专利名称：同种异体组织工程化软骨及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及组织工程化软骨及其制各方法和用途。
背景技术：
软骨组织作为一种结缔组织主要起支撑、保护、分散应力等作用。组织学上可分为透明软骨(关节软骨、肋软骨、鼻软骨、气管软骨)、弹性软骨(会厌软骨、耳软骨)、纤维软骨(半月板)三类。它们在组织学上都是只含有软骨细胞的单一组织，内部无血管，营养主要依靠组织液的渗透。
从结构上看，软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，其周围厚厚的软骨囊作为一道天然屏障，将软骨细胞与周围组织分离开来。因此，软骨组织具有抗原性弱，不易被机体免疫系统识别和攻击而具有较轻免疫排斥反应的特点。早期的研究结果表明，同种异体软骨细胞可以在受体体内存活并保持分泌基质的功能。
软骨病损是临床常见疾病之一，如由创伤、感染、自身免疫、肿瘤等因素引起的各种关节表面疾患；耳廓软骨、鼻、喉软骨支架的缺损、畸形；以及儿童骨骺生长板的创伤、早闭、坏死等。由于软骨组织几乎没有自我修复能力，所以必须利用软骨或其它替代材料进行修复。
自体软骨组织移植疗效可靠，但必须以牺牲人体正常组织为代价，且患者要多遭受一次手术的痛苦。此外，自体组织来源有限，小块移植物还有易变形的问题。
目前，虽然有一些人工合成的软骨组织代用品，还存在着组织相容性、材料机械特性等方面的缺陷，尚不能满足临床上的各项要求。
组织工程学为软骨组织缺损的治疗开辟了新的途径。组织工程用少量细胞在体外扩增，然后接种到生物可降解材料上，构建成组织，用于移植，修复缺损。
构建组织工程化软骨组织的重要条件之一是必须获得大量的有功能和活力的软骨细胞，研究表明，原代单层培养的软骨细胞能够持续表达特异性II型胶原数日至数周，但在随后的传代培养中，软骨细胞发生“去分化”，即向成纤维样细胞转化，开始表达I型和III型胶原，丧失分泌软骨基质的能力，植入体内后已无成软骨能力，所以难以用少量自体组织经体外培养扩增后来获得大量有正常功能的软骨细胞，限制了其在临床的应用。
因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、可操作性强的组织工程化软骨。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的安全性高、制法简便的组织工程化软骨。
本发明的另一目的就是提供所述组织工程化软骨的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种一种组织工程化软骨移植物，它包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)软骨细胞，所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的胚胎软骨细胞。
在一优选例中，所述的软骨细胞是同种异体的。
在另一优选例中，所述的移植物为液态，且软骨细胞的含量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的移植物为固态，且软骨细胞的含量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的软骨细胞表达II型胶原。
在另一优选例中，所述软骨细胞来源于3-10月龄自然流产人胎儿的软骨。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。
在本发明的第二方面，提供了一种制备组织工程化软骨移植物的方法，包括步骤将软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，形成移植物，其中所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的软骨细胞。
在一优选例中，移植物中软骨细胞的含量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。
图1是人胎儿软骨细胞的增殖率曲线。
图2是人胎儿软骨细胞的增殖曲线。
图3是以胎儿软骨细胞为种子细胞来源，裸鼠体内构建的组织工程化软骨的照片(大体观)。
图4是组织工程化软骨的HE染色照片，表明组织工程化软骨组织学观察与正常软骨组织结构接近(HE染色，×200)。
具体实施例方式
同种异体软骨组织作为一种移植物来源，因其独特的结构和免疫学特性，而引起研究者和临床医生的兴趣。同种异体来源的软骨细胞具有来源广泛，取材容易，一次可获取大量细胞的优点，此外，由于成熟的软骨组织属于无血管结构的组织，在很大程度上隔离了免疫细胞，使得组织工程化软骨组织能够在体内长期存活。
不同生长、发育阶段的同种异体软骨细胞可以在有组织相容性差异，并且具有完全免疫功能的同种异体动物体内形成软骨组织。本发明人经过广泛而深入的研究，发现胚胎来源的软骨细胞所形成的组织工程化软骨比新生及成年动物来源的软骨细胞所形成的新生软骨在受体体内存留的时间要显著延长。因此，胚胎来源的软骨细胞可以作为组织工程化软骨组织的种子细胞来源。尤其是体外培养原代至第六代的软骨细胞具有较强的增殖能力，可与药学上可接受的降解材料一起构成组织工程化软骨移植物，有效地用于修复软骨损伤。在此基础上完成了本发明。
