专利名称：松材线虫病的早期诊断检测方法
技术领域：
本发明涉及一种松材线虫病的检测方法。
(2)背景技术松材线虫(Busaphelenchus xylphilus)病是松树的一种毁灭性病害，它能使大片松树快速死亡，造成巨大经济损失；然而，由于松材线虫病发病初期症状不明显，往往错失防治良机，造成经济损失和病害流行。所以对其早期诊断就显得尤为重要。
原先，检测松材线虫都是沿用贝尔曼氏漏斗法。其基本装置为一合适直径的漏斗，漏斗管端接一段橡皮管，以弹簧止水夹控制管的开闭。漏斗放在铁架的圆环上，其内盛满清水。从松树树干上劈下一部分树皮，切成小块，包在一块方形的薄纱布内，浸在水内。线虫从松树皮中游出。经纱布而沉落在漏斗管底。经一昼夜后，打开弹簧夹，流出少量水，收集在玻璃皿内，水内含有线虫。再用显微镜鉴定水内含有的线虫是不是松材线虫。(毕志树、李进编《植物线虫学》，农业出版社，211-212)。这种方法虽然能够分离出线虫，但是具有明显的缺点1)劈掉不少树皮，松树变得很难看，破坏森林景观；2)费工费时；3)需要用很多漏斗，且占用很多实验室空间。
(3)发明内容本发明的目的旨在提供一种利用微生物真菌将松材线虫诱出鉴定的检测方法。本发明所用的微生物真菌盘多毛(Pestalotia sp.)真菌是从福建省龙岩市的红豆杉上分离得到的，菌株的分类命名盘多毛属，该菌体己保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微尘物中心，登记入册的编号为CGMCC NO.0756，株号Ps0202。
本发明的技术方案如下步骤一配制霉菌培养基，适于霉菌生长的培养基有马铃薯汁培养基(PDA)，草浸汁培养基、玉米粉培养基(CMA)、察培克养基、淘米水培养基及糖蜜培养基，培养基可为固体或液体；步骤二将配制好的固体霉菌培养基分装入小口径的试管内，装量为管子容量的1/3～1/2，用锡铂纸封口，经高压灭菌后倾倒成平面，冷却凝固后接种微生物真菌，20～28C培养3～5天后(菌丝约覆盖1/3琼脂平面)，5～10C冷藏备用；或将配制好的液体培养基装入容器内，塞上棉花塞或用纱布包住容器瓶口高压灭菌，冷却后接种微生物真菌，25～28℃培养3～5天后分装小口径试管，每支装量2～3ml，用锡铂纸封口，竖放备用。
所说的微生物菌为盘多毛(Pestalotia sp.)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)、加拿大盘革菌(Aleurodiscus canadensis skolko)、松壳囊孢(Cytospora pini Desm.)或克拉夫特杰大干酪菌(Tyromyces kravtzevianus Bondarzew&Parmasto in Parmasto)。
另外，试管内还可加松树的枝条，高压灭菌(或用酒精消毒)后放入试管内。
步骤三在待测的松树树干上凿出或钻出直径与试管相同，深度为试管长度1/3的圆孔。揭去试管口的锡铂纸，塞入一小团消毒过的棉花，并滴加2～5ml灭菌水，然后将试管插入树干上的圆孔；当气温低于24℃时，试管插入后用黑色袋或布包裹，并扎紧，以提高试管内的温度。
步骤四检测管插入后在树体上保留3～5天，然后拔出，先用解剖镜对着管壁检查，一般线虫在管壁上蠕行，比较容易发现，特别是线虫大多数聚集在管壁上有凝集水的位置，或者有水膜的地方。
可以把检测管放在培养箱中25℃培养3～4天后再取出镜检，这样线虫得以繁殖，会大大提高检出率。
用这种方法检测松材线虫病，既可实现早期诊断，又可使松树免于削皮之患，达到保护松林景观的目的。因为松树萎蔫病发病初期，其病原一松材线虫数量很少，本方法能把线虫诱入管子内，在其培养的真菌上虫量迅速扩增，从而提高检测的灵敏度，同时便于操作，有利于大规模检测及松树线虫病早期普查。
(4)具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1将200g马铃薯洗净去皮，切成小块或推成细丝，按1∶5的比例加1000ml水(w∶v)，煮沸30min.(注意防止烧糊，可用水浴)，用纱布过滤，滤汁添水至煮前的体积。再加200g蔗糖，17g琼脂，调pH6左右。
将配制好的培养基分装入18×180mm的试管，每支试管装量5ml，用锡铂纸扣住试管口，并包住试管壁上沿。经1.0kg/cm2灭菌30min.，然后倾倒成平面，冷却凝固后接种盘多毛(Pestalotia sp.)，25℃培养3天，待菌丝约覆盖1/3琼脂平面时，取出置于5～10C冰箱中冷藏备用。
