专利名称：基于末端脱氧核糖核酸转移酶的基因芯片技术的制作方法
技术领域：
本发明属于基因芯片技术领域，更具体地涉及一种新的基于末端脱氧核糖核酸转移酶的基因芯片信号标记方法，以及利用该方法进行质量控制的方法。
背景技术：
基因芯片是二十世纪九十年代发展起来的一项前沿生物技术。将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500微米)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。
基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到Southern印迹杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出Northern印迹杂交和点杂交技术。这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。
美国Affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究(Fodor SPA，Read JL，Pirrung MC，et al.Light-directed，spatiallyaddressable parallel chemical synthesis[J].Science，1991，251(4995)767-773；Fodor SPA，Rava RP，Huang XC，et al.Multiplexed biochemical assays withbiological chips[J].Nature，1993，364(6437)555-556.)。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在约1平方厘米的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描和计算机分析等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生(Schena M，Shalon D，Dais R，et al.Quantitative monitoring ofgene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science，1995，270(5235)467-470；Schena M，Shalon D，Heller R，et al.Parallel human genomeanalysismicroarray-based expression monitoring of 1000 genes[J].PNAS.USA，1996，93(20)10614-10619)，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。
基因芯片从制作上可分为两大类原位合成法(DNA chip)和微矩阵法(DNAmircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等人发明，他们将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，用单核苷酸或其它生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循环都有特定的核苷酸结合上去，直到设定的寡核苷酸长度，每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上。微矩阵法最早由Stanford大学的P.Brown等人发明，将PCR等方法得到的cDNA用针点或喷点的方法直接排列到玻片等介质上，从而制备成芯片。
原位合成的寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片。
基因芯片最早是由于高通量、大规模研究基因功能的需求而产生的，但随着基因芯片技术的日渐成熟，人们惊喜地发现基因芯片在传染性疾病和遗传病的诊断上有独特的应用前景和巨大的商业市场。感染性病原体诊断芯片就是将待测病原体的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，将从病人血清中抽提出病原体的DNA或RNA经扩增标记萤光后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机分析，判断阴阳性。诊断芯片区别于其他检测手段的优越性在于(1)检测样品为各类致病基因片段，提高了检测效率；(2)因无需机体免疫反应，能及早诊断，且待测样品用量较少；
