专利名称：重组靶向融合蛋白GnRH－TNFαm及其抗肿瘤用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程蛋白质药物领域，更具体地，本发明涉及编码新型重组靶向抗肿瘤新药融合蛋白GnRH-TNFαm的基因、包含所述基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离的靶向融合蛋白GnRH-TNFαm以及该靶向融合蛋白对一类恶性肿瘤细胞的特异杀伤作用。
背景技术：
尽管恶性肿瘤的早期诊断、手术与放化疗等方面的技术和手段近年来都有了长足的发展和进步，对早期恶性肿瘤患者进行手术与放化疗联合应用也可取得很好的效果，但对那些无手术指征的晚期恶性肿瘤患者来说，他们不但要承受放化疗所带来的严重毒副作用，而且还要承担目前的放化疗措施无法治愈其所患恶性肿瘤的风险。实际上，导致全世界目前每年仍有一千万以上的人因为恶性肿瘤而失去生命的根本原因，就在于缺乏真正有效的抗肿瘤药物。
腺癌(adenocarcinoma)是临床上最难治疗的恶性肿瘤之一。据统计，发生于结肠、乳腺和肺的腺癌是临床上常见的3种主要肿瘤，如果把源于卵巢、子宫内膜、前列腺、胰腺、肾和肝等组织器官的腺癌也考虑在内，那么，死于腺癌的人数将超过死于肿瘤的总人数的1/2。由此看来，对适于腺癌治疗的新药或其它治疗手段的需求是迫切的。
促性腺激素释放肽(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是一种主要由下丘脑合成和分泌的神经多肽激素。它通过“下丘脑→垂体→性腺轴”来实现生殖生理调节的目的。研究发现，除垂体外，GnRH及其受体GnRHR还表达于脑、乳腺、卵巢、子宫内膜、睾丸、肾上腺、前列腺和胎盘等组织以及源于乳腺、卵巢、子宫内膜、前列腺、胰腺、结肠、肺、肾和肝等组织器官的腺癌。试验证实，GnRH及其类似物对肿瘤细胞的增殖均有一定的抑制作用，所以，它们在妇科和肿瘤等领域已受到广泛关注。临床上常将GnRH及其类似物用于性腺机能低下、不育和促性腺激素依赖的肿瘤等疾病的治疗。据此看来，GnRHR可作为有关腺癌特异药物作用的标靶之一。
TNFα发现于1975年，由于其对包括神经纤维瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等在内的多种肿瘤细胞系都具有明显的杀伤作用，所以，美国政府早在1985年就批准了用TNFα来治疗恶性肿瘤的临床试验申请。但TNFα因为其系统使用时的毒性太大而限制了应用。不过考虑到TNFα在已知细胞因子中的抗肿瘤活性最强的事实，人们一直在努力开发其应用潜力。比如，因为大量研究结果均证实，当采用肢体或器官隔离灌注或病灶内直接注射等方法时，由于可以明显提高TNFα的局部浓度而显著改善其疗效和减轻其毒副作用，所以，TNFα的肢体隔离灌注法在欧洲已被批准用于肢体的恶性恶黑素瘤和深部组织的软组织瘤等的临床治疗了。
为提高某种毒素或细胞因子的局部浓度和改善疗效，更为克服局部灌注或注射时操作上不方便的缺陷，人们常通过构建靶向融合蛋白来实现这一目的。
因为GnRHR具有作为腺癌靶向治疗标靶的潜力，所以，出现了由GnRH与微生物毒素(绿脓杆菌毒素PE)或植物毒素(美洲商陆抗病毒蛋白PAP)等共同构成的靶向融合蛋白GnRH-PE66和GnRH-PAP。在细胞水平的研究中，GnRH-PE66不仅对许多具性激素反应性的腺癌细胞系有明显的细胞毒性，对源于结肠、肺、肝和肾脏等器官的腺癌细胞也表现出很强的杀伤作用，而且对源于患者的腺癌原代培物也同样有效。另一方面，只是因为由10个氨基酸组成的靶向域GnRH的存在，融合毒素GnRH-PE66就只杀伤那些源于患者癌变卵巢或结肠的原代培养物，而不影响源于同一患者的正常卵巢或结肠的细胞的生长。再者，GnRH-PE66在动物体内可以明显抑制肿瘤移植物的生长，且无明显的毒副作用。所有这些结果都说明，以GnRH为靶向域的融合毒素具有很强的特异性。
在肿瘤研究领域，尽管人们构建了大量的抗肿瘤靶向融合蛋白，但真正有可能用于临床的却极少。其关键在于这些抗肿瘤靶向融合蛋白的免疫原性。因为在这些抗肿瘤靶向融合蛋白中，其靶向域有许多都是源于异种动物的完整抗体或抗体的可变区，而且其抗肿瘤效应域多是一些源于动物、植物或微生物的毒素蛋白。因此，这些抗肿瘤靶向融合蛋白往往因为会刺激患者产生中和抗体而使重复使用无效。
综上认为，(1)TNFα具有很好的开发应用潜力——是已知的抗肿瘤活性最强的细胞因子，但因为特异性差、毒副作用大而无法应用。(2)腺癌是很重要的目标疾病——患者群庞大，且极难治疗。(3)GnRH受体是腺癌特异药物攻击的理想标靶——绝大多数腺癌细胞表面都有GnRH受体存在，并且GnRH本身对腺癌细胞的增殖就具有抑制作用。有鉴于此，我们构建了一种完全由人体的正常组份GnRH和TNFα构成的靶向融合蛋白GnRH-TNFαm，以期克服原型TNFα的毒副作用和为晚期恶性肿瘤患者尤其是腺癌患者提供一种高效、无毒或低毒的治疗药物。
发明内容
由于本发明的内容主要涉及编码新型的重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的基因、包含所述基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和分离的靶向融合蛋白GnRH-TNFαm以及该靶向融合蛋白对恶性肿瘤细胞的特异杀伤作用等方面，因此，本发明的目的主要有以下几个方面本发明最重要的目的在于提供一种抗肿瘤新药靶向融合蛋白GnRH-TNFαm。该靶向融合蛋白是一种全新的分子，它由人GnRH和人TNFα衍生物共同组成，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。在构建该融合蛋白时，于其GnRH部分的第1位氨基酸之前增加了1个氨基酸(Met)，分别于其TNFα部分的第1位氨基酸之前后增加了6个(Glu Phe Pro Pro Pro Ala)和3个氨基酸(Arg Gly Pro)。由于GnRH的存在及其与GnRH受体之间的相互作用，该靶向融合蛋白被赋予了新的特征，即既具有原型TNFα样活性，又具有相对特异性，更具有原型TNFα所不具备的活性(对原型TNFα本身耐受的肿瘤细胞的杀伤作用)。也就是说，与因为毒副作用过大而无法应用于肿瘤临床治疗的原型TNFα相比，本发明的重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm具有更好的应用前景。
