专利名称：一种检测布鲁加达综合症基因突变的方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属人类遗传学和内科心血管领域，主要涉及特发性室颤布鲁加达(Brugada)综合症SCN5A基因突变的检测方法，及其在预防、诊断及治疗Brugada综合症方面的用途。
该疾病经常显现具有常染色体显性遗传的特点，国外的研究发现心脏钠离子通道α亚单位(voltage-gated sodium channel type V；SCN5A)基因与该疾病有关，自1999年以来已经发现有9个该基因的突变与Brugada综合征有关，它们分别为Frameshift、L567Q、V1398stop、R1432G、R1512W、T1620M、S1710L、Y1795C、A1924T。但目前都没有申请相关的专利。
Brugada综合征作为引起特发性室颤猝死的重要疾病之一，其死亡的方式是“健康的”突然的死亡，在预防上可能较那些有心脏结构和功能异常的患者更加被动和消极。目前虽然有众多研究表明其中存在着SCN5A基因上的突变，但作为带有遗传倾向的疾病，它存在种族间的差别，中国患者体内的基因突变可能与已经在欧美患者上发现的基因突变点不同，所以不揭示中国人特发性室颤的基因突变情况，而仅依赖国外的研究成果，显然不能够保障中国人的生命安全。
直接基因测序作为现在分析基因组信息学的主要技术平台，已经相当成熟、便捷。所以我们采用Sanger双脱氧链终止法双向测序法对1个Brugada综合征家系进行基因测序，分析存在的可能突变。
本发明通过PCR及测序法获得Brugada综合征的一种SCN5A突变基因，再通过RT-PCR方法获取野生型SCN5A的cDNA，利用克隆技术构建该基因的重组体，通过定点突变技术获取该基因的突变重组体，并将上述重组体转染入HEK293细胞中，用于Brugada综合征的防治研究。
本发明方法通过以下步骤实现1)采用盐析法获取相应的基因组核苷酸序列；2)获取目的基因(SCN5A，编码心肌快钠离子通道Alpha亚单位)的27个外显子的PCR产物；3)采用Sanger双脱氧链终止法双向测序法分析各自的核苷酸序列，发现Brugada综合征患者的SCN5A基因第22个外显子存在缺陷，是1个杂合基因移码突变，在4087位置上插入一个C，其序列为4150 tcactgcgga cgctgcgtgc actccgtcct ctgagagcct ctgtcacgatttgagggcat gagg 4114；4)获取健康个体心肌组织样本；5)通过RT-PCR法获取SCN5A基因的cDNA，引物序列为PrimerSCN5AfGGAAGCTTTGTGCCCAGAAGCAGGAHind IIIPrimerSCN5ARGAGATATCCCCCAGGCTGGTTTGTGEcoR V6)构建野生型SCN5A基因的质粒重组体；7)将野生型SCN5A基因的质粒重组体(SCN5A-pcDNA3.1)，通过定点突变获取突变型SCN5A-pc DNA3.1，突变位于整个重组体中的第4887个与第4889之间。
本发明构建的SCN5A重组体，其载体为pcDNA3.1(+)，构建重组体所使用的限制性内切酶为Hind III和EcoR V。
本发明利用脂质体转染法将该野生型SCN5A重组体和突变型SCN5A重组体转染入HEK293细胞中，通过G418进行抗性筛选。
利用本发明的检测方法可以用于人群中Brugada综合征高危患者的早期诊断，而转染成功的细胞可以用于研究防治该综合征的特异性药物。
图2为SCN5A基因4087insC突变及相应的氨基酸变化。
图3为SCN5A基因突变后造成的通道蛋白结构改变模式图。
图4为以Hind III和EcoRV作为限制性内切酶构建野生型SCN5A基因重组体的构建。
图5为野生型SCN5A基因重组体酶切鉴定。
图6为SCN5A重组体定位突变示意图。
实施例11、Brugada综合征家系和正常健康人资料的收集1个Brugada综合征家系成员共11人，其中临床诊断患病者3例，正常8例。另设对照组30例，均为正常南方汉族人群。临床诊断Brugada综合征的标准为1ECG呈右束支传导阻滞，伴V1-V3导联ST段下斜型抬高，变化时隐时现，且PR及QT间期正常；2反复发生晕厥，特发性室颤发生率高；3无明显器质性心脏病证据。符合以上3点诊断为Brugada综合症。仅有第一点的诊断Brugada型心电图。
先证者，男，37岁，以“心肺复苏术后6天”入院。患者于入院前6天无明显诱因突发晕厥，意识丧失，伴大汗，面色苍白，四肢抽搐。心电图示心室纤颤。经心肺复苏10分钟后意识恢复。入院后行心电图示Brugada型心电图，见
