观察到症状的出现延迟4天。
为了跟踪通过AGII病毒载体表达的外源基因的定位，用AGII-GUS和AGII-GFP分别接种南瓜和黄瓜幼苗。AGII-GUS-感染的南瓜在感染后15天分析GUS活性，且观察叶片，茎和根中的GUS染色(图6A-D)。在感染的叶片中GUS染色的分布不均匀，且染色集中在主脉和邻近细胞簇周围(图6A)。茎显示出均匀染色，集中在脉管组织周围(图6B-C)。感兴趣的是，在不定根(图6C)和侧生根(图6D)中检测到强GUS染色。通过在紫外光下观察分析AGII-GFP感染的黄瓜的GFP。在AGII-GFP感染的叶片，茎，花和果实中观察到绿色荧光(图6E，F-右侧，G，H-左侧)，表明在这些器官中表达GFP。在用AGII感染的同等发育的器官中没有观察到相似的荧光(图6F-左侧，6H-右侧)；在叶片(图6E)和雄花(图6G)中可见不均匀的荧光。在果实中，荧光主要位于胚胎组织且在果皮层或中果皮中程度较低(图6H-左侧)。
这些结果表明根据本发明的植物中表达的外源基因在包括果实的各种植物组织中表达。
实施例3在葫芦中通过AGII表达有生物学活性的人干扰素-α 2a为了定量外源基因在宿主植物器官中的表达，且为了证实AGII表达载体在葫芦中的生物技术潜力，我们将IFN编码序列插入NIb-CP插入位点(图1A和1B)。将含有AGII-IFN cDNA的质粒接种到南瓜和黄瓜植物上导致完全感染。感染后5-7天内观察到与亲本病毒AGII所产生的症状相似的症状。通过RT-PCR分析在NIb和CP之间含有IFN-2a基因的后代病毒证实AGII基因组内IFN-2a基因的存在。
图2A是后代病毒RNA的RT-PCR分析。感染后14或24天时从AGII-IFN系统感染的叶片提取总RNA，并用侧翼为NIb-CP插入位点的引物进行RT-PCR。对含有AGII-IFN cDNA的质粒(pAGII-IFN)进行PCR作为对照。然后在EtBr琼脂糖凝胶上分析扩增产物(显示了阴性图像)。预期大小(bp)的含有插入基因和侧翼476bp AGII的扩增片断用箭头标记。HindIII-EcoRI消化的λDNA用作分子量标记(M)。
图2B显示了在南瓜植物中累积的AGII-IFN。累积表示为AGII累积百分数(100％)。通过DAS-ELISA测定病毒水平且它是从三株独立的植物取出的三个独立的样品的平均值。所有样品在所示的感染后天数时从发育相当的叶片上收集。
因此，IFN基因在感染后至少24天时在AGII基因组中保持完整(图2A)并累积到与AGII相似的水平(图2B)。另外，在从植物到植物6次连续传代(以3周的间隔)后IFN基因保持稳定。
南瓜(Cucurbita pepo L.cv.Ma’ayan)和单性黄瓜(Cucumissativus L.cv.Muhasan)商业品种的幼苗通过AGII-IFN(8株植物)或AGII(4株植物)的液体接种感染。作为对照，包含了未感染的植物(4株植物)。植物在自动灌溉和施肥条件下在半工业化带网的房间内垂直生长。图3A包括AGII-IFN-感染的和无病毒的植物照片，它们在幼苗接种后45天时拍摄。两者没有明显的区别。植物感染通过DAS-ELISA证实。AGII-IFN感染对植物生长和发育的影响通过监测植物表型和症状表达，和通过估计作物产量来评估。生长期间，用AGII-IFN感染的黄瓜植物正常发育。AGII-IFN植物在其叶片或果实上不显示任何可见症状，且在表型上与无病毒植物无区别(图3A)。感染的南瓜植物也正常发育，仅在其叶片上显示出轻微的弥散花叶症状，但在其果实上无症状(无照片)。通过从接种后3周开始，在1个月期间内收集可销售的黄瓜果实(每个大约60克)测量作物产量。图3B是比较无病毒植物和AGII-及AGII-IFN-感染的植物之间黄瓜产量的直方图。果实(平均大小为60g)在1个月期间内从植物上收集。提供的数据为3或4株独立植物的平均值±SD。在无病毒植物中获得了每株植物大约2kg果实的产量(图3B)，在接种AGII-IFN和AGII的植物中获得了相当的产量(图3B)。
图3C是显示在黄瓜植物中AGII和AGII-IFN病毒累积的直方图。在来自不同植株的4个样品中通过DAS-ELISA测定病毒水平。在感染后45天时从发育相当的叶片收集所有样品。在这些植物的叶片中测量到相似的病毒累积水平(图3C)，证实了病毒感染不影响水果生产。
图3D是后代病毒RNA的RT-PCR分析。总RNA从重组病毒(按所示)感染的植物叶片或从无病毒植物中提取，并用侧翼为IFN插入位点的引物进行RT-PCR。对含有AGII-IFN cDNA的质粒(pAGII-IFN)进行PCR作为对照。含有(995)或不含(476)IFN的预期大小(bp)的片断用箭头标记。HindIII-EcoRI-消化的λDNA用作分子量标记(M)；值得注意的是AGII-IFN内的IFN基因在试验植物(表示为植物号17和20)中即使在接种后2个月以RT-PCR证实仍然保持完整(图3D)。
图4A是在感染后60天时在AGII-IFN-接种的黄瓜叶片中测量的IFN活性的直方图。该值在减去背景活性(AGII-感染的黄瓜的活性)后获得。提供的数据为三次独立测量的平均值±SD。直方图下面提供了试验叶片的发育阶段(重量和离顶端的位置)和AGII-IFN病毒量。n.d.＝未测定。在感染后60天和30天时分别分析上述黄瓜(代表植物17和20)和南瓜植物的感染叶片的IFN活性。在嫩叶(第二叶；图4A)中测量到每克鲜重(gFW)157×103和34×103IU的活性。在老叶(第4-6叶；图4A)中发现更高的IFN活性。然而，在叶片充分伸展后(第8叶)，IFN活性突然降低(图4A)。在茎中测量到21×103IU/gFW的平均活性。
图4B是图4A中试验的样品的免疫印迹分析。使用抗-IFN多克隆抗体分析可溶性蛋白质提取物(70μg)。重组IFN(Rec，4ng)用作凝胶迁移率对照。对分析过干扰素的样品的免疫印迹分析显示出存在与抗-IFN抗体反应的蛋白带。另外，带强度与IFN活性的水平相关，表明该带代表IFN(图4B)。正如预期，该带表现出比重组hIFN-2a略微缓慢的凝胶迁移率，因为IFN序列上添加了8个氨基酸残基(图1B)。
图4C显示了在感染后30天时在接种AGII-IFN的南瓜叶片中测量的IFN活性。该值在减去背景活性(AGII-感染的南瓜的活性)后获得。提供的数据为三次独立测量的平均值±SD。在南瓜中，嫩叶(离顶端第4叶，图4C)中的IFN活性与黄瓜(图4A)相当。在对照植物的叶片中没有发现活性。为了将叶片中的病毒累积与蛋白质表达联系起来，通过定量DAS-ELISA测量试验叶片中AGII CP的量(图4A，直方图下面)。随着叶片的成熟测量到AGII CP的量增加。得到在CP累积与IFN的生物学活性之间不相关。这点在含有最大量AGII CP且表现出最低IFN活性的充分伸展的叶片中尤其显著(图4A)。
图5A和B显示了在感染后60或30天时分别在AGII-IFN接种的黄瓜(图5A)或南瓜(图5B)植物的果实提取物中发现的IFN活性。该值在减去背景活性(AGII-感染的植物的活性)后获得。提供的数据为三次独立测量的平均值±SD。试验的果实发育阶段(重量)和AGII-IFN病毒量在直方图下面提供。n.d.＝未测定。
