专利名称：基于标记引物杂交的基因芯片技术的制作方法
技术领域：
本发明属于基因芯片技术领域，更具体地涉及一种新的基于标记引物杂交的基因芯片质量控制的方法。
背景技术：
基因芯片是二十世纪九十年代发展起来的一项前沿生物技术。将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500微米)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。
基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到Southern印迹杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出Northern印迹杂交和点杂交技术。这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。
美国Affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究(Fodor SPA，Read JL，Pirrung MC，et al.Light-directed，spatiallyaddressable parallel chemical synthesis[J].Science，1991，251(4995)767-773；Fodor SPA，Rava RP，Huang XC，et al.Multiplexed biochemical assays withbiological chips[J].Nature，1993，364(6437)555-556.)。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在约1平方厘米的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描和计算机分析等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生(Schena M，Shalon D，Dais R，et al.Quantitative monitoring ofgene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)467-470；Schena M，Shalon D，Heller R，et al.Parallel human genomeanalysismicroarray-based expression monitoring of 1000 genes[J].PNAS.USA，1996，93(20)10614-10619)，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。
基因芯片从制作上可分为两大类原位合成法(DNA chip)和微矩阵法(DNAmircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等人发明，他们将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，用单核苷酸或其它生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循环都有特定的核苷酸结合上去，直到设定的寡核苷酸长度，每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上。微矩阵法最早由Stanford大学的P.Brown等人发明，将PCR等方法得到的cDNA用针点或喷点的方法直接排列到玻片等介质上，从而制备成芯片。
原位合成的寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片。
基因芯片最早是由于高通量、大规模研究基因功能的需求而产生的，但随着基因芯片技术的日渐成熟，人们惊喜地发现基因芯片在传染性疾病和遗传病的诊断上有独特的应用前景和巨大的商业市场。感染性病原体诊断芯片就是将待测病原体的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，将从病人血清中抽提出病原体的DNA或RNA经扩增标记萤光后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机分析，判断阴阳性。诊断芯片区别于其他检测手段的优越性在于(1)检测样品为各类致病基因片段，提高了检测效率；(2)因无需机体免疫反应，能及早诊断，且待测样品用量较少；
(3)诊断芯片技术是DNA杂交技术和荧光标记技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；(4)自动化程度高，利于大规模推广应用。
在疾病诊断方面，已有一些单一疾病基因诊断芯片产品上市，例如美国的Affymetrix公司已利用基因芯片进行爱滋病病毒(HIV)的研究工作，并有商业化的GeneChip HIV PRT诊断芯片上市，用于爱滋病的早期诊断。
目前，基因芯片包括寡核苷酸芯片和cDNA芯片两类，其技术中的几个关键环节包括PCR制备靶基因，点样及固定，探针制备和共同参照系统，杂交，检测与分析。
