专利名称：新型人细胞信号相关蛋白，其编码序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的人细胞信号相关分子PHDP多肽及其多核苷酸编码序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。PHDP是一种新的与细胞信号传导有关的细胞内可溶性蛋白，具有PH结构域介导的细胞膜转位活性。
背景技术：
对于多细胞生物，细胞间及细胞内部信号的正确传导对保持各细胞间的相互协调是十分重要的。细胞内部信号传导有多种途径，尤以蛋白磷酸化为特征的一系列信号传导过程，因涉及到细胞基因的表达与调控，与许多病理与胜生理过程有关而引起人们的重视。不同的信号分子之间相互识别、准确无误地传递信号，不仅依赖于信号分子所特有的激酶区(催化靶分子特定氨基酸残基磷酸化)，更有赖于各信号分子特定的相互识别与结合部位。这些识别与结合部位可主要分为3类Src Homology 2(SH2)结构域、Src Homology 3(SH3)结构域和Pleckstrin Homology(PH)结构域。
PH结构域(血小板-白细胞C激酶底物同源结构域)是一种存在于多种信号传导蛋白和细胞骨架相关蛋白中的大约由120个氨基酸组成的功能性区域。由于它们与血小板-白细胞C激酶底物(pleckstrin)中的一段重复序列具有同源性，所以称为Pleckstrin Homology(PH)结构域。这一同源区的频繁出现是Mayer等和Haslam等分别于1993年进行计算机基因库资料分析时发现的。PH结构域是胞内信号传导相关蛋白的重要组成部分。目前已经发现的含有PH结构域的蛋白质有100多种，主要为一些参与信号转导的分子，分属于GAP/GRF/GEF(GTP交换因子)、蛋白丝/苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、磷脂酶C(PLC)、生长因子受体结合蛋白(Grb)、和酵母分泌蛋白(Sec)等家族，其中大部分该类蛋白与细胞膜表面受体的信号转导下游事件有关。PH结构域在信号转导分子中的广泛分布提示，它可能与SH2和SH3结构与功能类似，在细胞信号转导网络中介导信号分子之间的相互作用。目前的研究显示PH结构域具有多种功能活性，包括结合G蛋白βγ亚单位、蛋白激酶C(PKC)和磷酸肌醇等，从而参与蛋白质-蛋白质及蛋白质-脂质的相互作用。
在二级结构上，PH结构域由两个几乎相互垂直的、分别含有两个反向平行的3股和4股的β片层和一个C端的α螺旋构成。PH结构域中存在6个保守区域，分别位于1-13、14-23、24-31、32-55、56-66、和67-88之间，其中第三个保守区的保守性最差。每个保守区中含有数个保守的疏水残基，表明每个亚结构域具有一个或多个二级结构元件。保守区之间由不同数目的氨基酸残基插入而间断，这些插入部位可能是蛋白质结构中暴露出来的肽环。环的长度，尤其是β1/β2、β3/β4、β6/β7之间的环在不同的PH结构域中变化很大，可能与配体的结合有关。不同蛋白质中的PH结构域在一级结构上的同源性并不很高，但是对其空间结构的研究发现，其肽链主链折叠方式基本相同，这样就在结构上证实了PH结构域是一类真正的功能性结构域。
随着对包含PH结构域蛋白的结构和生物学功能研究的深入，人们发现PH结构域可能在多种细胞信号事件中均发挥重要功能。PH结构域的异常可导致与信号转导途径中其他分子得相互作用异常，从而可引起多种遗传性疾病。如酪氨酸蛋白激酶Btk(bruton tyrosine kinase)PH结构域中的R28C突变与XID小鼠的性染色体连锁性免疫缺陷症(XID)有关。在人类性染色体连锁性底γ球蛋白血症(XLA)中也发现Btk的PH结构域中数个位点突变。
鉴于信号相关蛋白的重要作用，本领域迫切需要开发新的细胞信号相关蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人细胞信号相关蛋白PHDP蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的PHDP多肽，该多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且在血清刺激情况下发生细胞膜转位的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少40％相同性(a)编码上述人PHDP的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中84-1553位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-3675位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有人PHDP蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达人PHDP蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人PHDP蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的人PHDP多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-3675个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人PHDP多肽活性的化合物，以及抑制人PHDP多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人PHDP多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在PHDP蛋白的方法，它包括将样品与PHDP蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在PHDP蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与人PHDP多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人PHDP多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人PHDP多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人PHDP蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人PHDP多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗肿瘤、炎症、神经系统和心血管病等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1是本发明的人PHDP蛋白的PH结构域与其他家族成员的PH结构域同源性比较图。与PH结构域一致(consensus)序列相同的氨基酸在多个个序列之间用灰体标出，相似的氨基酸用方框标出。序列上方为α螺旋和β片层所在位置图2是本发明的人PHDP蛋白的Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲线图。