来自同一黄瓜和南瓜植物的果实中测定的IFN活性(图5A和5B)比同一植物叶片中的活性(图4A和4C)低2到4倍。最高活性均在黄瓜和南瓜两者的最小未成熟果实中发现(图5A和5B)。平均来说，在南瓜果实比在黄瓜中测量的IFN活性高两倍(图5A和5B)。黄瓜果实中AGII CP的累积比叶片中低两个数量级，这与两器官之间的IFN活性差异一致。
图5C和D显示了在感染后60或30天时分别在AGII-IFN接种的黄瓜植物20(图5C)或南瓜(图5D)的果实部分中发现的IFN活性。该值在减去AGII-感染的果实的背景活性后获得。提供的数据为三次独立测量的平均值±SD。
令人感兴趣的是，在黄瓜和南瓜果实部分中的IFN活性分析表明大多数活性位于果实胎座组织和/或胚胎组织(果核)，而在中果皮和果皮层低得多(图5C和5D)。
实施例4在不同葫芦品种中通过AGII表达有生物学活性的人干扰素-α 2a为了确定在各种农业上重要的品种中容易生产干扰素，在绿皮密生西葫芦(zucchini squash)和黄瓜的商业品种中进行实验。结果在表1中总结。干扰素的表达水平在所有试验的品种中都高。
表1.各种葫芦品种果实中的干扰素α 2a活性
a从至少三个不同的果实测量的平均活性。
实施例5口服施用在南瓜中产生的人干扰素α 2a对小鼠实验结肠炎的影响为了测量植物中生产的干扰素α 2a对结肠炎的影响，采用结肠炎的TNBS小鼠模型。该模型基本上如Gotsmann等(2001)和Ilan等(2000)所述。简单的说，小鼠是在标准实验室食物上维持并保持12小时光照/黑暗周期的正常近亲交配的雌性小鼠。通过结肠内滴注三硝基苯磺酸(TNBs)诱导结肠炎。在结肠炎诱导14天后用表达干扰素α2a的南瓜果实提取物给处理的小鼠口服给药。作为对照，诱导结肠炎的小鼠接受相同量的不表达干扰素α 2a的南瓜果实提取物或者牛血清白蛋白。通过标准临床，目视和显微镜检等级评估结肠炎。通过ELISA测定血清细胞因子分泌。
通过评估腹泻水平，结肠炎的目视评分，细胞因子水平和组织学损伤分级完成耐受性诱导对实验结肠炎的影响的评估。结果在表2中总结。
给未诱导结肠炎的小鼠口服施用南瓜提取物或者含有干扰素α2a的南瓜提取物对其健康状况无不利影响(B和C组)。然而，给诱导结肠炎的小鼠口服施用表达干扰素α 2a的南瓜果实提取物(D组)显著改善其实验型结肠炎。D组的这些小鼠体重增加，腹泻不严重，且表现出显著改善的目视和显微镜检结肠炎参数。与诱导了结肠炎且未给予表达干扰素α 2a的南瓜提取物的小鼠(E组)相比这些小鼠中IFNγ水平减少而IL10水平增加。
总之，该实验证实口服施用表达人干扰素α 2a的南瓜果实提取物对诱导结肠炎的小鼠肠道产生阳性影响。这表明干扰素在吞咽后在消化道中被吸收，与现有技术的教导相反。无论观察到的效果是全身性还是局部的，都表示口服干扰素治疗的实用性相对于临床药物有明显改进。
表2口服施用表达干扰素α 2a的南瓜果实提取物在小鼠结肠炎模型中的影响
尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，很明显许多选择，修饰和变化对本领域的技术人员是显而易见的。因此，本发明打算包含落在所附权利要求的实质和大范围内的所有这些选择，修饰和变化。
本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请以其整体在本文中引用作为本说明书的参考，其范围等同于在本文中作为参考文献引用的每篇出版物，专利和专利申请具体和单独所示的范围。另外，在本申请中对任一参考文献的引用或认证将不构成承认该参考文献是可作为本发明的现有技术能够得到的。
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序列表I(1)一般信息(i)申请人查切·阿拉齐；约尔·摩西·希博莱斯；阿米特·加隆；(ii)发明名称给受试者供应补充干扰素的系统和方法(iii)序列数20(iv)联系地址(A)联系人Mark M.Friedman C/O Mr.Bill PolkinghornDiscovery Dispatch(II)街道(C)城市(D)国家美国(E)邮编20772(v)计算机可读形式(A)媒体类型1.44MB，3.5英寸软盘(B)计算机Twinhead*Slimnote-890TX(C)操作系统MS DOS version 6.2，Windows version 3.11(D)软件Windows 2.0的Word转化为ASCI文件(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(vii)优先权申请数据(A)申请号60/253,136(B)申请日2000年11月28日(C)申请号
(D)申请日(E)申请号(F)申请日(viii)律师/代理人信息(A)姓名Friedmarn，Mark M.
(B)登记号33,883(C)参考/摘要号910/14(ix)电讯信息(A)电话972-3-5625553(B)电传972-3-5625554(C)传真SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度498(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO1的序列描述ATGTGTGATC TGCCGCAGAC TCACTCTCTG GGTTCTCGTC GTACTCTGAT 50GCTGCTGGCT CAGATGCGTC GTATCTCTCT TTTCTCCTGC TTGAAGGACA 100GACATGACTT TGGATTTCCC CAGGAGGAGT TTGGCAACCA GTTCCAAAAG 150GCTGAAACCA TCCCTGTCCT CCATGAGATG ATCCAGCAGA TCTTCAATCT 200CTTCAGCACA AAGGACTCAT CTGCTGCTTG GGATGAGACC CTCCTAGACA 250AATTCTACAC TGAACTCTAC CAGCAGCTGA ATGACCTGGA AGCCTGTGTG 300ATACAGGGGG TGGGGGTGAC AGAGACTCCC CTGATGAAGG AGGACTCCAT 350