需要检测的松树，用凿子或钻子在树干上凿出或钻出一个直径18mm、深度约60mm的圆孔。然后把长成菌丝的检测管插入圆孔中，临插入时揭去锡铂纸，使管口对准圆孔。所有检测的管子，在插入前均塞入一小团消毒过的棉花于近管口处，然后再滴加2.5ml灭菌水。以保证其水分供应。
因当时气温低于24℃，每支试管插入后均用黑色小塑料袋包裹，并用橡皮筋扎紧，以提高试管内的温度。
用这种接种了盘多毛的马铃薯汁琼脂培养基的检测管20支，插入林中的20棵松树的树于上进行第一批试验，插在树上3天带回实验室，放在25℃培养箱中4天后用解剖镜检查，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
用同样的检测管15支，插入林中的15棵松树的树干上进行第二批试验，在树上经过5天带回实验室，当晚镜检发现3支管内有线虫，阳性率为20％。
而同样的方法把清水对照组插入树体，阳性率为0。
实施例2与实施例1不同的是采用液体培养基，即每1000ml溶液中加入200g马铃薯、20g蔗糖配制而成。配成的液体培养基分装入容量500ml的三角烧瓶中，每瓶装量100ml。然后塞上棉花塞或用8层纱布包住瓶口。经高压灭菌，冷却后按无菌操作法接种盘多毛，在摇床上振荡培养3天，分装入18×180mm的试管，每支试管装量2ml，用锡铂纸封口，竖放备用。
用这种接种了盘多毛的马铃薯汁液体培养基的检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上进行第一批试验，在树上经过3天带回实验室，放在25℃培养箱中4天后用解剖镜检查，结果从2棵松树上诱引出了线虫，阳性率为10％。
用同样的检测管15支，插入林中的15棵松树的树干上进行第二批试验，在树上经过5天带回实验室，当晚镜检发现3支管内有线虫，阳性率为20％。
实施例3与实施例1不同的是在培养基中加了松树的枝条，方法是取无线虫的健康松树上的枝条，加工成长50mm、粗3～5mm的小短棒，高压灭菌，然后放入管子中。
用这种接种盘多毛、并且加入了松枝条的马铃薯汁琼脂培养基的检测管3支，插入林中的3棵松树的树干上，3天后带回实验室，当天立即检查，就从其中1支管中发现了线虫。放在25C培养箱中4天后检查，从其中2支管中发现线虫。结果表明从2棵松树上诱引出了线虫，阳性率为66.7％。
实施例4
与实施例1不同的是采用草浸汁培养基，其配方为干草(粉碎)50g或鲜草200g，KH2PO12g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 5.5～7。干草(常常使用稻草)或鲜草(可用草皮修剪下来的草)在高压灭菌锅中先在120C下煎煮30min后过滤。
用这种接种了盘多毛的草浸汁琼脂培养基的检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例5与实施例1不同的是用糖蜜配培养基，即把糖蜜稀释成1/8～1/6，或废糖蜜掺入1/10～1/20糖蜜，混合后pH调至5.5～7，以6～6.5最佳。
用这种装接种了盘多毛的糖蜜琼脂培养基的检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例6与实施例1不同的是培养基是CMA培养基，其配方为玉米(玉米片)20g，蔗糖20g，琼脂17g，蒸馏水1000ml。玉米片在500ml水中60C下煮1小时。用布过滤，把滤液加入溶于500ml水中的琼脂液中，再加水补足1000ml。
把这种接种了盘多毛的CMA培养基的检测管20支插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例7用察培克(Czapek)培养基，其配方为NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蔗糖30g，琼脂15g，蒸馏水1000ml(蔗糖要在临灭菌前放入)。其余同实施例1。
把这种接种了盘多毛的察培克培养基的检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例8与实施例1不同的是其所接种的真菌是灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)把这种接种了灰葡萄孢的马铃薯汁琼脂培养基检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例9接种的真菌是加拿大盘革菌(Aleurodiscus canadensis skolko)，其余同实施例1。