图3是本发明的人PHDP RT-PCR表达分析。
图4是本发明的人PHDP Northern印迹杂交所显示的分布。结果提示PHDP是一种具特定组织分布的分子。
图5是本发明的人PHDP蛋白表达的Western印迹分析，提示PHDP蛋白表达于某些肿瘤细胞中。
图6A-6D是本发明的人PHDP蛋白的免疫荧光分析，提示PHDP具有PH结构域介导的细胞膜转位活性。图6A显示了三种不同的PHDP-GFP融合表达载体的编码蛋白全长(FL)，N端PH结构域(N105)以及C端无PH结构域的361个氨基酸(C361)；以VNG-FL(图6B)、VNG-N105(图6C)和VNG-C361(图6D)转染细胞，经血清饥饿后再以20％血清刺激。在Confocal显微镜下每60秒拍摄照片。
具体实施例方式
经大规模随机测序和同源比较，本发明人从人骨髓基质细胞cDNA文库中分离到一个全长新基因，其所包含的ORF可编码一个含有Pleckstrin Homology(PH)结构域的蛋白，因此将该新基因命名为PHDP(Pleckstrin HomologyDomain-containing Protein)。该分子与人CK2相互作用蛋白(CK2 interactingprotein)和小鼠来源的一个推定蛋白TNF细胞内结构域相互作用蛋白(TNFintracellular domain-interacting protein)高度同源，尤其在PH结构域附近区域同源性更高。PHDP在多种正常人组织和肿瘤细胞中均有表达。经荧光显微镜和Confocal显微镜分析显示，PHDP的绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白在20％血清刺激下可迅速转移到细胞膜上；而缺失PH结构域的PHDP蛋白没有表现出信号的膜转位。这提示PHDP蛋白能够通过与膜磷脂的结合介导信号分子的相互作用。
人细胞信号相关蛋白PHDP与已知包含PH结构域的蛋白具有较高的同源性，而且至少在血清诱导下，PH结构域可介导PHDP的细胞膜转位。因此，这提示PHDP与其他包含PH结构域的蛋白一样能够通过与膜磷脂的结合介导信号分子的相互作用，从而参与细胞的信号传导功能，调控多种生理和病理活动，发挥重要作用，并可能在组织生长发育、抗肿瘤以及免疫功能调节等多个领域的免疫诊断和免疫治疗方面具有重要的开发和应用价值。
在本发明中，术语“PHDP蛋白”、“PHDP多肽”或“包含血小板-白细胞C激酶底物同源结构域的细胞信号相关蛋白PHDP”可互换使用，都指具有人包含血小板-白细胞C激酶底物同源结构域的细胞信号相关蛋白PHDP的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的PHDP蛋白或多肽”是指PHDP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化PHDP蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人PHDP蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人PHDP蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人PHDP多肽”指具有人PHDP蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人PHDP蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人PHDP蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人PHDP DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人PHDP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人PHDP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人PHDP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人PHDP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人PHDP蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人PHDP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人PHDP蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码PHDP蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的人PHDP核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al. Science1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或PHDP蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的PHDP多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人PHDP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人PHDP多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J BioChem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人PHDP编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人PHDP蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗PHDP蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗PHDP蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人PHDP蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人PHDP蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人PHDP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人PHDP基因产物或片段。