TCTGGCTGTG AGGAAATACT TCCAAAGAAT CACTCTCTAT CTGAARGAGA 400AGAAATACAG CCCTTGTGCC TGGGAGGTTG TCAGAGCAGA AATCATGAGA 450TCTTTTTCTT TGTCAACAAA CTTGCAAGAA AGTTTAAGAA GTAAGGAA498(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度166(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg ThrII5 10 15Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys20 25 30Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly35 40 45Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met50 55 60Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala65 70 75Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr80 85 90Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly95 100 105Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val110 115 120Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys125 130 135Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg140 145 150Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys155 160 165
GluSEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度34(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO3的序列描述GCTGCAGTCA TGTGATCTGC CGCAGACTCA CTCT 34SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度31(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO4的序列描述CAGTGTCGAC TTCCTTACTT CTTAAACTTT C 31SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度22(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO5的序列描述AGCTCCATAC ATAGCTGAGA CA 22SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度498(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO6的序列描述TGGTTGAACC AAGAGGCGAA 202)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度1359(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO7的序列描述TCACAACCGG AAGTTCAGTT CTTCCAAGGA TGGCGACGAA TGTTTGACAA 50
IIIGTTTAGGCCC AGCCTAGATC ATGTGTGCAA AGTTGACCAC AACAACGAGG 100AATGTGGTGA GTTGGCAGCA ATCTTTTGTC AGGCTCTATT CCCAGTAGTG 150AAACTATCGT GCCAAACATG CAGAGAAAAG CTTAGTAGAG TTAGCTTCGA 200GGAATTCAAA GACTCTTTGA ACGCAAACTT TATTATCCAC AAGGATGAAT 250GGGATAGTTT CAAGGAAGGC TCTCATTACG ATAATATTTT CAAATTGATC 300AAAGTGGCAA CACAGGCTAC TCAGAATCTC AAGCTCTCAT CTGAAGTTAT 350GAAGTTAGTT CAGAACCACA CAAGCACTCA CATGAAGCAA ATACAAGACA 400TCAACAAGGC GCTCATGAAA GGTTCATTGG TTACGCAAGA CGAATTGGAC 450TTAGCTTTGA AACAGCTTCT TGAAATGACT CAGTGGTTTA AGAACCACAT 500GCATCTGACT GGTGAGGAGG CATTGAAAAT GTTCATAAAT AAGCGCTCTA 550GCAAGGCCAT GATAAATCCT AGCCTTCTAT GTGACAACCA ATTGGACAAA 600AATGAAATTT TGTTTGGGGA GAAAGAGATA CATTCCAAGC GATTATTCAA 650GAACTTCTTC GAAGAAGTAT ACCAGCGAAG GATATACGAA GTACGTAGTG 700CGAACTTTCC AAATGGTACT CGTAAGTTGG CCATAGGCTC ATTGATTGTA 750CCACTCAATT TGGATAGGGC ACGCACTGCA CTACTTGGAG AGAGTATTGA 800GAAGAAGCCA CTCACATCAG CGTGTGTCTC CCAACAGAAT GGAAATTATA 850TACACTCATG CTGCTGTGTA ACGATGGATG ATGGAACCCC GATGTACTCA 900GAGCTTAAGA GCCCGACGAA GAGGCATCTA GTTATAGGAG CTTCTGGTGA 950TCCAAAGTAC ATTGATCTGC CAGCATCTGA GGCAGAACGC ATGTATATAG 1000CAAAAGAAGG TTATTGCTAT CTCAATATTT TCCTCGCAAT GCTTGTGAAT 1050GTTAATGAGA ACGAAGCAAA GGATTTCACC AAAATGATTC GTGATGTTTT 1100GATCCCCATG CTTGGGCAGT GGCCTTCATT GATGGATGTT GCAACTGCAG 1150CATATATTCT AGGTGTATTC CATCCTGAAA CGCGATGCGC TGAATTACCC 1200AGGATCCTTG TTGACCACGC TACACAAACC ATGCATGTCA TTGATTCTTA 1250TGGATCACTA ACTGTTGGGT ATCACGTGCT CAAGGCCGGA ACTGTCAATC 1300ATTTAATTCA GTTTGCCTCA AATGATATGC AAAGCGAGAT GAAACATTAC 1350AGAGTTGGC 1359SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度453(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO8的序列描述