由于不可能将大量基因的PCR产物进行精确定量，加上PCR长度不同，每个点的DNA固定率也略有差异，因此就不可能将芯片上的每个点控制在相同的拷贝数。另外，通常情况下靶基因的量并未达到饱和，因此杂交信号的绝对值并没有意义，只能用于双色荧光系统，测定两种组织的表达差异(Wang K，Gan l，JefferyE et al.Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas usingcDNA microarray，Gene，1999，229(1-2)101～108；Wolf M，El-Rifai W，Tarkkanen M，et al(2000)Novel findings in gene expression detected in humanosteosarcoma by cDNA microarray.Cancer Genet Cytogenet 123(2)128-32)。当cDNA芯片用于比较多种组织的表达谱分析时，只能采用共同参照的方法，即用多种细胞或组织的混合mRNA作对照，或用单种组织或细胞的mRNA作对照，将每个待测样品与共同参照进行双色荧光杂交，对得到的荧光比值进行聚类分析(Alizadeh AA，Eisen MB，Davis RE，et al.(2000)Distinct types of diffuse large B-celllymphoma identified by gene expression profiling.Nature，403(6769)503-11；Brown M，Grundy W，Lin D，et al.(2000)Knowledge-based analysis of microarraygene expression data by using support vector machines.PNAS，97(1)262-367.)。这些方法的缺陷是(1)缺乏大量的恒定的组织或细胞来源，因此不同次实验得到的混合mRNA误差大，影响聚类结果；(2)即使是混合的mRNA，也有相当数量的基因的mRNA未表达，因此在计算荧光比值时，大量基因的分母为零或分母太小，低于荧光值的线性范围，使比值无意义或误差太大，影响聚类分析；(3)细胞或组织的成本高，mRNA抽提成本高。
此外，目前的基因芯片技术中有一个很大的缺陷，就是没有一种有效的方法对基因芯片的质量进行监控。目前，常采用mRNA杂交进行质检，但由于大量基因未表达或低表达而没有或弱的杂交信号，从而影响质检结果判断。以表达谱芯片为例，其质量在一定程度上决定了表达谱试验结果的可靠性。目前对所制造的表达谱质量进行监控的方法通常都采用直接表达谱试验进行检测。该方法技术复杂，而且不能得到关于基因芯片表面DNA含量的直接信息。
因此，本领域迫切需要开发新的基因芯片参照系统以及质量控制方法。
发明内容
本发明的目的就是提供了一种基于标记引物杂交的基因芯片参照系统。
本发明的另一目的是提供了基于标记引物杂交的基因芯片质量控制的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种核酸检测的方法，包括步骤(a)用第一标记物标记通用引物；(b)用第二标记物标记源自样品的cDNA探针；(c)将带有第一标记物的标记的通用引物与带有第二标记物的标记的cDNA探针混合，形成混合物；(d)将步骤(c)获得的混合物与基因芯片杂交；(e)采集第一标记物发出的可检测信号和第二标记物发出的可检测信号，并将第一标记物发出的可检测信号作为共同参照，校正第二标记物发出的可检测信号，其中，第一标记物发出的可检测信号不同于第二标记物发出的可检测信号。
较佳地，步骤(b)中的cDNA探针是从mRNA通过逆转录法制备的cDNA单链。
在一优选例中，所述的可检测信号是荧光。
在另一优选例中，第一标记物和第二标记物中一者是Cy3，另一者是Cy5。
在另一优选例中，步骤(d)中还包括用管家基因进行数据校正(尤其是对多组数据进行片间校正)。
在另一优选例中中，所述的样品为一个以上的样品，即多样品。
在本发明的第二方面，提供了一种基因芯片质量检测方法，包括步骤(i)用标记物标记通用引物；(ii)将标记的通用引物与基因芯片上点样的核酸杂交，形成杂交的复合物；(iii)检测芯片上复合物发出的可检测信号。通过与一定的质量标准(如无效点比例小于5％)比较，就可进行质量监控。
在一优选例中，所述的标记物选自Cy3、Cy5、Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
在另一优选例中中，所述的基因芯片是cDNA芯片。
图1显示了基于标记引物杂交对1152点cDNA芯片进行质检结果。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现可将通用的标记引物用作杂交探针，提供一种标准的参照信号。这样，就可以作为共同的参照系统和用于芯片的质量控制。在此基础上完成了本发明。
由于PCR制备靶基因时通常采用质粒载体上的序列作通用引物进行PCR，因此，cDNA芯片上的每一个点的DNA上都有通用引物序列，而且通用引物的拷贝数直接代表了cDNA芯片上的每一个点的DNA的拷贝数。将PCR通用引物进行荧光标记，通过利用标记引物与固定在基因芯片上的DNA片段杂交，其杂交信号的荧光强弱直接反应了每个点的DNA的量的差异，从而达到对基因芯片表面所固定的DNA进行定量的目的。