图1(ECG呈右束支传导阻滞，V1-V2导联ST段马鞍形抬高，PR及QT间期正常)，超声心动图及冠状动脉造影均未见异常。诊断为Brugada综合症，于2001.7.18安装ICD。2、相应的基因组DNA样本制备抽取Brugada综合征家系成员和正常健康人的血样标本，采用Qiagen公司全血基因组DNA抽提试剂盒提取各自的基因组DNA，具体方法参考试剂盒说明书。3、获取SCN5A基因采用聚合酶链反应(PCR)扩增SCN5A基因。根据Genbank SCN5A基因组全序列(序列号M77235)设计27个外显子的引物。其引物为OptimumExon primer sequence length Product LengthTmExon2 AGCCTCTCTGCAAATGGTGT 20 60℃ 498bpTTGACAAGGGAGTTGCACAG 20Exon3 GCCTTTCTACACAAGGGCCTA21 60℃ 294bpTAGGACCAGCAGGGAATCAG 20Exon4 GGTAGCACTGTCCTGGCAGT 20TGGACTCAAGTCCCCCTTC 19Exon5 TCACTCCACGTAAGGAACCTG21 60℃ 约300bpATGTGGACTGCAGGGAGGAAGC 22Exon6 ATTTGTCGGCTCTTCGAACTT21 456bpAAGCATGTCCACTGCCAATAG21Exon7 CCACCTCTGGTTGCCTACAC 20 60℃ 约400bp
CTGCGGTCTCACAAAGTCTTC 21Exon8 TGGGGTCAGGGCATAAATAG20 62℃ 300bpGAGTGCCCCTCACCAGCAT 19Exon9-10 GTGGCACTAGGTTTGTGAAGC 21 60℃ 1271bpTCCTCACTAACAGGCACGTCT 21Exon11-12 GGCTGCACAAAGTCTCAATG20 60℃ 1302bpTCAGTTTGGGAGACCAGACC20Exon13-14 CCAGTGTCCCATCAAGACCT20 58℃ 1550bpTCCTTACCCATGAAGGCTGT20Exon15 GAGCAGGCTGGAGAAGAGAG20 58℃ 478bpTGGGTGAAGGCATGACAGAT20Exon16 GCTTTCAGGCAGGAGCTAGA20 60℃ 533bpGGGTGGGTAGCTGGGTAGAT20Exon17 CTCGGAGCTGTTTGTCACAG20 60℃ 819bpAGGGCATGAGTGGTGGATAG20Exon18 TGAAGACAGCTGGAGGCAAT20 60℃ 464bpGTACCGTCTCTCCCCTGTCA20Exon19 GAGGCCAAAGGCTGCTACTCAG 22 60℃ 约300bpCCTGTCCCCTCTGGGTGGAACT 22Exon20 AAGAGTGCCCGCAGAGC 17 62℃ 364bpGGTACcAGCGCTCCACTG 18Exon21 CACTTGGAAGGCATTCTCATC 21 58℃ 796bpCCTGGGTCACTCAGACTTACG 21Exon22 GCCTACTGTCTGTCCCCAAC20 60℃ 299bpGGCCATAGGACATCAGAAGC20Exon23 CAGCCAGGGAGTTCATTCTT20 58℃ 503bpATCCTCCTATGAAGATCCAGCA 22Exon24 CTCAAGCGAGGTACAGAATTAAATGA 60℃ 约300bp
GGGCTTTCAGATGCAGACACTGATExon25 GCCTGTCTGATCTCCCTGTGTGA60℃CCTGTCTGGTCTCCCTGTGTCAExon26 GTCAATCCTGGCATCCTCAT 20 60℃ 307bpAAAGACTGTGAAGCGGCTCT 20Exon27 CAGGACTTTTTCCTCTGCACTC 22 58℃ 527bpAGGGTTGTACATGGCATTCAG 21Exon28 TGGCTCCTTGCCATATAGAGA 21 62℃ 1500bpGAACTCTGCCTGGTTGATCC 20PCR扩增条件为预变性92℃ 1min；变性92℃ 10sec；退火62℃ 30secs；延伸72℃ 1.0min；循环35次；后延伸72℃ 5min。PCR结果经琼脂糖凝胶电泳检测，结果不理想的由梯度PCR仪重新行PCR摸索最佳条件。