Ser Gln Pro Glu Val Gln Phe Phe Gln Gly Trp Arg Arg Met Phe5 10 15Asp Lys Phe Arg Pro Ser Leu Asp His Val Cys Lys Val Asp His20 25 30Asn Asn Glu Glu Cys Gly Glu Leu Ala Ala Ile Phe Cys Gln Ala35 40 45Leu Phe Pro Val Val Lys Leu Ser Cys Gln Thr Cys Arg Glu Lys50 55 60Leu Ser Arg Val Ser Phe Glu Glu Phe Lys Asp Ser Leu Asn Ala65 70 75Asn Phe Ile Ile His Lys Asp Glu Trp Asp Ser Phe Lys Glu Gly80 85 90Ser His Tyr Asp Asn Ile Phe Lys Leu Ile Lys Val Ala Thr Gln95 100 105Ala Thr Gln Asn Leu Lys Leu Ser Ser Glu Val Met Lys Leu Val110 115 120Gln Asn His Thr Ser Thr His Met Lys Gln Ile Gln Asp Ile Asn125 130 135Lys Ala Leu Met Lys Gly Ser Leu Val Thr Gln Asp Glu Leu Asp140 145 150Leu Ala Leu Lys Gln Leu Leu Glu Met Thr Gln Trp Phe Lys Asn155 160 165His Met His Leu Thr Gly Glu Glu Ala Leu Lys Met Phe Ile Asn170 175 180Lys Arg Ser Ser Lys Ala Met Ile Asn Pro Ser Leu Leu Cys Asp185 190 195Asn Gln Leu Asp Lys Asn Glu Ile Leu Phe Gly Glu Lys Glu Ile200 205 210His Ser Lys Arg Leu Phe Lys Asn Phe Phe Glu Glu Val Tyr Gln215 220 225Arg Arg Ile Tyr Glu Val Arg Ser Ala Asn Phe Pro Asn Gly Thr230 235 240Arg Lys Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Val pro Leu Asn Leu Asp245 250 255Arg Ala Arg Thr Ala Leu Leu Gly Glu Ser Ile Glu Lys Lys Pro260 265 270Leu Thr Ser Ala Cys Val Ser Gln Gln Asn Gly Asn Tyr Ile His
IV275 280 285Ser Cys Cys Cys Val Thr Met Asp Asp Gly Thr Pro Met Tyr Ser290 295 300Glu Leu Lys Ser Pro Thr Lys Arg His Leu Val Ile Gly Ala Ser305 310 315Gly Asp Pro Lys Tyr Ile Asp Leu Pro Ala Ser Glu Ala Glu Arg320 325 330Met Tyr Ile Ala Lys Glu Gly Tyr Cys Tyr Leu Asn Ile Phe Leu335 340 345Ala Met Leu Val Asn Val Asn Glu Asn Glu Ala Lys Asp Phe Thr350 355 360Lys Met Ile Arg Asp Val Leu Ile Pro Met Leu Gly Gln Trp Pro365 370 315Ser Leu Met Asp Val Ala Thr Ala Ala Tyr Ile Leu Gly Val Phe380 385 390His Pro Glu Thr Arg Cys Ala Glu Leu Pro Arg Ile Leu Val Asp395 400 405His Ala Thr Gln Thr Met His Val Ile Asp Ser Tyr Gly Ser Leu410 415 420Thr Val Gly Tyr His Val Leu Lys Ala Gly Thr Val Asn His Leu425 430 435Ile Gln Phe Ala Ser Asn Asp Met Gln Ser Glu Met Lys His Tyr440 445 450Arg Val Gly453SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度837(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO9的序列描述
TCAGGCACTC AGCCAACTGT GGCAGACACT GGAGCTACAA AGAAAGATAAAGAAGATGAC AAAGGGAAAA ACAAGGACGT TACAGGCTCC GGCTCAGGTGAGAAAACAGT AGCAGCTGTC ACGAAGGACA AGGATGTGAA TGCTGGTTCTCATGGGAAAA TTGTGCCGCG TCTTTCGAAG ATCACAAAGA AAATGTCATTGCCACGCGTG AAAGGAAATG TGATACTCGA TATTGATCAT TTGCTGGAATATAAACCGGA TCAAATTGAG TTATATAACA CACGAGCGTC TCATCAGCAGTTCGCCTCTT GGTTCAACCA GGTTAAGACG GAATATGATT TGAACGAGCAACAGATGGGA GTTGTAATGA ATGGTTTCAT GGTTTGGTGC ATTGAGAATGGCACTTCACC CGACATTAAT GGAGTGTGGG TTATGATGGA CGGAAATGAGCAAGTTGAGT ATCCCTTGAA ACCAATAGTT GAAAATGCAA AGCCAACGCTGCGGCAAATA ATGCATCATT TTTCAGATGC AGCGGAGGCA TATATAGAGATGAGAAATGC AGAGGCACCA TACATGCCGA