(3)诊断芯片技术是DNA杂交技术和荧光标记技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；(4)自动化程度高，利于大规模推广应用。
在疾病诊断方面，已有一些单一疾病基因诊断芯片产品上市，例如美国的Affymetrix公司已利用基因芯片进行爱滋病病毒(HIV)的研究工作，并有商业化的GeneChip HIV PRT诊断芯片上市，用于爱滋病的早期诊断。
目前，基因芯片包括寡核苷酸芯片和cDNA芯片两类，其技术中的几个关键环节包括PCR制备靶基因，点样及固定，探针制备和信号标记，杂交，检测与分析。
酶学方法在基因芯片技术中的应用包括以下两类(1)核酸产物扩增[Wolf M，El-Rifai W，Tarkkanen M，et al(2000)Novel findings in gene expression detected inhuman osteosarcoma by cDNA microarray.Cancer Genet Cytogenet 123(2)128-32]；(2)信号标记[Trainor GL and Jensen MA(1988)A procedure for the preparation offluorescence-labeled DNA with terminal deoxynucleotidyl transferase.NucleicAcids Res 16(24)11846；Pastinen T.，Kurg A.，Metspalu A.，et al(1997)MinisequencingA Specific Tool for DNA Analysis and Diagnostics onOligonucleotide Arrays.7606-614；KWOK(2001)Fluorescence polarization innucleic acid analysis.P6180408 U.S.；Zanzucchi(2000)Method for enhancingfluorescence.P6118126U.S.]。
酶法进行信号标记，可分为杂交前标记和杂交后标记两类。前者有引物直接标记法和掺入法，后者有引物延伸法和引物连接法。虽然这些方法有着各自的优势，但缺点也是明显的。引物直接标记法，成本高；掺入法，效率低，不稳定。而且引物延伸法和引物连接法适用范围小，只适用于寡核苷酸芯片。
此外，目前的基因芯片技术中有一个很大的缺陷，就是没有一种有效的方法对基因芯片的质量进行监控。
因此，本领域迫切需要开发新的、高效的用于基因芯片的信号标记方法。
发明内容
本发明的目的就是提供了一种基于末端脱氧核糖核酸转移酶的高效的基因芯片信号标记方法，以及用该方法制备的基因芯片。
本发明的另一目的是提供含有上述基因芯片的试剂盒。
本发明的另一目的是提供了基于末端脱氧核糖核酸转移酶的基因芯片质量控制的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种对核酸进行信号标记的方法，包括步骤(a)混合核酸分子、末端脱氧核糖核酸转移酶、和带可检测信号的单核苷酸，形成混合物；(b)混合物在5-50℃，反应5-240分钟，形成标记的核酸分子。
在一优选例中，还包括步骤(c)洗涤去除未掺入的单核苷酸。
在另一优选例中，带可检测信号的单核苷酸是Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤将形成的标记分子点样于基因芯片基片上，形成基因芯片。
在本发明的第二方面，提供了一种基因芯片，它含有点样在基因芯片基片上的DNA分子，所述的DNA分子的3′端具有带可检测信号的单核苷酸或其同聚物。较佳地，所述的单核苷酸是Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
在一优选例中，所述的带可检测信号的单核苷酸或其同聚物是通过末端脱氧核糖核酸转移酶的末端转移反应而添加在DNA分子的3′端的。
在本发明的第三方面，提供了一种基因芯片质量检测方法，包括步骤(a)将制备的基因芯片与末端脱氧核糖核酸转移酶、带可检测信号的单核苷酸接触，其中所述的基因芯片上点样有核酸分子；(b)在约5-50℃，反应约5-240分钟，从而使芯片上的核酸分子形成标记的核酸分子；(c)检测芯片上标记的核酸分子发出的可检测信号。
在一优选例中，在步骤(c)之前还包括步骤洗涤去除未标记的单核苷酸。
在本发明第四方面，提供了一种试剂盒，它含有本发明所述所述基因芯片。较佳地，所述的试剂盒还含有杂交盒、预杂交液、杂交液和说明书。
图1显示了基于末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)的转基因检测芯片检测结果。
图2显示了用TdT方法对1152点cDNA芯片进行质检结果。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)可以高效地将标记物添加在核酸分子的3′端，从而可用作基因芯片技术中的信号标记方法。此外，该末端转移反应还可用于芯片的质量控制。在此基础上完成了本发明。