采用Qiagen公司的PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。4、基因缺陷分析测序反应反应循环条件为预变性96℃ 1min；变性96℃ 10sec；退火和延伸的温度和时间同PCR条件；循环35次；后延伸4℃。所得测序反应产物用乙醇纯化。
测序应用MAGEBASE1000测序仪及采取Sanger双脱氧链终止法双向测序。所有步骤及条件按照MAGEBASE1000测序仪要求，由MAGEBASE1000测序自带序列读取软件读取序列，应用DNASTAR应用软件包中SeqMan软件进行分析。
通过上述程序后发现，Brugada综合症患者SCN5A基因发生了杂合的突变，为明确突变情况，对突变的序列进行了克隆转入感受态大肠杆菌，传代，来自父系和母系的基因片段分开。经测序发现该突变为SCN5A基因第22个外显子4087位置上插入了一个碱基C，参见图2，其中最前与最后一排为基因编码的氨基酸，中间为突变与正常的DNA序列比较。可见突变DNA与正常DNA序列比较，在4087位插入一个碱基C。突变导致第1313位氨基酸产生移码突变，1314-1317氨基酸都与标准不同，1318位终止。我们采用国际惯例对此进行了命名，称之为SCN5A4087insC。5、突变造成的氨基酸序列分析针对SCN5A4087insC基因突变，我们分析了对应的氨基酸序列，结果发现该突变导致通道蛋白1314-1317氨基酸发生改变并自1318位终止(参见图2)，导致钠离子通道第3结构域S4结构变化，S5-6缺失，第4结构域全部缺失，结果参见图3，其中左图表示正常钠离子通道α亚基模式图，由4个重复的结构域组成，每个结构域有6个跨膜螺段，共有24个螺段；4个结构域彼此互相折叠、靠拢，围在一起，形成中间孔道，允许钠离子进入。右图表示在突变后，第3结构域S4结构变化，S5-6缺失，第4结构域全部缺失。这些缺失导致钠离子孔道无法形成，通道不完整。6、突变基因重组体的构建为了建立研究该突变基因可能造成的功能缺陷和以后基因治疗以及药物治疗上的需要，我们构建了该突变基因的重组体。
(1)野生型SCN5A基因重组体的构建；1)提取心肌细胞总RNA.一般采用TRIzol Reagent试剂盒，方法参考Trizol抽提试剂盒说明书；2)用poly(dT)引物逆转录合成一链cDNA，再用特异性引物做PCR，合成双链DNA；SCN5A的RT-PCR的特异性引物如下PrimerSCN5AfGGAAGCTTTGTGCCCAGAAGCAGGAHind IIIPrimerSCN5ARGAGATATTCCCCCAGGCTGGTTTGTGEcoRV具体步骤如下Oligo(dT)12-18引物(1ug/ul) 1ulTotal RNA X(1ng-5ug)10mM dNTP 1.0ulDEPC H2O10-X ul12.0ul↓65℃，10min，迅速冰上冷却，离心；↓+5xBuffer 4.0ul0.1DTT 2.0ulSuperScriptTMII(200U/ul) 1.0ulRnaseOUTTM(40U/ul)1.0ul↓20.0ul水域42℃，60min→70℃，15min→至于冰水中10xBuffer 5.0ul50mM MgCl21.5ul1ul 10mMdNTP 1.0ulPrimerF(10uM) 1.0ulPrimerR(10uM) 1.0ulTaq DNA polymerase(5U/ul) 0.4ulcDNA(from first-strand reaction) 2ulddH2O38.1ul↓ 50.0ul2xGC Buffer12.5ul25mM dNTP 4.0ulPrimerF(10uM) 1.0ulPrimerR(10uM) 1.0uldd H2O4.5ulcDNA(from first-stand reaction)2.0ulTaq/pfu(10∶1)(5U/ul) 0.25ulPCR扩增条件为预变性94℃ 1min；变性95℃ 30sec；退火61℃ 1min；延伸68℃ 10min；循环30次；后延伸72℃ 5min。
3)Hind III和EcoRV酶切pcDNA3.1(+)；4)用牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化；5)用T4DNA连接酶(promega)连接pcDNA3.1和插入片段SCN5A，参图4；6)电转化到大肠杆菌DH5α，在琼脂培养板上划板，37过夜；7)挑菌，在加Ampicillin的液体LB培养液中过夜；8)提质粒，用插入序列上没有的载体上有的酶切位点做酶切；9)经过KpnI酶切后证实重组体构建成功，参见图5，其中1DNA ladder(1kb)；2pcDNA3.1-SCN5A经KpnI限制性内切酶作用得到的两个DNA片断，长度分别为长度为4314bp和7233bp；3pcDNA3.1-SCN5A，片断长度为11547bp；10)直接测序，证明SCN5A-pcDNA3.1重组体构建成功。