GGTATGGTTT GCTTCGAAACCTACGGGATA GGAGTTTAGC ACGATATGCT TTTGATTTCT ATGAAGTCAATTCTAAAACT CCTGAAAGAG CCCGCGAAGC TGTTGCGCAG ATGAAAGCAGCAGCTCTTAG CAATGTTTCT TCAAGGTTGT TTGGCCTTGA TGGAAATGTTGCCACCACTA GCGAAGACAC TGAACGGCAC ACTGCACGTG ATGTTAATAGAAACATGCAC ACCTTACTAG GTGTGAATAC AATGCAGSEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度279(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO10的序列描述Ser Gly Thr Gln Pro Thr Val Ala Asp Thr Gly Ala Thr Lys Lys5 10 15Asp Lys Glu Asp Asp Lys Gly Lys Asn Lys Asp Val Thr Gly Ser20 25 30Gly Ser Gly Glu Lys Thr Val Ala Ala Val Thr Lys Asp Lys Asp35 40 45Val Asn Ala Gly Ser His Gly Lys Ile Val pro Arg Leu Ser Lys50 55 60Ile Thr Lys Lys Met Ser Leu Pro Arg Val Lys Gly Asn Val Ile65 70 75
VLeu Asp Ile Asp His Leu Leu Glu Tyr Lys Pro Asp Gln Ile Glu80 85 90Leu Tyr Asn Thr Arg Ala Ser His Gln Gln Phe Ala Ser Trp Phe95 100 105Asn Gln Val Lys Thr Glu Tyr Asp Leu Asn Glu Gln Gln Met Gly110 115 120Val Val Met Asn Gly Phe Met Val Trp Cys Ile Glu Asn Gly Thr125 130 135Ser Pro Asp Ile Asn Gly Val Trp Val Met Met Asp Gly Asn Glu140 145 150Gln Val Glu Tyr Pro Leu Lys Pro Ile Val Glu Asn Ala Lys Pro155 160 165Thr Leu Arg Gln Ile Met His His Phe Ser Asp Ala Ala Glu Ala170 175 180Tyr Ile Glu Met Arg Asn Ala Glu Ala Pro Tyr Met Pro Arg Tyr185 190 195Gly Leu Leu Arg Asn Leu Arg Asp Arg Ser Leu Ala Arg Tyr Ala200 205 210Phe Asp Phe Tyr Glu Val Asn Ser Lys Thr Pro Glu Arg Ala Arg215 220 225Glu Ala Val Ala Gln Met Lys Ala Ala Ala Leu Ser Asn Val Ser230 235 240Ser Arg Leu Phe Gly Leu Asp Gly Asn Val Ala Thr Thr Ser Glu245 250 255Asp Thr Glu Arg His Thr Ala Arg Asp Val Asn Arg Asn Met His260 265 270Thr Leu Leu Gly Val Asn Thr Met Gln275 2792)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度561(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO11的序列描述
ATGACCAACA AGTGTCTCCT CCAAATTGCT CTCCTGTTGT GCTTCTCCAC 50GACAGCTCTT TCCATGAGCT ACAACTTGCT TGGATTCCTA CAAAGAAGCA 100GCAATTGTCA GTGTCAGAAG CTCCTGTGGC AATTGAATGG GAGGCTTGAA 150TACTGCCTCA AGGACAGGAG GAACTTTGAC ATCCCTGAGG AGATTAAGCA 200GCTGCAGCAG TTCCAGAAGG AGGACGCCGC AGTGACCATC TATGAGATGC 250TCCAGAACAT CTTTGCTATT TTCAGACAAG ATTCATCGAG CACTGGCTGG 300AATGAGACTA TTGTTGAGAA CCTCCTGGCT AATGTCTATC ATCAGAGAAA 350CCATCTGAAG ACAGTCCTGG AAGAAAAACT GGAGAAAGAA GATTTCACCA 400GGGGAAAACG CATGAGCAGT CTGCACCTGA AAAGATATTA TGGGAGGATT 450CTGCATTACC TGAAGGCCAA GGAGGACAGT CACTGTGCCT GGACCATAGT 500CAGAGTGGAA ATCCTAAGGA ACTTTTACGT CATTAACAGA CTTACAGGTT 550ACCTCCGAAA C 5612)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度187(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO12的序列描述Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe5 10 15Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu20 25 30Gln Arg Ser Ser Asn Cys Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu35 40 45Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asn Phe Asp50 55 60Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp
