用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物pcr方法

专利名称：用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法。
(2)背景技术细菌感染性疾病长期危害人类健康，快速敏感检出病原菌是防制疾病的重要步骤。近年来，PCR技术已被应用于病原菌的检测，这些检测技术可分为2大类，分别为特异性引物PCR和非特异性引物PCR，前者依目的菌不同而往往需要不同的引物，而不同引物序列又可能需要不同的扩增条件，故当待检菌不明时则需进行多次PCR才可能得到结果，因此，难以达到快速特异检测的目的；后者一般根据细菌16S rRNA基因的保守性合成通用引物，所扩增的产物往往需要配合RFLP(限制性段片多态性分析)、SSCP(单链构象性多态性分析)或序列分析才能进行确定，故操作步骤较为繁锁。
(3)发明内容本发明的目的旨在提供一种利用抗体特异性识别待检菌，再采用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，快速特异地检测病原菌的方法。
本发明所说的免疫捕捉法通用引物PCR(iUPPCR)方法操作步骤如下1)抗体包被采用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液，将针对各种细菌的特异性抗体配制成抗体含量为1～10μg/mL的溶液，分别包被至固相载体上，每份50mL于4℃下过夜，然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；所说的固相载体为酶联反应板或塑料反应小管；2)封闭每孔加入50μL10％小牛血清，36～38℃封闭1hr，甩干；3)免疫捕捉每孔加入细菌溶液20～40μL，于36～38℃温育1hr，用PBS-T洗板5次，每次3～5min；4)热变性释放模板每孔加入20～40μL无菌双蒸水，沸水浴加热8～10min，吸取8～36μL裂解液作为PCR反应模板；5)通用引物PCR(UPPCR)在PCR反应管中依次加入10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L的MgCl23μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，74μmol/L的引物0.085μL，5U/μL的Taq酶0.1μL，最后加入模板至总体积25～50μL，混合后，94℃变性1min，51℃复性1min，70℃延伸2.5min，共循环40次；所说的引物为通用引物，由Sangon公司合成，选自细菌16S rRNA基因保守区，引物序列如下正向引5’-AAACTCAAAGGAATTCGG-3’，逆向引物5’-GACGGGCGGTG TACAA-3’；6)PCR产物鉴定取PCR产物5μL，与适量加样缓冲液混合，点样于含0.5mg/μL的溴化乙啶(EB)的2.5％琼脂糖凝胶中，80V电泳30min，观察结果。
本发明将抗原抗体反应的特异性与PCR强大的扩增效率相结合，建立了检测病原菌的iUPPCR，其特异性是通过抗体对抗原的特异识别来达到，只有能被抗体识别的细菌才能被捕捉到，而被捕捉到的细菌均可经通用引物按同一程序扩增，故可以达到快速检出的目的，本免疫捕捉法PCR具有相当的敏感性，比直接裂解法PCR敏感，PCR产物条带更清晰。这可能是由于免疫捕捉的过程是利用了亲和层析的原理，从而将不利于PCR扩增的杂质除去，因此理论上1个细菌也可检出，这对于临床血液标本中的病原菌的检测具有重要意义。PCR标本来源不同，处理方法各异，用传统PCR检测方法不仅费时费力，而且干扰PCR扩增的物质也较多，容易出现假阴性，对于微量标本更是如此。采用本法可直接将标本加入反应孔内，通过亲和法进行标本纯化，从而不但提高了敏感性、同时也减少所需时间。具有快速、特异、敏感的特点，且重复性高。由于本发明使用的是细菌的通用引物，因此可推广至其它病原菌的检测，具有较好的临床推广价值。
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图1为实施例3中福氏志贺菌型间交叉实验结果的PCR产物电泳图。
图2为实施例5中免疫捕捉法UPPCR和热变性法UPPCR检测粪便中志贺菌的比较实验PCR产物电泳图。
(5)具体实施方式
实施例1实验菌种痢疾志贺菌(Shinglla dysenteriae)I型，宋氏志贺菌(Shigella sonnei)，福氏志贺菌(Shigella flexneri)1a、2a、2b、3a、4、5、Y变种，鲍氏志贺菌(Shigella boydii)1。其中痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16购自江西省卫生防疫站，福氏志贺菌1a、2a、2b、3a、5、Y变种购自福建省卫生防疫站。