本发明的第二个目的在于提供一种编码抗肿瘤新药靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的基因GnRH-TNFαm，其具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
本发明的第三个目的在于提供两种分别包含所述基因GnRH-TNFαm的表达型重组体pLEGTI和pLT30GTI。
本发明的第四个目的在于提供两种分别包含所述表达型重组体的工程菌pLTEGTI/DH5α和pLT30GTI/BL21/DE3。
本发明的第五个目的在于提供靶向融合蛋白GnRH-TNFαm对恶性肿瘤细胞具有特异杀伤作用的试验证据。
图1示出了携带有人TNFαcDNA的重组体pLT9KGITNFαm图2示出了测序载体pBluescript II SK图3示出了携带有突变型TNFαcDNA(TNFm)的测序重组体pYYSKTNFαm图4示出了携带有融合蛋白基因GnRH-TNFαm的测序重组体图5示出了携带有融合蛋白基因GnRH-TNFαm的温控型表达型重组体pLTEGTI图6示出了携带有融合蛋白基因GnRH-TNFαm的IPTG诱导型表达型重组体pLT30GTI图7示出了融合蛋白基因GnRH-TNFαm的温控型表达型重组体pLTEGTI的表达结果，其中泳道1DH5空菌/诱导；泳道2蛋白Marker(自上而下97，66，43，31，20，14.4kD；但31kD带不清楚)；泳道3pLTEGTI/DH5/不诱导；泳道4pLTEGTI/DH5/42℃诱导。
图8示出了GnRH-TNFαm的IPTG诱导型表达型重组体pLT30GTI的表达结果，其中泳道1工程菌BL21(DE3)/pLT30GTI(5h)；泳道1工程菌BL21(DE3)/pLT30GTI(3h)；泳道3蛋白分子量标记(自上而下为97，66，43，31，20，14.4kD)图9示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα对L929细胞作用24h的结果图10示出了GnRH-TNFαm与原型TNFα对Act D活化前后的L929细胞杀伤作用的比较图11示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα对肝癌细胞HepG2的作用结果图12示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα对乳腺癌细胞MCF-7的作用结果图13示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα对宫颈癌细胞HeLa的作用结果图14示出了融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα对胰腺癌细胞SW1990的作用结果图15示出了GnRH-TNFαm和TNFα分别与Act D联合应用于肝癌细胞HepG2的结果图16示出了GnRH-TNFαm和TNFα分别与Act D联合应用于乳腺癌细胞MCF-7的结果图17示出了融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药联合应用于乳腺癌细胞MCF-7的结果图18示出了GnRH-TNFαm和TNFα分别与Act D联合应用于宫颈癌细胞HeLa的结果图19示出了融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药联合应用于宫颈癌细胞HeLa的结果图20示出了GnRH-TNFαm和TNFα分别与Act D联合应用于胰腺癌细胞SW1990的结果图21示出了融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药联合应用于胰腺癌细胞SW1990的结果具体实施方案本发明利用本实验室克隆的人TNFα的cDNA为模板，对其进行2次PCR扩增，以实现对TNF cDNA的突变改造和与GnRH cDNA的融合，获得编码重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的融合基因GnRH-TNFαm。经DNA序列分析证明融合基因GnRH-TNFαm完全符合预期序列。
将融合基因GnRH-TNFαm分别克隆进大肠杆菌表达载体pCW111或pET-30a中，获表达型重组体pLTEGTI和pLT30GTI。将表达型重组体分别转化进大肠杆菌DH5α或BL21/DE3中，经筛选获高表达工程菌。在工程菌pLTEGTI/DH5α和pLT30GTI/BL21/DE3中，重组融合蛋白GnRH-TNFαm的表达量分别达细胞总蛋白的12％和30％左右。