较佳地，指那些能与人PHDP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人PHDP蛋白的分子，也包括那些并不影响人PHDP蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人PHDP基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人PHDP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人PHDP蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人PHDP蛋白功能的抗体以及不影响人PHDP蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人PHDP基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人PHDP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人PHDP蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人PHDP蛋白。此外，与人PHDP蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人PHDP蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人PHDP蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人PHDP蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人PHDP蛋白阳性的细胞(例如淋巴结细胞等)。
多克隆抗体的生产可用人PHDP蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与PHDP蛋白发生相互作用的物质，如配体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽或其激动剂或拮抗剂可直接用于或协助疾病治疗，例如，用于肿瘤、炎症，神经系统和心血管病方面的治疗。在使用时，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明PHDP多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的PHDP蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
人PHDP蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于PHDP蛋白的无表达或异常/无活性的PHDP蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的PHDP蛋白，以抑制内源性的PHDP蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将PHDP基因转移至细胞内。构建携带PHDP基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人PHDP基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
抑制人PHDP mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与人PHDP蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人PHDP蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人PHDP蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人PHDP蛋白水平，可以用作解释人PHDP蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断PHDP蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在PHDP蛋白的方法是利用PHDP蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与PHDP蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在PHDP蛋白。
PHDP蛋白的多聚核苷酸可用于PHDP蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，PHDP蛋白的多聚核苷酸可用于检测PHDP蛋白的表达与否或在疾病状态下PHDP蛋白的异常表达。如PHDPDNA序列可用于对活检标本的杂交以判断PHDP蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用PHDP蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测PHDP蛋白的转录产物。
检测PHDP基因的突变也可用于诊断PHDP蛋白相关的疾病。PHDP蛋白突变的形式包括与正常野生型PHDP DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明PHDP蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人骨髓基质细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为3675个碱基，其开放读框位于84-1553位，编码全长为490个氨基酸的人PHDP蛋白(SEQ ID NO2)。PHDP蛋白在结构上含有一个Pleckstrin Homology(PH)结构域。PHDP与人CK2相互作用蛋白具有一定的同源性，全序列的相似性(Similarity)为43％，一致性(Identity)为32％。PHDP和小鼠来源的一个推定蛋白TNF细胞内结构域相互作用蛋白也表现同源，尤其在PH结构域附近区域同源性更高。RT-PCR和Western分析表明，造血系细胞如U-937、K-562、KG-1、MOLT-4、NAMALWA和Reh细胞等，肿瘤细胞系如肺癌、结肠腺癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、上皮癌等细胞系均不同程度表达PHDP。在正常成人组织中PHDP mRNA表达比较广泛，如心脏、骨骼肌、胸腺、脾脏、肝脏、甲状腺、淋巴结、骨髓等组织。细胞膜转位试验显示，至少在血清诱导下，PHDP的细胞膜转位是由PH结构域介导的。已进行的研究提示，PHDP可能与其他包含PH结构域的同源蛋白相似，通过与蛋白或膜脂的结合来介导信号分子的相互作用，参与细胞信号传导，调控多种生理和病理活动，具潜在的细胞分化分化发育调控、抗肿瘤作用。因此，PHDP蛋白或其相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗肿瘤、神经系统和遗传性等疾病提供新的免疫诊断和靶向治疗途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人PHDP cDNA的克隆用Trizol试剂(Life Technologies公司)提取人骨髓基质细胞总RNA。然后，从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后，用SuperScriptII克隆试剂盒(Life Technologies)。将cDNA片段定向插入到载体的多克隆位点上，转化DH5α细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5’末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO2所示)。此蛋白质被命名为人细胞信号相关蛋白PHDP，其编码基因命名为人PHDP基因。