(2)通过定点突变获取突变型SCN5A-pcDNA3.1利用QuickChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene)进行SCN5A-pcDNA3.1的定点突变，在4887bp位置插入了一个碱基C(参见图6)，并经直接测序证实。
(3)含野生型SCN5A和突变型SCN5A细胞株的建立1)野生型SCN5A-pcDNA3.1细胞株的建立在转染前二天，将细胞以2×105的密度接种到24孔板中，培养基0.5m为包含10％胎牛血清的MEM，不含抗生素。次日细胞长到约90-95％融合。以每孔100μl DNA转染试剂混合物(1μg野生型SCN5A-pcDNA3.1质粒/50μl无血清MEM2μlLipofectAMINEF2000转染试剂/50μl无血清MEM)的量直接加到细胞中。在37℃含5％ CO2的孵箱中孵育24小时。此后将其按1∶10的细胞比例放到培养瓶中培养，此时培养基已经含有800μg/ml的G418用以筛选抗性细胞。当肉眼可见培养瓶中有白色点状单个细胞克隆时，刮取后移至新的培养瓶中，约2个月后，细胞稳定生长。
2)突变型SCN5A-pcDNA3.1细胞株建立方法同野生型SCN5A-pcDNA3.1细胞株的建立。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.一种检测布鲁加达(Brugada)综合症基因突变的方法及用途，其特征是通过PCR及测序法获得Brugada综合征的一种SCN5A突变基因，再通过RT-PCR方法获取野生型SCN5A的cDNA，利用克隆技术构建该基因的重组体，通过定点突变技术获取该基因的突变重组体，并将上述重组体转染入HEK293细胞中，用于Brugada综合征的防治研究。
2.如权利要求1所述的检测Brugada综合症基因突变的方法，其特征是该方法通过以下步骤实现1)采用盐析法获取相应的基因组核苷酸序列；2)获取目的基因(SCN5A，编码心肌快钠离子通道Alpha亚单位)的27个外显子的PCR产物；3)采用Sanger双脱氧链终止法双向测序法分析各自的核苷酸序列，发现Brugada综合征患者的SCN5A基因第22个外显子存在缺陷，是1个杂合基因移码突变，在4087位置上插入一个C，其序列为4150 tcactgcgga cgctgcgtgc actccgtcct ctgagagcct ctgtcacgatttgagggcat gagg 4114；4)获取健康个体心肌组织样本；5)通过RT-PCR法获取SCN5A基因的cDNA，引物序列为PrimerSCN5AfGGAAGCTTTGTGCCCAGAAGCAGGAHind IIIPrimerSCN5ARGAGATATCCCCCAGGCTGGTTTGTGEcoRV6)构建野生型SCN5A基因的质粒重组体；7)将野生型SCN5A基因的质粒重组体(SCN5A-pcDNA3.1)，通过定点突变获取突变型SCN5A-pc DNA3.1，突变位于整个重组体中的第4887个与第4889之间。
3.如权利要求2所述的检测Brugada综合症基因突变的方法，其特征是构建的SCN5A重组体，其载体为pcDNA3.1(+)，构建重组体所使用的限制性内切酶为Hind III和EcoRV。
4.如权利要求1和2所述的检测Brugada综合症基因突变的方法，其特征是利用脂质体转染法将该野生型SCN5A重组体和突变型SCN5A重组体转染入HEK293细胞中，通过G418进行抗性筛选。
5.如权利要求1所述的检测Brugada综合症基因突变的方法及用途，其特征是该检测方法可以用于人群中Brugada综合征高危患者的早期诊断，而转染成功的细胞可以用于研究防治该综合征的特异性药物。
全文摘要
一种检测布鲁加达综合症基因突变的方法及用途，是通过PCR及测序法获得Brugada综合征的一种SCN5A突变基因，再通过RT－PCR方法获取野生型SCN5A的cDNA，利用克隆技术构建该基因的重组体，通过定点突变技术获取该基因的突变重组体，并将上述重组体转染入HEK293细胞中，用于Brugada综合征的防治研究。
文档编号C12Q1/68GK1472341SQ0213631
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月30日 优先权日2002年7月30日
发明者陈君柱, 朱建华, 陶谦民, 郑良荣, 张芙荣, 郭晓纲, 尚运鹏 申请人:浙江大学医学院附属第一医院