专利名称：控制乙醇产生的方法
技术领域：
本发明涉及控制乙醇产生和乳酸的高产率技术，且更具体地涉及利用酵母的适于产生乳酸的高表达系统。
背景技术：
由于重组DNA技术的进步，通过使外源基因自身在宿主如微生物、霉菌、动物、植物或昆虫中表达，并使含该基因的转化体生长以获得靶基因产物的技术已得到发展。例如，通过培养酵母等，经发酵生产是可能产生大量靶基因产物的。
已进行了多种尝试来利用酵母产生L-乳酸。也尝试将牛乳酸脱氢酶(LDH)基因插入酿酒酵母来产生L-乳酸(Eri Adhi等，“通过表达乳酸脱氢酶和缺失丙酮酸基因来修饰酿酒酵母的代谢途径，用于乳酸在低pH值发酵”，J.Ferment.Bioeng.，86卷，No3，284-289，1988；Danio Porro等，“开发产生乳酸的代谢工程酿酒酵母”，Biotechnol.Prog.，11卷，294-298，1995，Kohyo(特表2001-516584号日本公报))。然而，在这些报告中均未观察到大量L-乳酸的产生。
已公知酿酒酵母中的丙酮酸脱羧酶有多种同工酶。在常见酵母中，丙酮酸脱羧酶1发挥作用。然而，如果由于破坏了主要基因等，使得该基因得不到表达，丙酮酸脱羧酶5发挥作用，因此，可维持乙醇的产生(“酵母丙酮酸脱羧酶基因表达的自动调节需要该酶，但不需要它的催化活性”，Ines Eberhardt，Hakan Cederberg，Haijuan Li，Stephen Koning，FrankJordan和Stephen Hohmann，Eur.J.Biochem.，Vol.262，191-201，1999)。
发明内容
如上所述，在酿酒酵母内产生大量L-乳酸的技术以前还未得到完善。本发明的目的之一是提供通过控制具有丙酮酸脱羧酶基因如酿酒酵母的宿主生物体内乙醇产生而稳定、大量产生乳酸的技术。
本发明的发明者将研究集中于在酿酒酵母内产生乳酸时得到表达的乳酸脱氢酶(LDH)，并发现这样的转化体可有效产生乳酸，该转化体已导入编码具有乳酸脱氢酶活性、并且所提供的丙酮酸底物亲和力可等于或超过宿主生物体所固有的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力的外源蛋白质的DNA。丙酮酸是导致乙醇产生的丙酮酸脱羧酶的常见底物；乳酸脱氢酶作为乳酸产生的催化剂；等等。现在，与丙酮酸脱羧酶比较，在该转化体中乳酸脱氢酶对丙酮酸具有更高水平的底物亲和力；因此，抑制了通过丙酮酸脱羧酶催化的乙醇产生，并促进了通过外源乳酸脱氢酶催化的乳酸产生。以这种方式，通过该转化体是可增加乳酸产量的。
基于以上发现，公开下述发明本发明的一个方面是公开了这样的转化体，所述转化体中已导入编码具有乳酸脱氢酶活性、并且其所提供的丙酮酸底物亲和力可等于或超过宿主生物体所固有的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力的外源蛋白质的DNA。本发明也提供这样的转化体，该转化体中导入了在宿主染色体上丙酮酸脱羧酶基因的启动子调控下的或替代所述启动子的所述启动子同源物调控下的编码外源蛋白质的DNA。
本发明转化体中的上述外源蛋白质应优选的是牛乳酸脱氢酶或其同源物。如果是由序列号1所示的氨基酸序列或其同源物组成，该蛋白质尤其有效。此外，上述蛋白质优选的由序列号3中所示的DNA序列编码。该DNA序列优选地为由该转化体拥有的如序列号4中所示的DNA序列。
宿主染色体上的上述启动子应优选的是丙酮酸脱羧酶1基因启动子。此外，该启动子应优选地使用序列号2中所示的DNA序列或其同源物。
在本转化体中，上述宿主生物体应优选来自酵母属，以及更为优选的是酿酒酵母。
本发明的另一方面是公开了乳酸制造方法，提供了培养该转化体的方法和从上述方法中获得的培养产物中分离乳酸的方法。该方法可稳定且有效地制造乳酸。
附图简述
图1图1图解了酿酒酵母的密码子使用和使用频率。
图2图2图解了牛源LDH和经修饰LDH的碱基序列的同源性分析结果。顶行显示牛源LDH的碱基序列，而底行显示经修饰的碱基序列，其中与牛源LDH碱基序列不同的碱基以符号(A、T、C或G)表示。
图3图3图解了在实施方案1和合成步骤(步骤1-4)中所使用的用于PCR合成长链DNA的引物结构。
图4图4图解了构建的载体pBTrp-PDC1-LDHKCB的质粒图谱。
图5图5图解了图5中所示的构建该载体的部分过程。
图6图6图解了pBTrp-PDC1-LDH构建过程的另一部分。
图7图7图解了pBTrp-PDC1-LDH构建过程的另一部分。
图8图8图解了图5中所示构建该载体的过程(最后步骤)的另一部分。
图9图9图解了在一个实施方案中获得的转化体的染色体DNA的目标位点的结构变化。
图10图10图解了在一个实施方案中产生的乳酸和乙醇产量的百分比。
图11图11图解了在一个实施方案中产生的乳酸和乙醇产量百分比的趋势。
图12图12图解了牛L-乳酸脱氢酶的丙酮酸饱和曲线。
图13图13图解了牛L-乳酸脱氢酶的Lineweaver-Burk曲线。
图14图14图解了构建具有编码来源于乳酸菌中的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)L-乳酸脱氢酶的DNA片段的载体(pBTrp-PDC1P-LDH；7.11kb)的部分过程。
图15图15图解了构建具有编码来源于乳酸菌中的长双歧杆菌L-乳酸脱氢酶的DNA片段的载体(pBTrp-PDC1P-LDH；7.11kb)的另一部分过程；该解了图14所示过程的后期阶段。
图16图16图解了来源于酵母的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸饱和曲线。
图17图17图解了来源于酵母的丙酮酸脱羧酶的Lineweaver-Burk曲线。
本发明优选的实施方案本发明的实施方案详述如下。
(转化体)转化体中表达的外源蛋白质具有乳酸脱氢酶(LDH)活性，并且转化体所具有的丙酮酸底物亲和力可等于或超过欲转化的宿主生物体所固有的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力。
这里，从生物体如酵母的糖酵解系统的丙酮酸产生乳酸的反应中，LDH作为介导反应的酶已众所周知。这里，乳酸包括L(+)乳酸和D(-)乳酸，但优选的是L(+)乳酸。L(+)乳酸由L(+)-LDH产生，D(-)乳酸由D(-)-LDH产生。
LDH可作为本发明的外源蛋白质。根据生物体的种类，甚至在一种生物体中，也存在不同的同源物。本发明中，具有LDH活性的蛋白质包括天然LDH和通过化学合成或基因工程合成的人工LDH。
LDH应优选来源于真核微生物如酵母；和更为优选地来源于高等真核生物，如植物、动物或昆虫；以及甚至更为优选地来源于更高等真核生物，包括哺乳动物如牛。牛源LDH是最为优选的。牛源LDH的一个例子是由序列号1中所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
来源于肌肉、心脏等的牛源LDH可以得到，并可以使用。可以使用酶编号为EC1.1.1.27的酶。
此外，本发明的外源蛋白质包括这些型别LDH的同源物。LDH同源物包括具有LDH活性、在天然来源LDH的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸的蛋白质，以及在氨基酸序列上与天然来源的LDH具有至少70％、更为优选地具有至少80％同源性且具有LDH活性的蛋白质。
应当指出，只要起始蛋白质的功能得到维持，氨基酸序列中变异的数量不受到限制，但优选的应在氨基酸总数的70％以内、更为优选的是30％以内、最为优选的是20％以内。
例如，预期的同源物应是在序列号1所示的氨基酸序列中替换、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸、并具有LDH活性的蛋白质；或其氨基酸序列与序列号1中所示的氨基酸序列具有至少70％、更为优选的是具有至少80％同源性并且具有LDH活性的蛋白质。
应当指出，序列同源性可利用如BLAST(http://blast.genome.ad.jp/)或FASTA(http://fasta.genome.ad.jp/SIT/FASTA.html)进行同源性检索而确定。
利用位点特异性移位导入法(Current Protocols I Molecular Biology，Ausubel等编辑(1987)Publish.John Wily & Sons Selection 8.1-8.5)等，根据需要将替换、缺失、插入和/或添加变异导入欲修饰的氨基酸序列，可实现氨基酸序列的修饰。此类修饰不受限于变异的人工导入或合成，并且包括通过人工变异处理产生的修饰和自然界中通过氨基酸变异产生的修饰。
本发明中使用的外源蛋白质应优选对丙酮酸具有高底物亲和力。这里，底物亲和力是指在如式(1)所示的米氏方程(Michaelis-Menten equation)中的Km值。
