专利名称：抗菌高丽菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有防止农作物作病害作用的微生物。
背景技术：
灰霉病(botrytis sp.)、稻纹枯病(Rhizoctonia solani)等农作物病害是农作物的主要病害，对其的防治具有重要意义，利用微生物对其进行防治有待于研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种其发酵液具有杀菌作用的微生物—抗菌高丽菌。
本发明所述的抗菌高丽菌命名为抗菌高丽菌Kribbella antibiotica YIM31530，保藏编号为CCTCC NOM203013。
本发明所述的抗菌高丽菌系从我国云南丽江玉龙雪山采集的土壤样品中分离得到。现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2003年2月14日，保藏编号为CCTCC NOM203013。
本发明所述的抗菌高丽菌，属于类诺卡氏菌形稀有放线菌，菌株在大多数培养基上生长良好，气生菌丝黄白色，基内菌丝浅黄色至黄白色。初生菌丝多分枝，断裂成不规则的杆状体。气生菌丝分枝并常断裂成长短不一的杆状体，不游动。明胶液化、牛奶凝固和胨化以及淀粉水解、黑色素的产生均呈阳性，硝酸还原，纤维素分解呈阴性，不产硫化氢。能利用葡萄糖、半乳糖、果糖木糖、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖、甜醇、甘油、甘露醇、山梨醇、醋酸钠等所有供试碳源。细胞壁含有meso-DAP和甘氨酸。
培养条件(一)斜面培养条件培养基葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
(二)种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
(三)发酵培养条件按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。得到发酵液。
本发酵液的抗病试验(一)灰霉病盆栽生物测定法(上海农药研究所协助测定)试验用药前一天选择一张真叶期(孢子或菌块接种用)或子叶期(菌块接种用)长势一致盆栽苗。用喷雾法将药剂(本发酵液的乙醇抽提物)喷洒于瓜苗叶片上。喷好药后将试材在喷药廊或温室中晾三小时左右。选择合适的接种时间，接种诱发。菌丝块法接种，在已长好灰霉病菌平皿中，用直径5mm打孔器，在菌落边缘切取菌落圆块，然后贴到药剂处理过的瓜苗叶片中央，置20℃左右恒温室保湿箱中保温保湿4-5天视空白对照发病情况进行调查。孢子接种法，孢子培养参见“黄瓜灰霉病菌培养管理标准”。在已长满孢子的培养基皿中，加入纯净水，用不锈钢平勺轻轻刮取表面孢子，用四层纱布过滤，制成孢子悬浮液，用血球计数板，镜检观察孢子数量，控制孢子浓度在50-60万个/ml之间，然后加入5％的葡萄糖和1％酵母浸汁；然后用细雾手喷枪及WM-4型无油气体压缩机控制压力0.1MP(1kgf/cm2)，在黄瓜苗上均匀喷雾接种孢子悬浮液，每大盘(80-90盆小苗)喷菌液40ml左右，立即小心移至恒温室(20℃)保湿箱中保温保湿诱发，4-5天左右视空白对照发病情况进行分级调查。按有关标准进行数据处理及分析。
(二)水稻纹枯病盆栽生物测定方法(上海农药研究所协助测定)试验用药前一天选择二叶一心或三叶一心、长势一致盆栽稻苗，按照“药剂喷洒标准”进行喷雾，喷好药(本发酵液的乙醇抽提物)后将试材在喷药廊或温室中晾干。或者采用灌根法，按每亩用有效量50g、100g、200g三种剂量，分别根据所用盆栽用盆大小，按量均匀施于有浅水层的各盆稻苗中。
接种诱发选择合适的接种时间接种诱发。纹枯病菌的培养参见“水稻纹枯病培养管理标准”。将平皿中已长好的纹枯病菌，用菌块切割器把每皿切成20块菌丝块备用。在已喷过药的每盆稻苗基部中央夹接一块纹枯病菌丝块，注意菌块不要与盆土及水层接触，然后将苗放入恒温室(26-28℃)中下层保湿箱中保湿，24小时后再将稻苗从中下层移至顶层有灯光照射(2000勒克司)的保湿箱中，箱内湿度维持80-90％，五天后根据病状分级调查。根据有关规定进行数据处理及分析。
(三)水稻稻瘟病盆栽生物测定法(上海农药研究所协助测定)试验用药前一天选择二叶一心或三叶一心、长势一致盆栽稻苗，按序排放，供试验用。参见“药剂喷洒标准”进行喷雾，喷好药(本发酵液的乙醇抽提物)后将试材在喷药廊或温室中晾干(3小时左右)。或者使用灌根法，按每亩用有效量50g、100g、200g三种剂量，分别根据所用盆栽用盆大小，按量均匀施于有浅水层的各盆稻苗中。
接种诱发选择合适的接种时间接种诱发。孢子培养参见“稻瘟病菌培养管理标准”。在已长满孢子的培养基皿中，加入纯净水，用不锈钢平勺轻轻刮取表面孢子，尽量注意不要弄碎表面菌丝层，用双层纱布过滤，制成孢子悬浮液，取0.1ml孢子悬浮液，从血球计数板盖玻片边缘加入计数板中，在显微镜下用计数器计数，控制孢子浓度在20-30万个/ml，备用。用细雾手喷枪及WM-4型无油气体压缩机控制压力0.1MP(1kgf/cm2)，在稻苗上均匀喷雾接种孢子悬浮液每盘(80-90盆小苗)喷菌液40ml左右，立即小心移至恒温室(26-28℃)中下层保湿箱中保湿，保湿(RH100％)诱发，24小时后再将稻苗从中下层移至顶层有灯光照射(2000勒克司光照强度)的保湿箱中，逐渐打开保湿箱通气孔，使箱内湿度维持80-90％，不使稻苗过湿发黄，并每天观察稻苗生长有无异常，五天左右空白对照病斑稳定后即可根据病斑多少进行分级调查。
普筛时2级以下方可进入再筛。按有关规定进行数据处理及分析。
(四)菌株YIM31530的筛选结果见附图8。
本菌株具有防治灰霉病(botrytis sp.)、稻纹枯病(Rhizoctonia solani)等农作物病害的作用，具有从中开发出新型、高效、无毒的天然杀菌剂的巨大潜力。