通用引物由Sangon公司合成，选自细菌16S rRNA基因保守区，经鉴定为电泳纯。引物序列如下正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3’逆向引向物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’。
诊断血清上述志贺菌属各菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品，4步硫酸铵法提纯抗体。PCR试剂Taq酶(MBI产品)，dNTPs(Sangon产品)。
限制性内切酶Hae III(Ferments产品)。
分子量标准pGEM-7Zf(+)/Hae III Markers(Sangon产品)。
肉汤培养基0.5％牛肉膏，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min，37℃摇床培养18～24h。
细菌计数显微镜直接计数和平板计数。
iUPPCR操作步骤1)首先抗体包被用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液将上述志贺菌属各菌抗体稀释为10μg/mL，分别加入酶联反应板各孔，每孔50μL，于4℃冰箱过夜，然后用pH7.4，0.01mol/LPBS-T洗板3次，每次3min。
2)封闭10％小牛血清37℃封闭1hr后甩干。
3)免疫捕捉每孔加入细菌溶液20μL，于37℃保温1hr，用PBS-T洗板5次，每次3min。
4)热变性释放模板每孔加入20μL无菌双蒸水，沸水浴加热10min，吸取18μL裂解液作为PCR反应模板。
5)UPPCR在PCR反应管中依次加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，引物(74μmol/L)各0.085uL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，最后加入模板至总体积25μL。混合后，94℃变性1min，51℃复性1min，70℃延伸2.5min，共循环40次。
6)PCR产物鉴定取PCR产物5μL，与适量加样缓冲液混合，点样于2.5％的含0.5μg/mL EB的琼脂糖凝胶中，80V电泳30min。取限制性内切酶Hae III产品对PCR产物进行酶切鉴定，结果其酶切片段大小与理论值相符。
实施例2中和实验同时设立中和组和对照组进行中和实验。材料及iUPPCR操作步骤均同实施例1，将痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16菌液稀释成20μL菌液中含50 CFU病原菌。中和组取20μL菌液与等体积50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL相应抗体混合，于37℃温育1hr后加于反应板中；对照组则加入20μL菌液和20μL无菌水，其余步骤不变。中和结果见表1，三组中和组均无PCR扩增产物，而相应对照组均有扩增产物。
表1iUPPCR检测痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16的中和实验结果中和组抗体浓度 对照组50μg/mL 100μg/mL200μg/mL痢疾志贺菌I型- -- +宋氏志贺菌 - -- +福氏志贺菌4- -- +鲍氏志贺菌16 - -- +实施例3iUPPCR交叉实验1)用种特异的单价诊断血清提纯抗体进行交叉实验材料同实施例1，以痢疾志贺氏菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4和鲍氏志贺菌16的单价诊断血清所提抗体包被反应板，每种抗体包被4孔，分别用于捕捉4种志贺氏菌，其余步骤同实施例1，PCR产物鉴定结果表明种间无交叉反应出现(见表2)。
表2采用特异性单价抗体捕捉的iUPPCR检测痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4和鲍氏志贺菌16的交叉实验结果痢疾志贺菌I型宋氏志贺菌福氏志贺菌4鲍氏志贺菌16抗痢疾志贺氏I型 +- --抗宋内志贺氏-+ --抗福氏志贺氏4 -- +-抗鲍氏志贺氏16-18 -- -+2)用型特异的单价诊断血清提纯抗体进行交叉实验以福氏志贺菌1型、2型、3型、4型、5型、6型单价诊断血清所提抗体包被反应板，每一种抗体包被6孔，分别用于捕捉福氏志贺菌1a、2a、3a、4、5、Y变种，其余步骤不变，PCR产物鉴定结果表明，型间无交叉反应出现(见表3)。图1为福氏志贺菌型间交叉反应实验结果的PCR产物电泳图，图1中1福氏志贺菌1a与抗1型抗体反应2福氏志贺菌2a与抗1型抗体反应3福氏志贺菌2a与抗2型抗体反应4福氏志贺菌3a与抗2型抗体反应