数学表达式1V0＝k2E0[S]/([S]+Km).............(1)应当指出，V0是稳态初速度，[S]是底物浓度，[ES]是由酶和底物组成的复合体的浓度，E0是酶的总浓度，k2是ES→E+S的速度常数。
米氏方程是基于底物S、酶E、底物-酶复合体ES和产物P之间的关系，如下述的式(2)所示。k1是从底物S和酶E产生复合体ES的平衡常数，k2是从复合体ES产生产物P和酶E的平衡常数，k1是从复合体ES分解成酶E和底物S的平衡常数。
数学表达式2 这里，利用下述式(3)从常数中定义Km。
数学表达式3V0＝k2[ES]k1[E][S]＝(k2+k1)[ES][E][S][ES]=k2+k-1k1=Km......(3)]]>此外，如式(4)所示，Km可用多种浓度代替。
数学表达式4Km＝(E0-[ES])[S]/[ES].........(4)例如利用水平轴显示底物浓度，垂直轴显示初速度作图，底物亲和力可通过在固定酶浓度的条件下确定底物浓度[S]和初速度V0之间的关系来确定。底物亲和力也可从Lineweaver-Burk曲线确定。
与宿主生物体所固有的丙酮酸脱羧酶相比较，本发明中外源蛋白质的丙酮酸底物亲和力应优选地等于或超过该酶的丙酮酸底物亲和力。底物亲和力应优选地在相同温度和pH条件等之下比较。温度和pH条件可通过考虑宿主生物体中这些酶进行催化的环境来确定。例如，这些酶的底物亲和力应优选地在温度30-37℃、pH6.0-7.5之间测量。
外源蛋白质的丙酮酸底物亲和力应优选地约是1.5mM或更少。因为如果丙酮酸底物亲和力超过1.5mM，宿主生物体的丙酮酸脱羧酶倾向于与丙酮酸反应。更为优选的是，该值应为1mM或更少。甚至更为优选的是，该值应为0.5mM或更少，以及最为优选的应是0.1mM或更少。
此外，外源蛋白质的丙酮酸底物亲和力应优选地等于或超过宿主生物体的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力。如果外源蛋白质的丙酮酸底物亲和力低于宿主生物体的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力，宿主生物体的丙酮酸脱羧酶倾向于与丙酮酸反应。在本说明书中，相等的底物亲和力表示相应的底物亲和力即Km值是相等的；更高的底物亲和力表示一个底物亲和力(Km值)低于另一相应的Km值。
已将编码这种外源蛋白质的DNA导入本发明的转化体。对该DNA的来源没有限制，可是cDNA、基因组DNA、合成DNA等等。
此外，本发明的DNA可具有天然来源编码LDH的碱基序列、或其碱基序列部分或全部得到修饰并编码具有LDH活性的蛋白质的DNA。它也可以是具有天然来源的编码或合成LDH同源物的碱基序列的DNA。
本发明所使用DNA可具有的碱基序列为在欲转化的宿主生物体经常使用的密码子使用。例如，该DNA可具有酵母属，尤其是具有酿酒酵母所利用的密码子使用的遗传学编码的碱基序列。
应当指出，DNA可化学合成、或利用Fujimoto等(Hideya Fujimoto，Synthetic Gene Creation Method，Plant Cell Engineering Series 7，PlantPCR Experiment Protocol，1997，Shujunsha Co.Ltd.，p95-100)研制的方法合成，它是合成长链DNA所公知的方法。
(DNA构建体)
通过将编码外源蛋白质氨基酸序列的DNA导入宿主生物体，并让该DNA编码的蛋白质表达，可在宿主细胞中产生乳酸。
对于转化，可使用在宿主细胞内表达包含含有本发明DNA的DNA片段的DNA构建体。转化中DNA构建体的形式不以任何方式受到限制，并且根据外源基因的导入方式(染色体外或染色体内)或宿主细胞的类型，可选择和采用质粒(DNA)、噬菌体(DNA)、反转录转座子(DNA)或人工染色体(YAC、PAC、BAC、MAC等)。此外，对DNA构建体无结构限制，如可为线状或环状。因此，DNA构建体可具有任一所述载体的片段和本发明的DNA。优选的原核细胞载体、真核细胞载体、动物细胞载体和植物细胞载体在本领域已众所周知。
应当指出，例如质粒DNA可是YCp型的大肠杆菌-酵母穿梭载体，如pRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123；YEp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，如pYES32或YEp13；YIp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135；来源于大肠杆菌的质粒(ColE型质粒，如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A；pIA型质粒，如pACYC177或pACYC184；pSC101型质粒，如pMW118、pMW119、pMW218、pMW219等等)；或来源于枯草芽孢杆菌的质粒(pUB110、pTP5等)。例如，噬菌体DNA可是λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt100、gt11、或zap)、φX174、M13mp18、或M13mp19。例如反转录转座子可是Ty因子。例如YAC可以是pYACC2。
例如，利用合适的限制性酶将含本发明DNA的片段切割，并将该片段插入所使用载体DNA的限制性酶位点或多克隆位点产生本发明的DNA构建体。
提供的本发明DNA构建体的第一种形式具有与包含本发明DNA的DNA片段连接的启动子片段，以便所述DNA片段可表达。换句话说，本发明的DNA片段可受启动子控制地连接于启动子下游。
优选地使用酵母表达本发明DNA产物，即具有LDH活性的蛋白质，因此，使用在酵母内表达自我的启动子是优选的。对这种启动子，优选的是使用，例如丙酮酸脱羧酶基因启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子或AOX1启动子。尤其是，来源于酵母属的丙酮酸脱羧酶1基因启动子是优选的，并且使用来源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶1基因启动子更为优选。这是因为，在酵母属(酿酒酵母)的乙醇发酵过程中，这些启动子得到高水平表达。应当指出，利用PCR扩增法，使用酵母属的酵母丙酮酸脱羧酶1基因的基因组DNA作为模板分离所述启动子序列。来源于酿酒酵母的所述启动子的碱基序列如序列号2所示。对于本发明DNA构建体的启动子片段，可使用包含序列号2所述的碱基序列的DNA、包含其中具有一个或几个碱基缺失、替换、或添加的序列号2所述碱基序列并具有启动子活性的DNA、或在严谨条件下与来源于序列号2所示的部分或全部碱基序列的DNA杂交、或与其互补链杂交并具有启动子活性(换句话说，为所述启动子的同源物)的DNA。
提供的本发明DNA构建体的第二种或另一种形式具有本发明DNA和用于宿主染色体同源重组的DNA片段。用于同源重组的DNA片段是与DNA欲导入的宿主染色体目标位点邻近的DNA序列同源的DNA序列。应提供用于同源重组的至少一个、优选的两个DNA片段。例如，用于同源重组的两个DNA片段应优选具有与染色体目标位点上游和下游DNA同源的DNA序列，并且本发明DNA应优选连接在这些DNA片段之间。
当通过同源重组的方法将本发明DNA导入宿主染色体时，可将本发明DNA以受宿主染色体上的启动子调控的状态导入。在这种情况下，通过导入本发明DNA，可同时破坏由上述启动子控制的内源基因，并允许该外源DNA表达，而内源基因不表达。当上述启动子在宿主细胞中为高表达的启动子时，这种方法尤为有效。
为在宿主染色体上创建这种表达系统，优选的是以宿主染色体中的高表达基因为目标，并将本发明DNA导入控制该基因的启动子下游，以便该启动子可控制本发明DNA。如果将乙醇发酵微生物如酵母作为宿主，可以以丙酮酸脱羧酶基因(尤其是丙酮酸脱羧酶1基因)作为目标，并导入在内源丙酮酸脱羧酶基因启动子控制下的编码LDH活性蛋白质的DNA。在这种情况下，可用于同源重组的DNA片段与丙酮酸脱羧酶1基因的LDH结构基因区序列或其邻近区(包括起始密码子附近的序列、起始密码子上游区的序列、和结构基因内部的序列)同源。优选地，以酵母属(尤其是酿酒酵母)作为宿主，并使用靶向所述宿主丙酮酸脱羧酶1基因的DNA构建体。利用这种DNA构建体，仅使用单一载体破坏丙酮酸脱羧酶1基因和用LDH替换该结构基因就可实现。因为丙酮酸脱羧酶1基因是介导丙酮酸到乙醛的不可逆反应的酶，其基因的破坏预期可抑制由乙醛产生乙醇，并且同时促进LDH使用丙酮酸作为底物产生乳酸。
通过提供用于宿主染色体同源重组的DNA片段，甚至第一种DNA构建体也可变成用于同源重组的DNA构建体。在第一种DNA构建体中，该DNA构建体内的启动子片段也可作为同源重组的DNA片段。例如，对宿主酿酒酵母，具有以酿酒酵母宿主染色体启动子如丙酮酸脱羧酶1基因启动子作为启动子片段的DNA构建体构成了以上述基因1作为靶向位点的靶向载体。在这种情况下，第一种DNA构建体优选地提供具有与丙酮酸脱羧酶1基因的结构基因区同源的序列。
