专利名称：对虾白斑杆状病毒dUTPase基因及其编码的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对虾白斑杆状病毒基因的核苷酸序列。具体地说，本发明涉及对虾白斑杆状病毒W-DUT多肽的基因序列，该多肽蛋白是一种具有dUTPase活性的蛋白。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和活性多肽的生产方法。
背景技术：
对虾白斑杆状病毒(white spot bacilliform virus，WSBV)又称为对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒病原之一，它能高致死率的侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，因此它不仅严重危害对虾养殖，还对海洋生态造成了影响。WSBV是双链DNA病毒，基因组全长305kb，是迄今为止发现的最大的动物病毒(J.Virol.2001，7511811-11820)。基因组序列遗传分析及形态学特征都表明WSBV是一种新病毒，它不属于目前已知的任一种病毒家族。目前还难以对WSS进行预防和控制，一方面由于WSBV能在自然环境中存活较长时间，更重要的是人们对此病毒分子水平的了解还很少。基因组序列分析表明WSBV可能编码一系列与核酸代谢有关的酶类，(其中预测的ORF wsv112可能编码dUTPase，)从而较少或不依赖于宿主脱氧核糖核苷的合成，这一点可能十分有利于病毒基因组的复制，使之能够持续感染且感染宿主范围广。
尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(deoxyuridine triphosphatase，dUTPase)是生物体内的一种重要水解酶类，编号为EC3.6.1.23。它的基本功能就是催化尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸(dUTP)，使其水解为焦磷酸和尿嘧啶脱氧核糖核苷单磷酸(dUMP)，dUMP经甲基化变为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷单磷酸(dTTP)，而dTTP又是合成DNA的主要成分之一。因此dUTPase在核酸的生物合成中起重要作用，为DNA合成提供原料，同时它所催化的水解过程又使细胞中dUTP相对于dTTP保持在很低的水平，从而防止尿嘧啶错误掺入染色体DNA中，维持了生物体的相对稳定。dUTPase广泛存在于原核和真核生物中，包括动物、植物、酵母和大肠杆菌细胞中均有此酶，在许多病毒的基因组中也有dUTPase的编码基因(dut)。其中慢病毒的dUTPase对于病毒的高效复制起着重要的作用(Biochim BiophysActa，1997，1339181～191)，而对有些病毒而言，dUTPase本身就是构成病毒毒力的重要组成部分，如疱疹病毒的dUTPase是构成对宿主细胞的神经毒性和神经侵袭能力的成分(J Virol，1992，666706～6713)，因此有可能利用dUTPase的这些特性，筛选抗病毒药物(Purine andPyrimidine Metabolism in Man，Vol.VIII，pp.135^138，PlenumPress，New York)。本发明首次从WSBV基因组中克隆并鉴定了WSBV的dUTPase(W-DUT)基因，有望运用于对虾白斑病的防治。
发明内容
本发明中的编码W-DUT活性多肽的核苷酸序列是如此获得的。以纯化的WSBV基因组DNA构建文库，测定病毒基因组全序列，根据序列合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列作为引物，经PCR扩增获得了SEQ ID No.1的序列。然后通过重组表达W-DUT基因，纯化W-DUT基因的表达产物，生物学方法证明W-DUT基因编码的蛋白具有dUTPase活性。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该核苷酸编码一种新的dUTPase，此蛋白被命名为W-DUT。
本发明的另一个目的是提供一种新的dUTPase，该蛋白被命名为W-DUT。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的dUTPase的方法。
本发明还提供了这种dUTPase基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码W-DUT蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID No.1中1-的核苷酸序列由至少70％的相似性；或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID No.1中1-的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.1中1-位的核苷酸序列。