对本发明的重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm进行了大量的体外细胞试验研究，结果证实，与标准品TNFα相比，重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在具有程度相当的TNFα样活性的同时，对小鼠成纤维细胞的杀伤作用明显降低，对耐受TNFα的肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，且与常用化疗药物之间的协同作用明显提高。这些结果提示，与因为毒副作用过大而无法应用于肿瘤治疗的原型TNFα相比，本发明提供的重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在肿瘤的治疗方面具有很好的应用前景。
以下将参照附图和实施例详细描述本发明。
实施例1.编码重组靶向融合蛋白的基因GnRH-TNFαm的获得1.PCR引物及其序列pvt35’-TTAGAATTCCCGCCACCGGCCGTACCGGGTCCAAGATCA-3’EcoRIPvt45’-TATGGATCCTTATCACAGGGCAATGAT-3’BamHI Stop codonsPgt15’-AAACATATGCAGCACTGGTCCTATGGTCTGCGCCCTGGCGAATTCCCGCCACCG-3’NdeI EcoRIPgt25’-AAACATATGCAGCACTGGTCCCATGGTTGGTGTCCGGGCGAATTCCCGCCACCG-3’NdeI EcoRI2.突变型TNFαcDNA(TNFαm)的获得利用PCR引物pvt3和pvt4对本实验室构建的重组质粒pLT9KGITNFαm(图1)中的TNFαcDNA进行特异扩增，获突变型TNFα的cDNA(TNFαm)。其结果是在TNFαcDNA的5’端引入1个EcoRI位点(GAA TTC)和几个额外氨基酸的密码子GAA TTCCCG CCA CCG GCCGTACCG GGT CCAAGA TCA(其中带下划线的黑体字)。这段编码序列对应的氨基酸序列为Glu Phe Pro ProPro AlaValArg Gly ProArg Ser。同时，还在其3’端引入2个终止密码子(UAA UGA)和1个BamHI位点(GGA TCC)。为确证所获DNA片段即为预期的TNFαm，将其进行EcoRI/BamHI双酶切，并与经同样处理的测序载体pBluescript II SK(图2)相连，获测序重组体pYYSKTNFαm(图3)。其酶切鉴定结果和序列分析结果均完全符合预期。
3.融合基因GnRH-TNFαm的获得为获得预期可与GnRH受体阳性的肿瘤细胞特异结合的靶向融合蛋白GnRH-TNFαmm，利用PCR引物“pgt1/pvt4”对模板pYYSKTNFαm中的TNFαm进行特异扩增。其结果是在TNFαm cDNA的5’端引入1个NdeI位点(CAT ATG)和GnRH的编码区(CAGCACTGGTCCTATGGTCTGCG CCCTGGC)。TNFm cDNA的其它部分无变化，3’端仍为2个终止密码子(UAA UGA)和1个BamHI位点(GGA TCC)。为确证所获DNA片段即为预期的融合基因GnRH-TNFαm，将其进行BamHI单酶切(将其5’端当成平端)，并与经XbaI(补平)/BamHI双酶切的测序载体pBluescript II SK相连(XbaI恢复)，获测序重组体pLTSKGTI(图4)，其酶切图谱鉴定结果和序列分析结果均符合预期。
实施例2.融合基因GnRH-TNFαm温控型表达型重组体pLTEGTI的构建为了能在E.coli中将融合基因GnRH-TNFαm表达成融合蛋白GnRH-TNFαm，将其克隆进本实验室构建的E.coli表达载体pCW111的NdeI/BamHI之间，从而将其表达置于温控启动子PRPL的控制之下。其构建过程是对pLTSKGTI进行NdeI/BamHI双酶切，回收融合基因GnRH-TNFαm片段，然后与经同样处理的表达载体pCW111相连，从而获融合基因GnRH-TNFαm的温控型表达型重组体pLTEGTI(图5)。其酶切图谱鉴定结果与预期相符。
实施例3.融合基因GnRH-TNFαm的IPTG诱导型表达载体pLT30GTI的构建pLT30GTI的构建过程是对pLTSKGTI进行NdeI/BamHI双酶切，回收融合基因GnRH-TNFαm片段，然后与经同样处理的表达载体pET30相连，从而获融合基因GnRH-TNFαm的IPTG诱导型表达型重组体pLT30GTI(图6)。其酶切图谱鉴定结果与预期相符。
实施例4.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的诱导表达1.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的温控诱导表达在获得了融合基因GnRH-TNFαm的温控型表达型重组体pLTEGTI后，分别对其多个工程菌株pLTEGTI/DH5α进行了30～32℃活化扩增和42℃诱导表达。图7是融合蛋白GnRH-TNFαm表达水平最高菌株的表达产物的SDS-PAGE电泳结果。本胶经激光扫描分析和积分计算，两种融合蛋白的表达量与菌体总蛋白之比达12％以上。
2.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的IPTG诱导表达为提高目的蛋白的表达水平，又对工程菌pLT30GTI/BL21(DE3)进行了IPTG(IPTG的终浓度为1mM)诱导表达。图8是融合蛋白GnRH-TNFαm表达水平最高菌株的表达产物的SDS-PAGE电泳结果。本胶经激光扫描分析和积分计算，两种工程菌中表达水平最高者的融合蛋白均达到了菌体总蛋白的30％。
实施例5.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的摇瓶法表达和分离纯化1.重组靶向蛋白GnRH-TNFαm的摇瓶法表达为获得一定量的融合蛋白供活性研究用，对表达水平最高的工程菌pLT30GTI/BL21/DE3进行了摇瓶法培养和IPTG诱导表达。