应当指出，可在DNA构建体中连接终止子并根据需要连接顺式元件如增强子、剪接信号、polyA信号、选择性标志物或核糖体结合序列(SD序列)。对选择性标志物没有特别的限制，可使用多种公知的标志，如药物抗性基因或营养缺陷型基因。例如，可使用二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因等等。
(通过DNA构建体转化)DNA构建体一旦形成，可通过合适的方法将其导入合适的宿主细胞，如转化法、转染法、结合法、原生质体融合、电穿孔法、脂质体法、醋酸锂法、粒子枪法、磷酸钙沉淀法、农杆菌法、PEG法、或直接显微注射法。导入DNA构建体后，在选择培养基中培养经转化细胞。
对宿主细胞，可使用细菌如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；酵母如酿酒酵母、裂变酵母(Saccharmyces pombe)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；昆虫细胞如sf9或sf21；哺乳动物细胞如COS细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)；来自甘薯、烟草等的植物细胞。宿主细胞优选导致乙醇发酵的微生物如酵母、或耐酸微生物，其实例包括以酵母属为代表的酵母，如酿酒酵母。特别的实例包括酿酒酵母IFO2260株和YPH株。
在通过DNA构建体创建的转化体中，DNA构建体的结构组分出现在染色体上或染色体外元件(包括人工染色体)上。如果DNA构建体维持在染色体外或基于随机整合插入染色体时，以LDH的底物丙酮酸作为底物的其它酶如丙酮酸脱羧酶基因(在为酵母属中酵母的情况下所述其它酶为丙酮酸脱羧酶1基因)优选通过靶向载体敲除。
当导入如上所述并可实现同源重组的DNA构建体后，则存在位于宿主染色体目标启动子或置换所述启动子的所述启动子同源物下游并与之可调控地连接的作为本发明DNA的DNA片段。在酵母属酵母的转化体中，优选提供位于宿主染色体丙酮酸脱羧酶1基因启动子下游或替换所述启动子的所述启动子同源物下游的本发明DNA，以便可通过所述启动子调控本发明的DNA。
此外，选择性标志基因和部分破坏的结构基因(在对应于DNA构建体同源序列的位置处)通常位于同源重组的本发明DNA下游。
本发明DNA是否插入目标启动子的下游可利用PCR法或Southern杂交法验证。例如，可通过从转化体中提取DNA、利用导入位点特异引物进行PCR和在电泳中从PCR产物检测预期条带。备选地，也可使用荧光染料标记的引物进行PCR。这些方法是本领域技术人员所公知的。
(乳酸的生产)培养通过导入DNA构建体获得的转化体可在培养物中产生乳酸，它是外源基因的表达产物。然后通过从培养物中分离获得乳酸。在本发明中，“培养物”包括培养上清、和培养细胞或微生物、和细胞或微生物的破碎物。
对于培养本发明的转化体，培养条件可根据转化体的类型选择。这些培养条件是本领域工作人员所公知的。
对培养使用微生物如大肠杆菌或酵母作为宿主获得的转化体的培养基，可使用任何天然或合成的培养基，只要所述培养基含有微生物可利用的碳源、氮源和无机盐等，并可有效培养转化体。对碳源，可使用碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉或纤维素；有机酸如醋酸或丙酸；醇类如乙醇或丙醇。对氮源，可使用无机铵盐或有机铵盐，如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵或磷酸铵；其它含氮化合物；蛋白胨；肉膏；或玉米浆。对无机物，可使用磷酸钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜或碳酸钙等。
培养通常在充气条件下进行，如在30℃摇动培养或好氧搅拌培养6-24小时。在培养时，pH值应优选维持在2.0-6.0之间。pH值水平可利用无机或有机盐、碱溶液等调节。在培养时，如果需要，可向培养基中加入抗生素如氨苄青霉素或四环素。
对培养使用动物细胞作为宿主获得的转化体，可使用通常使用的RPMI1640培养基或DMEM培养基，或加入胎牛血清等的上述任何一种培养基。通常在5％CO2、37℃培养1-30天。在培养时，根据需要，可向培养基中加入抗生素如卡那霉素或青霉素。
可利用分批法或连续法进行培养。对培养方法，可使用以乳酸盐形式获得乳酸的方法，当用碱如铵盐或钙盐中和乳酸时形成如乳酸铵或乳酸钙。也可使用以游离乳酸形式获得乳酸的方法。
培养完成后，从培养物中分离作为基因产物的乳酸时，可使用多种常规纯化方法的组合。例如，如果乳酸产生于转化细胞内部，可使用常规方法从细胞中分离基因产物，如超声破碎、研磨、或压力破碎以破坏细菌细胞。在该个例中，需要的话，应加入蛋白酶。如果乳酸产生于培养上清，通过过滤、离心分离等从溶液中除去固体。
例如，培养过程完成后，培养液通过至少一步固体-液体分离过程分离成为固体和液体，如皮带推进、离心分离或过滤推进。优选应用纯化过程分离滤液。在纯化过程中，例如，可使用电透析从含乳酸的滤液中移去有机酸和糖，而不移去乳酸，并获得乳酸溶液或乳酸铵溶液。如果获得乳酸铵溶液，可使用双极性膜等分解铵以产生乳酸水溶液和氨水。如果上述滤液中除乳酸外的有机酸和糖的量很少，可不进行电透析、需要的话通过蒸发水份浓缩、然后使用双极性膜。
应当指出，对培养液和粗提取级分，除上述纯化乳酸或其盐的方法之外，可使用多种纯化和分离方法，如利用有机溶剂和蒸馏分离和提取。此外，需要的话，对培养液、粗提取级分或其纯化产物通过酯化、丙交酯转化、低聚合或预聚合，可获得多种类型的乳酸衍生物。需要的话，可从乳酸发酵液中收集乳酸、其盐、和一种或多种乳酸衍生物。
(实施方案)虽然本发明的实施方案如下所述，但不专门用于限制本发明的范围。
(实施方案1设计L-乳酸脱氢酶基因的DNA序列)为在高等真核生物酵母属的酿酒酵母中有效产生来源于牛的L-乳酸脱氢酶，我们设计了新的非天然存在的、用于编码牛来源L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列的DNA基因序列。
1)使用酿酒酵母经常使用的密码子。
2)在跨越起始密码子处，加入Kozaks序列(ANNATGG)。
3)尽可能除去mRNA中不稳定序列和重复序列。
4)使GC含量对整个序列的偏离一致。
5)采取措施保证在设计序列内部不产生不适合于基因克隆的限制性酶位点。
6)加入用于插入染色体的插入型载体两端的限制性酶EcoR I、XhoI和Afl III。
对于酵母中的密码子使用频率，从密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)获得的酿酒酵母密码子使用如图2所示，确定了频繁用于特定氨基酸的密码子(下划线处的密码子)。
编码具有LDH活性的蛋白质的新DNA序列(999bp)(此后称为LDHKCB基因)如序列号3所示，该序列基于上述设计方针2-5而获得，并应用图1所示密码子使用中频繁使用的密码子。另外，包括序列号3所示DNA序列和其起始密码子上游和其终止密码子下游的DNA序列(1052bp)(此后称为LDHKCB序列)如序列号4所示。
在序列号3所示的DNA序列中，与原始DNA序列使用的密码子不同的密码子在除甲硫氨酸之外的所有氨基酸中得到使用。应当指出，新采用的密码子都是图1所示中经常使用的密码子。此外，图2显示原始牛源LDH基因和LDHKCB基因基于计算机的同源分析结果。如图2所表明的那样，发现在几乎全部DNA序列上需要大量的替换。
(实施方案2LDHKCB序列的全合成)在本实施方案中，使用Fujimoto等的方法，该方法是合成长链DNA所公知的方法(Hideya Fujimoto，Synthetic Gene Creation Method，PlantCell Engineering Series 7，Plant PCR Experiment Protocol.1997，Shujunsha Co.Ltd.，p95-100)。该方法的原理如下合成约100mer的多条寡核苷酸引物以在3’端含有10-12mer之间的重叠。然后，缺失区域利用寡核苷酸引物之间的重叠区进行延伸、通过使用两端引物进行PCR扩增。依次重复该操作以合成长链靶DNA。对PCR扩增仪，使用Gene AmpPCR system9700(PE Applied Biosystems Inc.)。
具体地，首先混合两种欲连接的寡核苷酸引物，在KOD-plus-DNA聚合酶(Toyobo)存在下，进行DNA延伸反应，条件为96℃ 2分钟、68℃ 2分钟、54℃ 2分钟和72℃ 30分钟。下一步，使用1/10的样品作为模板进行PCR(聚合酶链反应)。在该反应中，样品首先在96℃维持2分钟，然后在两端引物存在下完成25循环(每循环由96℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 90秒组成)，最后在4℃维持。对该反应，使用与DNA聚合酶一起供给的缓冲液和dNTP混合物等。