序列SEQ ID NO1全长为3675bp，包括83bp的5’端非编码区和2119bp的3’端非编码区，编码含490个氨基酸的多肽。理论上计算未糖基化的成熟分子的分子量约为53.35 kD，计算等电点为5.19。PHDP蛋白的Kyte-doolitte疏水性分析(图2)提示该蛋白为可溶性蛋白。
BLAST分析(图1)表明其与已知基因不同，与人CK2相互作用蛋白序列同源，相似性为43％，一致性为32％。此外，PHDP与其他包含PH结构域的蛋白如小鼠推定的TNF细胞内结构域相互作用蛋白在PH结构域中表现较高水平的同源。
实施例2用RT-PCR方法进行人PHDP的细胞表达分析用Trizol试剂提取处于对数生长期相应细胞系的细胞总RNA，取5μg细胞总RNA与1μg Oligo-dT12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μl ddH2O进行稀释。PCR扩增引物如下有义引物5’GCA GAG AGT GCAGAA CCG T(SEQ ID NO3)，反义引物5’T TCT CCT GTA GAG GGT CAC(SEQ IDNO4)，同时以β-肌动蛋白作为阳性对照。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，扩增参数为95℃15秒、57℃30秒、72℃30秒，28个循环后PCR产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与SEQ ID NO1所示的936-1545完全相同。
实验结果(图3)提示，PHDP mRNA在U-937、K-562、HL-60、KG-1、MOLT-4、Jurkat、NAMALWA、Reh、MCF7、HT-29、HeLa、PC-3和A431细胞中均有不同程度的表达，在NB4、A549、LoVo和Caov-3中未见表达。
实施例3人PHDP的Northern印迹分析按如下常规方法进行Northern印迹待检滤膜置于10ml经68℃预热的杂交液，在杂交炉(Bellco)中于68℃预杂交30分钟；将标记好的cDNA探针于95～100℃变性2～5分钟，置冰上迅速冷却后加入杂交液(cDNA探针终浓度为2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混匀，于68℃杂交2小时。杂交结束后，滤膜用2×SSC、0.05％SDS室温淋洗数次，继振荡冲洗30～40分钟，其间更换洗液数次。随后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振荡冲洗20～40分钟。最后滤膜用塑料保鲜膜包裹，于-70℃曝光X线胶片24～48小时。
Northern印迹杂交结果(图4)显示在正常成人组织中PHDP mRNA表达比较广泛，如心脏、骨骼肌、胸腺、脾脏、肝脏、胎盘、肺、外周血白细胞、甲状腺、淋巴结、气管、肾上腺、骨髓等组织，其中在心脏、骨骼肌、胸腺、甲状腺中表达水平较高。在脑、结肠、肾脏、小肠、胃、脊髓中未见表达。这表明PHDP蛋白是一种特定表达的蛋白。
实施例4人PHDP重组表达在该实施例中，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，以抽提的骨髓细胞mRNA为模板进行RT-PCR，或者以实施例1中的全长质粒DNA为模板进行扩增，获得人PHDP DNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-AC GGA TCC ATG GAG GAG GAG GGT GTGA A-3’(SEQ ID NO5)该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是翻译起始码和人PHDP的编码序列；3’端引物序列为5’-GC GAA TTC CTA GGG TGC ACT TCT CCT GTA G-3’(SEQ ID NO6)该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人PHDP的部分编码序列。
将获得的PCR产物纯化后经BamH I/EcoR I酶切再与质粒pGEM-3ZF按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌BL21，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。将正确序列的人PHDP cDNA EcoR I酶切片段克隆至表达载体pGEX-2T(Pharmacia公司)，形成载体pGEX-2T-PHDP，然后转化大肠杆菌BL21。阳性克隆用BamH I/EcoRII酶切鉴定，产物行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实，已插入了所设计的PHDP编码序列。
挑表达PHDP的阳性BL21克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃ 300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH 8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到人PHDP-GST融合蛋白。融合蛋白的分子量大小与预测值相符。
实施例5抗人PHDP抗体的产生将实施例4中获得的重组蛋白人PHDP用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人PHDP基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。
实施例6PHDP蛋白表达的Western检测收集细胞(5×106细胞/样品)，用PBS洗一遍后，用T-PERTM Tissue ProteinExtraction Reagent提取全蛋白，具体操作按试剂盒说明进行。之后用BCA法测定蛋白浓度，调节至一致后，样品每20μl与4μl 6X上样缓冲液(100mmol/LTris-HCL，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，PH6.8)混匀，于100℃水浴煮沸5分钟后，行12％SDS-PAGE电泳，随后以100V恒定电压于4℃把聚丙烯酰胺中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色并标记方向，标出蛋白分子量标准所在位置。室温阻断4小时(10％脱脂奶粉的TBST溶液)，将兔源PHDP多抗按1∶1000稀释于脱脂奶粉溶液中，正常兔血清为阴性对照，与硝酸纤维素薄膜于室温反应2小时后，用TBST(0.05％Tween20的TBS溶液)洗涤3次，每次10分钟。然后加以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶2000稀释)，室温孵育60分钟，TBST洗三次，每次10分钟，将Western印迹荧光检测试剂中的A液和B液以等体积混和，室温孵育1分钟后，甩干，压膜，曝光，显影。