(1)工程菌的活化挑单菌落接种于5ml LB培养液中(卡那霉素终浓度为50mg/L)，37℃200rpm培养8～12h。
(2)工程菌的扩增将活化的菌液转接入20ml LB中，37℃200rpm培养8～12h。
(3)IPTG诱导将20ml菌液移入含卡那霉素的1000ml LB中，37℃200rpm 4h。加40％的葡萄糖水溶液25ml和IPTG(终浓度为1mM)，37℃200rpm诱导表达5h。然后离心收集菌体，。
2.切胶法分离纯化重组靶向蛋白GnRH-TNFαm(1)收集和洗涤菌体8000rpm 5分钟收集细菌，称菌体湿重。用含40ml 3％Triton X-100，50mM Tris-HCl和2mM EDTA的溶液(下列各洗涤缓冲液的用量均为30～50ml缓冲液/g湿菌体)洗涤菌体，搅拌器上搅匀10～30分钟。8000rpm 5分钟收集菌体。
(2)破碎菌体用裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.5～9.0，2mM EDTA，100mM NaCl，5％Triton X-100，0.5mg/ml溶菌酶)将细胞悬浮。为保证溶菌酶的作用效果，裂解液的pH值宜高不宜低。用搅拌器室温下搅拌半小时，使菌体与溶液完全混匀，再将其于37℃200rpm 4h，以使悬浮液因为溶菌酶的作用而粘稠。
(3)超声处理和收集包涵体每次超声10秒，间隔15秒，90～100次左右，直至菌液不再粘稠。然后8000rpm 7分钟收集包涵体。
注超声在冰水浴中进行，以防止蛋白炭化。超声波功率不宜过大(一般75～150W即可)，否则也会导致蛋白炭化。超声处理时的容器以玻璃烧杯为佳。超声波探头的以位于液面下3cm和烧杯底部以上2cm左右为好。
(4)洗涤包涵体用洗涤液(5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，pH8.0)充分悬浮沉淀，充分搅拌后8000rpm 10分钟收集包涵体。
(5)SDS-PAGE电泳分离和电洗脱将所得包涵体行SDS-PAGE电泳后，将凝胶放入1％KCl溶液中，室温下染色15分钟。切下目的蛋白所在部分，将凝胶捣碎，放入透析袋中，同时往透析袋中加5～10ml的Tris-甘氨酸溶液进行电洗脱(电泳缓冲液也为Tris-甘氨酸溶液)。10mA下8～10小时后，反相电压电泳5分钟。
(6)透析收集透析袋中的液体并离心，将上清液转入另一透析袋，置蒸馏水中于4℃透析24小时以上。每4小时换蒸馏水一次。
(7)沉淀用PEG-10000对透析袋进行脱水(4℃4～5h)，至袋中液量为4～5ml(越少越好)。将透析袋中的液体倒入离心管中，加入酸性丙酮(样品∶酸性丙酮＝1∶5)，混匀后于-20℃冷冻12小时。将冻存样品震荡后于12000rpm离心15分钟。吸弃上清，再加10ml酸性丙酮，混匀后同样条件再离心1次。吸弃上清，将沉淀所在的离心管置-20℃冷冻室冻干。
(8)冷冻干燥每支冻干产物中加适量蒸馏水溶解，将蛋白质溶液分装入Eppendorf管中(0.5ml/支)，于-70℃冷冻2小时以上，然后置入冷冻真空干燥器抽吸冻干。将冻干品置于-70℃保存备用。
2.包涵体洗涤法分离纯化重组靶向蛋白GnRH-TNFαm在该方法中，“菌体的收集和洗涤”、“菌体的破碎”和“菌体的初步超声处理”等同上述“切胶法”，故不赘述。
(1)包涵体的洗涤和再裂解用洗涤液(5％Triton X-100，50mMTris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，pH8.0)充分悬浮和洗涤所获包涵体(于4℃搅拌1～2h后8000rpm 10分钟)2次后，待充分悬浮后再用超声波处理50次(10秒/次)，最后8000rpm 10分钟收集包涵体。
(2)包涵体的溶解和复性用变性缓冲液(6mol/L盐酸胍，0.1mol/Ltris-HCl，PH8.6，1mmol/L EDTA，0.05mmol/L NaCl，10mmol/LDDT)在冰浴中溶解包涵体(尽量减小溶液的体积)。12000rpm 10分钟离心包涵体溶液，将1体积上清加入100体积蛋白复性液(50mmol/L Tris-HCl，PH8.0，1mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.25mol/L左旋精氨酸，5mmol/L DDT)中，于4℃轻轻搅拌48小时以使蛋白复性。
(6)透析将复性后的蛋白溶液移入透析袋，置蒸馏水中透析24小时。将透析后的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，待冻实后行真空冷冻干燥，-70℃备用。
实施例6.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的TNFα样活性的检测为了解靶向融合蛋白GnRH-TNFαm是否还具有原型TNFα的相关活性及其活性的相对强度，就Act D致敏的小鼠成纤维(瘤)细胞L929(测定TNFα细胞毒活性的经典细胞系)对靶向融合蛋白GnRH-TNFαm与标准品TNFα的反应性进行比较研究。
用不含小牛血清的RPMI 1640基本培养液(含有1mmol/L的氧化型谷胱甘肽和4mmol/L的还原型谷胱甘肽)溶解靶向融合蛋白GnRH-TNFαm，0.22μm的滤器过滤除菌后置4℃备用。
收集对数生长期的L929细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640完全培养液将其稀释成1×105cell/ml。按2×104cell/孔的量将L929细胞加入96孔板中，37℃5％CO2条件下培养过夜。