本发明所述的抗菌高丽菌，已于2003年2月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位简称CCTCC，保藏编号为M203013，保藏单位地址武汉，珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072。
图1为本发明所述的抗菌高丽菌在酵母膏-麦芽膏培养基上的电镜照片。
图2为本发明所述的抗菌高丽菌在酵母膏-麦芽膏培养基上的电镜照片。
图3为本发明所述的抗菌高丽菌的培养特征。
图4为本发明所述的抗菌高丽菌的生理生化特征。
图5为本发明所述的抗菌高丽菌的碳氮源利用情况。
图6为本发明所述的抗菌高丽菌和部分相关菌在GenBank数据库的16SrDNA序列及登录号。
图7为本发明所述的抗菌高丽菌及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。
图8为本发明所述的抗菌高丽菌菌株YIM31530发酵液抗病筛选结果。
具体实施例方式
实施例从我国云南河口采集的土壤样品，在实验室中按下列条件培养，即可获得本发明所述的抗菌高丽菌。
(一)菌株培养条件1.斜面培养条件培养基葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
2.种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
按以下发酵培养条件培养，即可获得发酵液按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
本发明所述的抗菌高丽菌的16S rDNA全序列如下TTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCCTTCGGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTACCCTTCACTTCGGGATAAGCCTCGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCATCACGGNCTTCATGGNTTGTGGTTGAAAGTTCTGGCGGTGGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG
AATATTGCGCAATGGACGAAAGTCTGACGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCACGTCGGGAGTGAAAACTCGGAGCTTAACTCCGAGCCTGCTTCCGATACGGGCAGACTAGAGGTAGGCAGGGGAGAGCGGAACTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTCCTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATAGGGAAATCTCACAGAGATGTGAGGTCCGTAAGGGTCCTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTAGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
权利要求
1.一种抗菌高丽菌，其特征在于命名为抗菌高丽菌Kribblla antibioticaYIM 31530，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NOM203013。
2.根据权利要求1所述的抗菌高丽菌，其特征在于该菌种的16S rDNA全序列如下TTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCCTTCGGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTACCCTTCACTTCGGGATAAGCCTCGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCATCACGGNCTTCATGGNTTGTGGTTGAAAGTTCTGGCGGTGGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGACGAAAGTCTGACGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCACGTCGGGAGTGAAAACTCGGAGCTTAACTCCGAGCCTGCTTCCGATACGGGCAGACTAGAGGTAGGCAGGGGAGAGCGGAACTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTCCTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATATAGGGAAATCTCACAGAGATGTGAGGTCCGTAAGGGTCCTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTAGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种具有防治农作物病害的微生物，本发明命名为抗菌高丽菌Kribbellaantibiotica YIM 31530，现保存在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NOM203013。本发明具有防治灰霉病(botrytis sp)、稻纹枯病(Rhizoctonia solani)、稻瘟病(Pyricularia oryzae)等农作物病害的作用，效果稳定而持久，具有从中开发出新型、高效、无毒天然农用杀菌剂的巨大潜力。
文档编号C12N15/31GK1542124SQ03124068
公开日2004年11月3日 申请日期2003年4月29日 优先权日2003年4月29日
发明者李文均, 姜怡, 文孟良, 陈琦冈, 李铭刚, 徐丽华, 姜成林 申请人:云南省微生物研究所