在本方面的另一方面，提供了一种分离的W-DUT活性多肽，它包括具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有W-DUT活性多肽的方法。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明中分离的多核苷酸全长为528个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.1，其中开放阅读框位于1-528位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“W-DUT编码序列”是指编码具有W-DUT活性多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1中的1-528位序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID No.1序列的编码框1-528位核苷酸中，由一个和多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.1中1-528位核苷酸相似性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID No.2所述的序列。该术语还包括与SEQ ID No.1中1-528的核苷酸序列的相似性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与W-DUT相同功能的SEQ ID No.1序列变异形式。这些形式包括若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳地5个以内)核苷酸。
在本发明中，“纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少50％，较佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯化可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC测量多肽的纯度。
在本发明中，术语“W-DUT蛋白多肽”指具有dUTPase蛋白活性的SEQ ID No.2序列的多肽。该术语还包括具有dUTPase功能的SEQ ID No.2序列变异形式。这些变异形式包括(但不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括W-DUT蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、修饰形式、在高或低的严谨度条件下能与W-DUT DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗W-DUT多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含W-DUT多肽或者其片段的融合蛋白。
本发明还提供W-DUT蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然W-DUT多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传突变体，诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生的随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基的序列，还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
另一方面，本发明还包括对W-DUT DNA或是其片段编码的多肽能特异性相互作用的多克隆抗体、单克隆抗体及其它及其它能够抑制W-DUT功能的分子。这里，“特异性”是指能相互作用并结合于W-DUT基因产物或片段。
图1重组W-DUT表达纯化的SDS-PAGE图谱；图2酶反应混合物的FPLC分析图谱具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 W-DUT基因的克隆和测序以WSBV基因组DNA为模板，用引物P1、P2扩增W-DUT基因。
P15′-GAGAGGATCCGACTCATCTGCATCTGTCGTG-3′(SEQID No.3)；P25′-GAGCGAGCTCTTCAGTAAAATTTGGGTT-3′(SEQ IDNo.4)；划线部分GGATCC为BamH I酶切位点，GAGCTC为Sac I酶切位点。
PCR反应条件为94℃ 30秒55℃ 30秒68℃ 5分钟(30圈)
琼脂糖凝胶电泳纯化扩增片段后，克隆到原核表达质粒载体pQE30，获得重组表达质粒pQE30-dut，进行测序，测序所得W-DUT基因序列详见SEQ ID No.1。
根据得到的核苷酸序列推导出的W-DUT的氨基酸序列，共176个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。