根据图3进行一系列的重叠PCR以合成最终的目标基因片段。如图3所示的所有28条引物(BA、B01、BB、B02、BC、B03、BD、B04、BE、B05、BF、B06、BG、B07、BH、B08、BI、B09、BJ、B10、BK、B11、BL、B12、BM、B13、BN和B14)的DNA序列分别如序列号5-32所示。确证合成的LDHKCB基因的碱基序列后，使用EcoR I限制性酶处理。然后使用标准方法，将该序列连接至pCR2.1 TOPO载体(Invitrogen)，其中该载体以同样的方式使用EcoR I限制性酶处理。所得到的载体称为pBTOPO-LDHKCB载体。
(实施方案3构建用于酵母染色体导入的载体)利用实施方案2中全合成的LDHKCB序列，构建酵母染色体插入型载体。该载体称为pBTRP-PDC1-LDHKCB，并且其质粒图谱如图4所示。
1.为构建pBTRP-PDC1-LDHKCB分离PDC1P片段通过使用酿酒酵母YPH株(Stratagene Corp.)基因组DNA作为模板进行PCR扩增分离PDC1P片段。
利用快速DNA试剂盒(Bio101 Inc)、并根据附录中所述的详细方法，制备酿酒酵母YPH株的基因组DNA，其中该试剂盒是基因组制备试剂盒。利用分光光度计Ultro spec 3000(Amersham Pharmacia Biotech Inc)测量DNA浓度。
对PCR，使用据说可产生高精确扩增片段的Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.Ltd.)作为扩增酶。制备总体积为50μl的反应液，该溶液包含利用上述方法制备的酿酒酵母YPH株的基因组DNA 50ng、50pmol引物DNA和0.2U单位Pyrobest DNA聚合酶。利用PCR扩增仪系统(Gene Amp PCR system 9700，PE Applied Biosystems Inc.制造)，使反应液经过DNA扩增。PCR扩增仪的反应条件如下首先溶液在96℃维持2分钟，然后经过25个循环(每循环由96℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 90秒组成)，最后维持在4℃。通过在1％ TBE琼脂糖凝胶中电泳的方法，证明PCR扩增片段是所扩增的基因片段。应当指出，合成的DNA(Sawaday Technology Co.)作为反应的引物DNA，并且该引物的DNA序列如下所述。
将限制性酶BamH I位点加至PDC1P-LDH-U(31mer，Tm值为58.3℃)末端
ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C(序列号33)将限制性酶EcoR I位点加至PDC1P-LDH-D(31mer，Tm值为54.4℃)末端ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(序列号34)2.构建包含启动子和靶基因的重组载体在来源于酿酒酵母丙酮酸脱羧酶1基因(PDC1)的启动子序列控制下的牛源乳酸脱氢酶基因(LDH基因)用作靶基因。
用于构建本发明重组载体而构建的染色体插入型的新载体命名为pBTrp-PDC1-LDHKCB。构建本发明载体的实例详述如下。该实施方案的概述图解于图5-8。应当指出，构建载体的方法不受限于这里所述的方法。
如上所述，当构建载体时，使用酿酒酵母YPH株基因组DNA作为模板进行PCR扩增，分离PDC1基因启动子片段(PDC1P)971bp和PDC1基因下游区片段(PDC1D)518bp。虽然将上述方法用于PCR扩增，将下述引物作为扩增PDC1基因下游区片段的引物将限制性酶Xho I位点加至PDC1D-LDH-U(34mer，Tm值为55.3℃)末端ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C(序列号35)将限制性酶Apa I位点加至PDC1D-LDH-D(31mer，Tm值为54.4℃)末端ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G(序列号36)通过上述反应获得的PDC1P和PDC1D扩增基因片段各自经过乙醇沉淀过程纯化后，将PDC1P扩增片段和PDC1D扩增片段分别与限制性酶BamH I/EcoR I和Xho I/Apa I反应。应当指出，下面所使用的全部酶由Takara Shuzo Co.Ltd.制造。另外，一系列详细的乙醇沉淀过程的操作和限制性酶处理基于“分子克隆-实验室手册，第二版”(Maniatis等，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)进行。
构建该载体的一系列反应操作根据普遍公知的DNA亚克隆方法进行。简而言之，将通过上述PCR方法扩增的、并应用限制性酶处理的PDC1P片段连接至用限制性酶BamH I/EcoR I(Takara Shuzo)和去磷酸化酶碱性磷酸酶(BAP，Takara Shuzo)处理过的pBluescript II SK+载体(Toyobo)进行T4 DNA连接酶反应。对T4 DNA连接酶反应，使用LigaFast快速DNA连接系统(Promega Corporation)，下面是所包括的详细方法。
下一步，使用其中连接反应已发生的溶液进行感受态细胞的转化。对感受态细胞，使用大肠杆菌JM109株(Toyobo)，下面是所包括的详细方法。将获得的溶液涂布于含100μg/ml抗生素氨苄青霉素的LB平板上，并过夜孵育。使用插入片段的引物DNA、采用菌落PCR法和对通过miniprep制备的质粒DNA溶液进行限制性酶切来确证生长的菌落。然后分离目标载体(pBPDC1P载体)(图5中间)。
下一步，如图5中间所示，利用上述同样的方法，将LDHKCB基因片段亚克隆至pPDC1P载体中，以创建pBPDC1P-LDHKCB载体(图5下部)，其中LDHKCB基因片段通过限制性酶EcoR I和末端修饰酶T4DNA聚合酶加工由Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho构建的pBTOPO-LDHKCB载体而获得，pBPDC1P载体同样通过限制性酶EcoRI和末端修饰酶T4 DNA聚合酶加工。
另一方面，如图6所示，利用上述同样的方法，将LDH基因(来源于长双歧杆菌)片段亚克隆至pBPDC1P载体以创建pBPDC1P-LDH1载体(图6)，其中LDH基因片段通过限制性酶EcoR I/Aat II和末端修饰酶T4 DNA聚合酶加工由Toyata Jidosha Kabushiki Kaisha构建的pYLD1载体而获得，pBPDC1P载体同样通过限制性酶EcoR I和末端修饰酶T4DNA聚合酶加工。应当指出，上述pYLD1载体已导入大肠杆菌(名称大肠杆菌pYLD1)，并根据布达佩斯条约(最初保藏日期1999年10月26日)进行了国际保藏，保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(邮政编码305-8566日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6)，保藏号为FERM BP-7423。
下一步，如图7所示，用Xho I/Apa I处理该载体，并连接至经扩增的PDC1D片段以创建pBPDC1P-LDH载体(如图7上部所示)，其中PDC1D片段以同样的方式用限制性酶处理。最后，将用EcoRV加工的pBPDC1P-LDH II载体连接至Trp标记片段以构建pBTrp-PDC1-LDH载体，其中Trp标记片段通过对pRS404载体(Stratagene Inc.)应用AatII/Ssp I和T4 DNA聚合酶加工获得。
下一步，如图8所示，用限制性酶Apa I/EcoR I加工pBPDC1P-LDHKCB载体；另外，用限制性酶Apa I和Stu I将pBTrp-PDC1-LDH载体加工成含有Trp标记的片段。将扩增片段连接以构建为最终构建体的染色体插入型pBTrp-PDC1-LDHKCB载体。
为确证构建的染色体插入型pBTrp-PDC1-LDHKCB载体，实施碱基序列测定。将ABI PRISM310基因分析仪(PE Applied Biosystems Inc)用于分析碱基序列，并且如制备样品和使用仪器的方法的细节按照分析仪附带的说明书进行。作为样品使用的载体DNA用碱提取法制备。使用样品前，首先利用GFX DNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech Inc)进行柱纯化，然后采用Ultro spec 3000分光光度仪(Amersham PharmaciaBiotech Inc)测量其DNA浓度。