本发明的发明点在于，将TdT末端转移反应的方法应用于基因芯片技术中的信号标记和质量监控。
如本文所用，“TdT末端转移反应”或“末端转移反应”指，在末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)催化下，将dNTP、ddNTP等单核苷酸聚合于单链或双链DNA的3′-OH末端的反应。
在杂交之前或杂交之后，通过TdT末端转移反应，可以在目的DNA的3′-OH末端聚合一个或多个带有信号标记(荧光、同位素)的核苷酸或其同聚物，从而使其完成信号标记。
用于本发明的带有信号标记的单核苷酸，可以是任何带有可检测信号(如荧光团或同位素)的单核苷酸。代表性的例子包括(但并不限于)Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
用于本发明的末端脱氧核糖核酸转移酶没有特别限制，可以是来源于任何物种的末端脱氧核糖核酸转移酶。末端脱氧核糖核酸转移酶的制法和特性已为人们所知，并且在众多文献中有描述。
末端脱氧核糖核酸转移酶的反应条件也是本领域技术人员所已知的。优选的反应条件如下(i)液相反应。
在反应体系中加入1×反应液(通常是HEPES缓冲液，pH约7-8)；Cy3-dUTP或Cy5-dUTP 1-100mmol/L；TdT酶0.5～50U；核酸产物(单链或双链DNA或寡核苷酸)1～5000ng。此外，反应体系中还可含有1-100mmol/l镁离子。
上述反应体系中各成分混匀后，20-40℃反应10～120分钟，然后进行纯化，去掉未掺入的单核苷酸，对芯片进行杂交及信号检测。也可不经过纯化而直接进行杂交。
(ii)固相反应。
在反应体系中加入1×反应液(通常是HEPES缓冲液，pH约7-8)；Cy3-dUTP或Cy5-dUTP 1-100mmol/L；TdT酶0.5～50U。此外，反应体系中还可含有1-100mmol/l镁离子。
各成分混匀后，将反应液加入基因芯片上20-40℃反应10～120分钟。反应后，用0-0.5％的SDS溶液(或其它类似物)洗去未掺入的单核苷酸，通过扫描分析每个点的信号。
本发明的TdT末端转移标记法，有多种使用方式，其中包括(但并不限于)(1)可以先对与探针进行标记，然后与样品中所含的核酸分子进行杂交。
(2)可以先对与探针互补的序列进行标记，然后与芯片上的探针进行杂交。
(3)直接在芯片表面进行TdT末端转移反应，对探针进行标记，然后通过检测信号强度来判断芯片的质量，实现监控。
本发明还提供了一种基因芯片，其上点样的寡核苷酸或DNA分子的末端带有通过TdT法而标记的标记物(如Cy3-dUTP或Cy5-dUTP)。本发明基因芯片除了采用TdT法进行标记之外，其基片和盖玻片等其他材料或因素，与现有的基因芯片相同，没有特别限制。例如芯片基片可以使用目前基因芯片领域常用的各种材料，例如玻璃、塑料、硅片、陶瓷等。
在本发明另一方面，提供一种可进行多样本检测的基因芯片试剂盒，它包括本发明的基因芯片。此外，该试剂盒还可所述的试剂盒还含有杂交盒、预杂交液、杂交液和说明书。
与目前国际上基因芯片领域中使用的信号标记方法相比，本发明基于末端脱氧核糖核酸转移酶的标记方法具有主要以下优点1.操作简单，成功率高。只需常规的产物扩增过程，避免了掺入法扩增效率低、稳定性差的问题。
2.标记效率高，灵敏度提高。此法可在一个核酸产物上标记多个信号分子，提高了信号的标记效率和灵敏度。
3.适用范围广，既可用于寡核苷酸芯片，又可用于cDNA芯片。
此外，本发明方法不仅有效实现了基因芯片技术中点样效果的检测。同时，该方法还解决了基因芯片制造过程中质量无法监控的难题，使得基因芯片在制造的标准化，信号标记的稳定性，检测的高灵敏度方面都有了很大提高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1芯片中目的DNA的信号标记(1)用常规PCR法制备目的DNA。
(2)末端转移反应。
在50ul末端转移反应体系中含有HEPES 10mmol/L，pH 7.2；MgCl28mmol/L；DTT 0.1mmol/L；Cy3-dUTP 10mmol/L；TdT酶10U；目的DNA产物200ng。混合后，在PCR仪上设置反应程序37℃，60分钟。反应后，进行乙醇沉淀去掉未掺入的单核苷酸。
同时，采用掺入法进行目的DNA的信号标记作对照。
与掺入法相比，基于末端脱氧核糖核酸转移酶的信号标记法操作方便，目的DNA的产率高，标记效率高，信号检测的灵敏度高。
实施例2转基因检测芯片的样本标记(液相反应)1.按常规方法制备含有35个待检基因的探针的转基因检测芯片。
2.按常规方法抽提待检样本的DNA，取25ng的基因组DNA，加入相应的待检基因的PCR引物，并进行常规多重PCR反应。