实施例2 重组W-DUT的表达与纯化将含有W-DUT基因的重组表达质粒pQE30-dut转化大肠杆菌BL21，选取阳性克隆在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇培至A600＝0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃诱导6h后收集菌体。加入冰冷的裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，15mM咪唑，pH8.0)，超声裂解细菌(300W×10s×10次)，4℃15,000rpm离心20min；上清与预先用裂解缓冲液平衡的Ni-NTAAgarose混匀，4℃反应10min，装柱；用洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，30mM咪唑，pH8.0)洗去杂蛋白；洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)洗脱目的蛋白。用SDS-PAGE鉴定纯化蛋白的分子量约为23kD，纯度达95％以上。结果见图1。
图1重组W-DUT表达纯化的SDS-PAGE图谱，图1说明如下-IPTG诱导前；+IPTG诱导；T细胞总蛋白；S诱导细胞的可溶性蛋白；FTNi-NTA柱纯化过程中未能与柱结合的蛋白；Ni-NTA经Ni-NTA柱纯化所得的目的蛋白实施例3 重组W-DUT的抗体制备将实施例2中获得的纯化的重组蛋白用等体积的完全Freund’s佐剂乳化，用0.25-0.5mg/mL乳化过的蛋白对小鼠进行皮下注射，每只0.2mL。10天后用不完全Freund’s佐剂乳化的同样剂量的相同抗原再注射以加强免疫产生抗体，之后每隔7天加强免疫一次，至少进行2次。分析所获抗血清的滴度和特异性。
实施例4 重组W-DUT的dUTPase活性的测定dUTPase的活性测定参照Larsson的方法(FEBS Lett.1998，441327-330)，将酶溶液与反应缓冲液[Tris-Cl(8.0)10mM，MgCl22mM，DTT 1mM，dUTP 5μM]分别于37℃保温，反应开始时，在反应缓冲液中加入酶溶液至终浓度100ng/mL；反应在37℃进行5min，终止反应时，在反应体系中加入1N HCl至终浓度50mM。用FPLC检测反应产物，柱填料为SOURCE 15Q，检测波长254nm，流速2.5mL/min。先用14柱体积含0.01N HCl的0.01M KCl平衡，上样0.5mL后，用0.01M KCl 0.01N HCl-0.01M KCl 0.2N HCl进行梯度洗脱，洗脱总体积为10柱体积，对底物和产物峰面积进行积分，换算求得底物量和产物量。以标准dUTP、dUMP为参照，可观察到加入rW-DUT后，底物dUTP峰消失，出现产物dUMP(图2)，图2酶反应混合物的FPLC分析图谱a.反应前 b.反应后；证明重组W-DUT确实具有催化dUTP水解为dUMP的酶活性。
改变底物dUTP浓度，测定水解反应的初速度，通过双倒数作图求得反应Km值为1.2μM。改变反应底物，当dUTP降解达到90.2％时，dATP、dTTP、dGTP、dCTP的降解率都小于4％(表1)，说明重组W-DUT能够特异且高效的催化dUTP水解。
在阅读了本发明的上述讲述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
表1重组W-DUT的底物特异性Nucleotide ％HydrolysisdUTP90.5dATP2.8dTTP3.6dGTP1.2dCTP0.6
序列表1.SEQ ID No.1的信息1)序列特征A)长度528bpB)类型核酸C)链性双链D)拓扑结构线性2)分子类型DNA3)序列描述SEQ ID No.11ATGGACTCAT CTGCATCTGT CGTGTTTATG AGATTCGCCC CTCCCGGGGA GGAAACTGCATACCTGAGTA GACGTAGACA GCACAAATAC TCTAAGCGGG GAGGGCCCCT CCTTTGACGT61 CTTCCGCCCA GACGTGCCAC GCCCGGTTCT GTCGCCTACG ACCTATTTCC CTCTGAAGAAGAAGGCGGGT CTGCACGGTG CGGGCCAAGA CAGCGGATGC TGGATAAAGG GAGACTTCTT121 ATGGATATCG AACCTATGGG ACTGGCCAAG ATCTCTACTG GATATGGAAT AGACAAGTTTTACCTATAGC TTGGATACCC TGACCGGTTC TAGAGATGAC CTATACCTTA TCTGTTCAAA181 CCCGACGGCT GTTATGGACA AATTGTGTCA CGTTCTGGGA TGACATGGAA GAACAACACTGGGCTGCCGA CAATACCTGT TTAACACAGT GCAAGACCCT ACTGTACCTT CTTGTTGTGA241 AGTGTACCTA CTGGAACGAT TGATGTGGAT TATAGGGGAG AATTGAAAGT GATTCTGCGCTCACATGGAT GACCTTGCTA ACTACACCTA ATATCCCCTC TTAACTTTCA CTAAGACGCG301 AACCATAGTG CAGAAAAAAG TGTGCCAATC AGAAAGGGAA CCAGCATTGC CCAGTTGATTTTGGTATCAC GTCTTTTTTC ACACGGTTAG TCTTTCCCTT GGTCGTAACG GGTCAACTAA361 TTCTTAAGAT ATTGTGATGT CGAGGAAGAA CAGATTGTGT ATATTAATGA AACCACGGGAAAGAATTCTA TAACACTACA GCTCCTTCTT GTCTAACACA