Western印迹结果(图5)显示HeLa、MOLT-4、Jurkat、HL-60、K-562、U-937细胞中均有PHDP蛋白的表达。蛋白条带的分子量约为54kD，与预测分子量基本一致。
实施例7PHDP-GFP(绿色荧光蛋白)真核融合表达载体的构建在该实施例中，以实施例1中的全长质粒DNA为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人PHDP DNA作为插入片段。PCR反应参数为95℃ 15秒，58℃ 30秒，72℃ 45秒，20循环后72℃延伸10分钟，全长PHDP(FL)上游引物为5′-G GAT CCC TGG AAG CGA GTG GCG GA-3′(5′端含BamH I位点)(SEQ ID NO7)，下游引物为5′-GG TAC C GGTGCA CTT CTC CTG TAG AG-3′(5′端含KpnI位点)(SEQ ID NO8)，产物编码全长PHDP蛋白。
PHDP的PH结构域(N105)上游引物为5′-G GAT CCG ATG GTG GAC AAG GCTGGC T-3′(5′端含BamH I位点)(SEQ ID NO9)，下游引物为5′-GG TACCTT GCC TCG GTT AAT CCC TTC-3′(5′端含Kpn I位点)(SEQ ID NO10)，产物编码PHDP蛋白的PH结构域(105个氨基酸)。
不包含PH结构域(C361)上游引物为5′-CAG GAT CCC GAT GAG GTA AAGGTG GAC-3′(5′端含BamH I位点)(SEQ ID NO11)，下游引物为5′-GGTAC CCT CCT GTA GAG GGT CAC CA-3′(5′端含Kpn I位点)(SEQ ID NO12)，产物编码PHDP蛋白的缺失PH结构域的C端361个氨基酸。
PCR产物纯化后直接与pGEM-T载体按常规方法重组并转化至感受态细菌DH5α。挑取白色克隆进行鉴定、纯化并测序(测序引物为T7和SP6及基因特异性引物GAG TGC AGA ACC GTC CCA)。将正确序列的酶切片段经纯化后克隆至表达载体pNGFP经酶切鉴定阳性克隆后，重组子分别记为VNG-FL(全长)、VNG-N105(PH结构域)和VNG-C361(无PH结构域)(图6A)。经测序证实，已插入了所设计的PHDP编码序列。
实施例8PHDP蛋白的免疫荧光分析以实施例7中所构建的三种PHDP全长或片段的GFP融合表达载体质粒DNA利用LipofectAMINE试剂(Invitrogen)进行真核细胞COS-7的基因转染，以pNGFP质粒载体作为无关对照。瞬时转染细胞于转染后36小时以胰酶消化，铺于无菌盖玻片上，以含有0.5％胎牛血清的DMEM培养基进行血清饥饿18小时，随后在共聚焦显微镜下以含20％血清的培养基刺激细胞10分钟，并进行实时观察。
结果(图6B、6C和6D)显示血清饥饿条件下VNG-FL、VNG-N105和VNG-C361转染细胞的荧光信号均散在分布在胞浆内；加入20％血清后，VNG-FL和VNG-N105细胞荧光信号在2分钟即开始迅速转移到细胞膜上，并可一直持续到10分钟以后；而VNG-C361转染细胞或者GFP转染细胞在加入血清10分钟后荧光信号仍分布在胞浆内。实验结果提示，至少在血清诱导下，PHDP的细胞膜转位是由PH结构域介导的，而且单独的PH结构域已经足以介导这种细胞膜转位和膜结合功能。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>第二军医大学免疫学研究所<120>新型人细胞信号相关蛋白，其编码序列及用途<130>024975<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3675<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(84)..(1553)<223><400>1cttggccggg cgtagacgcg gtggcagagc ccgcgcggcg ctggaagcga gtggcggagc60ggcgggacct cggcggactc gcc atg gag gag gag ggt gtg aag gaa gcc ggt113Met Glu Glu Glu Gly Val Lys Glu Ala Gly1 5 10gag aag cct cgg gga gca cag atg gtg gac aag gct ggc tgg atc aag 161Glu Lys Pro Arg Gly Ala Gln Met Val Asp Lys Ala Gly Trp Ile Lys15 20 25aag agc agt ggg ggc ctc ctg ggt ttc tgg aaa gac cga tat ctg ctc 209Lys Ser Ser Gly Gly Leu Leu Gly Phe Trp Lys Asp Arg Tyr Leu Leu30 35 40ctc tgc cag gcc cag ctg ctg gtc tat gag aat gag gat gat cag aag 257Leu Cys Gln Ala Gln Leu Leu Val Tyr Glu Asn Glu Asp Asp Gln Lys45 50 55tgt gtg gag act gtg gag ctg ggc agc tat gag aag tgc cag gac ctt 305Cys Val Glu Thr Val Glu Leu Gly Ser Tyr Glu Lys Cys Gln Asp Leu60 65 70cgt gcc ctc ctc aag cga aaa cac cgc ttt atc ctg ctg cga tcc cca 353Arg Ala Leu Leu Lys Arg Lys His Arg Phe Ile Leu Leu Arg Ser Pro75 80 85 90ggg aac aag gtc agc gac atc aaa ttc cag gca ccc acc ggg gag gag 401Gly Asn Lys Val Ser Asp Ile Lys Phe Gln Ala Pro Thr Gly Glu Glu95 100 105aag gaa tcc tgg atc aaa gcc ctc aat gaa ggg att aac cga ggc aaa 449Lys Glu Ser Trp Ile Lys Ala Leu Asn Glu Gly Ile Asn Arg Gly Lys110 115 120aac aag gct ttc gat gag gta aag gtg gac aag agc tgc gcc ctg gag 497Asn Lys Ala Phe Asp Glu Val Lys Val Asp Lys Ser Cys Ala Leu Glu125 130 135cat