专利名称：提纯寡核苷酸的方法
技术领域：
本发明涉及提纯寡核苷酸的新方法。更准确地说，本发明涉及使用物理方法使寡核苷酸从溶液中沉淀和分离的提纯寡核苷酸的新方法。
背景技术：
寡核苷酸及其类似物被开发和在分子生物学如在各种方法中用作探针、引物、接头、衔接物和基因片段。寡核苷酸在诸如治疗、诊断和科研领域内发挥重要作用。
已知多细胞有机体的大多数身体状态、包括大多数疾病状态受到蛋白质影响。这些蛋白质直接起作用或通过它们的酶催化功能或者其它功能起作用，以主要比例促成动物和人类的许多疾病和调节功能。对于疾病状态而言，经典治疗通常聚焦在与这些蛋白质的相互作用上，进而减轻它们的疾病引发或者疾病增强功能。在新式治疗方法中，希望调节这些蛋白质的实际产生。通过干扰蛋白质的产生可能获得具有最小副作用的最大治疗效果。因此这些治疗方法的一般目标是干扰或以另外的方式调节导致非需要蛋白质形成的基因表达。
一种用于抑制特异基因表达的方法是使用寡核苷酸、尤其是与特殊靶信使RNA(mRNA)序列互补的寡核苷酸。用于这种用途的几种寡核苷酸目前正处于临床试验阶段。硫代磷酸酯寡核苷酸目前在人的临床试验中用作反义药剂、包括用作抗病毒药用于各种疾病状态。人们也提出了其它作用机制。例如，转录因子在转录调节过程中干扰双链DNA。寡核苷酸可用作转录因子的竞争性抑制剂调节它们的作用。几个最近的报告描述了这些相互作用(参见，Bielinska，A.等人，Science，1990年，250卷，997-1000页；和Wu，H.等人，Gene，1990年，89卷，203-209页)，作为参考以全文引入本文。
寡核苷酸及其类似物除了用作蛋白质的间接和直接调节剂之外，也在诊断性试验中获得应用。这些诊断性试验可以使用诸如生物流体、组织、完整细胞或者分离的细胞成分进行。如同基因表达抑制一样，诊断应用利用了寡核苷酸及其类似物与核酸互补链杂交的能力。杂交是寡聚化合物通过Watson-Crick和/或Hoogsteen碱基对序列特异性氢键键合到RNA或者DNA上。这些碱基对的碱基可以说是彼此互补。
寡核苷酸及其类似物也广泛用作科研试剂。它们用于了解许多其它生物分子的功能以及用于其它生物分子的制备中。例如，在PCR反应中使用寡核苷酸及其类似物作为引物扩大了商品化工业。PCR已经成为商业和科学研究实验室的支柱，PCR的应用成倍增加。例如，目前PCR技术在法学、古生物学、进化研究和遗传咨询中获得应用。商业上开发了试剂盒，协助未经过分子生物学培训的人员应用PCR。天然和合成的寡核苷酸及其类似物在这些PCR技术中都用作引物。
寡核苷酸及其类似物也用于其它实验室研究方法。部分这些用途的描述参见普通实验室操作指南，如Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第二版，J.Sambrook等人主编，美国冷泉港实验室出版社编辑，1989年；和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人主编，Current Publications，1993年；每个作为参考以全文被引入本文。这些用途包括诸如合成寡核苷酸探针、用抗体和低聚化合物筛选表达文库、DNA测序、DNA通过聚合酶链式反应的体外扩增、和克隆DNA的定向位点诱变。参见Molecular Cloning第二册，ALaboratory Manual，supra。也参见“DNA-蛋白质相互作用和聚合酶链式反应”(DNA-protein interactions and the polymerase chain reaction)，Current Protocols in MolecularBiology，第二卷，supra；每个作为参考以全文引入本文。
因为广泛应用，寡核苷酸及其类似物被定制以提供所需用途的性质。因此，许多化学修饰被引入到寡聚化合物中作为科学研究试剂和治疗实体增加它们在诊断中的效用。这些修饰包括但不限于下述目的的修饰用来增加与靶点链的结合、帮助识别寡核苷酸或者寡核苷酸-靶点复合体、增加细胞渗透、稳定那些降解或者干扰寡核苷酸及其类似物的结构或活性的核酸酶及其他酶、一旦序列特异性结合到靶点上提供一种破坏方式(终止事件)、改善寡核苷酸的药代动力学性质、以及调节寡核苷酸的摄取和细胞分布。
对天然存在的寡核苷酸的修饰包括，例如，使用非同位素标记诸如荧光素、生物素、洋地黄毒苷、碱性磷酸酯酶或其它报道分子进行标记。为增加最后得到的类似物的核酸酶稳定性，对磷酸核糖主链进行了其它修饰。这些修饰的实例包括但不限于膦酸甲酯、硫代磷酸酯或者二硫代磷酸酯键连和2′-O-甲基核糖糖单位的引入。
也可修饰反义寡核苷酸使其与亲脂分子偶联。亲脂偶联物的存在显示可改善寡核苷酸的细胞渗透，因此改善了细胞内寡核苷酸的分布。更进一步，在细胞培养研究中，寡核苷酸与亲脂分子偶联能提高寡核苷酸的自由摄取而无需任何转染剂。偶联的寡核苷酸也能改善含磷酸二酯键连的寡核苷酸的蛋白质结合。随着这些化合物成功地用于诊断和治疗用途，也需要改良的寡核苷酸及其类似物。
化学文献公开了许多通过含磷酸共价键连偶联核苷以生成确定序列的寡核苷酸的方法。最通行的方法之一是亚磷酰胺技术(例如参见，Advances in the Synthesis of oligonucleotides by the PhosphoramiditeApproach，Beaucage，S.L.；Iyer，R.P.，四面体，1992年，48卷，2223-2311页及该文引用的参考文献以全文引入本文作为参考)，其中含游离羟基的核苷或者寡核苷酸与受保护的氰乙基亚磷酰胺单体在弱酸存在下反应形成亚磷酸酯键合结构。亚磷酸酯键连的氧化和随后氰乙基的水解生成所需要的磷酸二酯键连或者硫代磷酸酯键连。
酰胺乙基作为某些磷酸二酯的保护基的能力首次被Ziodrou和Schmir.Zioudrou等人，J.Amer.Chem.Soc.，85卷，3258页，1963年观察到；作为参考以全文引入本文。这种方法的一种形式被推广到使用oxaphospholidine核苷构件作为常规亚磷酰胺的代用品进行寡核苷酸二聚体和低聚物的固相合成。Iyer等人，四面体通讯，39卷，2491-2494页，1998年；1996年12月12日出版的PCT国际公开WO/9639413；每个作为参考以全文引入本文。Wilk等人，有机化学杂志，62卷，6712-6713页，1997年，也报道了Wilk等人使用N-三氟乙酰基-氨基链烷醇作为磷酸酯保护基的相似方法，J.Org.Chem.62卷，6712-6713页，1997年；作为参考以全文引入本文。这种脱保护由下述机制所决定N-三氟乙酰基的除去，然后氨基烷基磷酸三酯环化成氮杂环烷烃(azacyclane)，环化过程伴有磷酸二酯基的释放。
固相技术在寡核苷酸合成方法中继续发挥巨大作用。通常将3′-most核苷固着在用羟基或者氨基残基官能化的载体上，然后以分步方式向其中加入额外的核苷，在引入核苷的3′-官能团和载体结合核苷的5′-羟基之间形成需要的键。不言而喻，这种分步组装需要审慎选择合适的保护基。这些保护基用于防护长大的低聚物的核苷碱基部分的磷部分，直到低聚物从载体上切割掉。
切割以后，为生产纯化寡核苷酸产品，寡核苷酸在有些情况下通常必须进行处理和加工，如脱保护、沉淀和分离。沉淀方法是用逆溶剂处理溶液中的寡核苷酸产物形成凝聚固体悬浮液。然后从液相中分离该固体产物。全面记载了用于寡核苷酸沉淀和干燥的确定方法。寡核苷酸可以制备如下例如，在Maniatis的Techniques in MolecularBiology中所述技术。
一种用于提纯寡核苷酸的技术包括，例如用反相HPLC分离和汇集的DMT-保护的全长部分在-20℃的大体积乙醇中沉淀，用恒流高速离心(15K)分离，然后在水中重建。通过酸化使寡核苷酸水溶液的pH值为3.3-4.1除去4，4′-二甲氧基三苯甲基醚保护基。反应完成后，用3M乙酸钠稀释该溶液，然后在-20℃的乙醇中沉淀，通过高速离心分离并重新溶解在水中。用1N氢氧化钠调节寡核苷酸水溶液的pH值为7.0-7.4，在-20℃的乙醇中沉淀，通过恒流高速离心分离，然后在水中重建。最终重新形成的寡核苷酸水溶液通过冷冻干燥使用56小时干燥周期进行干燥。
然而，上述提纯方案要求使用通常仅能加工相对小批量寡核苷酸的昂贵高速离心机。另外，上述方法要需要将大量溶剂冷却到-20℃。
根据上文，仍旧需要改良的提纯寡核苷酸的方法。尤其是需要迅速而有效地生产高收率的纯化寡核苷酸的方法。该方法可优选在周围温度下进行。另外，该方法优选使用节约成本的分离技术使纯化寡核苷酸能够从溶液中分离。
发明概述本发明涉及用于提纯寡核苷酸和高收率地生产纯化寡核苷酸产品的新方法。更准确地说，本发明涉及用于聚集寡核苷酸和分离得到的聚集物的新方法。本发明方法可以在周围温度下操作并允许使用节约成本的物理技术分离聚集物。本发明也涉及用于小规模和大规模操作的节约成本的下游加工技术。