VI65 70 75Ala Ala Val Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile80 85 90Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val95 100 105Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Arg Asn His Leu Lys110 115 120 Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly125 130 135Lys Arg Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile140 145 150Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Asp Ser His Cys Ala Trp Thr155 160 165Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Val Ile Asn Arg170 175 180Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn1852)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度498(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO13的序列描述ATGAAATATA CAAGTTATAT CTTGGCTTTT CAGCTCTGCA TCGTTTTGGG 50TTCTCTTGGC TGTTACTGCC AGGACCCATA TGTAAAAGAA GCAGAAAACC 100TTAAGAAATA TTTTAATGCA GGTCATTCAG ATGTAGCGGA TAATGGAACT 150CTTTTCTTAG GCATTTTGAA GAATTGGAAA GAGGAGAGTG ACAGAAAAAT 200AATGCAGAGC CAAATTGTCT CCTTTTACTT CAAACTTTTT AAAAACTTTA 250AAGATGACCA GAGCATCCAA AAGAGTGTGG AGACCATCAA GGAAGACATG 300AATGTCAAGT TTTTCAATAG CAACAAAAAG AAACGAGATG ACTTCGAAAA 350GCTGACTAAT TATTCGGTAA CTGACTTGAA TGTCCAACGC AAAGCAATAC 400ATGAACTCAT CCAAGTGATG GCTGAACTGT CGCCAGCAGC TAAAACAGGG 450AAGCGAAAAA GGAGTCAGAT GCTGTTTCGA GGTCGAAGAG CATCCCAG 498
2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度166(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO14的序列描述Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val5 10 15Leu Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu20 25 30Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val35 40 45Ala Asp Asn Gly Thr Leu phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys50 55 60Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe65 70 75Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln80 85 90Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe95 100 105Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn110 115 120Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu125 130 135Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly140 145 150Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser155 160 165Gln
VII2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度714(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO15的序列描述ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCACTGGA GTTGTCCCAA TTCTTGTTGA 50ATTAGATGGT GATGTTAATG GGCACAAATT TTCTGTCAGT GGAGAGGGTG 100AAGGTGATGC AACATACGGA AAACTTACCC TTAAATTTAT TTGCACTACT 150GGAAAACTAC CTGTTCCATG GCCAACACTT GTCACTACTT TCTCTTATGG 200TGTTCAATGC TTTTCAAGAT ACCCAGATCA TATGAAACGG CATGACTTTT 250TCAAGAGTGC CATGCCCGAA GGTTATGTAC AGGAAAGAAC TATATTTTTC 300AAAGATGACG GGAACTACAA GACACGTGCT GAAGTCAAGT TTGAAGGTGA 350TACCCTTGTT AATAGAATCG AGTTAAAAGG TATTGATTTT AAAGAAGATG 400GAAACATTCT TGGACACAAA TTGGAATACA ACTATAACTC ACACAATGTA 450TACATCATGG CAGACAAACA AAAGAATGGA ATCAAAGTTA ACTTCAAAAT 500TAGACACAAC ATTGAAGATG GAAGCGTTCA ACTAGCAGAC CATTATCAAC 550AAAATACTCC AATTGGCGAT GGCCCTGTCC TTTTACCAGA CAACCATTAC 600CTGTCCACAC AATCTGCCCT TTCGAAAGAT CCCAACGAAA AGAGAGACCA 650CATGGTCCTT CTTGAGTTTG TAACAGCTGC TGGGATTACA CATGGCATGG 700ATGAACTATA CAAA 7142)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度1809(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓朴学线型