如本文所用，术语“通用引物序列”指制备cDNA芯片时所采用的质粒载体上的一段序列。该段序列被设计作为通用引物，用于通过PCR反应而扩增出cDNA。应理解，通用引物序列的具体序列取决于所用的质粒载体。对于不同的质粒载体，其通用引物序列可参见其质粒图谱或厂商提供的说明书。例如，当选用pBS质粒时，通用引物序列可选自T3、T7启动子序列。最常用的通用引物序列包括T3、T7启动子序列、以及M13(+)、M13(-)通用引物序列。通用引物可以是一种引物，也可以多种通用引物的混合物。
本发明将标记引物作为共同参照的核酸检测方法，包括步骤(a)用第一标记物标记通用引物。
可用化学或酶法使通用引物带有可检测信号。例如，用化学方法将荧光分子修饰到通用引物上；或用酶法(如TdT酶)将带可检测信号(如荧光或同位素)转移到引物上。
用于本发明的带有可检测信号的单核苷酸，可以带有任何带有可检测信号(如荧光团或同位素)。代表性的例子包括(但并不限于)Cy3，Cy5，Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
(b)用第二标记物标记源自样品的cDNA探针。
待检测的、源自样品的cDNA探针也可用常规方法标记。然而，第一标记物发出的可检测信号应不同于第二标记物发出的可检测信号。
至于从样品制备mRNA以及从mRNA逆转录成cDNA等操作，都是本领域技术人员熟知的。
(c)形成标记的通用引物和标记的cDNA探针的混合物。
将带有第一标记物的标记的通用引物与带有第二标记物的标记的cDNA探针混合，即可形成混合物。
(d)将步骤(c)获得的混合物与基因芯片杂交。
将基因芯片进行变性处理(如热变性)，然后用混合物与固定在基因芯片表面的DNA之间进行杂交。热变性和杂交的条件是本领域技术人员熟知的。
此外，在杂交之间，cDNA芯片宜经过预杂交处理，例如用鱼精DNA进行预杂交。
(e)数据采集和处理采集第一标记物发出的可检测信号和第二标记物发出的可检测信号，并将第一标记物发出的可检测信号作为共同参照，校正第二标记物发出的可检测信号。通用引物与芯片上固定的核酸分子所形成的复合物，该复合物上的第一标记物发出的可检测信号不仅可用于校正同一芯片内的各数据点，还可用于校正不同芯片之间的数据。
当然，还可与其他方法，例如管家基因法，结合使用以便更精确地进行校正。
与目前国际上基因芯片技术相比，本发明基于标记引物杂交的参照系统具有主要以下优点1.标记引物容易获得，一次可得到可做上千次的引物，而且重复性好，避免了cDNA杂交方法过程复杂，结果重复性差的问题；2.引物杂交的荧光信号只跟靶基因的拷贝数有关，能更好地校正由于各种原因引起地靶基因之间量的不同，避免了mRNA杂交时荧光值太小或为零的情况，这对于质检和聚类分析都很重要。
3.操作简单，成功率高，实验成本大大降低，工作效率大大提高；4.数据的可靠性大大提高。
该方法不仅可用于cDNA芯片表达谱聚类分析的参照系统，还可以用于基因芯片的质量监控，解决了基因芯片制造过程中质量无法监控的难题，使得基因芯片在制造的标准化方面有了很大提高。
本发明的基因芯片质量监控方法包括以下步骤(i).引物标记可用化学或酶法使通用引物带有可检测信号。例如，用化学方法将荧光分子修饰到通用引物上；或用酶法(如末端转移酶(TdT酶))将带可检测信号(如荧光或同位素)转移到引物上。
用于本发明的带有可检测信号的单核苷酸，可以带有任何带有可检测信号(如荧光团或同位素)。代表性的例子包括(但并不限于)Cy3，Cy5，Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
(ii).标记的通用引物与基因芯片的杂交。
将cDNA芯片进行变性处理(如热变性)，然后用预先标记荧光的引物与固定在基因芯片表面的DNA之间进行杂交。热变性和杂交的条件是本领域技术人员熟知的。
此外，在杂交之间，cDNA芯片宜经过预杂交处理，例如用鱼精DNA进行预杂交。
(iii).数据采集和处理最后是用本领域熟知的手段进行数据采集和处理。例如用芯片扫描仪进行扫描，并用数据处理软件进行数据分析。并与一定质量标准(如无效点比例小于5％)进行比较。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1cDNA芯片质量监控(1)制备基因芯片用通用引物(T3或T7启动子序列)进行cDNA的PCR反应，并用这些PCR产物，通过常规基因芯片制造技术，制成含有1000-14000个基因的基因芯片。
(2)制备标记的通用引物在50ul通用的标记引物体系中含有HEPES 10mmol/L，pH 7.2；MgCl28mmol/L；DTT 0.1mmol/L；Cy3-dUTP(或Cy5-dUTP)10mmol/L；TdT酶10U；通用引物20uM。混合后，在PCR仪上设置反应程序37℃，60分钟。反应后，进行乙醇沉淀去掉未掺入的单核苷酸。
(3)质量监控具体试验方法如下将表达谱芯片放在100℃的反应体系中变性2min，取出后放在无水乙醇中冷却30s，然后取出在空气中自然晾干。用含鱼精DNA的杂交液进行预杂交。然后将用过量浓度的cy3或者cy5标记引物与预杂交处理过的cDNA进行杂交，杂交条件为50℃，4小时(杂交液用量则视杂交面积大小而定)。杂交完成后，清洗基因芯片后即用ScanArray 4000扫描仪在70或75扫描强度下扫描。质量判定标准为点的平均荧光信号大于3000，无效点比例小于5％即为合格片。
质量检验结果如图1所示，点的平均信号大于3000，无效点比例小于5％，为合格片。此外，各点信号强度直接反映了该点DNA固定量的多少，如没有信号，则表明该点没有DNA，为无效点。
