专利名称：中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法
技术领域：
本发明是一种用于鉴定中药浙贝母的引物及其鉴定方法，涉及中药材鉴定的本发明设计的浙贝母聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为引物15’-CTAAATAGGCGG GCGAGCTAATC-3’引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。
中药材浙贝母聚合酶链反应鉴定的方法为
(1)药材DNA提取按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA质量的鉴定用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物可扩增各种植物的5S rRNA间区序列。引物的DNA序列为AS5’-GGATCC GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-15’-GGA TCC TTA GTG CTGGTA TGA TCG CA-3’(Cai ZH，Li P，Dong TX et，al.The molecular diversity of5S-rRNA spacer domain in Fritillaria species revealed by PCR analysis.PlantaMedica，1999，65360-364.)；引物浓度为30pmol/μl，除将反应体系中引物1、引物2改为AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除复性温度改为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。
(3)鉴别性PCR引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均为30μL为参考点，各物品的用量为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM) 0.6μl引物1、引物2各 0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0单位供试品DNA模板 1.0～2.0μl无离子水 加到30μl(4)PCR循环在PCR仪上，95℃予变性4min，然后按下列参数进入30循环变性95℃ 10～50秒复性60～65℃ 20～50秒延伸72℃ 20～60秒循环结束后在72℃保持2～10分钟补齐。
(5)电泳观察取出PCR反应液4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。
如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应剂量的比例为参考点，相应地增加或减少。
若有阳性扩增，则供试品为浙贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为浙贝母。
本发明的效果是本发明解决贝母类药材浙贝母的鉴别问题。我们在对浙贝母的鉴别中，设计了鉴别浙贝母的一对高特异性引物，该鉴定引物在给定的PCR条件下，只能特异地鉴别浙贝母，而对于任何其他种类的贝母或生物材料提取的总DNA均不能扩增出该基因片段。当供试样品用本鉴定引物进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳观察有无扩增条带的出现，即可准确地判定药材的真伪。用此对引物可以制造用于浙贝母鉴别的试剂盒。本发明对于中药生产、销售部门快速、准确地鉴别浙贝母药材，搞好药材的质量控制，是十分必要的，对于各地市药检部门打击假冒伪劣，净化药材市场具有十分重要的价值。
具体实施例方式首先从贝母类药材不同种的原植物中提取总DNA，用PCR方法扩增多个基因片段并分别纯化，对各纯化片段进行DNA序列分析，建立浙贝母及其近缘种、混淆种的DNA序列数据库，在比较数据库的基础上，选择合适的DNA片段，针对药材伪、混品出现的情况，设计一对鉴别性PCR引物引物15’-CTAAATAGGCGG GCGAGCTAATC-3’引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即可得到鉴定引物的白色粉未结晶。
采用上述引物对浙贝母的真伪进行鉴别，以反应体系30μl为例，采用以下步骤进行浙贝母的鉴别性聚合酶链反应(1)药材DNA提取按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。
(2)模板DNA质量的鉴定用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物可扩增各种植物的5S rRNA基因间区序列。引物的DNA序列为AS5’-GGA TCC GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-15’-GGA TCC TTAGTG CTG GTA TGA TCG CA-3’；引物浓度为30pmol/l，除将反应体系中引物1、引物2改为AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除复性温度为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。
(3)鉴别性PCR引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均为30μL为参考点，各物品的用量为10×TaqDNA聚合酶缓冲液 3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM) 0.6μl引物1、引物2各 0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0单位供试品DNA模板 1.0～2.0μl无离子水 加到30μl(4)PCR循环在PCR仪上，95℃予变性4min，然后按下列参数进入30循环变性95℃10～50秒复性60～65℃20～50秒延伸72℃20～60秒循环结束后在72℃保持2～10分钟补齐。
(5)电泳观察取出PCR反应4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。
若有阳性扩增，则供试品为浙贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为浙贝母。中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法<110>中国药科大学<120>中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法<160>2<210>1<211>23<212>DNA<2 13>浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)<400>1ctaaataggc gggcgagcta atc<210>2<211>24<212>DNA<213>浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)<400>1tattagcatt aatcgatcga attc
权利要求
1.一种中药浙贝母聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于鉴定引物DNA序列为引物15’-CTAAATAGGC GGGCGAGCTA ATC-3’；引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGAATTC-3’，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉未结晶。
2.根据权利要求1所述鉴定引物鉴定中药浙贝母的方法，其特征在于中药材浙贝母聚合酶链反应(PCR)鉴定步骤为(1)药材DNA提取按常规进行，用无离子水将供试品DNA模板浓度调节至0.2～0.5μg/μL。(2)模板DNA质量的鉴定用另一对通用引物鉴别模板DNA的质量，该对引物扩增各种植物的5S rRNA间区序列。引物的DNA序列为AS5’-GGATCCGTG CTT GGG CGA GAG TAG TA-3’；AS-15’-GGA TCC TTA GTG CTG GTATGA TCG CA-3’；引物浓度为30pmol/μl，除将反应体系中引物1、引物2改为AS、AS-1外，其它各物品用量同(3)；除复性温度改为53℃外，扩增反应条件同(4)；电泳分析同(5)。若得到阳性扩增，则表明模板合格，可进行后续步骤的检验；若无扩增条带，则需改进DNA提取条件，待获得合格的模板后再进行后续步骤的检验。(3)鉴别性PCR引物用无离子水溶解并稀释至30pmol/μL。以反应体系均为30μL为参考点，各物品的用量为10×TaqDNA聚合酶缓冲液3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(10mM)0.6μl引物1、引物2各0.5μlTaq DNA聚合酶 1.0～2.0单位供试品DNA模板 1.0～2.0μl无离子水 加到30μl(4)PCR循环在PCR仪上，95℃予变性4min，然后按下列参数进入30循环变性95℃ 10～50秒复性60～65℃ 20～50秒延伸72℃ 20～60秒循环结束后在72℃保持2～10分钟补齐。(5)电泳观察取出PCR反应液4μl与加样缓冲液1μl混合，2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。如总的反应体积不为30μl，反应物品的用量以30μl反应剂量的比例为参考点，相应地增加或减少。若有阳性扩增，则供试品为浙贝母；若为阴性，即无扩增条带，则供试品不为浙贝母。
3.根据权利要求1所述鉴定引物，其特征在于鉴定引物DNA序列为引物15’-CTAAATAGGC GGGCGAGCTA ATC-3’；引物25’-TATTAGCATTAATCGATCGA ATTC-3’，用该引物设计的用于鉴别浙贝母的鉴别性聚合酶链反应试剂盒及其鉴定方法。
全文摘要
本发明属于中药鉴定技术领域，是一种用于鉴定中药浙贝母的引物及其鉴定方法。本发明设计的浙贝母聚合酶链反应的鉴定引物DNA序列为引物15’－CTAAATAGGCGGGCGAGCTA ATC－3’；引物25’－TATTAGCATT AATCGATCGAATTC－3’。鉴定方法为提取药材的总DNA；用一对引物AS、AS－1进行扩增以检查总DNA的质量，若有阳性扩增则模板DNA质量合格；用本发明的一对鉴定引物进行扩增；电泳检查扩增结果，若用鉴定引物得到阳性扩增，则供试品为浙贝母，若无阳性扩增则供试品不为浙贝母。本发明能够实现浙贝母的快速、准确地鉴别。
文档编号C12Q1/25GK1438326SQ0311300
公开日2003年8月27日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者李萍, 王冲之, 彭昕 申请人:中国药科大学