用RPMI1640完全培养液将样品做适当稀释将靶向融合蛋白GnRH-TNFαm按0.3∶1∶3∶10∶30∶100的比例分别分成6个剂量组，终浓度分别为0.045μg/ml、0.15μg/ml、0.45μg/ml、1.5μg/ml、4.5μg/ml和15μg/ml。将标准品TNFα按1∶3∶10∶30∶100∶300的比例也分为6个剂量组，最终浓度分别为1IU/ml、3IU/ml、10IU/ml、30IU/ml、100IU/ml和300IU/ml。另设1个共同的“0”剂量组。每个剂量组均设3个平行孔。
向上述含有样品的培养液中加入Act D，使终浓度为1μg/ml。吸弃细胞培养孔中的旧培养液，按0.2ml/孔的量加入含样品的新培养液，继续培养24小时。
按终浓度为500μg/ml的剂量加入MTT(每孔加5mg/ml的MTT原液20μl)，37℃5％CO2条件下继续培养(染色)4小时。
分别吸弃(尽)孔中的旧培养液，每孔加DMSO 180μl，室温下缓慢摇动显色15分钟，用酶标仪测OD570nm。
根据公式计算细胞存活率＝试验组OD值/阴对OD值×100％细胞杀伤率＝(1-细胞存活率)×100％结果从图9中可以看出，在所用剂量范围内作用24h后，除最低剂量组外，其它各组的GnRH-TNFαm和标准品TNFα对经Act D活化的L929细胞均具有显著的杀伤作用(P＜0.05或P＜0.01)，二者的杀伤率分别为GnRH-TNFαm——7.3％、30.6％、69.5％、77.5％、78.7％和81.5％，标准品TNFα——18.6％、22.7％、47.8％、64.4％、76.0％和74.2％。说明重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm较好地保留了原型TNFα的活性。
实施例7.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm与TNFα受体之间的亲和力由于小鼠成纤维细胞L929表面具有大量的TNFα受体和对TNFα很敏感，因此该细胞的杀伤试验常被用于检测TNFα及其衍生物的生物学活性。我们借助于该试验，对靶向融合蛋白GnRH-TNFαm和原型TNFα与TNFα受体之间的亲和力进行了比较研究(剂量设置与“实施例6.”完全相同)，结果发现(参见图10)(1)对未经Act D活化的L929细胞来说，在所用剂量范围内，TNFα各剂量组的杀伤作用强度均明显高于对应的GnRH-TNFαm各组，二者的平均杀伤率分别为55.6％和25.8％。假设TNFα的细胞杀伤作用完全取决于与其存在于靶细胞表面的TNFα受体之间的相互作用，那么，GnRH-TNFαm与TNFα受体的亲和力只有TNFα与TNFα受体之间的亲和力的的46.4％。
(2)对于经Act D活化的L929细胞来说，则是GnRH-TNFαm各剂量组的杀伤作用强度明显高于对应的TNFα各组，二者的平均杀伤率分别为86.6％和77.8％。即GnRH-TNFαm的平均杀伤率是TNFα的111％。
(3)Act D可使GnRH-TNFαm对L929细胞的平均杀伤率提高60.8％(86.6％-25.8％)，而只可使TNFα对L929细胞的平均杀伤率提高22.2％(77.8％-55.6％)。也就是说，GnRH-TNFαm与Act D之间的协同作用强度是TNFα与Act D之间的2.74倍(60.8％/22.2％)。
以上结果说明了两个方面的问题，即与原型TNFα相比，靶向域GnRH的引入，降低了融合蛋白GnRH-TNFαm与TNFα受体之间的亲和力；靶向域GnRH的存在，增强了融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药物之间对肿瘤细胞的协同杀伤作用。
人们知道，导致TNFα毒性严重而无法用于临床的主要原因在于TNFα受体的广泛分布(组织细胞特异性低)和TNFα与其受体之间的高亲和力。而我们引入靶向域GnRH后，既降低了GnRH-TNFαm与TNFα受体之间的亲和力，又增强了GnRH-TNFαm与化疗药物之间协同作用。也就是说，不但靶向融合蛋白GnRH-TNFαm本身的毒副作用减轻了，而且还可以通过与化疗药物联合应用的方式来进一步减轻其可能有的毒副作用。
实施例8.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm对耐受TNFα的肿瘤细胞的杀伤作用虽然重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm较好地保留了原型TNFα的活性，但是，二者在组成方面毕竟不完全相同——在前者中引入了作为靶向域的GnRH。如前所述，我们之所以将GnRH作为TNFα发挥作用的靶向域，主要是因为(1)TNFα具有很好的开发应用前景——是已知的抗肿瘤活性最强的细胞因子，但因为其特异性差(由于TNFα受体分布的组织特异性差)、毒副作用大而无法应用。(2)腺癌是很重要的目标疾病——患者群庞大，且极难治疗。(3)GnRH受体是腺癌特异药物攻击的理想标靶——绝大多数腺癌细胞表面都有GnRH受体存在，并且GnRH本身对腺癌细胞的增殖就具有抑制作用。其最终目的是为了获得一种高效、无毒或低毒的肿瘤治疗药物。
为研究本身就对肿瘤细胞的增殖具有一定抑制作用的靶向域GnRH的存在对GnRH-TNFαm的活性究竟有无影响，或有什么影响，以及与原型TNFα相比，GnRH-TNFαm的肿瘤细胞杀伤活性的特点，本发明人就重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm对已知为原型TNFα抗性的肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞HeLa以及胰腺癌细胞SW1990等的细胞杀伤活性进行了比较研究。