gtg aca cgg gac cgg gtg cga ggg ggc cag cga cgc cgg cca cca 545His Val Thr Arg Asp Arg Val Arg Gly Gly Gln Arg Arg Arg Pro Pro140 145 150acg aga gtc cac ctg aag gag gtg gcc agt gca gct tct gac ggt ctt 593Thr Arg Val His Leu Lys Glu Val Ala Ser Ala Ala Ser Asp Gly Leu155 160 165 170ctg cgc ctg gat ctt gat gtt ccg gac agt ggg cca cca gtg ttt gcc 641Leu Arg Leu Asp Leu Asp Val Pro Asp Ser Gly Pro Pro Val Phe Ala175 180 185ccc agc aat cat gtc agt gaa gcc caa cct cgg gag aca ccc cgg ccc 689Pro Ser Asn His Val Ser Glu Ala Gln Pro Arg Glu Thr Pro Arg Pro190 195 200ctc atg cct cct acc aag cct ttc cta gca cct gag acc acc agc cct 737Leu Met Pro Pro Thr Lys Pro Phe Leu Ala Pro Glu Thr Thr Ser Pro205 210 215ggt gac agg gtg gag acc cct gtg ggg gag aga gcc cca acc cct gtc 785Gly Asp Arg Val Glu Thr Pro Val Gly Glu Arg Ala Pro Thr Pro Val220 225 230tca gca agc tct gag gtc tcc cct gag agc caa gag gac tca gag acc 833Ser Ala Ser Ser Glu Val Ser Pro Glu Ser Gln Glu Asp Ser Glu Thr235 240 245 250cca gca gag gag gac agt ggc tct gag cag cct ccc aac agc gtc ctg 881Pro Ala Glu Glu Asp Ser Gly Ser Glu Gln Pro Pro Asn Ser Val Leu255 260 265cct gac aaa ctg aag gtg agc tgg gag aac ccc agc ccc cag gag gcc 929Pro Asp Lys Leu Lys Val Ser Trp Glu Asn Pro Ser Pro Gln Glu Ala270 275 280cct gct gca gag agt gca gaa ccg tcc cag gca ccc tgt tct gag act 977Pro Ala Ala Glu Ser Ala Glu Pro Ser Gln Ala Pro Cys Ser Glu Thr285 290 295tct gag gct gcc ccc agg gag ggt ggg aag ccc cct aca ccc cca ccc 1025Ser Glu Ala Ala Pro Arg Glu Gly Gly Lys Pro Pro Thr Pro Pro Pro300 305 310aag atc tta tca gag aaa ctg aaa gcc tcc atg ggt gag atg cag gct 1073Lys Ile Leu Ser Glu Lys Leu Lys Ala Ser Met Gly Glu Met Gln Ala315 320 325 330tct ggg cca cct gct cca ggc aca gtg cag gtc tca gtg aat ggc atg 1121Ser Gly Pro Pro Ala Pro Gly Thr Val Gln Val Ser Val Asn Gly Met335 340 345gat gac agt cct gag cct gcc aag ccc tct cag gct gag ggc acc cca 1169Asp Asp Ser Pro Glu Pro Ala Lys Pro Ser Gln Ala Glu Gly Thr Pro
350 355 360gga act cct cca aag gat gca aca aca tcc aca gca ctg ccc ccc tgg 1217Gly Thr Pro Pro Lys Asp Ala Thr Thr Ser Thr Ala Leu Pro Pro Trp365 370 375gac ctg cca cct cag ttc cat ccc cgc tgc tcc tcc ctt ggg gac ttg 1265Asp Leu Pro Pro Gln Phe His Pro Arg Cys Ser Ser Leu Gly Asp Leu380 385 390ctt ggg gaa ggc ccg cgg cat ccc ttg cag ccc agg gaa cgg cta tat 1313Leu Gly Glu Gly Pro Arg His Pro Leu Gln Pro Arg Glu Arg Leu Tyr395 400 405 410cgg gcc cag ctg gag gtg aag gtg gcc tcg gaa cag acg gag aaa ctg 1361Arg Ala Gln Leu Glu Val Lys Val Ala Ser Glu Gln Thr Glu Lys Leu415 420 425ttg aac aag gtg ctg ggc agt gag ccg gcc cct gtt agt gcc gaa aca 1409Leu Asn Lys Val Leu Gly Ser Glu Pro Ala Pro Val Ser Ala Glu Thr430 435 440ttg ctc agc cag gct gtg gag cag ctg agg cag gcc acc cag gtc ctg 1457Leu Leu Ser Gln Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln Ala Thr Gln Val Leu445 450 455cag gaa atg aga gat ttg gga gag ctg agc cag gaa gca cct ggg cta 1505Gln Glu Met Arg Asp Leu Gly Glu Leu Ser Gln Glu Ala Pro Gly Leu460 465 470agg gag aag cgg aag gag ctg gtg acc ctc tac agg aga agt gca ccc 1553Arg Glu Lys Arg Lys Glu Leu Val Thr Leu Tyr Arg Arg Ser Ala Pro475 480 485 490tagggccttc tgggccagag