(实施方案4酵母的转化)根据Ito等研发的方法(Ito H，Y Fukuda，K Murata和A Kimura，转化碱处理的完整酵母细胞，J Bacteriol，Vol.153，p163-168)，将基因导入酵母。简而言之，酵母IFO2260株(发酵研究所注册的酵母株，Osaka)在10mlYPD培养基中于30℃培养至其达到对数生长期，其中所述酵母株已除去色氨酸合成功能。然后收集酵母，并用TE缓冲液洗涤。下一步，加入0.5ml TE缓冲液和0.5ml 0.2M醋酸锂，并将该混合物在30℃振动培养1小时。然后，用限制性酶Apa I和Sac I(均由Takara Shuzo制造)对染色体插入型pBTrp-PDC1-LDHKCB载体进行加工，并加至培养物中，其中所述载体利用实施方案3的方法构建。
本发明的酵母悬液于30℃摇动培养30分钟后，加入150μl 70％聚乙二醇4000(Wako Pure Chemical Industries)，并将混合物充分搅拌。然后，混合物于30℃再振动培养1小时后，在42℃热休克5分钟。然后洗涤细菌，并悬于200μl水中，并将该溶液涂布于色氨酸选择性培养基。
将获得的菌落涂布于新的色氨酸划线培养基，并且对显示为稳定的经选择菌株利用PCR分析检查基因导入。通过在2ml YPHD培养基中过夜振动培养单克隆、收集菌体、加入500μl 50mM Tris-HCl和玻璃珠(425-600μm，酸洗涤，SIGMA)、并使混合物于4℃旋涡15分钟，制备用于PCR的酵母基因组DNA。使该溶液的上清经过乙醇沉淀，并溶于50μl无菌水中。使用5μl制备的基因组DNA作为模板，在50μl反应液中实施PCR。将Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)用作DNA扩增的酶，并使用PCRamplifier Gene Amp PCR system 9700(PE Applied Biosystems Inc)。PCR扩增仪的反应条件如下将溶液首先于96℃维持2分钟；然后使之经过30个循环(每个循环由96℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 90秒组成)；最后使之维持于4℃。使用的引物序列如下LDH-KCB-UTGG TTG ATG TTA TGG AAG AT(20mer)(序列号37)LDH-KCB-DGAC AAG GTA CAT AAA ACC CAG(21mer)(序号38)PDC1P-U3GTA ATA AAC ACA CCC CGC G(19mer)(序列号39)具有稳定色氨酸合成功能和利用这些引物通过PCR确证的菌株判定为已适当导入LDHKCB基因的转化体。在本实施方案中，将获得的命名为KCB-27、KCB-210和KCB211的三株菌株作为这样的转化体。图9显示这些酿酒酵母转化体的基因组染色体结构。
(实施方案5测量转化体中乳酸的产生量)对构建的三种转化体实施发酵实验。作为预培养，将转化体在含有2％葡萄糖的YPD液体培养基中过夜培养。收集菌体并洗涤后，将其接种于含有15％葡萄糖的YPD液体培养基，以便使酵母菌浓度为1％(0.5g/50ml)，并使其于30℃发酵几天。每24小时对该发酵液取样，并估计L-乳酸的含量。对测量产量，使用生物传感器BF-4(Oji ScientificInstruments)按照该仪器的使用者手册所述的详细测量方法进行。
图10和表1显示在含有15％葡萄糖的发酵第三天培养液中L-乳酸量和乙醇量的测量结果。至于KCB-27株，图11和表2显示在第0和5天之间的L-乳酸量和乙醇量的趋势。
即使每个转化体仅导入单一拷贝的LDHKCB基因，在每1升培养液中可证实乳酸有4.5-5.0％(45.0-50.0g)之间的产量，其中所述转化体(KCB-27、KCB-210和KCB-211菌株)中已导入LDHKCB基因。同时，乙醇产量是5％，大约比亲本菌株预期产量少2.5％。
本结果清楚地显示，与过去报告的例子比，酿酒酵母中L-乳酸的产量有极为显著的增加。此外，产量的增加推定是由于导入LDH，其中LDH具有等于或高于来源于酵母的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力。也同样推定导入的在染色体丙酮酸脱羧酶1基因启动子控制下的LDH在起作用。
上述结果显示甚至单一拷贝可使产量产生显著的增加。因此，推测导入2个或更多拷贝甚至将进一步增加产量。
(实施方案6测量来源于不同真核生物的L-乳酸脱氢酶的丙酮酸底物亲和力(米氏常数和Km值))使用下述方法测量来源于牛的L-乳酸脱氢酶的丙酮酸底物亲和力(米氏常数和Km值))。将结果与来源于乳酸菌的L-乳酸脱氢酶的丙酮酸底物亲和力比较。
为测量丙酮酸底物亲和力(Km值)，首先将丙酮酸、NADH和FBP加入至纯化的L-乳酸脱氢酶使发生酶反应。然后，利用分光光度计(JASCO制造的Ubest-55)在ABS为340nm处测定NADH的减少率，并测定每种L-乳酸脱氢酶的活性。
下一步，基于在不同丙酮酸浓度水平下L-乳酸脱氢酶活性值，绘制丙酮酸饱和曲线并由计算出的各自倒数来绘制Lineweaver-Burk曲线。然后确定L-乳酸脱氢酶的丙酮酸底物亲和力(米氏常数和Km值)。
通过将pH调整为7.0的50mM MOPS缓冲液(Narakai制造)、0.15mMNADH(SIGMA制造)、1mM FBP(SIGMA)加入0.05μg纯化的牛肌肉来源的L-乳酸脱氢酶(SIGMA)制备溶液，将溶液于37℃维持2-3分钟。
下一步，加入不同浓度(0.01-100mM)的丙酮酸(Wako Pure ChemicalIndustries)。快速混合后，将溶液放置于分光光度仪，并确定在ABS340nm处吸光值在1分钟内的变化。
应当指出，利用下述公式(数学表达式5)确定LDH活性。
LDH活性值(U/mg蛋白质)＝(1分钟内的吸光值变化/0.0063)×(1000μg/0.05μg)×(200μl/1000μl)×(1/1000)应当指出，根据1)Minowa T，Iwata S，Sakai H和Ohta T.，编码L-乳酸脱氢酶的长双歧杆菌基因的序列和特征以及该酶的一级结构；变构部位的新特征，Gene，1989，85卷，161-168和2)SIGMA乳酸脱氢酶(LDH/LD)附带的使用者手册中所述，实施上述操作。
基于获得的LDH活性，以垂直轴为[V]＝LDH酶活性(U/mg)、水平轴为[S]＝丙酮酸浓度(mM)，创建丙酮酸饱和曲线。该图如图12所示。
此外，分别以1/[V]和1/[S]为垂直轴和水平轴，创建由所述各自倒数计算的Lineweaver-Burk曲线。图13显示该酶的曲线。
利用Lineweaver-Burk曲线和1/[V]轴的交点是1/Vmax，该曲线与1/[S]轴的交点是-1/Km，计算丙酮酸浓度底物亲和力(Km值)。
每条Lineweaver-Burk曲线显示，来源于牛肌肉的L-乳酸脱氢酶的丙酮酸底物亲和力是0.1mM。本发明的发明者认为来源于乳酸菌长双歧杆菌的L-乳酸脱氢酶的丙酮酸底物亲和力是1.0mM。
通过将编码来源于乳酸长双岐杆菌的L-乳酸脱氢酶的DNA导入并使其高水平表达的重组酵母产生的L-乳酸和乙醇的量如下所述。(发酵条件是在含有15％葡萄糖的YPD培养基中于30℃培养3天)。图14和15显示了用于重组酵母中的所述乳酸菌来源LDH的载体(pBTrp-PDC1P-LDH；7.11kb)和构建该载体的过程。在所述的经转化酵母中，通过PDC1启动子将所述基因经敲入宿主染色体上的PDC基因座而可控导入。已证实，该经转化酵母有2个拷贝，其中所述的L-乳酸脱氢酶基因已导入宿主染色体上的一对PDC基因座中。应当指出，除图14和15所述的步骤以外，构建所述载体和转化酵母的操作与实施方案3和4中的一致。
如表3所示，当将该结果与实施方案5中测试的、从牛肌肉来源的L-乳酸脱氢酶所获得的结果比较，导入牛肌肉来源LDH的酵母产生的L-乳酸的量大约是导入乳酸菌来源LDH的酵母的2倍。
(实施方案7测量来源于酵母的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力(米氏常数和Km值))为测量酵母来源的丙酮酸脱羧酶活性和丙酮酸底物亲和力(Km值)，首先将丙酮酸、NADH和维生素B1加入纯化的丙酮酸脱羧酶进行酶反应。然后，利用分光光度仪确定NADH在ABS340nm处的减少率，并确定酵母来源的丙酮酸脱羧酶的活性。
下一步，基于在不同丙酮酸浓度下丙酮酸脱羧酶活性值，绘制丙酮酸饱和曲线并由计算出的各自倒数来绘制Lineweaver-Burk曲线。然后确定丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力(Michaelis常数和Km值)。
将下述溶液在4℃维持2-3分钟，其中溶液的制备为向0.05μg纯化的酵母来源丙酮酸脱羧酶(SIGMA)中加入pH调整为7.0的34mM咪唑HCl缓冲液(由Wako Pure Chemical Industries制造)、0.15mM NADH(SIGMA制造)和0.2mM焦磷酸维生素B1(SIGMA)。