本发明涉及用于提纯寡核苷酸的方法，所述的方法包括步骤在足够形成寡核苷酸聚集物的条件下，使寡核苷酸与聚集剂和沉淀增强剂反应；分离出寡核苷酸聚集物，形成分离的寡核苷酸。在某些实施方案中，聚集剂是醇类，诸如甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇或变性乙醇。在其它实施方案中，沉淀增强剂包括盐，诸如钠盐(Na+)、锂盐(Li+)、铵盐(NH4+)、钾盐(K+)、镁盐(Mg+)、铯盐(Cs+)或锌盐(Zn+)。例如，沉淀增强剂可以是乙酸钠(NaOAc)或氢氧化钠(NaOH)。
在本发明的某些实施方案中，寡核苷酸是存在于溶液中的保护的寡核苷酸。保护基包括但不限于三甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、一甲氧基三苯甲基、9-苯基呫吨-9-基和9-(对甲氧苯基)呫吨-9-基。寡核苷酸在溶液中的存在浓度优选至少约550OD/ml，至少约600OD/ml或者至少约650OD/ml。
在本发明的其它实施方案中，寡核苷酸是存在于溶液中的脱保护的寡核苷酸。所述寡核苷酸在溶液中的存在浓度优选至少约2250OD/ml，约2500OD/ml-约7500OD/ml，或者约4500OD/ml-约6500OD/ml。
尽管可以在宽的反应温度范围内使用聚集剂处理寡核苷酸，然而优选在约15℃-约25℃、更优选在约18℃-约20℃之间使用所述聚集剂处理寡核苷酸。
在某些实施方案中，用所述沉淀增强剂处理寡核苷酸先于用所述聚集剂处理所述寡核苷酸。另外，用所述聚集剂处理寡核苷酸可以先于用所述沉淀增强剂处理所述的寡核苷酸，或者可以用所述沉淀增强剂和所述聚集剂的混合物处理寡核苷酸。
寡核苷酸可以存在于溶液中。当寡核苷酸存在于溶液中时，优选以约1份溶液对至少约1.5份(体积)聚集剂、更优选约2份-约4份聚(体积)集剂、甚至更优选约2.5份-约4.5份聚集剂(体积)的比率用聚集剂处理寡核苷酸。
在某些实施方案中，通过高速或者低速离心使寡核苷酸从所述溶液中分离。另外，可以通过重力沉降或者过滤使寡核苷酸从所述溶液中分离。
在优选方案中，纯化寡核苷酸的制备如下在足够形成第一寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂处理包含5′-保护的寡核苷酸的第一溶液，分离寡核苷酸，然后将分离的寡核苷酸聚集物溶解，形成第二溶液。用脱保护试剂处理第二溶液除去5′-保护基，在足够形成第二寡核苷酸聚集物的条件下用聚集剂和沉淀增强剂处理第二溶液，使寡核苷酸聚集物分离和溶解，形成第三溶液。在足够形成第三寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理第三溶液，形成第三寡核苷酸聚集物，分离第三寡核苷酸聚集物，提供纯化寡核苷酸。
在另一个实施方案中，纯化寡核苷酸的制备如下在足够形成第一寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理包含寡核苷酸的第一溶液，分离和溶解分离出的第一寡核苷酸聚集物，形成第二溶液；在足够形成第二寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理第二溶液，形成第二寡核苷酸聚集物，分离第二寡核苷酸聚集物，生成纯化寡核苷酸。
第一溶液可以通过酸化含有5′-保护的寡核苷酸的HPLC洗脱液制备，其中洗脱液是通过切割及碱解封的5′-保护的寡核苷酸的HPLC提纯生成。
在其它实施方案中，得到的纯化寡核苷酸纯度至少约90％、更优选至少约98％。在某些实施方案中，第一溶液是得自粗寡核苷酸的高压液相层析的洗脱液，其中使用装载反相介质或者强阴离子交换树脂的柱进行高压液相层析。
附图简述
图1表示可用于本发明的制备寡核苷酸的固相合成方案。
图2提供可用于图1所述合成方案中的亚磷酰胺实例。
图3表示载体结合分子的二甲氧三苯甲基脱保护，然后是缩合反应，其中载体结合分子与活化的2′-脱氧或者2′-甲氧基乙基修饰的亚磷酰胺单体反应。
图4表示四唑与载体结合分子的5′-羟基反应生成亚磷酸三酯和1-H-四唑的等价物。
图5表示将0.2M苯乙酰二硫化物(PADS)在乙腈∶3-甲基吡啶为1∶1的混合物中形成的溶液递送到反应柱中使亚磷酸三酯硫化，该反应形成相应的硫代磷酸三酯。
图6表示封端反应步骤，其中通过在吡啶/乙腈中递送乙酸酐与乙腈和N-甲基咪唑形成的混合物，使任何未反应的5′-羟基被乙酰化。图6也表示出最终步骤，其中通过过滤除去载体并用乙醇和水的混合物洗涤。
发明详述本发明涉及用于提纯寡核苷酸的方法，其中在足够形成寡核苷酸聚集物的条件下，使所述寡核苷酸与至少一种聚集剂和至少一种沉淀增强剂反应；然后分离寡核苷酸聚集物，提供分离的寡核苷酸。当寡核苷酸是聚集物形式时，主要由于其大小和质量，寡核苷酸的分离变得更为方便。例如，聚集的寡核苷酸更大，因此更容易通过过滤分离。同样，聚集物更重，在离心或者沉降方法过程中对引力效应更敏感。
通过变更反应条件，诸如所使用的聚集剂、所使用的沉淀增强剂、溶剂温度、溶剂与寡核苷酸比、成分添加顺序、寡核苷酸浓度和/或溶剂类型，寡核苷酸可以高效聚集，然后分离，得到纯化材料。本文公开的本方法提供了常规提纯方法之外的替代节约成本的方法，因为本发明方法可以不使用诸如高速离心机、冷却器和冷冻干燥机的设备而操作，因此减少生产时间和成本。另外，根据本发明使反应条件最佳化，可以获得极高收率的纯化寡核苷酸。
本发明的术语“寡核苷酸”包括但不限于含有许多通过含磷键连诸如亚磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯键连连接的单体亚单位的化合物。通过使用硫代磷酸酯核苷间键连，可使寡核苷酸具有核酸酶抗性。因此寡聚化合物包括寡核苷酸、其类似物和合成寡核苷酸。
如本文所用，术语“寡聚核苷”包括含有两个或更多的具有非磷连接部分的核苷亚单位的低聚物或者聚合物。寡聚核苷可以有具有通过糖基键附着于杂环碱基部分上的呋喃核糖部分的单体亚单位或者核苷。
可以连接寡核苷酸和寡聚核苷，得到嵌合寡聚化合物。除天然存在的磷酸二酯连接基团之外，含磷和非磷的连接基团可用于制备寡核苷酸、寡聚核苷和寡聚嵌合化合物(寡聚化合物)，所述连接基团包括但不限于以下基团含磷键连二硫代磷酸酯(-O-P(S)(S)-O-)；硫代磷酸酯(-O-P(S)(O)-O-)；氨基磷酸酯(-O-P(O)(NJ)-O-)；膦酸酯(-O-P(J)(O)-O-)；磷酸三酯(-O-P(OJ)(O)-O-)；氨基磷酸酯(-O-P(O)(NJ)-S-)；硫羰烷基膦酸酯(-O-P(S)(J)-O-)；硫代烷基磷酸三酯(-O-P(O)(OJ)-S-)；硼烷基磷酸酯(-R5-P(O)(O)-J-)；含非磷键连硫代二酯(-O-C(O)-S-)；硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NJ)-S-)；
硅氧烷(-O-Si(J)2-O-)；氨基甲酸酯(-O-C(O)-NH-和-NH-C(O)-O-)；氨基磺酸酯(-O-S(O)(O)-N-和-N-S(O)(O)-N-)；吗啉代磺酰胺(-O-S(O)(N(吗啉代)-)；磺酰胺(-O-SO2-NH-)；硫化物(-CH2-S-CH2-)；磺酸酯(-O-SO2-CH2-)；N，N′-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)；硫代甲缩醛(-S-CH2-O-)；甲缩醛(-O-CH2-O-)；酮缩硫醇(-S-C(J)2-O-)；和酮缩醇(-O-C(J)2-O-)；胺(-NH-CH2-CH2-)；羟胺(-CH2-N(J)-O-)；羟基亚胺(-CH＝N-O-)；和肼基(-CH2-N(H)-N(H)-)。
“J”代表通常是氢或者烷基的取代基，但是其可以是一种类型的键连与另一种类型的键连不同的更复杂基团。
除了上述包括天然存在键连中一种或者多种-O-P(O)2-O-原子被修饰或者取代之外，连接基团可包括5′-亚甲基和天然存在键连中一个或多个原子的修饰。无限制地，这种类型的键连包括如下键连酰胺(-CH2-CH2-N(H)-C(O))和-CH2-O-N＝CH-；和烷基磷(-C(J)2-P(＝O)(OJ)-C(J)2-C(J)2-)。
其中J如上所述。