5福氏志贺菌3a与抗3型抗体反应6福氏志贺菌4与抗3型抗体反应7福氏志贺菌4与抗4型抗体反应8福氏志贺菌5与抗4型抗体反应9福氏志贺菌5与抗5型抗体反应10福氏志贺菌Y变种与抗5型抗体反应11福氏志贺菌Y变种与抗6型抗体反应MpGEM-7Zf(+)/HaeIII Makers表3采用型特异性单价抗体捕捉的iUPPCR检测福氏志贺菌1a、2a、3a、4、5和Y变种的交叉实验结果福氏志贺菌1a2a3a45Y变种抗1型抗体+ -----抗2型抗体- +----抗3型抗体- -+---抗4型抗体- --+--抗5型抗体- ---+-抗6型抗体- -----实施例4实验菌种宋氏志贺菌(Shigella sonnei)购自江西省卫生防疫站。
通用引物同实施例1。
诊断血清宋氏志贺菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品，4步硫酸铵法提纯抗体。
PCR试剂同实施例1。
分子量标准同实施例1。
肉汤培养基同实施例1。
细菌计数同实施例1。
每孔加入稀释定量后的细菌20μl进行捕捉，其浓度分别为每20μL菌液中含有菌体20、100、500、1000CFU。同时采用iUPPCRT和直接裂解法UPPCR进行扩增，iUPPCR操作方法同实施例1。直接裂解法UPPCR为取细菌培养液于3500rpm离心20min收集菌体，依实验要求用双蒸水稀释细菌，沸水变性10min，12000rpm离心10min。取上清液作为模板，进行UPPCR扩增。结果两法均为阳性。
将细菌浓度定为200、100和20个CFU/400μL，均分为20份。10份用于免疫捕捉，另10份用于热变性，其余步骤不变，结果表明两法有非常显著的差异(P均＜0.01)。(见表4)表4比较免疫捕捉法UPPCR和热变性法UPPCR检测10、5和ICFU细菌的敏感性10 CFU细菌5 CFU细菌 1 CFU细菌管数阳性数 阳性率(％)阳性数 阳性率(％)阳性数 阳性率(％)免疫捕捉UPPCR10 10 100.0 10 100.0440.0热变性法UPPCR10 660.0220.0 00空白对照 500 0000P＜0.01实施例5粪便环境模拟实验实验菌种痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)I型购自江西省卫生防疫站。
通用引物同实施例1。
诊断血清痢疾志贺菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品，4步硫酸铵法提纯抗体。
PCR试剂同实施例1。
限制性内切酶同实施例1。
分子量标准同实施例1。
肉汤培养基同实施例1。
细菌计数同实施例1。
粪便环境模拟标本用无菌生理盐水将正常人粪便1g均匀悬浮，2500r/min离心10min，取上清稀释痢疾志贺菌I型，稀释后浓度为100 CFU/200μL，分别于10个反应孔中进行捕捉，其余步骤不变。取粪便环境模拟标本，同时用iUPPCR和热变性直接裂解法UPPCR检测。iUPPCR方法同实施例1，热变性法同实施例4，结果前法的10管中有8管为阳性，阳性率为80％，后法的10管中无扩增产物出现(见图3)。两者有非常显著的差异(P＜0.01)。PCR产物经酶切鉴定，其片段与理论值相符。图3中1pGEM-7Zf(+)/HaeIII Markers2免疫捕捉法UPPCR产物3热变性法UPPCR产物实施例6
通用引物同实施例1。
诊断血清同实施例1。
PCR试剂同实施例1。
限制性内切酶同实施例1。
分子量标准同实施例1。
肉汤培养基同实施例1。
细菌计数同实施例1。
iUPPCR操作步骤同实施例1。
沙门氏志贺氏琼脂(SS Agar)上海市医学化验所试剂厂产品。
污水样品采集从厦门大学附近医院和居民区污水排放点取污水35份，每份5mL，置于无菌容器中室温静置2hr，分别取上清20μL用于捕捉和40μL用于细菌培养。
污水细菌培养称取53克沙门氏志贺氏琼脂，加入1000mL冷蒸馏水微火煮沸使完全溶解，冷至50℃左右倾入无菌平皿中凝固后备用。取40μL污水样品涂布平皿，37℃培养24hr。
血清学鉴定挑取无色半透明菌落，按玻片凝集实验进行血清学鉴定。
以志贺菌属各菌型特异性抗体包被反应板，检测采自厦门大学附近的污水样品35份，同时采用细菌培养结合血清型反应的检测方法比较。结果iUPPCR检测的阳性率显著高于细菌培养和血清学方法(见表5)。从表中可看出两法有非常显著的差异(P＜0.01)，同时随机对5份阳性产物进行酶切鉴定，结果与理论片段长度一致。