3.取上述PCR反应产物3ul置于200ul PCR薄壁管中，并加入5×TdT缓冲液5ul(pH7.2)、1mM Cy5-dCTP 1ul、TdT 2-5U，并以灭菌蒸馏水补足体积至25ul。
4.将步骤2反应液在37℃下反应30分钟(注意避光)。
5.取6ul步骤3反应产物，加经55℃预热的杂交液6μl，混匀后95℃3分钟、0℃5分钟后全部转移到芯片的点样区域，加盖玻片(注意不要有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进55℃，水浴内保温1小时。
6.打开杂交舱，取出芯片，用1×洗脱液冲掉盖玻片，然后把芯片放入盛有1×洗脱液的染色缸，放置5分钟，用ddH2O冲洗二遍。室温避光干燥。
7.用ScanArray 4000扫描仪在70或75扫描强度下扫描，扫描结果如图1所示。
总共35个基因，每个基因重复点5个点，外周为阳性对照点。分成4组进行多重PCR，并对PCR产物用TdT酶法标记，杂交结果显示12条基因为阳性。
实施例3cDNA芯片的质量检测(固相反应)1.用通用引物进行cDNA的PCR反应，并用这些PCR产物，通过常规基因芯片制造技术，制成含有1000-14000个基因的基因芯片。
2.在20ul反应体系中含有HEPES 10mmol/L(pH7.2)；MgCl28mmol/L；DTT 0.1mmol/L；Cy3-dUTP 10mmol/L；TdT酶5U。将反应液加入基因芯片上，37℃反应60分钟，使固定在芯片上的cDNA的延伸一个到多个带有Cy3标记的核苷酸；3.反应后，用0.2％的SDS溶液洗去未掺入的单核苷酸，通过扫描分析每个点的信号，从而分析芯片的质量。质量判定标准为点的平均荧光信号大于3000，无效点比例小于5％即为合格片。
质量检验结果如图2所示，点的平均信号大于3000，无效点比例小于5％，为合格片。这表明，本发明方法可以实现cDNA基因芯片技术中质量监控。
实施例4寡核苷酸芯片的质量检测(固相反应)重复实施例3的程序，不同点仅在于用寡核苷酸芯片替换cDNA芯片。
结果同样表明，本发明方法可以实现寡核苷酸基因芯片技术中质量监控。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种对核酸进行信号标记的方法，其特征在于，包括步骤(a)混合核酸分子、末端脱氧核糖核酸转移酶、和带可检测信号的单核苷酸，形成混合物；(b)混合物在5-50℃，反应5-240分钟，形成标记的核酸分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(c)洗涤去除未掺入的单核苷酸。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，带可检测信号的单核苷酸是Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤将形成的标记分子点样于基因芯片基片上，形成基因芯片。
5.一种基因芯片，其特征在于，含有点样在基因芯片基片上的DNA分子，所述的DNA分子的3′端具有带可检测信号的单核苷酸或其同聚物，所述的单核苷酸是Cy3-dUPT，Cy5-dUPT，或其混合物。
6.如权利要求5所述的基因芯片，其特征在于，所述的带可检测信号的单核苷酸或其同聚物是通过末端脱氧核糖核酸转移酶的末端转移反应添加在DNA分子3′端的。
7.一种基因芯片质量检测方法，其特征在于，包括步骤(a)将制备的基因芯片与末端脱氧核糖核酸转移酶、带可检测信号的单核苷酸接触，其中所述的基因芯片上点样有核酸分子；(b)在5-50℃，反应5-240分钟，从而使芯片上的核酸分子形成标记的核酸分子；(c)检测芯片上标记的核酸分子发出的可检测信号。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(c)之前还包括步骤洗涤去除未标记的单核苷酸。
9.一种试剂盒，其特征在于，它含有权利要求5所述基因芯片。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有杂交盒、预杂交液、杂交液和说明书。
全文摘要
本发明提供了一种基于末端脱氧核糖核酸转移酶的、高效的基因芯片信号标记方法。该方法包括步骤(a)混合核酸分子、末端脱氧核糖核酸转移酶、带可检测信号的单核苷酸，形成混合物；(b)混合物在5－50℃，反应5－240分钟，形成标记的核酸分子。该方法不仅可用于基因芯片技术中的信号标记，还可用于芯片的质量控制。
文档编号C12Q1/68GK1473941SQ02136438
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月9日 优先权日2002年8月9日
发明者谢毅, 毛裕民, 李瑶, 裘敏燕, 谢 毅 申请人:上海博星基因芯片有限责任公司