用于合成上述取代核苷间键连的合成方案公开在WO91/08213、WO90/15065、WO91/15500、WO92/20822、WO92/20823、WO91/15500、WO89/12060、EP216860、US92/04294、US90/03138、US91/06855、US92/03385、US91/03680、美国专利申请07/990,848、07,892,902、07/806,710、07/763,130、07/690,786、5,466,677、5,034,506、5,124,047、5,278,302、5,321,131、5,519,126、4,469,863、5,455,233、5,214,134、5,470,967、5,434,257、Stirchak，E.P.等人，Nucleic Acid Res.，1989年，17卷，6129-6141页；Hewitt，J.M.等人，1992年，11卷，1661-1666页；Sood，A.等人，J.Am.Chem.Soc.，1990年，112卷，9000-9001页；Vaseur，J.J.等人，J.Amer.Chem.Soc.，1992年，114卷，4006-4007页；Musichi，B.，等人，J.Org.Chem.，1990年，55卷，4231-4233页；Reynolds，R.C.等人，J.Org.Chem.，1992年，57卷，2983-2985页；Mertes，M.P.等人，J.Med.Chem.，1969年，12卷，154-157页；Mungall，W. S.等人，J.Org.Chem.，1977年，42卷，703-706页；Stirchak，E.P.等人，J.Org.Chem.，1987年，52卷，4202-4206页；Coull，J.M.等人，Tet.Lett.，1987年，28卷，745页；和Wang，H.，等人，Tet.Lett.，1991年，32卷，7385-7388页；作为参考以全文引入本文。
可以对核苷酸的糖、碱基、或者磷酸酯基作其它修饰。代表性修饰公开在1991年7月25日公开的WO91/10671、1992年2月20日公开的WO92/02258、1992年3月5日公开的WO92/03568和美国专利5,138,045、5,218,105、5,223,618、5,359,044、5,378,825、5,386,023、5,457191、5,459,255、5,489,677、5,506,351、5,541,307、5,543,507、5,571,902、5,578,718、5,587,361、5,587,469中，所有专利转让给本申请的受让人。上面每个引用出版物的公开作为参考引入本文。
本文使用的术语“寡核苷酸类似物”是指可以含有天然存在(即“天然的”)和非天然存在的合成部分例如含有修饰的糖和/或核碱基(nucleobase)的核苷(nucleosidic)亚单位的化合物。这些寡核苷酸类似物通常在结构上与天然存在或者合成的野生型寡核苷酸有区别，但是在功能上是可交换的。因此，寡核苷酸类似物包括所有可有效起到模拟所需要的RNA或者DNA链结构和/或功能作用、例如通过杂交到靶点上的这些结构。术语“合成核苷”是指修饰核苷。代表性的修饰包括核苷的杂环碱基部分的修饰给出非天然存在的核碱基、核苷的糖部分的修饰和/或核苷间键连的修饰。
本文使用的“未修饰的”或者“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤，及嘧啶碱基胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。“修饰的”或者“非天然存在的”核碱基包括其它的合成和天然核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和5-丙炔胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-脱氮鸟嘌呤和8-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括美国专利3,687,808公开的核碱基以及Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering，858-859页，Kroschwitz，J，I.主编，John Wiley & Sons，1990年中公开的核碱基、Englisch等人，Angewandte Chemie，国际版，1991年，30卷，613页公开的核碱基以及Sanghvi Y.S.，第15章，Antisense Research andApplications，289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.主编，CRC出版社，1993年中公开的核碱基，每个作为参考以全文引入本文。
某些杂环碱基部分特别用于增加寡聚化合物与互补靶点的结合亲合力。这些杂环碱基包括5-取代嘧啶、6-偶氮嘧啶和N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘌呤和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲胞嘧啶取代表明可使核酸双螺旋稳定性增加0.6-1.2℃(标识符，276-278页)，该取代目前是优选的碱基取代，甚至更特别的是当与选择性2′-糖修饰如2-甲氧基乙基相结合时仍优选该取代。
指导杂环碱基部分(修饰核碱基)制备的代表性美国专利包括但不限于US3,687,808、4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941和5,808,027，其中某些专利是共同所有，每个专利作为参考以全文引入本文。
本文使用的术语“2-取代基”是指选择性附着在糖的2′-位的基团。然而，取代基团可以另外地或者额外地附着在糖的其它位置(如3′-和/或5′-位)、选定的杂环碱基部分或者在杂环碱基与糖部分两者上。
取代基的代表性列表包括氢、羟基、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C5-C20芳基、O-烷基、O-烯基、O-炔基、O-烷基氨基、O-烷基烷氧基、O-烷基氨基烷基、O-烷基咪唑、S-烷基、S-烯基、S-炔基、NH-烷基、NH-烯基、NH-炔基、N-二烷基、O-芳基、S-芳基、NH-芳基、O-芳烷基、S-芳烷基、NH-芳烷基、N-苯二酰亚氨基、卤素(尤其是氟)、氨基、硫醇基、酮基、羧基、硝基、亚硝基、腈、三氟甲基、三氟甲氧基、咪唑、叠氮基、肼基、羟氨基、异氰酸根合、亚砜、砜、硫化物、二硫化物、甲硅烷基、芳基、杂环、碳环、嵌入剂、报道基团、共轭物、聚胺、聚酰胺、聚二醇和式(O-烷基)m醚，其中m是1-约10。在这些聚醚中，优选线形和环状的聚乙二醇(PEGs)和含(PEG)基团，如冠醚及Ouchi等人(Drug Design and Discovery，1992年，9卷，93页)、Ravasio等人(有机化学杂质，1991年，56卷，4329页)和Delgardo等人(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1992年，9卷，249页)公开的聚醚，每个作为参考以全文引入本文。其它糖修饰公开在Cook，P.D.，Anti-Cancer DrugDesign，1991年，6卷，585-607页中，其作为参考以全文引入本文。氟代、O-烷基、O-烷氨基、O-烷基咪唑、O-烷基氨基烷基和烷氨基取代在美国专利6,166,197中描述，作为参考以全文引入本文。
寡聚化合物包括大量的键合核苷，其中优选的核苷间键连是3′，5′-键连。然而，可另外使用2′，5′-键连(如1998年7月14日提交的美国专利申请09/115,043)。2′，5′-键连是将核苷酸亚单位糖部分的2′-位与临近核苷酸亚单位糖部分的5′-位共价连接的键连。
本文所述寡核苷酸可有不对称中心。除非另有陈述，所有手性的、非对映的和消旋形式归入本发明。几何异构体也可能存在于本文所述化合物中，所有这些稳定的异构体都被本发明所预计到。可以理解含有不对称取代碳原子的化合物可以以旋光活性形式或者消旋形式或者通过合成分离。
所有存在于中间体或者最终化合物中的原子的同位素归入本发明。同位素包括具有相同原子序数和不同质量数的原子。非限制性地举例来说，氢的同位素包括氚和氘。
一些代表性修饰寡聚化合物包括至少一个含有以下取代基之一的核苷C1-C10低级烷基、取代低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或者O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡聚化合物药代动力学性质的基团、或者用于改善寡聚化合物药效性质的基团及其它具有相似性质的取代基。优选的修饰包括2′-甲氧乙氧基[2′-OCH2CH2OCH3、亦称′-O-(2-甲氧基乙基)或者2′-MOE](Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995年，78卷，486页)，即烷氧烷氧基。另外优选的修饰是2′-二甲氨氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，亦称2′-DMAOE。代表性氨氧取代基在1999年6月25日提交的题目为“氨氧-官能化低聚物”的共有美国专利申请09/344,260；以及1999年8月9日提交的题目为“氨氧官能化低聚物及其制造方法”的美国专利申请09/370,541中描述，作为参考以全文引入本文。