(xi)SEQ ID NO16的序列描述ATGTTACGTC CTGTAGAAAC CCCAACCCGT GAAATCAAAA AACTCGACGG 50CCTGTGGGCA TTCAGTCTGG ATCGCGAAAA CTGTGGAATT GATCAGCGTT 100GGTGGGAAAG CGCGTTACAA GAAAGCCGGG CAATTGCTGT GCCAGGCAGT 150TTTAACGATC AGTTCGCCGA TGCAGATATT CGTAATTATG CGGGCAACGT 200CTGGTATCAG CGCGAAGTCT TTATACCGAA AGGTTGGGCA GGCCAGCGTA 250TCGTGCTGCG TTTCGATGCG GTCACTCATT ACGGCAAAGT GTGGGTCAAT 300AATCAGGAAG TGATGGAGCA TCAGGGCGGC TATACGCCAT TTGAAGCCGA 350TGTCACGCCG TATGTTATTG CCGGGAAAAG TGTACGTATC ACCGTTTGTG 400TGAACAACGA ACTGAACTGG CAGACTATCC CGCCGGGAAT GGTGATTACC 450GACGAAAACG GCAAGAAAAA GCAGTCTTAC TTCCATGATT TCTTTAACTA 500TGCCGGAATC CATCGCAGCG TAATGCTCTA CACCACGCCG AACACCTGGG 550TGGACGATAT CACCGTGGTG ACGCATGTCG CGCAAGACTG TAACCACGCG 600TCTGTTGACT GGCAGGTGGT GGCCAATGGT GATGTCAGCG TTGAACTGCG 650TGATGCGGAT CAACAGGTGG TTGCAACTGG ACAAGGCACT AGCGGGACTT 700TGCAAGTGGT GAATCCGCAC CTCTGGCAAC CGGGTGAAGG TTATCTCTAT 750GAACTGTGCG TCACAGCCAA AAGCCAGACA GAGTGTGATA TCTACCCGCT 800TCGCGTCGGC ATCCGGTCAG TGGCAGTGAA GGGCGAACAG TTCCTGATTA 850ACCACAAACC GTTCTACTTT ACTGGCTTTG GTCGTCATGA AGATGCGGAC 900TTGCGTGGCA AAGGATTCGA TAACGTGCTG ATGGTGCACG ACCACGCATT 950AATGGACTGG ATTGGGGCCA ACTCCTACCG TACCTCGCAT TACCCTTACG 1000CTGAAGAGAT GCTCGACTGG GCAGATGAAC ATCGCATCGT GGTGATTGAT 105OGAAACTGCTG CTGTCGGCTT TAACCTCTCT TTAGGCATTG GTTTCGAAGC 1100GGGCAACAAG CCGAAAGAAC TGTACAGCGA AGAGGCAGTC AACGGGGAAA 1150CTCAGCAAGC GCACTTACAG GCGATTAAAG AGCTGATAGC GCGTGACAAA 1200AACCACCCAA GCGTGGTGAT GTGGAGTATT GCCAACGAAC CGGATACCCG 1250TCCGCAAGGT GCACGGGAAT ATTTCGCGCC ACTGGCGGAA GCAACGCGTA 1300AACTCGACCC GACGCGTCCG ATCACCTGCG TCAATGTAAT GTTCTGCGAC 1350GCTCACACCG ATACCATCAG CGATCTCTTT GATGTGCTGT GCCTGAACCG 1400TTATTACGGA TGGTATGTCC AAAGCGGCGA TTTGGAAACG GCAGAGAAGG 1450TACTGGAAAA AGAACTTCTG GCCTGGCAGG AGAAACTGCA TCAGCCGATT 1500ATCATCACCG AATACGGCGT GGATACGTTA GCCGGGCTGC ACTCAATGTA 1550CACCGACATG TGGAGTGAAG AGTATCAGTG TGCATGGCTG GATATGTATC 1600ACCGCGTCTT TGATCGCGTC AGCGCCGTCG TCGGTGAACA GGTATGGAAT 1650TTCGCCGATT TTGCGACCTC GCAAGGCATA TTGCGCGTTG GCGGTAACAA 1700GAAAGGGATC TTCACTCGCG ACCGCAAACC GAAGTCGGCG GCTTTTCTGC 1750TGCAAAAACG CTGGACTGGC ATGAACTTCG GTGAAAAACC GCAGCAGGGA 1800GGCAAACAA 1809
VIII2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度33(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO17的序列描述ATGCTGCAGA AGACTAATCT TTTTCTCTTT CTC 332)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度42(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO18的序列描述TGACTGCAGC ATTACAGTGT CAAGCTCATC ATGTTTGTAT AG 422)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度190(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型
(xi)SEQ ID NO19的序列描述AACTGCAGTC AATGTTACGT CCTGTAGAAA CCC 332)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度190(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓朴学线型(xi)SEQ ID NO20的序列描述ACGCGTCGAC CTTTGTTTGC CTCCCTGCTG C 3权利要求