TATAATTACT TTGGTGCCCT421 GAGAGAACGA TTATTGACTC TAGTTCTAAA AAGGACAACA AAAATCAAGC AAGAAGCGTGCTCTCTTGCT AATAACTGAG ATCAAGATTT TTCCTGTTGT TTTTAGTTCG TTCTTCGCAC481 CGTGGAACTG GTGGATTTGG ATCTACAGAT AACCCAAATT TTACTGAAGCACCTTGAC CACCTAAACC TAGATGTCTA TTGGGTTTAA AATGACTT2.SEQ ID No.2的信息1)序列特征A)长度176个氨基酸B)类型氨基酸C)拓扑结构线性2)分子类型蛋白质3)序列描述SEQ ID No.21 METAspSerSerAlaSerValValPheMETArgPheAlaProProGlyGluGluThrAla21LeuProProArgArgAlaThrProGlySerValAlaTyrAspLeuPheProSerGluGlu41METAspIleGluProMETGlyLeuAlaLysIleSerThrGlyTyrGlyIleAspLysPhe61ProAspGlyCysTyrGlyGlnIleValSerArgSerGlyMETThrTrpLysAsnAsnThr
81 SerValProThrGlyThrIleAspValAspTyrArgGlyGluLeuLysValIleLeuArg101AsnHisSerAlaGluLysSerValProIleArgLysGlyThrSerIleAlaGlnLeuIle121PheLeuArgTyrCysAspValGluGluGluGlnIleValTyrIleAsnGluThrThrGly141GluArgThrIleIleAspSerSerSerLysLysAspAsnLysAsnGlnAlaArgSerVal161ArgGlyThrGlyGlyPheGlySerThrAspAsnProAsnPheThrGlu3.SEQ ID No.3的信息1)序列特征A)长度31bpB)类型核酸C)链性单链D)拓扑结构线性2)分子类型寡核苷酸3)序列描述SEQ ID No.3GAGAGGATCCGACTCATCTGCATCTGTCGTG4.SEQ IDNo.4的信息1)序列特征A)长度28bpB)类型核酸C)链性单链D)拓扑结构线性2)分子类型寡核苷酸3)序列描述SEQ ID No.4GAGCGAGCTCTTCAGTAAAATTTGGGTT
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码W-DUT活性多肽的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列与SEQ ID NO.1中1-528位的核苷酸序列有至少70％的相似性，或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID No.1中1-528位的核苷酸序列杂交。
2.如权力要求1中所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。
3.如权力要求1中所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQID No.1中从核苷酸1-528的核苷酸序列。
4.一种分离的W-DUT蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ IDNo.2序列的多肽。
6.一种产生具有W-DUT活性多肽的方法，其特征在于，该方法包括a.将编码具有W-DUT蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成W-DUT基因表达载体，所述的核苷酸序列与SEQID No.1中从核苷酸1-528位的核苷酸序列有至少70％的相似性；b.将步骤a中的表达载体转入宿主细胞，形成W-DUT活性多肽的重组细胞；c.在适合表达W-DUT活性多肽的条件下，培养步骤b中的重组细胞；d.分离出具有dUTPase的活性多肽。
7.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该重组的编码多肽的核苷酸序列为SEQ ID No.1中从核苷酸1-528位。
8.一种能与权利要求4所述的W-DUT活性多肽特异性结合的抗体。
全文摘要
本发明从对虾白斑杆状病毒(WSBV)基因组中克隆到一个与病毒核苷酸合成与代谢密切相关的尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)基因，该基因的核苷酸序列编码一种具有dUTPase活性的多肽。本发明还涉及dUTPase基因及其编码多肽的应用，以及所述活性多肽的生产方法。本发明首次通过生物学方法鉴定了WSBV病毒dUTPase(W－DUT)基因的功能，因dUTPase是核苷酸的合成与代谢的关键酶之一，因此涉及WSBV的快速复制和增殖，对该酶的抑制可能是防治对虾白斑病的有效途径之一，有望运用于对虾白斑病的防治。
文档编号C12N15/63GK1576369SQ03143910
公开日2005年2月9日 申请日期2003年7月28日 优先权日2003年7月28日
发明者杨丰, 刘小青 申请人:国家海洋局第三海洋研究所