gcaccatccc ttctggccat ccatcaagtc catcaaggcc 1613cagccctgct gagaaatgtg cttctgcttc tacagcaatg gctgcaggag ggccattggg 1673catgtcaggg tttggccatg acccgaagag actcctggcg tccttcctac tctgctctgg 1733ccagtggtgc caggtgccac ccagggctac tgcctggcta tctggcctgg cctctgggct 1793ggggctgggg ctgggagcac acacgctggg acctatgtgt ttgtgtggtc gttccaaact 1853gccccagggc tttgggggcg gcacttgggg tttctgggaa tgacatcatc tctgttcccc 1913atccccagta gtttacattc ctgacttctg aatacagcac agctgagccc cctgcagctc 1973ccatctccag ctattcctag gcaaagagcc tcatggctaa ggcagcctca aagccagccc 2033ctcctcccac ctattctgag tagctgcaga ggccttgggtccaggctcta ggttcatccc2093tcagttgggg ggaacgtagg acccagctgg agcctcttga gggagatgag aggcctcttt 2153gtgaggagga cattagctgt gtggcctctc tctctttggc cctgtttcct tttttgcaaa 2213acaaggacat tttctgcagc cccttcctct cagtgagcta tgattggagg gcttaggtct 2273ggaggattca agagtggaag aggaatttaa ggggtcccct agtctagtct ctgcccctgg 2333atagtgtcca gccttgtata tttctgaaga ggtggatccc agagtggctc tgatgtccac 2393attagaaaag cttacttgta atgatcatgt cagccttcag aagagaatcc ccaccaactt 2453ctgtgcctcc tcagatgggg atttatctgg atctctgtgg ttccttctca gccgaaacag 2513gtccagtatc ccagtcattt cttcaaatgc tgataggggt atgttggaat ccgaagccac 2573ttccccgcct tcaagcccca gatgggctgc tctcctgtaa ctttctagga gaagagacat 2633tttcttcttt ccctttcctg gtccatccct gcaccctggt cctctcccag cctctccccc 2693acattgtccc tgactctagg ggcacatcca gtctccatcg tgctgcagca gctggactga 2753gggcagagcc tgtaggtgca gaggccctgg ctcccgaggt ccagccactc tccctggggc 2813ctctggggtg agagcagctt ccgataggac ctgcccagat ttctgcatgt gcacttttgt 2873ttactgaaag agagaaaggg gggggtcaca gcaacatgcc ctggcctttc tgccctgttc 2933cccaacccca ctgaggcctg ctgcacaggt caatgccttc gttatcgtta ttgtactgtc 2993actttgttct tgaggtagta gtcaaggatc aggaggggca gatgtcttct ctgggctgcg 3053tggggccgga gcagaggtga gcagcaatgc actggttcgg gagcccccat cagcctcctt 3113gtgcaaactg ggcccccatg ccacagtctg gctttccctc catctgcccc aggacaagag 3173caagaaggac atcagttgcc cagtcatgtg atcccctgcc atcttgcctt aggaacagcc 3233ttcccccacc agcagccatg gctggctggg gcgttagcca agccacctac tgccaggaat 3293tggagcctca gttccctcct gtgtcaagta gctaactgca gcagctggac tgagggcaga 3353gtctgtgggt gcagagaccc tgcatgtagg tcacaggttg aggcccagcc actctccctg 3413gggcctggtg ggtaggcaag tagctctggg gccacctcaa gtgaccaaat gctattaatt 3473tccatccttt agcaggctgg gccctaggca ggaagctggc ttctgggaga ggagtgagaa 3533cgtgcagggc ctgcctagct tgcgtgcttg aggaaggtgg cattccgtgc ttgcctcctt 3593gaggagggtg gcattctgtg tcttctgctt atgaagcgcc tttcttaaag tttggcaata 3653aaatccattt ttatggaaaa aa3675<210>2<211>490<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Glu Glu Gly Val Lys Glu Ala Gly Glu Lys Pro Arg Gly Ala1 5 10 15Gln Met Val Asp Lys Ala Gly Trp Ile Lys Lys Ser Ser Gly Gly Leu20 25 30Leu Gly Phe Trp Lys Asp Arg Tyr Leu Leu Leu Cys Gln Ala Gln Leu35 40 45Leu Val Tyr Glu Asn Glu Asp Asp Gln Lys Cys Val Glu Thr Val Glu50 55 60Leu Gly Ser Tyr Glu Lys Cys Gln Asp Leu Arg Ala Leu Leu Lys Arg65 70 75 80Lys His Arg Phe Ile Leu Leu Arg Ser Pro Gly Asn Lys Val Ser Asp85 90 95Ile Lys Phe Gln Ala Pro Thr Gly Glu Glu Lys Glu Ser Trp Ile Lys100 105 110Ala Leu Asn Glu Gly Ile Asn Arg Gly Lys Asn Lys Ala Phe Asp Glu115 120 125Val Lys Val Asp Lys Ser Cys Ala Leu Glu His Val Thr Arg Asp Arg130 135 140Val Arg Gly Gly Gln Arg