其它优选的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可以对核苷和低聚物上的其它位置、尤其是3′末端核苷上糖的3′-位或者在具有来自2′-位键连如2′-5′键合低聚物的核苷的3′位以及在核苷5′末端核苷的5′位进行类似的修饰。低聚物也可具有糖模拟物如环丁基部分代替戊呋喃妥英基糖。指导这些修饰糖结构制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,0531、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，一种某些专利是共有的，每个作为参考以全文引入本文，并且1995年6月5日提交的共有美国专利申请08/468,037也作为参考引入本文。
本发明的寡聚化合物可被用于诊断、治疗和作为科研试剂和试剂盒。它们通过包括一种合适的可药用稀释液或者载体可被用于药物组合物。另外它们可被用于治疗患有以不需要的蛋白质产生为特征的有机体。有机体应该与含有能与编码不需要蛋白质的核酸链进行特异杂交序列的寡核苷酸接触。可以对从单细胞原核生物和真核生物到多细胞真核生物的有机体进行这种类型的治疗。任何利用DNA-RNA转录或者RNA-蛋白质翻译作为其遗传、代谢或细胞控制基本部分的有机体对本发明的治疗和/或预防性治疗敏感。看起来完全不同的有机体，诸如细菌、酵母、原生动物、海藻、所有植物和所有的高等动物形式，包括恒温动物，可以进行治疗。另外，可以治疗多细胞真核生物的每个细胞，因为它们包括DNA-RNA转录和RNA-蛋白质翻译作为其细胞活动的主要部分。此外，许多真核细胞的细胞器(如线粒体和叶绿体)也包括转录和翻译机制。因此，单细胞、细胞群或者细胞器也可以归入可以用治疗或者诊断寡核苷酸治疗的有机体的定义内。
本文要求保护的合成方法中的反应在有机合成领域技术人员易理解的适当的溶剂中进行，适当的溶剂通常是在反应进行的温度，即从溶剂凝固温度到溶剂沸点温度之间的温度内，与原始材料(反应物)、中间体或者产物基本不反应的任何溶剂。给定反应可以在一种溶剂或者多于一种溶剂的混合物中进行。用于特殊反应步骤的适当的溶剂可根据特殊的反应步骤选择。
用于组装本发明的低聚物的方法包括液相和固相化学方法。代表性液相技术在转让给本发明受让人的美国专利5,210,264中描述，其作为参考以全文引入本文。代表性固相技术是通常使用的用标准亚磷酰胺化学的DNA和RNA合成用固相技术，(例如参见，Protocols ForOligonucleotides And Analogs，Agrawal，S.主编，Humana出版社，Totowa，NJ，1993年，作为参考以全文引入本文)。
本发明的载体包括本技术领域通常已知的用在固相方法学中的载体，例如包括可控孔度玻璃(CPG)、草酰-可控孔度玻璃(例如参见，Alul等人，Nucleic Acids Research，1991年，19卷，1527页，作为参考以全文引入本文)，TentaGel载体--氨基聚乙二醇衍生化载体(例如参见，Wright等人，四面体通讯，1993年，34卷，3373页，作为参考以全文引入本文)和Poros--一种聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。
使用一种具体合成方案，固相合成使用亚磷酰胺作为活化磷酸酯化合物。在这种技术中，亚磷酰胺单体与正在长大的低聚物链上的游离羟基反应，生成亚磷酸酯化合物中间体，用标准方法使该中间体氧化成PV态。这种技术通常用于几种类型键连，包括磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键的合成。
通常，这种方法的第一步是使用本技术领域已知的标准方法和程序进行第一单体或者高级亚单位与载体的附着。载体是在固相合成方法学中能够起固相作用的底物，诸如Caruthers的美国专利4,415,732、4,458,066、4,500,707、4,668,777、4,973,679和5,132,418及Koster的美国专利4,725,677和参考34,069中所述的载体。连结物任选位于末端核苷酸和载体之间。连结物是本领域已知的用来连结载体与固相合成技术中起始合成子分子的官能团(如羟基)的短分子。例如，适当的连结物公开在Oligonucleotides And Analogues A PracticalApproach，Ekstein，F.主编，IRL出版社，N.Y.，1991年，第一章，1-23页，作为参考以全文引入本文。
然后处理载体结合单体或者高级合成子，从游离终端除去保护基。通常，用酸完成这种处理。然后载体结合单体或者高级低聚物与各个单体或者高级构件(如合成子)反应，形成具有亚磷酸酯或者硫代亚磷酸酯键连的化合物。在更优选实施方案中，合成子在无水条件下在活化剂诸如，例如1H-四唑、5-(4-硝基苯基)-1H-四唑或者二异丙氨基四唑存在下反应。
本发明可以使用保护的和未保护寡核苷酸。“保护的寡核苷酸”是指寡核苷酸上的潜在活性基团通过可逆化学修饰被修饰的寡核苷酸。本文使用的术语“保护性基团”和“保护基”包括但不限于三甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、一甲氧三苯甲基、9-苯基呫吨-9-基和9-(对甲氧基苯基)呫吨-9-基、叔丁氧基羰基、苄氧羰基、三甲苯基(2，4，6-三甲苯基)酯、苯甲酰酯、叔丁基二苯基甲硅烷基酯、三苯基甲基(三苯甲基；Tr)、S-叔丁基、S-p-丁基、S-对硝基苄基和S-对甲氧基苄基和苯二酰亚氨基(例如参见，Greene和Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis；第二版，John Wiley & Sons，纽约，1991年)，作为参考以全文引入本文。
寡核苷酸任选存在于溶液中。适当的溶剂可容易地被本领域技术人员推断出，包括在所用反应温度与反应物、中间体或者产物基本不反应的任何溶剂。尽管可以使用任何的各种溶剂，所述溶剂也优选起到下面所讨论的聚集剂的作用。寡核苷酸在溶液中的浓度在相当大范围内变化。例如，可使用约550OD/mL-约475OD/mL浓度的寡核苷酸。然而，可以理解，寡核苷酸在溶液中的浓度取决于各种因素，包括所使用的溶剂、寡核苷酸性质。尤其是，当提纯溶液中的受保护寡核苷酸时，寡核苷酸在溶液中的存在浓度优选至少为550OD/mL，更优选至少约600OD/mL，甚至更优选至少约700OD/mL，仍然更优选至少约850OD/mL。当寡核苷酸是存在于溶液中的脱保护寡核苷酸时，该寡核苷酸在所述溶液中的存在浓度至少约2250OD/mL，更优选至少约2500OD/mL，优选至少约3000OD/mL，更优选至少约4500OD/mL，甚至更优选至少约6500OD/mL，仍然更优选至少约7500OD/mL。
本文使用的术语“OD/mL”是指使用紫外(UV)分光光度计在260nm和1cm路径长度测量的吸光率。
本发明的术语“聚集剂”包括但不限于可用于直接处理寡核苷酸或者处理存在于溶液中的寡核苷酸而形成聚集物或者固体的部分。本发明适当的聚集剂包括但不限于醇诸如甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇和变性乙醇。
本文使用的术语“寡核苷酸聚集物”和“聚集物”是指具有通过物理方法可进行分离大小和质量的寡核苷酸簇。用于分离寡核苷酸聚集物的物理方法包括但不限于离心、重力沉降和过滤。
本文使用的术语“沉淀增强剂”是指对沉淀产生有利效应的物质。在一个实施方案中，沉淀增强剂包括盐。适合用作沉淀增强剂的盐包括但不限于钠盐(Na+)、锂盐(Li+)、铵盐(NH4+)、钾盐(K+)、镁盐(Mg+)、铯盐(Cs+)和锌盐(Zn+)。有用钠盐的具体实例包括乙酸钠(NaOAc)和氢氧化钠(NaOH)。
寡核苷酸在足够形成寡核苷酸聚集物的条件下与聚集剂和沉淀增强剂反应。得到的纯化寡核苷酸产物纯度至少约90％、更优选至少约98％。使用本技术领域普通技术人员熟知的技术，诸如毛细管凝胶电泳或者质谱法确定得到的寡核苷酸的纯度％。
可单独选择每个反应物(如寡核苷酸、聚集剂、沉淀增强剂和/或溶剂)的温度、反应物的添加顺序、寡核苷酸浓度与聚集剂浓度的比使得寡核苷酸聚集物的形成最优化。
反应物的温度可以在很宽范围内变动。例如，可以冷却一种或者多种反应物。然而，甚至当本发明在环境温度或者室温使用反应物时可以得到高产率的分离寡核苷酸。因此，避免使用昂贵的冷凝器及其相关时间限制，优选在室温(优选约15℃-约25℃，更优选约18℃-约20℃)使用该反应物。
另外，反应物的混合顺序可以变化。具体地说，反应物可以进行如下混合(a)用沉淀增强剂处理寡核苷酸先于用聚集剂处理；(b)用聚集剂处理寡核苷酸先于用沉淀增强剂处理；和(c)可以用沉淀增强剂和聚集剂的混合物处理寡核苷酸。优选用沉淀增强剂处理寡核苷酸先于用聚集剂处理。