本实施例表明，本发明的标记引物法能够弥补直接进行表达谱试验的不足。它不仅能够对表达谱芯片点样矩阵整齐度、大点数、溶点数进行检测，更重要的是，使用通用引物进行杂交时，还能够对基因芯片表面各点所固定的DNA量及均匀程度进行度量。
实施例2作为共同参照体系表达谱数据聚类分析在本实施例中，将标记的通用引物作为共同参照，矫正因靶基因量的差异引起的误差，使芯片用于多个样本之间的相似性比较。方法如下1.cDNA芯片用常规方法制备及预杂交，方法同实施例1；2.标记的Cy3(或Cy5)通用引物(M13(+)或M13(-)通用引物序列)的制备在50ul反应体系中含有HEPES 10mmol/L(pH 7.2)；MgCl28mmol/L；DTT0.1mmol/L；Cy3-dUTP(或Cy5-dUTP)100umol/L；TdT酶50U，根据靶基因载体序列设计的通用引物10uM。混合后，在PCR仪上设置反应程序37℃，60分钟。反应后，进行乙醇沉淀去掉未掺入的单核苷酸，制得3′端被标记的通用引物；或者在合成通用引物时在其5′端直接引入标记物Cy3(或Cy5)3.待测样本mRNA的制备，逆转录成cDNA，及CDNA探针标记。这些操作按照文献Schena M，Shalon D，Dais R，et al.Quantitative monitoring of geneexpfession patterns with a complementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)467-470中所述方法，用Cy5(或Cy3)进行标记；4.将标记通用引物和标记cDNA探针混合在一起。按照文献Schena M，Shalon D，Dais R，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with acomplementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)467-470中所述方法进行杂交及扫描；5.如果需要，可重复上述步骤，制备用于多个待测样本的由标记通用引物和标记cDNA探针构成的混合物，并杂交并扫描；6.数据处理和聚类分析，利用结合的通用引物所发出的荧光信号(第一信号)来校正结合的cDNA探针所发出的荧光信号(第二信号)，同时用管家基因对多组数据进行片间校正作为对照，用统计方法进行聚类分析。
结果表明，本发明的标记的通用引物所发出的荧光信号，可用作共同参照系统校正因靶基因量的差异引起的误差。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种核酸检测的方法，其特征在于，包括步骤(a)用第一标记物标记通用引物；(b)用第二标记物标记源自样品的cDNA探针；(c)将带有第一标记物的标记的通用引物与带有第二标记物的标记的cDNA探针混合，形成混合物；(d)将步骤(c)获得的混合物与基因芯片杂交；(e)采集第一标记物发出的可检测信号和第二标记物发出的可检测信号，并将第一标记物发出的可检测信号作为共同参照，校正第二标记物发出的可检测信号，其中，第一标记物发出的可检测信号不同于第二标记物发出的可检测信号。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的cDNA探针是从mRNA通过逆转录法制备的cDNA单链。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测信号是荧光。
4.如权利要求4所述的方法，其特征在于，第一标记物和第二标记物中一者是Cy3，另一者是Cy5。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中还包括用管家基因进行数据校正。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品为一个以上的样品。
7.一种基因芯片质量检测方法，其特征在于，包括步骤(i)用标记物标记通用引物；(ii)将标记的通用引物与基因芯片上点样的核酸杂交，形成杂交的复合物；(iii)检测芯片上复合物发出的可检测信号。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的标记物选自Cy3、Cy5、Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的基因芯片是cDNA芯片。
全文摘要
本发明提供了一种基于标记引物的基因芯片信号参照系统及核酸检测的方法，该方法包括步骤(a)用第一标记物标记通用引物；(b)用第二标记物标记源自样品的cDNA探针；(c)将标记的通用引物与标记的cDNA探针混合，形成混合物；(d)将步骤(c)获得的混合物与基因芯片杂交；(e)采集第一标记物发出的可检测信号和第二标记物发出的可检测信号，并将第一标记物发出的可检测信号作为共同参照，校正第二标记物发出的可检测信号。该方法不仅可用于基因芯片技术中的共同参照系统，还可用于芯片的质量控制。
文档编号C12Q1/68GK1473942SQ02136439
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月9日 优先权日2002年8月9日
发明者毛裕民, 谢毅, 李瑶, 裘敏燕 申请人:上海博星基因芯片有限责任公司