Arg Arg Pro Pro Thr Arg Val His Leu Lys145 150 155 160Glu Val Ala Ser Ala Ala Ser Asp Gly Leu Leu Arg Leu Asp Leu Asp165 170 175Val Pro Asp Ser Gly Pro Pro Val Phe Ala Pro Ser Asn His Val Ser180 185 190Glu Ala Gln Pro Arg Glu Thr Pro Arg Pro Leu Met Pro Pro Thr Lys195 200 205Pro Phe Leu Ala Pro Glu Thr Thr Ser Pro Gly Asp Arg Val Glu Thr210 215 220Pro Val Gly Glu Arg Ala Pro Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Glu Val225 230 235 240Ser Pro Glu Ser Gln Glu Asp Ser Glu Thr Pro Ala Glu Glu Asp Ser245 250 255Gly Ser Glu Gln Pro Pro Asn Ser Val Leu Pro Asp Lys Leu Lys Val260 265 270Ser Trp Glu Asn Pro Ser Pro Gln Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ser Ala275 280 285Glu Pro Ser Gln Ala Pro Cys Ser Glu Thr Ser Glu Ala Ala Pro Arg290 295 300Glu Gly Gly Lys Pro Pro Thr Pro Pro Pro Lys Ile Leu Ser Glu Lys305 310 315 320Leu Lys Ala Ser Met Gly Glu Met Gln Ala Ser Gly Pro Pro Ala Pro325 330 335Gly Thr Val Gln Val Ser Val Asn Gly Met Asp Asp Ser Pro Glu Pro340 345 350Ala Lys Pro Ser Gln Ala Glu Gly Thr Pro Gly Thr Pro Pro Lys Asp355 360 365Ala Thr Thr Ser Thr Ala Leu Pro Pro Trp Asp Leu Pro Pro Gln Phe370 375 380His Pro Arg Cys Ser Ser Leu Gly Asp Leu Leu Gly Glu Gly Pro Arg385 390 395 400His Pro Leu Gln Pro Arg Glu Arg Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Glu Val405 410 415Lys Val Ala Ser Glu Gln Thr Glu Lys Leu Leu Asn Lys Val Leu Gly420 425 430Ser Glu Pro Ala Pro Val Ser Ala Glu Thr Leu Leu Ser Gln Ala Val435 440 445Glu Gln Leu Arg Gln Ala Thr Gln Val Leu Gln Glu Met Arg Asp Leu450 455 460Gly Glu Leu Ser Gln Glu Ala Pro Gly Leu Arg Glu Lys Arg Lys Glu465 470 475 480Leu Val Thr Leu Tyr Arg Arg Ser Ala Pro485490<210>3<211>19<212>DNA<213>引物<400>3gcagagagtg cagaaccgt 19<210>4<211>19<212>DNA<213>引物<400>4ttctcctgta gagggtcac 19<210>5<211>28<212>DNA<213>引物<400>5acggatccat ggaggaggag ggtgtgaa 28<210>6<211>30<212>DNA<213>引物<400>6gcgaattcct agggtgcact tctcctgtag 30<210>7<211>24<212>DNA<213>引物<400>7ggatccctgg aagcgagtgg cgga 24<210>8<211>26<212>DNA<213>引物<400>8ggtaccggtg cacttctcct gtagag 26<210>9<211>26<212>DNA<213>引物<400>9ggatccgatg gtggacaagg ctggct 26<210>10<211>26<212>DNA<213>引物<400>10ggtaccttgc ctcggttaat cccttc 26<210>11<211>27<212>DNA<213>引物<400>11caggatcccg atgaggtaaa ggtggac27<210>12<211>25<212>DNA<213>引物<400>12ggtaccctcc tgtagagggt cacca 2权利要求
1.一种分离的人PHDP多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且在血清刺激情况下发生细胞膜转位的由(a)衍生的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中84-1553位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-3675位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种具有人PHDP多肽活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达人PHDP多肽的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人PHDP多肽活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的人PHDP多肽特异性结合的抗体。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明通过了一种包含血小板－白细胞C激酶底物同源结构域的细胞信号相关蛋白(Pleckstrin Homologydomain Domain－containing Protein，PHDP)。本发明提供编码此蛋白分子的多核苷酸和经重组技术产生这种蛋白分子的方法。本发明还公开了这种PHDP及其多核苷酸编码序列的用途。本发明证实了PHDP在血清刺激情况下发生细胞膜转位的特征。本发明还公开了抗此蛋白分子用于疾病的诊断及治疗的策略，特别是可用于癌症的诊断和治疗。
文档编号C12P21/02GK1475499SQ0213652
公开日2004年2月18日 申请日期2002年8月16日 优先权日2002年8月16日
发明者李楠, 陈涛涌, 曹雪涛, 李 楠 申请人:第二军医大学免疫学研究所