从下面将要述及的结果中可以看出，在所用剂量范围内(剂量设置与“实施例6.”完全相同)，虽然几乎所有浓度的标准品TNFα在24h、48h和72h等3个作用时间对上述4种肿瘤细胞均无明显的杀伤作用，但是，较高浓度的融合蛋白GnRH-TNFαm对这些肿瘤细胞的杀伤作用却很明显。
1.融合蛋白GnRH-TNFαm对肝癌细胞HepG2的杀伤作用结果如图11所示，在37℃作用24h、48h和72h后，融合蛋白GnRH-TNFαm在15μg/ml时对肝癌细胞HepG2表现出了明显的杀伤作用，杀伤率分别达56.4％、83.8％和82.2％(3个时间均为P＜0.001)。而标准品TNFα在3个作用时间和所有浓度条件下不但没有杀伤作用，而且还有一定的促生长作用。
2.融合蛋白GnRH-TNFαm对乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用结果如图12所示，在37℃作用24h后，只有15μg/ml的融合蛋白GnRH-TNFαm对乳腺癌细胞MCF-7表现出了强烈杀伤作用，杀伤率为47.7％(P＜0.001)。到48h时，1.5μg/ml、4.5μg/ml和15μg/ml组分别有11.0％(P＜0.05)、18.7％(P＜0.01)和66.1％(P＜0.001)的杀伤率。到72h时，4.5μg/ml和15μg/ml组分别有25.1％(P＜0.01)和64.3％(P＜0.001)的杀伤率。但是，标准品TNFα在3个作用时间和所有浓度条件下对该肿瘤细胞均无杀伤作用。
3.融合蛋白GnRH-TNFαm对宫颈癌细胞HeLa的杀伤作用结果如图13所示，融合蛋白GnRH-TNFαm对宫颈癌细胞HeLa的杀伤作用相对较弱，在作用24h和48h后，只有15μg/ml组有19.1％(P＜0.01)和42.0％(P＜0.001)的杀伤率，到72h时，4.5μg/ml和15μg/ml组的杀伤率分别为11.0％(P＜0.01)和69.4％(P＜0.001)。而标准品TNFα只在24h时表现出了轻微的杀伤作用。
4.融合蛋白GnRH-TNFαm对胰腺癌细胞SW1990的杀伤作用结果如图14所示，融合蛋白GnRH-TNFαm对胰腺癌细胞SW1990的杀伤作用相对较强，在作用24h后，4.5μg/ml和15μg/ml组分别有15.1％(P＜0.05)和48.6％(P＜0.01)的杀伤率。到48h和72h时，所有剂量组对该肿瘤细胞均表现出了显著的杀伤作用，这两个时间的最高杀伤率分别为63.3％(P＜0.001)和71.1％(P＜0.001)。
标准品TNFα对SW1990的作用结果是个例外，因为在所有的试验组中，只有最低剂量组(1IU/ml)的标准品在48h和72h时对肿瘤细胞的杀伤率超过了10％，分别为11.8％和12.0％(P＜0.05)。
实施例9.重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm与肿瘤化疗药物之间的协同作用临床上常因为抗肿瘤药物的毒副作用而严重影响疗效和患者的预后。假如靶向融合蛋白GnRH-TNFαm与常用化疗药物之间具有协同作用，则可通过减少彼此用量的方法来降低毒副作用。因此，我们在证实了重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm对已知为原型TNFα抗性的肝癌细胞HepG2及其它受试肿瘤细胞均具有明显的杀伤作用后，又对该融合蛋白和原型TNFα与临床上常用的化疗药物(如放线菌素D--Act D、顺铂--Cis、胺甲喋呤--MTX和5-氟尿嘧啶--5-FU)之间的协同作用进行了比较研究。
如果从该试验能够得出这样的结论，即“与原型TNFα和化疗药物联合应用时的结果相比，融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药物联合应用时对肿瘤细胞具有更强的协同杀伤作用”，那么，在临床应用过程中，就可以在减少融合蛋白GnRH-TNFαm和化疗药物的使用剂量和进一步降低其毒副作用的情况下，获得更好的治疗效果。
从以下结果可以看出，与原型TNFα相比，融合蛋白GnRH-TNFαm与所用化疗药物之间的确具有更强的协同作用效果。
1.融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药物联合应用时对肝癌细胞HepG2的协同杀伤作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm与ActD联合应用于HepG2的结果从图15中可以看出，联合应用24h后，Act D可使肿瘤细胞HepG2对融合蛋白GnRH-TNFαm和标准品TNFα的敏感性均明显增强(P＜0.05或＜0.01)，亦即与二者联合使用时均具有明显的协同作用。
另一方面，与两个剂量较高的标准品TNFα组相比，融合蛋白GnRH-TNFαm与Act D之间的协同作用更强，杀伤率更高，分别为76.2％vs 65.1％和88.2％vs 66.9％。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm与Cis、MTX或5-FU联合应用于HepG2结果与融合蛋白GnRH-TNFαm单独使用时的结果相比，融合蛋白GnRH-TNFαm与Cis、MTX或5-FU的联合应用并未使肝癌细胞HepG2的死亡率明显升高。提示，在所用剂量范围内，所用剂量的融合蛋白GnRH-TNFαm与这些化疗药物之间无明显协同作用。