寡核苷酸浓度与聚集剂浓度的比也可以变化。例如，当寡核苷酸在溶液中时，寡核苷酸溶液与聚集剂的体积比优选是1份溶液对至少约1.5份、更优选至少约2份和甚至更优选至少约2.5份的聚集剂。尽管可以使用超过约1∶2.5的溶液对聚集剂的比，仍优选该比保持在1份溶液对低于约4.5份的、更优选对低于约4份的聚集剂，因为使用更多聚集剂的成本低于所得到的收益。
一旦形成寡核苷酸聚集物，则分离寡核苷酸聚集物，形成分离的寡核苷酸。由于寡核苷酸聚集物的大小和质量，可有利地使用用于分离寡核苷酸聚集物的物理方法。例如，寡核苷酸可以通过高速离心、低速(如优选低于每分钟约3000转、更优选低于约2500转)离心、重力沉降和/或过滤分离。
所使用的具体分离方法至少在某种程度上可能影响其它反应条件(如所使用的聚集剂和/或溶液对聚集剂浓度的比)的选择。例如，当使用离心或者重力沉降时，优选用聚集剂以1份寡核苷酸对约5份聚集剂的体积比处理寡核苷酸。更准确地说，当使用离心来分离用乙醇处理过的寡核苷酸时，寡核苷酸溶液对聚集剂的体积比优选1份寡核苷酸溶液对约2-约4份聚集剂。同样地，当使用离心来分离用1-丙醇、异丙醇和/或变性乙醇处理过的寡核苷酸时，寡核苷酸溶液对聚集剂的体积比优选1份寡核苷酸对约3份的聚集剂。当使用重力沉降分离用乙醇处理过的寡核苷酸时，寡核苷酸溶液对聚集剂的体积被优选1份寡核苷酸对约2-约4.5份的聚集剂。另外，当使用重力沉降处理用1-丙醇、异丙醇和/或变性乙醇处理过的寡核苷酸时，寡核苷酸溶液对聚集剂的体积比优选1份寡核苷酸对约3份聚集剂。
将理解本发明方法可以用作寡核苷酸制备和/或处理过程的一部分。因此，本发明方法可与各种预处理和/或后处理步骤结合。例如，在聚集剂和沉淀增强剂与寡核苷酸反应之前，寡核苷酸反应可是受保护的、脱保护的和/或重建的。另外，被分离的寡核苷酸在另外使用之前可以被重建。另外，将理解可以连续使用多个沉淀步骤。
本说明书言及或者提到的每一专利、申请、印刷出版物及其它公开文献将作为参考以全文引入本文。
本技术领域的技术人员将理解，可以对本发明的更优实施方案进行各种改变和修改，所作的这些改变和修改未脱离本发明的精神。因此，所附的权利要求书覆盖所有这些属于本发明精神和范围内的对等变异。
实施例本发明方法的效果在下面实施例阐述。尤其是，该实施例表示各种影响寡核苷酸的沉淀性质包括温度溶剂、溶剂与寡核苷酸的比、成分的添加顺序、寡核苷酸浓度和溶剂类型的因素效应。
寡核苷酸沉淀使用的溶剂是乙醇、用5％甲醇变性的乙醇、1-丙醇和异丙醇(IPA)。在DMT-脱去的寡核苷酸沉淀过程中使用3.0M的NaOAc诱导相变。使用序列、嘌呤对嘧啶的比和化学修饰不同的寡核苷酸得到例子。所使用的寡核苷酸如表1所述。例如，寡核苷酸6<SEQID NO6>(ISIS104838)是2′-O-(2-甲氧基乙基)修饰的含有10-碱基的2′-脱氧缺口(gap)、也称5-10-5MOE缺口体(gapmer)的硫代磷酸酯寡核苷酸。生产寡核苷酸6(ISIS104838)使用的方法是使用固相有机合成、制备反相层析提纯、酸性脱保护、固-液分离和真空干燥来生产药物的多步骤方法。
表1
寡核苷酸6(ISIS104838)的化学合成应用亚磷酰胺化学过程并包括活化单体与延伸聚合物的顺序偶联，延伸聚合物的一个末端共价附着于载体基质上。固相方法通过对载体进行简单的溶剂洗涤使得每个合成步骤中反应产物的提纯变得容易。20-聚体的合成在封闭反应器中进行，无需中间寡核苷酸的分离。化学合成方法使得规定体积的试剂和溶剂的递送往返于载体化学反应器。计算机控制下的阀和泵调节试剂和溶剂的流动。
附图1表示从3′端向5′端顺序组装的寡核苷酸。寡核苷酸用二氯乙酸在甲苯中通过载体结合分子5′端的脱保护进行组装(步骤1)，使得载体结合分子与引入的活化亚磷酰胺单体缩合(步骤2)，将得到的亚磷酸三酯氧化硫化成硫代磷酸三酯(步骤3)，任何未反应的羟基通过酰化封端，防止与后面引入的单体进行无序偶联(步骤4)。重复这一系列步骤用于随后的偶联反应(步骤5)，除去O-氰乙基保护基(步骤6)，然后寡核苷酸6(ISIS104838)从载体切割掉并同时发生环外胺脱保护(步骤7)。最后的处理包括制备型反相HPLC(步骤8)、5′-O-4，4’-二甲氧基三苯甲基醚的酸脱保护(步骤9)、产品的分离(步骤10)及药物的真空干燥(步骤11)。
附图3至6说明生产线路图，其中使用适当的亚磷酰胺重复合成反应(步骤1-4)，合成药物。可用于本方法的亚磷酰胺的实例如附图2所示。
附图3描述二甲氧三苯甲基脱保护步骤(附图1的步骤1)，其中根据化学合成进度，使用10％v/v的二氯乙酸(DCA)在甲苯中的溶液处理，首先从2′-甲氧基乙基核糖核苷上除去5′-O-二甲氧基三苯甲基，然后从2′-脱氧或者2′-甲氧基乙基核糖核苷低聚物上除去5′-O-二甲氧基三苯甲基，这给出部分受保护的载体结合分子和相对稳定的碳正离子。然后通过乙腈洗涤除去过量的酸和释放的二甲氧基三苯甲基碳正离子。
完整周期中的第二步是载体结合分子的新释放出的5′-羟基与活化的2′-脱氧基或者2′-甲氧基乙基修饰的亚磷酰胺单体之间的缩合反应(附图1的步骤2)。通过亚磷酰胺的乙腈溶液与过量弱酸1-H-四唑混合完成原位活化。形成的四唑化物(tetrazolide)迅速与载体结合分子的5′-羟基反应，以接近定量的收率给出亚磷酸三酯和1-H-四唑的等价物。用乙腈洗涤从柱式反应器中除去过量试剂和副产物。
附图4描述通过向反应柱中递送0.2M苯乙酰二硫化物(PADS)在乙腈∶3-甲基吡啶为1∶1的混合物中形成的溶液进行亚磷酸三酯的硫化，形成相应的硫代磷酸三酯。用乙腈洗涤载体结合材料除去过量反应物和副产物。
附图5描述任何给定周期中的最后反应，该反应是封端步骤，其中未反应的5′-羟基通过在吡啶/乙腈中递送乙酸酐与乙腈和N-甲基咪唑的混合物进行乙酰化。得到的5’-O-乙酸酯在余下的整个合成期间一直保持稳定直到经过最后的氨解而切割。用乙腈洗涤除去过量反应物。
在19次5′-羟基脱保护、偶联、硫化和封端顺序的周期后，附图6表示氰乙基保护基用三乙胺的乙腈溶液处理从核苷酸间键连除去，生成硫代磷酸二酯，而寡核苷酸仍然与载体结合。这使得在碱基介导的β-消除过程中产生的丙烯腈被清除。在这些条件下，生成的丙烯腈不与存在的胸苷残余物反应并且可简单地从载体结合材料洗掉。然后在高温用氢氧化铵保温处理完成切割和碱基脱保护。过滤和用乙醇和水的混合物洗涤除去载体。合并的滤液和洗涤液浓缩，通过反相(RP)HPLC进行5′-DMT保护的寡核苷酸6(ISIS104838)粗品的脱保护。
在一个用于制备纯化寡核苷酸的方法中，通过RP-HPLC完成5′-脱保护产物粗品的层析提纯。RP-HPLC步骤除去由于不完全单体偶联所产生的DMT脱去的错误序列(步骤2)。该方法在使全长DMT保护产物从更短的DMT脱去的错误序列分离中有效。该效力应归于全长DMT保护产物与更短DMT脱去的错误序列所具有的疏水性差异。由于WatersHC-C18 HA“Bonda-Pak”十八烷基甲硅烷基二氧化硅(37-55μm，125)径向压缩柱的流动特性、效力、耐用性和高填充能力，选择其进行RP-HPLC步骤。径向压缩柱使用Biotage Kiloprep 100 HPLC系统用水/甲醇/2.5M乙酸钠平衡。
寡核苷酸6(ISIS104838)粗品在起始溶剂混合物中的溶液被装载到柱上，用甲醇在乙酸钠缓冲液(pH7.2)中的溶液逐步梯度洗脱该柱，通过连续UV吸收分光光度法监测洗脱图。以级分形式取DMT保护产物峰并进行分析。符合规格的级分汇集到一起并用于分析全长面积％。将含有主要产物的RP-HPLC洗脱液转移到沉淀器并溶解在0.01M乙酸钠(pH3)中。测定得到溶液的pH值，以测定结果为基准，计算所需的脱三苯甲基作用时间。在室温下在规定时间保温处理后，沉淀脱三苯甲基的寡核苷酸，分离得到的沉淀物。以类似方法制备寡核苷酸1-5，7和8。
在另一用于制备纯化寡核苷酸的方法中，计算需要量的室温乙醇，将其转移到沉淀器中并开始搅拌。将反相HPLC提纯得到的三苯甲基洗脱液材料转移到沉淀器的乙醇中，在离心过程中，沉淀寡核苷酸，并使不需要的HPLC流动相成分(如甲醇和盐)撇入废液中。以约3000RPM的速度开始低速离心，使用3000ml/分钟或者更小流速的蠕动泵将沉淀的寡核苷酸泵入离心机中。由于离心力，寡核苷酸粘附在转筒表面，而液体被撇去直接进入废液中。完成离心之后，使用氩气流干燥离心机转筒中沉淀的寡核苷酸。转筒中的寡核苷酸通过添加计算量的水并调整离心RPMs使水与寡核苷酸饼达到最大接触被重新溶解。将重新溶解的材料转移回到脱三苯甲基反应用沉淀器中。
将计算量的酸化溶液即0.01MNaOAc(pH＝2.9-3.1)添加到含有寡核苷酸溶液的沉淀器中，以测量的pH为基准使反应在计算时段内进行。加入计算量的3.0 MNaOAc(pH＝8.0)停止脱三苯甲基反应。
然后加入计算量的室温乙醇，该乙醇使寡核苷酸沉淀，但是使现已切割的5′-二甲氧基三苯甲基保留在溶液中，将该溶液直接导入废液中。以约3000RPM的速度进行离心，使用3000ml/分钟或者更小流速的蠕动泵将沉淀的寡核苷酸泵入离心机中，完成离心后，寡核苷酸通过添加计算量的水并调整离心的转数(RPMs)使水与寡核苷酸饼发生最大接触而重建寡核苷酸。