术语术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如纯化的细胞因子或分离的细胞因子。
术语“异种移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。
术语“自体移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某个体中取出并再施用于另一不同病人的方法。
本发明的软骨细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的软骨细胞，通常，本发明的软骨细胞的是同种异体的。一种优选的来源是来自自然流产的人胎儿，以3-10月胎龄左右为佳。获取软骨的部位也没有特别限制，可以是关节软骨、肋软骨或其他软骨。
分离获得软骨细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是通过胰酶、胶原酶消化进行分离，即用无血清F-12培养基(GIBCO公司)将胰酶或胶原酶浓度调整至0.1-5mg/ml(较佳地约为1mg/ml)，37℃±2℃恒温振荡器内消化约4-20h。检测时，可采用台盼蓝染色，显微镜下计数。通常，原代细胞活力＞50％即可。
软骨细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将软骨细胞在体外CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)1)F-12培养基(GIBCO公司)+10％胎牛血清；2)F-12培养基(GIBCO公司)+20％小牛血清；3)F-12培养基(GIBCO公司)+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进软骨细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。
适用于本发明的软骨细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的软骨细胞是体外培养的原代-第六代细胞。因为这一阶段软骨细胞具有较强的增殖力。对于这一阶段的软骨细胞，免疫组织化学染色证明了它们表达II型胶原，而原位杂交检测证实了其中有II型胶原mRNA表达。
可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。
优选的医学上可接受的生物可降解材料是可注射性的材料，例如藻酸钙凝胶、聚环氧乙烷等。
本发明组织工程化软骨中的软骨细胞浓度通常约为1×106/ml至1×108/ml或更高。当材料为可注射性材料时，以该液体材料调整软骨细胞浓度；当材料为固体性材料时，以培养液调整软骨细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以该固体材料能够吸附的培养液最大量为准。
在本发明的组织工程化软骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持软骨细胞表型、促进软骨细胞生长或基质合成能力等，或者促进组织生长、血管、神经长入等。
本发明的组织工程化软骨的制备方法简便，将一定数量的所述软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合即可。
用本发明方法形成的组织工程化软骨，分为两类，一类是软骨细胞与可注射性生物材料构成的复合物，该复合物可直接注射到皮下、软骨缺损处等体内各部位。另一类是软骨细胞与非可注射性复合物，该复合物可直接植入体内皮下、软骨缺损处等体内各部位。
本发明的优点在于(1)解决了软骨组织工程化构建种子细胞来源不足的问题，流产的胚胎可提供大量的软骨细胞来源；(2)胚胎软骨细胞较成年软骨细胞活力旺盛，基质分泌能力强，软骨组织形成速度快；(3)该细胞生物材料复合物可在适宜条件下保存，为临床修复软骨组织缺损提供“现货供应”的组织工程化软骨。省却病人自体软骨细胞培养所需的较长的等待时间。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人胚胎软骨细胞的分离培养自然流产的人胎儿，5月胎龄左右；产下10小时内。无菌操作分离关节软骨将收获的软骨块切成约2mm×2mm大小的碎片，置于15ml离心管中，PBS冲洗2次，按1g软骨组织加入15mg II型胶原酶的比例混合，并用无血清F-12培养基将II型胶原酶浓度调整至1mg/ml。37℃恒温振荡器内消化16h后，以150目不锈钢网过滤，1500r/min离心，去上清，PBS洗2次，F-12条件培养基重悬软骨细胞，台盼蓝染色，显微镜下计数，细胞活力＞85％的可用于组织构建。
从流产的胎儿关节软骨中分离软骨细胞的得率是2×107-4×107个/克人胎儿关节软骨，活力为90％。五月胎龄的胎儿可得关节软骨重量平均为5g。