2.融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药物联合应用时对乳腺癌细胞MCF-7的协同杀伤作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm与Act D联合应用于MCF-7的结果从图16中可以看出，联合应用24h后，Act D可使肿瘤细胞MCF-7对融合蛋白GnRH-TNFαm和标准品TNFα的敏感性均明显增强(P＜0.05或＜0.01)，亦即与二者联合使用时均具有明显的协同作用。
另一方面，与标准品TNFα相比，在剂量较高时，融合蛋白GnRH-TNFαm与Act D之间的协同作用更强，杀伤率更高(77.0％vs55.5％)。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm与Cis、MTX或5-FU联合应用于MCF-7的结果从图17可以看出，虽然融合蛋白GnRH-TNFαm单独使用时对MCF-7就有明显的(除最低剂量组外)杀伤作用(细胞死亡率最低7.5％，最高64.9％，平均25.5％)，但是，Cis与GnRH-TNFαm的联合应用并未使MCF-7的死亡率(最低17.9％，最高64.9％，平均28.4％)明显升高。该结果提示，在所用剂量范围内，彼此间无明显协同作用。
GnRH-TNFαm与MTX的合用时，则有部分剂量组细胞的死亡率(最低25.7％，最高67.6％，平均36.9％)明显升高(P＜0.05或＜0.01)。提示，在所用剂量范围内，彼此间有一定的协同作用。
GnRH-TNFαm与5-FU联合应用时，除最低剂量组(细胞死亡率9.9％)外，其它各试验组的细胞毒作用均明显增强(P＜0.05或＜0.01)，细胞死亡率在30.2％～70.0％之间，平均38.5％。提示，在所用剂量范围内，二者间有明显的协同作用。
与“GnRH-TNFαm/Cis”组的结果相比，除两个低剂量组外，“GnRH-TNFαm/5-FU”组的细胞杀伤效应更增(P＜0.05或＜0.01)。
与“GnRH-TNFαm/MTX”组相比，“GnRH-TNFαm/5-FU”组的两个较高剂量组的作用也更强(P＜0.05或＜0.01)。
该结果提示，在所用剂量范围内，在以乳腺癌细胞MCF-7为基础的细胞毒性试验中，5-FU与GnRH-TNFαm联合应用时的协同作用最强。
3.融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药物联合应用时对宫颈癌细胞HeLa的协同杀伤作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm与Act D联合应用于HeLa的结果从图18中可以看出，联合应用24h后，Act D可使肿瘤细胞HeLa对融合蛋白GnRH-TNFαm和标准品TNFα的敏感性均明显增强(P＜0.05或＜0.01)，亦即与二者联合使用时均具有明显的协同作用。
另一方面，在高剂量时，融合蛋白GnRH-TNFαm与Act D之间的协同作用更强，杀伤率更高(72.6％vs.41.7％，)。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm与Cis、MTX或5-FU联合应用于HeLa结果从图19可以看出，在Cis与融合蛋白GnRH-TNFαm联合应用时，只有最高剂量组的杀伤率明显升高(36.7％，P＜0.05)。提示彼此间有一定的协同作用GnRH-TNFαm与MTX联合应用时，各试验组的细胞毒作用明显增强(P＜0.05或＜0.01)，杀伤率范围在8.0％～26.9％之间。提示二者间有协同作用。
GnRH-TNFαm与5-FU联合应用时，各试验组的细胞毒作用均明显增强(P＜0.05或＜0.01)杀伤率范围在19.3％～58.7％之间。提示二者间有明显的协同作用。
比较而言，在所用剂量范围内，对HeLa细胞来说，5-FU与GnRH-TNFαm联合应用时的协同作用最强。
4.融合蛋白GnRH-TNFαm与化疗药物联合应用时对胰腺癌细胞SW1990的协同杀伤作用(1)融合蛋白GnRH-TNFαm与Act D联合应用于SW1990的结果从图20中可以看出，联合应用24h后，Act D可使肿瘤细胞SW1990对融合蛋白GnRH-TNFαm和标准品TNFα的敏感性均明显增强(P＜0.05或＜0.01)，亦即与二者联合使用时均具有明显的协同作用。
另一方面，在较高剂量时，融合蛋白GnRH-TNFαm与Act D之间的协同作用相对较强，杀伤率更高(71.3％vs.55.9％)。
(2)融合蛋白GnRH-TNFαm与Cis、MTX或5-FU联合应用于SW1990结果从图21可以看出，在Cis与融合蛋白GnRH-TNFαm联合应用时，各试验组的细胞杀伤率与GnRH-TNFαm单独使用时相比无明显变化。提示彼此间无明显协同作用除剂量最高的1个组外，GnRH-TNFαm与MTX联合应用时的细胞毒作用明显增强(P＜0.05)，杀伤率范围在24.2％～40.3％之间。提示二者间有一定的协同作用。
GnRH-TNFαm与5-FU联合应用时，各试验组的细胞毒作用均明显增强(P＜0.05)，杀伤率范围在18.9％～53.3％之间。提示二者间有很强的协同作用。
比较而言，在所用剂量范围内，对HeLa细胞来说，5-FU与GnRH-TNFαm联合应用于SW1990时的协同作用最强。