把这种接种了加拿大盘革菌的马铃薯汁琼脂培养基检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例10与实施例1不同的是其所接种的真菌是松壳囊孢(Cytospora pini Desm.)把这种接种了松壳囊孢的马铃薯汁琼脂培养基检测管20支，插入林中的20棵松树的树于上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例11与实施例1不同的是其所接种的真菌是克拉夫特杰夫干酪菌(Tyromyceskravtzevianus Bondarzew&Parmasto in Parmasto)把这种接种了克拉夫特杰夫干酪菌的马铃薯汁琼脂培养基检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
实施例12与实施例1不同的是培养基为淘米水培养基，其操作方法为淘米水静置一段时间后倾去上清液，沉淀用比重计测定为1.4Be左右，调节pH为6.5～7.0，然后按1.5～2.0％的比例加入琼脂并加热溶解之。
把这种接种了盘多毛的淘米水培养基的检测管20支，插入林中的20棵松树的树干上，结果从6棵松树上诱引出了线虫，阳性率为30％。
权利要求
1.松材线虫病的早期诊断方法，其特征在于所用的微生物真菌盘多毛(Pestalotia sp.)，株号Ps0202，其步骤如下步骤一配制霉菌培养基，适于的有马铃薯汁培养基(PDA)，草浸汁培养基、玉米粉培养基(CMA)、察培克培养基、淘米水培养基或糖蜜培养基，培养基为固体或液体；步骤二将配制好的固定霉菌培养基分装入小口径的试管内，装量为管子容量的1/3～1/2，用锡铂纸封口，经高压灭菌后倾倒成平面，冷却凝固后接种微生物真菌，20～28(℃培养3～5天，5～10℃冷藏备用；或将配制好的液体培养基装入容器内，高压灭菌，冷却后接种微生物真菌，20～28℃培养3～5天后分装小口径试管，每支装量2～3ml，用锡铂纸封口，竖放备用；所说的微生物菌为盘多毛(Pestalotia sp.)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)、加拿大盘革菌(Aleurodiscus canadensis skolko)、松壳囊孢(Cytospora pini Desm.)或克拉夫特杰夫干酪菌(Tyromyces kravtzevianus Bondarzew&Parmasto in Parmasto)；步骤三在被测的松树树干上凿出或钻出直径与试管相同、深度为试管长度1/3的圆孔。揭去试管口的锡铂纸，塞入棉花，并滴加2～5ml灭菌水，然后将试管插入圆孔中；步骤四3～5天后取出试管，解剖镜下观察、鉴定。
2.如权利要求1所述的松材线虫病的早期诊断方法，其特征在于步骤三中，插管后试管外用黑色袋或布包裹。
3.如权利要求1所述的松材线虫病的早期诊断方法，其特征在于步骤四中，取出的试管在培养箱中25℃下培养4～6天后再取出镜检。
4.如权利要求1所述的松材线虫病的早期诊断方法，其特征在于步骤二中，试管内放入松树的枝条。
5.如权利要求4所述的松材线虫病的早期诊断方法，其特征在于所说的松树的枝条为无线虫的健康松树上的松枝，取之加工成长50mm，粗3～5mm的小短棒，经高压灭菌或酒精消毒。
全文摘要
涉及一种松材线虫病的检测方法，在固体或液体霉菌培养基上接种盘多毛(株号Ps0202)或其它微生物真菌，在待测的松树树干上凿出或钻出圆孔，然后将装有菌体的试管插入树干上的圆孔，3～5天取出试管用显微镜观察、鉴定。用这种方法检测松材线虫病，既可实现早期诊断，又可使松树免于削皮之患，达到保护松林景观的目的。因为松树萎蔫病发病初期，其病原－松材线虫数量很少，本方法能把线虫诱入管子内，在其培养的真菌上虫量迅速扩增，从而提高检测的灵敏度，同时便于操作，有利于大规模检测及松树线虫病早期普查。
文档编号C12Q1/02GK1420180SQ0212994
公开日2003年5月28日 申请日期2002年8月23日 优先权日2002年8月23日
发明者潘沧桑 申请人:厦门大学