实施例2人胚胎软骨细胞体外增殖规律每代细胞经培养扩展后得到的细胞数，除以培养前接种的细胞数就是该代次细胞的增殖率；根据不同代次细胞的增殖率绘出增殖率曲线。假设原代细胞数为1，根据前述计算得出的增殖率，推算经扩展每一代次可得到的细胞数，据此再绘出细胞的增殖曲线。
结果如图1和图2所示，人胎儿软骨细胞在体外单层传代培养时，原代几乎不增殖，第一代开始增殖，第二、三代时增殖率最大；连续传代至第六代丧失增殖能力。
实施例3人胚胎软骨细胞体外培养基质合成规律免疫组织化学检测含培养单层软骨细胞的盖玻片置PBS漂洗，按DAKO EnVisionTM+System，Peroxidase(DAB)试剂盒(DAKO，Carpinteria，CA)提供的操作程序进行I、II、III型胶原的免疫组织化学检测。(一抗为来自OncogeneTM公司的鼠抗人I型胶原、II型胶原、III型胶原的单克隆Ig G)。用成纤维细胞作II型胶原的阴性对，作I型胶原、III型胶原的阳性对照，并设空白对照。
原位杂交接种在盖玻片上的软骨细胞用3％多聚甲醛固定。用地高辛标记的DNA试剂盒，分别作I、II、III型胶原mRNA的原位杂交检测。用成纤维细胞作对照，并设空白对照。免疫组化、原位杂交结果显示，原代、第一代、第二代软骨细胞只表达II型胶原；至第三代开始出现I、III型胶原的表达，II型胶原渐减少；到第六代II型胶原的表达消失。
实施例4软骨细胞-生物材料复合物的制备将原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代的细胞悬液分别离心(1500r/min)，倾去上清，将细胞沉淀与可注射性生物材料Pluronic F-127(一种市售的聚环氧乙烯商品)在4℃下充分混合，浓度为5×107个细胞/ml，制成细胞-聚环氧乙烯复合物。用2ml注射器吸取复合物备用。
实施例5组织工程化软骨构建逐次取每代人胎儿软骨细胞和30％Pluronic-F127混匀，使细胞终浓度为5×107/ml，无菌条件下，将软骨细胞-Pluronic-F127复合物注入裸鼠背部皮下，每点0.5ml。六周后取材。
结果如图3和图4所示。以胎儿软骨细胞为种子细胞来源，裸鼠体内构建的组织工程化软骨，不仅在大体观上与正常软骨相似，而且HE染色也表明组织工程化软骨组织学观察与正常软骨组织结构接近。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种组织工程化软骨移植物，其特征在于，它包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)软骨细胞，所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的胚胎软骨细胞。
2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的软骨细胞是同种异体的。
3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物为液态，且软骨细胞的含量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物为固态，且软骨细胞的含量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的软骨细胞表达II型胶原。
6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述软骨细胞来源于3-10月龄自然流产人胎儿的软骨。
7.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。
8.一种制备组织工程化软骨移植物的方法，其特征在于，包括步骤将软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，形成移植物，其中所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的软骨细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，移植物中软骨细胞的含量为1×106个细胞/ml-1×108个细胞/ml。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。
全文摘要
本发明提供了一种同种异体组织工程化软骨移植物，它包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)软骨细胞，所述的软骨细胞为体外培养原代至第六代的软骨细胞。本发明的同种异体组织工程化软骨可有效地治疗软骨病损。本发明还提供了该组织工程化软骨的制备方法和用途。
文档编号C12N5/08GK1476903SQ02136560
公开日2004年2月25日 申请日期2002年8月19日 优先权日2002年8月19日
发明者曹谊林, 刘伟, 崔磊 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院