序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm及其抗肿瘤用途<130>I20031302CB<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>531<212>DNA<213>人工序列<400>1atgcagcact ggtcctatgg tctgcgccct ggcgaattcc cgccaccggc cgtacgcggt60ccaagatcat cttctaaaac cccgagtgac aagcctgtag cccatgttgt agcaaaccct120caagctgagg ggcagctcca gtggctgaac cgccgggcca atgccctcct ggccaatggc180gtggagctga gagataacca gctggtggtg ccatcagagg gcctgtacct catctactcc240caggtcctct tcaagggcca aggctgcccc tccacccatg tgctcctcac ccacaccatc300agccgcatcg ccgtctccta ccagaccaag gtcaacctcc tctctgccat caagagcccc360tgccagaggg agaccccaga gggggctgag gccaagccct ggtatgagcc catctatctg420ggaggggtct tccagctgga gaagggtgac cgactcagcg ctgagatcaa tcggcccgac480tatctcgact ttgccgagtc tgggcaggtc tactttggga tcattgccct g 531<210>2<211>177<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu Phe Pro Pro Pro1 5 10 15Ala Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro20 25 30Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp35 40 45Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg50 55 60Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser65 70 75 80
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权利要求
1.一种重组融合蛋白GnRH-TNFαm，其由人促性腺激素释放肽(GnRH)和人肿瘤坏死因子α(TNFα)组成，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
2.编码重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的融合基因GnRH-TNFαm，其具有SEQ ID NO1的DNA序列。
3.包含有权利要求2所述的融合基因的表达型重组体。
4.如权利要求3所述的表达型重组体，其为温度诱导型表达重组体，所述融合基因GnRH-TNFαm的表达基于温度诱导来实现。
5.如权利要求4所述的表达型重组体，其为pLTEGTI，图谱见图5。
6.如权利要求3所述的表达型重组体，其为IPTG诱导型表达重组体，所述融合基因GnRH-TNFαm的表达基于IPTG诱导来实现。
7.如权利要求6所述的表达型重组体，其为pLT30GTI，图谱见图6。
8.由权利要求3-7任一项的表达型重组体转化、转染或转导获得的工程菌。
9.如权利要求8的工程菌，其为工程菌pLTEGTI/DH5α，其特征在于，它是由权利要求5所述的表达型重组体pLTEGTI转化大肠杆菌DH5α所得。
10.如权利要求8的工程菌，其为工程菌pLT30GTI/BL21/DE3，其特征在于，它是由权利要求7所述的表达型重组体pLT30GTI转化大肠杆菌BL21/DE3所得。
11.一种生产重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm的方法，包括在合适表达的条件下培养权利要求8-10任一项的工程菌，并且分离和纯化所述融合蛋白。
12.权利要求1的重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在制备杀伤，肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞HeLa和胰腺癌细胞SW1990等恶性肿瘤细胞的药物中的应用。
13.权利要求1的重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm在制备治疗GnRH受体阳性的恶性肿瘤的药物中的应用，所述恶性肿瘤选自发生于结肠、乳腺、肺、卵巢、子宫内膜、前列腺、胰腺、肾和肝中的腺癌。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1的重组靶向融合蛋白GnRH-TNFαm和选自放线菌素D、顺铂、胺甲喋呤或5-氟尿嘧啶的肿瘤化疗药物。
全文摘要
本发明提供了一种由人促性腺激素释放肽(GnRH)和人肿瘤坏死因子α(TNFα)衍生物共同组成的全新的重组靶向融合蛋白GnRH－TNFαm。由于GnRH的存在，该靶向融合蛋白被赋予了新的特征，即既具有原型TNFα的活性，又具有原型TNFα所不具备的活性，即对原型TNFα本身耐受的肿瘤细胞的杀伤作用，还具有更强的与常用化疗药物之间的协同作用。亦即，与因为毒副作用过大而无法应用于肿瘤治疗的原型TNFα相比，本发明的重组靶向融合蛋白GnRH－TNFαm在肿瘤的治疗方面具有很好的应用前景。本发明还提供了该重组靶向融合蛋白的DNA序列和其表达型重组体等。
文档编号C12P21/00GK1566156SQ0312394
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月11日 优先权日2003年6月11日
发明者卢圣栋, 李涛 申请人:中国医学科学院基础医学研究所