将重建的物质转移到合适大小的容器中，其中用冰醋酸和/或1.0N的NaOH调整该重建物质的pH值到7.2-7.5。向调整pH的寡核苷酸溶液中加入计算量的3.0M的NaOAc溶液。向沉淀器中加入计算量的室温乙醇，然后向该乙醇中加入脱三苯甲基溶液/NaOAc的混合物，乙醇使寡核苷酸沉淀并使调整pH步骤中生成的盐保留在溶液中，该溶解被直接引入废液中。
以约3000RPM的速度开始离心，使用3000ml/分钟或者更小流速的蠕动泵将沉淀的寡核苷酸泵入离心机中。完成离心后，使用氩气流干燥离心机转筒中沉淀的寡核苷酸。寡核苷酸通过添加计算量的水并调整离心转数使水与寡核苷酸饼达到最大接触而重建寡核苷酸。将重建的物质转移到适当的过滤用和冻干用容器中。
寡核苷酸通过重力沉降、离心或者过滤分离。使用10mL和50mL的尖底离心管进行长凳面重力沉降。在Sorvall固定角度旋转离心机中(E.I.DuPont de Nemours&公司，配备有SLA3000转片，能容纳10和25mL离心管)进行小规模旋管实验。使用最大容量为250g的CarrPowerfuge Pilot产生补充数据。使用20Kg容量的小型Robatel，Slab 320沉积离心机证明可量测性。在装有10μm或者20μm的316不锈钢过滤器的43mm、100mm和213mm的布氏漏斗中进行真空过滤实验。较大的过滤实验使用装有10μm底部烧结A 1/8 hp Gast真空泵的Pharmacia细线(fine line)350柱帮助过滤过程中的流动。
在以下的一种设备中进行干燥实验NAPCO真空烤箱、Leybold冻干机、LabLine烤箱或者按用户需要设计的装有进气口的水套真空过滤器。通过气相层析法分析干燥粉末的残余乙醇含量。
通过紫外(U.V.)分光光度计确定溶液中寡核苷酸的百分比。本文使用的术语“OD”是指使用1cm通路长度在260毫微米测量的吸光度。与特殊试验参数对应的残留在液相中的悬浮固体或者寡核苷酸的百分比是被强调因子有效性的标准量度。导致产物在溶液中低水平残留的变量被认为是有效的。
实施例1溶剂温度对全长二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的级分沉淀的影响。
将3mL初始浓度为1263OD/mL的寡核苷酸2<SEQ.ID No2>(ISIS2302)沉淀到3体积的冷(-20℃)或周围温度(18-20℃)的乙醇、1-丙醇、异丙醇或者变性乙醇(溶剂)中。得到的混合物进行简单搅拌，然后进行重力沉降1.5小时或者以2,000RPM的速度离心2分钟。使用紫外(UV)分光光度计分析液相的等分试样(1mL)，分析液相中寡核苷酸的浓度。确定液相中残留的寡核苷酸百分比(液相中寡核苷酸％)。用冷溶剂或者周围温度溶剂处理然后进行重力沉降和低速离心的结果如表2和3所示。
表2
表3
表2数据表明，当使用冷溶剂时，残留在液相中的溶解寡核苷酸总量为4.8-5.4％。根据观察，观察到用冷溶剂处理的寡核苷酸产生均匀分散的微细沉淀物，该沉淀物悬浮在液相中，1.5小时后未从溶剂中沉淀出来。相比之下，环境温度的溶剂立即生成大聚集物，该聚集物迅速沉淀，使液相得以澄清。对于被检验的每种溶剂而言，周围温度处理的寡核苷酸的上层清液中产物留有率为0.25-0.31％。
表3数据同样表明，通过冷温度沉淀法生成的淤浆液相中残留2.8-4.4％的悬浮固体，而当使用周围温度醇时，残留有小于0.3％的产物。在等量的寡核苷酸No.4<SEQ.ID No.4>(ISIS2503)在冷乙醇或者室温乙醇中沉淀然后以低速(2000RPM)离心或者通过沉降分离的平行实验中获得相似结果。
实施例2溶剂比对DMT保护的全长级分沉淀的影响。
将3mL等份的初始浓度为1785OD/mL的DMT保护的寡核苷酸4<SEQ.ID No4>(ISIS2503)在1-4.5体积的周围温度乙醇中沉淀。将得到的混合物简单搅拌1分钟，然后沉降1.5小时。沉降后，收集约1mL液相，测量在液相中残留的寡核苷酸的浓度和百分比(液相中寡核苷酸％)。结果如表4所示。
表4
表4数据表明对于2.5倍-3.5倍于寡核苷酸体积的乙醇而言，液相寡核苷酸含量小于0.58％；4倍、4.5倍和5倍于寡核苷酸体积的乙醇对沉淀没有显著的额外影响，但注意到液相中残留产物有轻微的增加。当使用1-丙醇和IPA时，结果与用乙醇观察到的结果几乎相同。使用变性醇的结果表明液相中寡核苷酸的百分比稍微增加。另外，观察到1-1.5倍体积的乙醇不足够诱导完全沉淀，而2倍于寡核苷酸体积的乙醇生成立即开始沉降的大聚集物。聚集物迅速变成胶状，不能通过搅拌再悬浮。未观察到用2.5-3.5倍于寡核苷酸体积的醇诱导沉淀之间的区别。另外，在沉降过程中形成的聚集物通过缓和的搅拌容易再悬浮。
除了迅速将淤浆转移到Sorvall离心机中并以2,000RPM离心2分钟之外，重复前述方案。离心后测量液相中寡核苷酸的残留量(液相中寡核苷酸％)，如表5所示。
表5
表5数据表明使用约2.5倍于寡核苷酸体积的过量乙醇没有显著益处。实际上，用约4.5倍于寡核苷酸体积的过量乙醇处理、然后离心后，溶液中寡核苷酸的残留量轻微增加。当使用1-丙醇、IPA和变性醇时，结果与使用乙醇产生的结果相比有轻微改善。
实施例3DMT-保护的全长寡核苷酸浓度对沉淀和过滤的影响。
从寡核苷酸2和4<SEQ.ID NO2；SEQ.ID NO4>(ISIS2302；ISIS2503)的产物中保留小体积的DMT-保护的寡核苷酸，进行如下检验将3mL寡核苷酸在3体积的周围温度乙醇中沉淀的同时搅拌1分钟。目测检查游浆性质，得到的淤浆用装有5.5cm、Whatman No.4过滤器的小布氏漏斗真空过滤。根据游浆可滤过性评定游浆等级(A-D)。假设生成的游浆能够保留在过滤器上，收集小体积的滤液，测量液相中寡核苷酸的残留百分比(液相中寡核苷酸％)。结果如表6所示。
表6
A＝不能完成过滤。B＝完成部分过滤。C＝产物保留在过滤器上。D＝产物保留在过滤器上，具有极慢的速率291、344、365、384、392和426OD/mL浓度的DMT-保护的洗脱液在沉淀过程中产生大聚集物。然而，聚集物在整个滤膜表面形成柔软的胶状薄膜，不能进行过滤。561、573和689OD/mL浓度的DMT-保护的洗脱液在沉淀过程中产生半坚硬粒状聚集物，该聚集物的过滤相当慢。当洗脱液浓度增加到706OD/mL及更大时，聚集物变得干而脆。过滤流速表明这些脆的聚集物可容易地从液相分离。分析表明小于0.3％的产物保留在废滤液中。使用周围温度1-丙醇、IPA和变性乙醇的方法与用乙醇得到结果相似。
实施例4溶剂温度对全长DMT-脱去的寡核苷酸沉淀的影响。
使脱三苯甲基的全长寡核苷酸1和2<SEQ.ID NO.1；SEQ.ID NO2>(ISIS5132和ISIS2302)(25mL)在3体积的-20℃和周围温度(18-20℃)的乙醇、1-丙醇、IPA和变性醇中沉淀。然后简单搅拌得到淤浆并沉降1.5小时。完成沉降后，提取1mL等分的液相，测量液相中寡核苷酸的残留百分比(液相中寡核苷酸％)。结果如表7所示。
表7
表7数据表明当使用每种醇时，结果是一致的。冷温度沉淀生成非常微细的、均匀分散的颗粒，沉降后溶液中残留4.2-5.8％的颗粒。然而，周围温度沉淀立即生成大聚集物，该聚集物迅速沉淀，沉降后液相中残留0.26-0.33％的产物。这一结果对应于使用周围温度溶剂的产物损失减少90％。
除了沉淀后旋管以2,000rpm离心2分钟之外，重复前述方案，测量液相中寡核苷酸的残留百分比(液相中寡核苷酸％)。结果如表8所示。
表8
表8数据表明当使用温度为-20℃的溶剂进行沉淀时，液相中残留2.8-4.0％的寡核苷酸。当使用周围温度(18-21℃)溶剂进行沉淀时，液相中残留0.21-0.25％的产物。
实施例5溶剂比对全长DMT-脱去的寡核苷酸沉淀的影响。
使两种寡核苷酸，寡核苷酸1和2<SEQ.ID NO1；SEQ.ID NO2>(ISIS5132和ISIS2302)(25mL)在1-5体积的乙醇、1-丙醇、IPA或者变性乙醇中沉淀，涡流25秒，沉降1.5小时。沉降后，收集1mL试样，测量液相中寡核苷酸百分比。结果如表9所示。
表9
观察到1-1.5倍体积的乙醇不足够诱导完全沉淀。2倍体积的乙醇产生大聚集物，该聚集物迅速沉降，在离心管底部上形成发粘层。用2.5倍、3倍和3.5倍于体积寡核苷酸的乙醇生成的聚集物没有显著区别。测量液相中残留的产物小于约0.39％。4倍、4.5倍和5倍体积的乙醇生成大聚集物，但是，沉降后液相中寡核苷酸的残留量轻微增加(大于约0.39％)。因此，大于约2.5倍于寡核苷酸体积的乙醇看起来不能改善产物回收。
除了使游浆以2,000rpm离心1分钟之外，重复前述方案，测量液相中寡核苷酸的残留百分比，结果如表10所示。
表10