1.一种用于给受试者提供补充干扰素的系统，该系统包括(a)病毒载体，所述的载体设计并构建成能够感染植物并在其中表达干扰素基因的至少一部分，和(b)所述的植物，该植物的至少一部分是受试者可食用的；其中干扰素基因的所述至少一部分的基因产物对于消费所述植物至少一部分的受试者是生物学有效的。
2.权利要求1的系统，其中所述的病毒载体是马铃薯Y病毒组载体。
3.权利要求2的系统，其中所述的马铃薯Y病毒组是绿皮密生西葫芦黄色花叶病毒(ZYMV)。
4.权利要求3的系统，其中所述的ZYMV是一种含有SEQ ID NOs.7和8中所列突变的减毒株。
5.权利要求1的系统，其中所述的干扰素基因的至少一部分包含哺乳动物干扰素基因序列。
6.权利要求5的系统，其中所述的哺乳动物干扰素基因序列包含人干扰素基因序列的至少一部分。
7.权利要求6的系统，其中所述的人干扰素基因序列是选自由干扰素α2a(SEQ ID NO.1)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一基因组成的组。
8.权利要求6的系统，其中所述的人干扰素基因序列是选自由干扰素β(SEQ ID NO.11)或干扰素γ(SEQ ID NO.13)和以FastA程序分析与所述干扰素基因的任一种有至少85％同源性的任一基因组成的组。
9.权利要求1的系统，其中所述的载体表达选自由干扰素α2a基因产物(SEQ ID NO.2)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
10.权利要求1的系统，其中所述的载体表达选自由干扰素β基因产物(SEQ ID NO.12)，干扰素γ基因产物(SEQ ID NO.14)和以FastA程序分析与所述干扰素基因产物的任一种有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
11.权利要求1的系统，其中所述的病毒载体从所述植物到第二植物的传染性被所述病毒载体中的一个突变阻止。
12.一种用于给受试者提供补充干扰素的系统，该系统包括(a)设计并构建成能够在植物中表达干扰素基因的至少一部分的DNA序列；和(b)所述的植物，该植物的至少一部分是受试者可食用的且该植物对于该DNA序列的转化易感；其中干扰素基因的所述至少一部分的基因产物对于消费所述植物的该至少一部分的受试者是生物学有效的。
13.权利要求12的系统，还包括将所述DNA序列导入所述植物的至少一个细胞，从而转化所述细胞的方法。
14.权利要求12的系统，其中所述的DNA序列包含土壤杆菌T-DNA的左侧边界和右侧边界。
15.权利要求12的系统，其中所述的干扰素基因的所述至少一部分包含哺乳动物干扰素基因序列。
16.权利要求15的系统，其中所述的哺乳动物干扰素基因序列包含人干扰素基因序列的至少一部分。
17.权利要求16的系统，其中所述的人干扰素基因序列是选自由干扰素α2a(SEQ ID NO.1)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一基因组成的组。
18.权利要求14的系统，其中所述的人干扰素基因序列是选自由干扰素β(SEQ ID NO.11)或干扰素γ(SEQ ID NO.13)和以FastA程序分析与所述干扰素基因的任一种有至少85％同源性的任一基因组成的组。
19.权利要求12的系统，其中所述的载体表达选自由干扰素α2a基因产物(SEQ ID NO.2)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
20.权利要求12的系统，其中所述的载体表达选自由干扰素β基因产物(SEQ ID NO.12)，干扰素γ基因产物(SEQ ID NO.14)和以FastA程序分析与所述干扰素基因产物的任一种有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
21.一种给受试者提供补充干扰素的方法，该方法包括步骤(a)引发植物在其至少一些细胞中表达干扰素基因的至少一部分；和(b)给受试者食用所述植物的至少一部分。
22.权利要求21的方法，其中所述的引发步骤由选自如下的行为来完成(i)用病毒载体感染所述植物的至少一个细胞，所述病毒载体设计并构建成能够在其中表达干扰素基因的至少一部分；和(ii)用设计并构建成能够在其中表达干扰素基因的至少一部分的DNA序列转化所述植物的至少一个细胞。
23.权利要求21的方法，其中所述的干扰素基因的所述至少一部分包含哺乳动物干扰素基因序列。
24.权利要求23的方法，其中所述的哺乳动物干扰素基因序列包含人干扰素基因序列的至少一部分。
25.权利要求24的方法，其中所述的人干扰素基因序列是选自由干扰素α2a(SEQ ID NO.1)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一基因组成的组。
26.权利要求24的方法，其中所述的人干扰素基因序列是选自由干扰素β(SEQ ID NO.11)或干扰素γ(SEQ ID NO.13)和以FastA程序分析与所述干扰素基因的任一种有至少85％同源性的任一基因组成的组。
27.权利要求21的方法，其中所述的引发植物表达的步骤包括表达选自由干扰素α2a基因产物(SEQ ID NO.2)和以FastA程序分析与其有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
28.权利要求21的方法，其中所述的引发植物表达的步骤包括表达选自由干扰素β基因产物(SEQ ID NO.12)，干扰素γ基因产物(SEQ ID NO.14)和以FastA程序分析与所述干扰素基因产物的任一种有至少85％同源性的任一蛋白质组成的组中的一种蛋白质的至少一部分。
29.一种给受试者提供口服生物学有效的蛋白质的方法，该方法包括步骤(a)引发植物在其至少一些细胞中表达口服生物学有效的蛋白质的至少一部分；和(b)给受试者食用所述植物的至少一部分。
30.权利要求29的方法，其中所述的引发步骤由选自如下的行为来完成(a)用病毒载体感染所述植物的至少一个细胞，所述病毒载体设计并构建成能够在其中表达编码口服生物学有效的蛋白质的基因的至少一部分；和(b)用设计并构建成能够在其中表达编码口服生物学有效的蛋白质的基因的至少一部分的DNA序列转化所述植物的至少一个细胞。
全文摘要
本发明公开了给受试者提供补充干扰素的系统和方法。一个公开的系统包括能感染植物并在其中表达干扰素的病毒载体和该可食用的植物。另一公开的系统包括能在植物中表达干扰素基因的DNA和可食用且对该DNA序列的转化易感的植物。还公开了包括引发植物表达干扰素基因的至少一部分和给受试者食用该植物的至少一部分的方法。
文档编号C12N15/82GK1575336SQ01822318
公开日2005年2月2日 申请日期2001年11月28日 优先权日2000年11月28日
发明者阿米特·加隆, 约尔·摩西·希博莱斯, 查切·阿拉齐, 亚龙·伊兰 申请人:病毒基因有限公司