下一步，加入不同浓度水平(0.01-100mM)的丙酮酸(Wako PureChemical Industries)。快速混合后，将溶液放置于分光光度仪(JASCO制造的Ubest-55)，并确定于ABS340nm处，吸光值在1分钟内的变化。
应当指出，利用下述公式(数学表达式6)确定PDC活性。
PDC活性值(U/mg蛋白质)＝(1分钟内的吸光值变化/0.0063)×(1000μg/0.05μg)×(200μl/1000μl)×(1/1000)应当指出，根据Pronk JT，Steensma HY和Dijken JP.，酿酒酵母中丙酮酸的代谢，Yeast，1996，12卷，1607-1633所述的方法实施本操作。
基于获得的PDC活性，以垂直轴为[V]＝PDC酶活性(U/mg)、水平轴为[S]＝丙酮酸浓度(mM)，创建丙酮酸饱和曲线。该图如图16所示。
此外，分别以1/[V]和1/[S]为垂直轴和水平轴，创建由所述各自倒数计算的Lineweaver-Burk曲线。图17显示该酶的曲线。利用Lineweaver-Burk曲线和1/[V]轴的交点是1/Vmax，该曲线与1/[S]轴的交点是-1/Km，计算丙酮酸浓度底物亲和力(Km值)。
Lineweaver-Burk曲线显示酵母来源丙酮酸脱羧酶的丙酮酸Km值是0.346mM。
0.346mM的数值是牛来源L-乳酸脱氢酶的丙酮酸Km值的3.46倍，其中后者在实施方案6中是0.1mM。换句话说，牛来源L-乳酸脱氢酶具有的底物亲和力是酵母来源丙酮酸脱羧酶的3.46倍。
此外，0.346mM的数值是长双歧杆菌来源L-乳酸脱氢酶的丙酮酸Km值的0.346倍，其中后者是1.0mM。换言之，所述乳酸菌来源L-乳酸脱氢酶的底物亲和力仅为酵母来源的丙酮酸脱羧酶的0.346倍。
在本说明书中所有引用的出版物包括专利和专利申请说明书，它们构成了本说明书的一部分，如每一种出版物各自清楚地描述的那样对它们全部引用。在引述中，日本专利申请号2001-286637、2002-128323、2001-287159、2002-128286、2002-65880和2002-65879中的专利申请说明书如每一说明书各自清楚地描述的那样对它们全部引用，也构成了本说明书的一部分。
本申请的工业利用领域本发明也提供在具有丙酮酸脱羧酶基因的宿主生物体内控制产生乙醇和稳定大规模产生乳酸的技术。
序列号3编码乳酸脱氢酶的经修饰DNA序列号4编码乳酸脱氢酶的经修饰DNA序列号5-39引物序列表序列表<110>丰田自动车株式会社<120>控制乙醇产生的方法<130>PCTJP20007(TSN2002-299-WO-00)<140>
<141>
<160>39<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>332<212>PRT<213>牛的<400>1Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu1 5 10 15His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly20 25 30Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val35 40 45Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp50 55 60Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly65 70 75 80Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala85 90 95Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg100 105 110Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser
115 120 125Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr130 135 140Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly145 150 155 160Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu165 170 175Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu180 185 190His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly195 200 205Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys210 215 220Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu225 230 235 240Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val245 250 255Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro260 265 270Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe275 280 285Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val290 295 300Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala305 310 315 320Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe325 330<210>2<211>971
<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>2aagggtagcc tccccataac ataaactcaa taaaatatat agtcttcaac ttgaaaaagg 60aacaagctca tgcaaagagg tggtacccgc acgccgaaat gcatgcaagt aacctattca 120aagtaatatc tcatacatgt ttcatgaggg taacaacatg cgactgggtg agcatatgct 180ccgctgatgt gatgtgcaag ataaacaagc aagacggaaa ctaacttctt cttcatgtaa 240taaacacacc ccgcgtttat ttacctatct ttaaacttca acaccttata tcataactaa 300tatttcttga gataagcaca ctgcacccat accttcctta aaagcgtagc ttccagtttt 360tggtggttcc ggcttccttc ccgattccgc ccgctaaacg catatttttg ttgcctggtg 420gcatttgcaa aatgcataac ctatgcattt aaaagattat gtatgctctt ctgacttttc 480gtgtgatgaa gctcgtggaa aaaatgaata atttatgaat ttgagaacaa ttctgtgttg 540ttacggtatt ttactatgga ataattaatc aattgaggat tttatgcaaa tatcgtttga 600atatttttcc gaccctttga gtacttttct tcataattgc ataatattgt ccgctgcccg 660tttttctgtt agacggtgtc ttgatctact tgctatcgtt caacaccacc ttattttcta 720actatttttt ttttagctca tttgaatcag cttatggtga tggcacattt ttgcataaac 780ctagctgtcc tcgttgaaca taggaaaaaa aaatatatta acaaggctct ttcactctcc 840ttgcaatcag atttgggttt gttcccttta ttttcatatt tcttgtcata ttcctttctc 900aattattatt ttctactcat aaccacacgc aaaataacac agtcaaatca atcaaagatc 960ccccaattct c 