表10数据表明2.5倍、3倍和3.5倍于寡核苷酸体积的醇产生的结果与沉降后观察到的结果相似。特别是，在那些寡核苷酸溶剂比的情况下，在液相中残留的寡核苷酸小于0.35％。当溶剂的相对比例从4倍增加到5倍时，液相中寡核苷酸的残留百分比从0.46增加到0.70％。然而，观察到每体积寡核苷酸使用2.5-3.5体积溶剂所形成的沉淀物略显凝胶状。
实施例6加入顺序的影响。
改变三种沉淀成分(如醇、DMT-脱去的寡核苷酸和乙酸钠)的添加顺序，然后使得到的淤浆沉降1.5小时，此时收集1mL液相试样，测量液相中寡核苷酸的残留百分比(液相中寡核苷酸％)，结果如表11所示。
根据A步骤，将145μL的3.0M的NaOAc加入到25mL浓度为2750OD/mL的DMT-脱去的寡核苷酸1或者2<SEQ.ID NO1；SEQ.ID NO2>(ISIS5132；ISIS2302)中，然后将得到的盐/寡核苷酸混合物加入到三种体积的乙醇、1-丙醇、IPA或者变性乙醇中并混合30秒。使得到的淤浆沉降1.5小时，收集1mL液相试样，测量液相中寡核苷酸的浓度(液相中寡核苷酸％)。观察到在将盐/寡核苷酸混合物加入到任何所用醇中时，形成大聚集物并立即开始沉降。表11数据表明沉降后液相残留小于约0.35％的寡核苷酸。
B步骤包括将145μL的NaOAc转移到75mL乙醇、1-丙醇、IPA或者变性乙醇中并混合2分钟。向该混合物中加入25mL的寡核苷酸溶液，得到的淤浆混合30秒。然后使该混合物沉降1.5小时，收集1mL液相试样测量液相中寡核苷酸的浓度。观察到使用这个方案产生的聚集物小，液相变得混浊。表11数据表明6.5-9.2％的寡核苷酸残留在液相中。
根据C步骤，将25mL寡核苷酸溶液转移到75mL乙醇中并混合1分钟。向该混合物中加入145μL的3.0M的NaOAc，将得到的淤浆混合30秒。然后如前所述使淤浆沉降并取样。这个方案产生大聚集物和小聚集物的混合物，1.5小时后小聚集物仍保持悬浮。收集液相试样，测量液相中寡核苷酸浓度。液相含有7.3-10.0％的产物。
表11
实施例7全长DMT-脱去的寡核苷酸浓度对聚集物形成和过滤的影响。
使用冻干粉末形式的寡核苷酸1或者5<SEQ.ID NO1或者SEQ.IDNO5>(ISIS5132或者ISIS3521)制备含有寡核苷酸浓度为1000OD/mL-4750OD/mL的溶液。向这些储液中加入3.0M的NaOAc，得到的混合物进行涡旋。使该混合物在3体积的乙醇中沉淀，得到的淤浆通过装有5.5cm的Whatman No.4过滤器的布氏漏斗真空过滤，以过滤难易为基准，评定游浆等级(A-D)。过滤后测量滤液中寡核苷酸的残留百分比(滤液中寡核苷酸％)。过滤结果如表12所示。
表12
*A＝不能完成过滤；B＝完成部分过滤；C＝产品残留在过滤器上；和D＝产品残留在过滤器上并具有优异流速。
观察到1000-2000OD/mL的寡核苷酸浓度生成大聚集物，该聚集物形成胶质层。因此，它们不能过滤。最初为2,250OD/mL的寡核苷酸浓度可以部分过滤并且3.5-3.9％的产物残留在液相中。
表12数据表明当寡核苷酸的初始浓度从2500增加到2750OD/mL时，过滤速率有显著改善并且液相中产物的残留百分比减小到0.6-1.3％。通过沉淀浓度为3000-4500OD/mL的寡核苷酸溶液可达到最佳过滤。过滤含有这些浓度的溶液使液相中产物的残留量减少到小于约0.3％。
实施例8根据FDA药品生产管理规范使用室温乙醇生产的批数使用室温乙醇和Carr离心机成功加工了六批寡核苷酸3-7<SEQ.IDNos3-7<SEQ.ID NOS3-7>(ISIS14803、ISIS2503、ISIS3521、ISIS104838和ISIS107248)。
实施例9小规模低速离心在Robatel Slab 320沉积离心机中以2,500rpm加工寡核苷酸2和3<SEQ.ID NOS 2，3>(ISIS2302、ISIS14803)。结果如表13所示。根据前述方案制备寡核苷酸。
表13
表13数据表明用低速离心在生产规模上可以获得良好收率。
实施例10小规模过滤和干燥使用50g-2.5Kg的DMT-脱去的寡核苷酸溶液进行几种检验。该方法如下1)将最终的DMT-脱去的寡核苷酸重建到120mg/mL-150mg/mL；2)搅拌的同时向DMT-脱去的寡核苷酸溶液加入2％-4％v/v的3.0M的NaOAc溶液；3)在温和搅拌下将得到的溶液转移到2.7-3.0体积的周围温度乙醇中；4)将淤浆转移到真空过滤器器械中，通过10或者20μm的316ss过滤器过滤；和5)用烘箱、真空烘箱进行真空干燥或者过滤干燥。如表14所示，得到的滤饼床高度范围从几个毫米到11厘米。收率数据显示产物的损失范围是0.18-0.30％。结果如表14所示。
表14
这些实验结果如表15所示。根据前述方案进行沉淀和过滤步骤。
表15
真空烘箱干燥收集大布氏漏斗中的203g寡核苷酸2<SEQ.ID No2>(ISIS2302)后，将滤饼和漏斗转移到真空烘箱中，将烘箱加热到30℃和压力为25in/Hg真空度。25小时后，从烘箱中取出干燥滤饼，通过#20筛筛选，混合，称重，检验试样的残余乙醇。最后干燥滤饼中乙醇含量是0.32％。干燥产品的重量是202.6g，表明产品损失小于0.2％。
真空盘式干燥在大布氏漏斗中收集177g寡核苷酸2<SEQ.ID No2>(ISIS2302)的湿滤饼，将其转移到316ss冻干盘中并迅速置于冻干器中。将搁板加热到30℃并且真空度为100微米。干燥24小时后，产品通过#10筛，混合并称重。最终干燥产品中的乙醇含量是0.056％。干燥材料的最终重量是178g，表明在加工期间产品基本无损失。
烘箱干燥制备、沉淀和在布氏漏斗中收集160g寡核苷酸1<SEQ.ID No1>(ISIS5132)实物模型溶液；迅速将得到的滤饼转移到预热为55℃的烘箱中，滤饼干燥12小时后通过#20筛，称重，混合。测量干燥产品的最终重量是159.6g，乙醇含量是0.33％。该方法约有0.2％的产品损失。
过滤器真空干燥通过真空过滤在特殊设计的水套过滤器中收集120g湿滤饼寡核苷酸1<SEQ.ID No1>(ISIS5132)。过滤后立即用氩气洗吹滤饼同时使30℃的水循环通过外套管。用氩气吹洗干燥15小时后，滤饼通过#20筛，混合并称重。产物的最终重量是119.5g。
实施例11寡核苷酸特异性修饰。
对下列序列，计算使5′-二甲氧基三苯甲基水平减小一半所需的产品特异性反应时间(以分钟表示)，其中x等于酸化后的pH值。
2302t1/2＝0.0148*100.6773(x)2503t1/2＝0.0031*100.9235(x)3521t1/2＝0.0074*100.7195(x)5132t1/2＝0.0147*100.7696(x)14803t1/2＝0.0103*100.6554(x)104838t1/2＝0.0072*100.8093(x)107248t1/2＝0.0200*100.7516(x)将半衰期计算得到的分钟数乘以15，得到的数是总反应时间。反复15次使5′-二甲氧基三苯甲基水平减少一半，检测到水平为零。
权利要求
1.一种用于制备纯化寡核苷酸的方法，该方法包括a)提供包含寡核苷酸的溶液；b)在足够形成寡核苷酸聚集物的条件下用聚集剂和沉淀增强剂处理所述溶液；和c)分离所述的寡核苷酸聚集物，形成所述的纯化寡核苷酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述溶液包含脱保护的寡核苷酸。
3.权利要求2所述的方法，其中所述溶液是酸性的。
4.权利要求3所述的方法，其中所述溶液通过使用可有效除去5′-保护基的脱保护剂处理溶液中的5′-保护的寡核苷酸来制备。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的5′-保护基选自三甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、一甲氧基三苯甲基、9-苯基呫吨-9-基和9-(对甲氧基苯基)呫吨-9-基。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的保护基是二甲氧基三苯甲基。
7.权利要求2所述的方法，其中所述的脱保护的寡核苷酸在所述溶液中的浓度是至少约2250OD/mL。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的脱保护的寡核苷酸在所述溶液中的浓度是约2250-约7500OD/mL。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的脱保护的寡核苷酸在所述溶液中的浓度是约4500-约6500OD/mL。
10.权利要求1所述的方法，其中所述溶液是通过在水中重建分离出的脱保护的寡核苷酸制备的。
11.权利要求1所述的方法，其中所述的聚集剂包括醇。
