专利名称：白色诺卡氏菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有NO合成酶抑制作用的微生物。
背景技术：
研究表明，NO在神经、免疫、心血管等多个系统中具有广泛而复杂的生理和病理作用。它是不稳定弥散性自由基通过大量的化学反应而发挥其生理作用，广泛影响信息传递过程、能量代谢和DNA的合成。例如脑缺血，NO会大量增加。过量的NO反过来会抑制DNA的合成，损伤细胞。因此，抑制NO合成酶，是医治神经、免疫、心血管疾病的重要环节。
发明内容
本发明的目的是提供一种其发酵液具有抑制NO合成酶作用的微生物——白色诺卡氏菌。
本发明所述的白色诺卡氏菌命名为白色诺卡氏菌Nocardia alba YIM30243，保藏编号为CCTCC NOM203017。
本发明所述的白色诺卡氏菌系从我国云南河口采集的土壤样品中分离得到。现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2003年2月14日，保藏编号为CCTCC NOM203017。
本发明所述的白色诺卡氏菌在大多数培养基上生长良好，气生菌丝呈黄白至粉红灰色，基内菌丝黄白至黄褐色。气生菌丝、基内菌丝不规则断裂。明胶液化、淀粉水解、硝酸还原呈阳性，牛奶凝固、胨化呈阴性，不产生硫化氢，不产生黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、肌醇、甘露醇、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸。细胞壁含有meso-DAP，全细胞水解物含有半乳糖和阿拉伯糖。
培养条件(一)斜面培养条件培养基葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
(二)种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
(三)发酵培养条件；按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。得到发酵液。
本发酵液对NO合成酶抑制剂筛选活性结果报告1.实验原理本法根据NOS在催化L-Arg氧化分解L-Cit和NO过程中同步引起NADPH氧化为NADP+而产生荧光变化。通过荧光检测在反应液中NADPH的消耗(激发光340nm，发射光440nm)，从而推断NOS的活性。
2.实验方法取0.1mg/ml浓度发酵液样品，10mM CaCl2，1mM L-Arg，0.5mM NADPH各10ul 加冷酶蛋白60ul(蛋白的制备取猪小脑匀浆，低温离心，脑重∶缓冲液＝1∶5(g/V)，20000离心10分钟取上清。Sephadex G25过滤脱盐) 低温快速短暂离心 立即340nm波长激发，440nm波长荧光值测定(反应温度30℃。反应体系中荧光值的降低速率可以间接反映NOS的活性。测定前振荡20s混合样品，逐孔测定，每孔计数10次求平均值。完成1次整板测定约100秒；连续测定13次。根据每孔获得的13个数据，计算荧光值变化斜率作为酶活性。)3.结果计算a)在96孔板中8孔作为对照，其中A1-D1用蒸馏水来代替样品，反应酶的最大活性；E1-H1分别加入最大浓度NOS抑制剂L-Nω-nitro-arg(LNNA)0.5mM，以该浓度下对酶活性的抑制率100％；b)样品的抑制率(样品的斜率-最大酶活性斜率)/(阳性药物斜率-最大酶活性斜率)×100％c)IC50计算复筛程序基本同上，每一个样品稀释成5个浓度，分别为10，2，0.4，0.08，0.016ug.ml-1。根据测定结果计算IC50。
本菌株具有抑制NO合成酶的作用，其发酵液对NO合成酶的抑制率达100％，而且药效持久、稳定、无毒，具有从中开发新型、高效、无毒的天然药物的巨大潜力。
本发明所述的白色诺卡氏菌已于2003年2月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位简称CCTCC，保藏编号为M203017，保藏单位地址武汉，珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072。
图1为本发明所述的白色诺卡氏菌在酵母膏-麦芽膏培养基上的显微镜照片。
图2为本发明所述的白色诺卡氏菌在酵母膏-麦芽膏培养基上的电镜照片。
图3为本发明所述的白色诺卡氏菌的培养特征。
图4为本发明所述的白色诺卡氏菌的生理生化特征。
图5为本发明所述的白色诺卡氏菌的碳氮源利用情况。
图6为本发明所述的白色诺卡氏菌和部分相关菌在GenBank数据库的16SrDNA序列及登录号。
图7为本发明所述的白色诺卡氏菌及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。
具体实施例方式
实施例从我国云南河口采集的土壤样品，在实验室中按下列条件培养，即可获得本发明所述的白色诺卡氏菌。
(一)菌株培养条件1.斜面培养条件培养基葡萄糖4g；酵母膏4g；麦芽膏5g；复合维生素3.75mg/L；琼脂15g；蒸馏水水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时间为1周。
2.种子培养条件从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
按以下发酵培养条件培养，即可获得发酵液按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养6天。培养基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃。
本发明所述的白色诺卡氏菌的16S rDNA部分序列如下CGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGTACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCANGGAATGCATGTTCTGTGGTGGAAAGATTTATCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCCAGCGACG
CCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCGACAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGTAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTTCTGTGAAAACTTGGGGCTCAACCTTAAGCTTGCAGGGGATACGGGCAGACTAGAGTACTTCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGAAACCTGCAGAGATGTAGGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTTGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
权利要求
1.一种白色诺卡氏菌，其特征在于命名为白色诺卡氏菌Nocardiaalba YIM 30243，现在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM203017。
2.根据权利要求1所述的诺卡氏菌，其特征在于该菌种的16SrDNA部分序列如下GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGTACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCANGGAATGCATGTTCTGTGGTGGAAAGATTTATCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCCCTTTCGACAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGTAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTCTGTCGCGTCTTCTGTGAAAACTTGGGGCTCAACCTTAAGCTTGCAGGGGATACGGGCAGACTAGAGTACTTCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGAAACCTGCAGAGATGTAGGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTATGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTTGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种具有NO(一氧化氮)合成酶抑制作用的微生物，本发明特征在于命名为白色诺卡氏菌Nocardia alba YIM 30243，现保存在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2003年2月14日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NOM203017。本发明具有抑制NO合成酶的活性，其发酵液对NO合成酶的抑制率在100％，效果稳定而持久，具有从中开发出新型、高效、无毒天然药物的巨大潜力。
文档编号C12N15/31GK1542126SQ0312407
公开日2004年11月3日 申请日期2003年4月29日 优先权日2003年4月29日
发明者李文均, 姜怡, 文孟良, 李铭刚, 徐丽华, 姜成林 申请人:云南省微生物研究所