971<210>3<211>999<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述编码乳酸脱氢酶的经修饰DNA<400>3atggctactt tgaaagatca attgattcaa aatttgttga aagaagaaca tgttccacaa 60aataaaatta ctattgttgg tgttggtgct gttggtatgg cttgtgctat ttctattttg 120atgaaagatt tggctgatga agttgctttg gttgatgtta tggaagataa attgaaaggt 180gaaatgatgg atttgcaaca tggttctttg tttttgagaa ctccaaaaat tgtttctggt 240aaagattata atgttactgc taattctaga ttggttatta ttactgctgg tgctagacaa 300caagaaggtg aatctagatt gaatttggtt caaagaaatg ttaatatttt taaatttatt 360attccaaata ttgttaaata ttctccaaat tgtaaattgt tggttgtttc taatccagtt 420gatattttga cttatgttgc ttggaaaatt tctggttttc caaaaaatag agttattggt 480tctggttgta atttggattc tgctagattt agatatttga tgggtgaaag attgggtgtt 540catccattgt cttgtcatgg ttggattttg ggtgaacatg gtgattcttc tgttccagtt 600tggtctggtg ttaatgttgc tggtgtttct ttgaaaaatt tgcatccaga attgggtact 660gatgctgata aagaacaatg gaaagctgtt cataaacaag ttgttgattc tgcttatgaa 720
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<223>人工序列的描述编码乳酸脱氢酶的经修饰DNA<400>4acagaattca caatggctac tttgaaagat caattgattc aaaatttgtt gaaagaagaa 60catgttccac aaaataaaat tactattgtt ggtgttggtg ctgttggtat ggcttgtgct 120atttctattt tgatgaaaga tttggctgat gaagttgctt tggttgatgt tatggaagat 180aaattgaaag gtgaaatgat ggatttgcaa catggttctt tgtttttgag aactccaaaa 240attgtttctg gtaaagatta taatgttact gctaattcta gattggttat tattactgct 300ggtgctagac aacaagaagg tgaatctaga ttgaatttgg ttcaaagaaa tgttaatatt 360tttaaattta ttattccaaa tattgttaaa tattctccaa attgtaaatt gttggttgtt 420tctaatccag ttgatatttt gacttatgtt gcttggaaaa tttctggttt tccaaaaaat 480agagttattg gttctggttg taatttggat tctgctagat ttagatattt gatgggtgaa 540agattgggtg ttcatccatt gtcttgtcat ggttggattt tgggtgaaca tggtgattct 600tctgttccag tttggtctgg tgttaatgtt gctggtgttt ctttgaaaaa tttgcatcca 660gaattgggta ctgatgctga taaagaacaa tggaaagctg ttcataaaca agttgttgat 720tctgcttatg aagttattaa attgaaaggt tatacttctt gggctattgg tttgtctgtt 780gctgatttgg ctgaatctat tatgaaaaat ttgagaagag ttcatccaat ttctactatg 840attaaaggtt tgtatggtat taaagaagat gtttttttgt ctgttccatg tattttgggt 900caaaatggta tttctgatgt tgttaaagtt actttgactc atgaagaaga agcttgtttg 960aaaaaatctg ctgatacttt gtggggtatt caaaaagaat tgcaatttta ataactcgag 1020cttggttgaa cacgttgcca aggcttaagt ga 1052<210>5<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
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<223>人工序列的描述引物<400>7atgataacaa ccacaaccac gacaaccata ccgaacacga taaagataaa actactttct 60aaaccgacta cttcaacgaa accaactaca ataccttcta 100<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8atgataacaa ccacaaccac20<210>9<211>100
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9tggttgatgt tatggaagat aaattgaaag gtgaaatgat ggatttgcaa catggttctt 60tgtttttgag aactccaaaa attgtttctg gtaaagatta 100<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10tggttgatgt tatggaagat20<210>11<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11taacaaagac catttctaat attacaatga cgattaagat ctaaccaata ataatgacga 60ccacgatctg ttgttcttcc acttagatct aacttaaacc 100<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>12taacaaagac catttctaat a 21<210>13<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13tgaatctaga ttgaatttgg ttcaaagaaa tgttaatatt tttaaattta ttattccaaa 60tattgttaaa tattctccaa attgtaaatt gttggttgtt 100<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14tgaatctaga ttgaatttgg t 21<210>15<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15taacatttaa caaccaacaa agattaggtc aactataaaa ctgaatacaa cgaacctttt 60aaagaccaaa aggtttttta tctcaataac caagaccaac 100<210>16<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16taacatttaa caaccaacaa a 21<210>17<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>17agagttattg gttctggttg taatttggat tctgctagat ttagatattt gatgggtgaa 60agattgggtg ttcatccatt gtcttgtcat ggttggattt 100<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>18agagttattg gttctggttg t 21<210>19<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>19