表5采用iUPPCR和细菌培养结合血清学方法检测35份污水样品的阳性率比较免疫捕捉法UPPCR 细菌培养和血清学方法阳性数 阳性率(％)阳性数阳性率在(％)痢疾志贺菌I型25.7 0 0.0痢疾志贺菌II型 00.0 0 0.0福氏志贺菌1型00.0 0 0.0福氏志贺菌2型15 42.95 14.3福氏志贺菌3型38.6 0 0.0福氏志贺菌4型00.0 0 0.0福氏志贺菌5型00.0 0 0.0福氏志贺菌6型00.0 0 0.0宋氏志贺菌 38.6 0 0.0鲍氏志贺菌1-600.0 00.0鲍氏志贺菌7-11 00.0 00.0鲍氏志贺菌12-1500.0 00.0鲍氏志贺菌16-1800.0 00.0合计 23 65.8514.3*P＜0.0
权利要求
1.用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于操作步骤如下1)抗体包被采用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液，将针对各种细菌的特异性抗体配制成抗体含量为1～10μg/mL的溶液，将溶液分别包被至固相载体上，每份50μL，于4℃下过夜，然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；2)封闭每份加入50μL10％小牛血清，36～38℃封闭1hr，甩干；3)免疫捕捉每份加入细菌溶液20～40μL，于36～38℃温育1hr，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min；4)热变性释放模板每份加入20～40μL无菌双蒸水，沸水浴加热8～10min，吸取18～36μL裂解液作为PCR反应模板；5)通用引物PCR(UPPCR)在PCR反应管中依次加入10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L的MgCl23μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，74μmol/L的引物0.085μL，5U/μL的Tag酶0.1μL，最后加入模板至总体积25～50μL，混合后，94℃变性1min，51℃复性1min，70℃延伸2.5min，共循环40次；所说的引物为通用引物，选自细菌16S rRNA基因保守区，引物序列如下正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3，逆向引物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’；6)PCR产物鉴定取PCR产物5μL，与适量加样缓冲液混合，点样于0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的2.5％琼脂糖凝胶中，80V电泳30min，观察结果。
2.如权利要求1所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于步骤4热变性释放模板中无菌双蒸水每份所加体积与步骤3免疫捕捉中每份所加细菌溶液体积一致。
3.如权利要求1所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于所说的固相载体为酶联反应板或塑料反应小管。
4.如权利要求3所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于所说的固相载体为酶联反应板。
全文摘要
涉及一种检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法,采用针对各种细菌的特异性抗体进行包被,经封闭后加入细菌溶液于36～38℃下免疫捕捉,然后热变性释放模板,吸取裂解液作为PCR反应模板,最后利用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR,本发明将抗原抗体反应的特异性与PCR强大的扩增效率相结合,建立了检测病原菌的iUPPCR,其特异性是通过抗体对抗原的特异识别来达到,只有能被抗体识别的细菌才能被捕捉到,而被捕捉到的细菌均可经通用引物按同一程序扩增,故可以达到快速检出的目的,重复性好,特异性强、敏感性高,其原理可用于几乎所有病原菌的检测,具有较好的应用推广价值。
文档编号C12Q1/68GK1366183SQ0210198
公开日2002年8月28日 申请日期2002年1月22日 优先权日2002年1月22日
发明者彭宣宪, 王三英, 张建营 申请人:厦门大学