12.权利要求11所述的方法，其中所述的从醇选自甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇和变性乙醇。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的沉淀增强剂包括盐。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的盐选自钠盐、锂盐、铵盐、钾盐、镁盐、铯盐和锌盐。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的盐是醋酸钠。
16.权利要求14所述的方法，其中所述的盐是氢氧化钠。
17.权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸在约15℃-约25℃的温度下用所述的聚集剂处理。
18.权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸在约18℃-约20℃的温度下用所述的聚集剂处理。
19.权利要求1所述的方法，其中在用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸之前用所述的沉淀增强剂处理所述的寡核苷酸。
20.权利要求1所述的方法，其中在用所述沉淀增强剂处理所述的寡核苷酸之前用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸。
21.权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸用所述沉淀增强剂和所述聚集剂的混合物处理。
22.权利要求1所述的方法，其中以约1份溶液对至少约1.5份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的溶液。
23.权利要求22所述的方法，其中以约1份溶液对约2-约4份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的溶液。
24.权利要求22所述的方法，其中以约1份溶液对约2.5-约4.5份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的溶液。
25.权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸聚集物通过离心分离。
26.权利要求25所述的方法，其中所述的离心以每分钟小于约3000转的速度进行。
27.权利要求26所述的方法，其中所述的离心以每分钟小于约2500转的速度进行。
28.权利要求25所述的方法，其中以1份寡核苷酸对约5份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸。
29.权利要求28所述的方法，其中所述的聚集剂是乙醇，以及以1份寡核苷酸对约2-约4份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸。
30.权利要求29所述的方法，其中所述的聚集剂选自1-丙醇、异丙醇和变性乙醇，以及以1份寡核苷酸对约3份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸。
31.权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸通过重力沉降分离。
32.权利要求31所述的方法，其中以1份寡核苷酸对5份聚集剂的体积比用所述的聚集剂处理所述的寡核苷酸。
33.权利要求32所述的方法，其中所述的聚集剂是乙醇，以及以1份寡核苷酸对约2-约4.5份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸。
34.权利要求27所述的方法，其中所述的聚集剂是乙醇，以及以1份寡核苷酸对约2-约3.5份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸。
35.权利要求34所述的方法，其中所述的聚集剂选自1-丙醇、异丙醇和变性乙醇，以及以1份寡核苷酸对约3份聚集剂的体积比用所述聚集剂处理所述的寡核苷酸。
36.权利要求1所述的方法，其中所述的寡核苷酸通过过滤分离。
37.权利要求36所述的方法，其中所述的寡核苷酸从所述溶液中分离后，所述的寡核苷酸在所述溶液中的残留量不大于约3.5％。
38.权利要求37所述的方法，其中所述的寡核苷酸从所述溶液中分离后，所述的寡核苷酸在所述溶液中的残留量不大于约1.5％。
39.权利要求38所述的方法，其中所述的寡核苷酸从所述溶液中分离后，所述的寡核苷酸在所述溶液中的残留量不大于约1％。
40.一种用于制备纯化寡核苷酸的方法，该方法包括步骤a)提供包含寡核苷酸的溶液；b)在足够形成寡核苷酸聚集物的条件下，用乙醇和钠盐处理所述溶液，其中所述的乙醇的温度为约15-约25℃；和c)分离所述的寡核苷酸聚集物，形成所述的纯化寡核苷酸。
41.权利要求40所述的方法，其中所述的钠盐是醋酸钠或者氢氧化钠。
42.一种用于制备纯化寡核苷酸的方法，该方法包括步骤a)提供包含寡核苷酸的溶液；b)在足够形成寡核苷酸聚集物的条件下，用沉淀增强剂处理所述溶液，然后用聚集剂处理所述溶液；和c)分离所述的寡核苷酸聚集物，形成所述的纯化寡核苷酸。
43.权利要求42所述的方法，其中所述的沉淀增强剂是醋酸钠。
44.权利要求42所述的方法，其中所述的聚集剂选自甲醇、乙醇、1-丙醇、异丙醇和变性乙醇。
45.一种用于制备纯化寡核苷酸的方法，该方法包括步骤在足够形成第一寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂处理含有5’-保护的寡核苷酸的第一溶液；分离所述的第一寡核苷酸聚集物；使分离出的第一寡核苷酸聚集物溶解在溶剂中，从而形成第二溶液；使用可有效除去所述的5’-保护基的脱保护剂处理所述的第二溶液；在足够形成第二寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理所述的第二溶液；分离所述的第二寡核苷酸聚集物；使所述的第二寡核苷酸聚集物溶解在溶剂中，得到第三溶液；在足够形成第三寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理所述的第三溶液；和分离所述的第三寡核苷酸聚集物，得到所述的纯化寡核苷酸。
46.权利要求45所述的方法，其中所述的第一溶液通过寡核苷酸粗品的层析得到的洗脱液。
47.权利要求46所述的方法，其中所述的层析是高压液相层析。
48.权利要求47所述的方法，其中所述的高压液相层析使用装载反相介质或强阴离子交换树脂的柱进行。
49.权利要求45所述的方法，其中所述的第一寡核苷酸聚集物或者第二寡核苷酸聚集物的分离通过重力沉降或者离心进行。
50.权利要求45所述的方法，其中所述的第三寡核苷酸聚集物的分离通过过滤进行。
51.权利要求45所述的方法，其中所述的纯化寡核苷酸的纯度是至少约90％。
52.权利要求51所述的方法，其中所述的纯化寡核苷酸的纯度是至少约98％。
53.一种用于制备纯化寡核苷酸的方法，该方法包括步骤在足够形成第一寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理含有寡核苷酸的第一溶液；分离所述的第一寡核苷酸聚集物；使分离出的第一寡核苷酸聚集物溶解在溶剂中，从而形成第二溶液；在足够形成第二寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理所述的第二溶液；分离所述的第二寡核苷酸聚集物，得到所述的纯化寡核苷酸。
54.权利要求53所述的方法，其中所述的纯化寡核苷酸的纯度是至少约90％。
55.权利要求54所述的方法，其中所述的纯化寡核苷酸的纯度是至少约98％。
56.权利要求53所述的方法，其中所述的第一溶液的寡核苷酸是5’-脱保护的寡核苷酸。
57.权利要求56所述的方法，其中所述的第一溶液是通过酸化含有5’-保护的寡核苷酸的HPLC洗脱液制备的。
58.权利要求57所述的方法，其中所述的HPLC洗脱液得自切割和碱基解封的5’-保护的寡核苷酸的HPLC提纯。
59.权利要求53所述的方法，其中所述的第一寡核苷酸聚集物的分离通过重力沉降或者离心进行。
60.权利要求53所述的方法，其中所述的第二寡核苷酸聚集物的分离通过过滤进行。
61.权利要求49所述的方法，其中所述的溶剂是水。
全文摘要
制备纯化寡核苷酸的方法，该方法是在足够形成寡核苷酸聚集物的条件下，用聚集剂和沉淀增强剂处理含寡核苷酸的溶液、分离寡核苷酸而生产纯化寡核苷酸。
文档编号C12Q1/68GK1514842SQ02811413
公开日2004年7月21日 申请日期2002年6月5日 优先权日2001年6月7日
发明者马克恩·N·穆尔, 约翰·查尔斯·阿瑟, 肯特·万索伊, 安东尼·N·斯科扎里, N 斯科扎里, 万索伊, 查尔斯 阿瑟, 马克恩 N 穆尔 申请人:Isis药物公司