cagaacagta ccaacctaaa acccacttgt accactaaga agacaaggtc aaaccagacc 60acaattacaa cgaccacaaa gaaacttttt aaacgtaggt 100<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>20cagaacagta ccaacctaaa a 21<210>21<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>21ctttgaaaaa tttgcatcca gaattgggta ctgatgctga taaagaacaa tggaaagctg 60ttcataaaca agttgttgat tctgcttatg aagttattaa 100<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>22ctttgaaaaa tttgcatcca g 21<210>23<211>100<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>23agacgaatac ttcaataatt taactttcca atatgaagaa cccgataacc aaacagacaa 60cgactaaacc gacttagata atacttttta aactcttctc 100<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>24agacgaatac ttcaataatt t 21<210>25<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>25tatgaaaaat ttgagaagag ttcatccaat ttctactatg attaaaggtt tgtatggtat 60taaagaagat gtttttttgt ctgttccatg tattttgggt 100<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>26
atgaaaaatt tgagaagagt 20<210>27<211>100<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>27gacaaggtac ataaaaccca gttttaccat aaagactaca acaatttcaa tgaaactgag 60tacttcttct tcgaacaaac ttttttagac gactatgaaa 100<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>28gacaaggtac ataaaaccca g 21<210>29<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>29aaaaaatctg ctgatacttt gtggggtatt caaaaagaat tgcaatttta ataactcgag 60<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>30aaaaaatctg ctgatacttt g 21<210>31<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>31acgttaaaat tattgagctc gaaccaactt gtgcaacggt tccgaattca ct 52<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>32acgttaaaat tattgagctc g 21<210>33<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>33atatatggat ccgcgtttat ttacctatct c31
<210>34<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>34atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31<210>35<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>35atatatctcg aggccagcta acttcttggt cgac 34<210>36<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>36atatatgaat tctttgattg atttgactgt g31<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>37tggttgatgt tatggaagat 20<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>38gacaaggtac ataaaaccca g 21<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>39gtaataaaca caccccgcg 19
权利要求
1.一种转化体，其中已导入编码具有乳酸脱氢酶活性、并且其所提供的丙酮酸底物亲和力等于或超过宿主生物体所固有的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力的外源蛋白质的DNA。
2.根据权利要求1的转化体，其中上述外源蛋白质是牛来源的乳酸脱氢酶或其同源物。
3.根据权利要求1的转化体，其中上述外源蛋白质为包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质或其同源物。
4.根据权利要求3的转化体，其中上述外源蛋白质由序列号3所示的DNA序列编码。
5.根据权利要求4的转化体，该转化体具有序列号4所示的DNA序列，用作编码上述外源蛋白质的DNA序列。
6.根据权利要求1的转化体，其中上述宿主生物体属于酵母属。
7.根据权利要求2的转化体，其中上述宿主生物体是酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。
8.根据权利要求1的转化体，其中编码上述外源蛋白质的DNA以可受到宿主染色体上丙酮酸脱羧酶基因的启动子调控或替代所述启动子的所述启动子同源物调控的方式导入。
9.根据权利要求8的转化体，其中所述外源蛋白质是牛来源乳酸脱氢酶或其同源物。
10.根据权利要求8的转化体，其中上述宿主生物体属于酵母属。
11.根据权利要求9的转化体，其中上述宿主生物体是酿酒酵母。
12.根据权利要求8的转化体，其中上述启动子是丙酮酸脱羧酶1基因的启动子。
13.根据权利要求8的转化体，其中包含序列号2所述碱基序列或其同源物的DNA用作上述启动子。
14.一种转化体，其中已导入编码具有乳酸脱氢酶活性、并且其所提供的丙酮酸底物亲和力等于或超过宿主生物体所固有的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力的外源蛋白质的DNA，其中宿主生物体为酿酒酵母，且其中编码上述外源蛋白质的DNA以可受到宿主染色体上丙酮酸脱羧酶1基因的启动子调控或替代所述启动子的所述启动子同源物调控的方式导入。
15.根据权利要求14的转化体，其中所述外源蛋白质是牛来源的乳酸脱氢酶或其同源物。
16.一种转化体，其中编码牛来源的乳酸脱氢酶或其同源物的DNA以可受到酵母属宿主染色体上丙酮酸脱羧酶1基因的启动子调控或替代所述启动子的所述启动子同源物调控的方式导入，且其中宿主染色体上丙酮酸脱羧酶1的结构基因已受到破坏。
17.根据权利要求16的转化体，其中上述宿主是酿酒酵母。
18.乳酸生产方法，该方法包括培养权利要求1所述转化体的步骤和从上述步骤获得的培养物中分离乳酸的步骤。
19.乳酸制造方法，该方法包括培养权利要求14所述转化体的步骤和从上述步骤获得的培养物中分离乳酸的步骤。
全文摘要
本发明提供了这样的转化体，所述转化体已导入编码具有乳酸脱氢酶活性且其所提供的丙酮酸底物亲和力可等于或甚至超过宿主生物体所固有的丙酮酸脱羧酶的丙酮酸底物亲和力的外源蛋白质的DNA。所述转化体可在具有丙酮酸脱羧酶基因的宿主生物体内稳定地大规模产生乳酸。
文档编号C12P7/56GK1639340SQ0380562
公开日2005年7月13日 申请日期2003年3月11日 优先权日2002年3月11日
发明者斋藤聪志, 早乙女理, 保谷典子, 松尾康生, 石田亘广, 平井正名, 今枝孝夫, 宫崎力, 德弘健郎 申请人:丰田自动车株式会社