专利名称：含有γ－谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母的制作方法
技术领域：
本发明涉及产生γ-谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母(Candidautilis)以及利用该产朊假丝酵母的食物。由此产生的γ-谷氨酰基半胱氨酸以及半胱氨酸可用于食品领域。
背景技术：
半胱氨酸被用于改善食品风味、口感等等的目的。蛋白水解法、半合成法等等均是已知的生产半胱氨酸的方法，目前主要使用的是蛋白水解法和半合成法。为了用半胱氨酸提高食品的风味和口感，需要富含半胱氨酸的天然食物原料。然而迄今为止，已知的这类天然食物原料几乎没有。同时据报道，有一种富含半胱氨酸的食物原料可通过对含有γ-谷氨酰基半胱氨酸的酵母提取物进行加热或酶处理而获得(WO00/30474)。
在酿酒酵母中，γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶以半胱氨酸和谷氨酸为底物合成γ-谷氨酰基半胱氨酸。进一步，谷胱甘肽合成酶以γ-谷氨酰基半胱氨酸和甘氨酸为底物合成出谷胱甘肽。富含γ-谷氨酰基半胱氨酸的酵母在WO00/30474；Otake et al.，Agri.Biol.Chem.，54(12)3145-3150(1999)；Chris et al.，Molecular Biology of the Cell.，8，1699-1707(1997)；Inoue et al.，Biochimica et Biophysica Acta，1395，315-320(1998)等中均有报道。然而所有报道都涉及用酿酒酵母进行的研究，并无应用产朊假丝酵母的文献报道。
产朊假丝酵母先前被归类于毕赤酵母或者汉森酵母属，但目前被归类于假丝酵母属。假丝酵母属是15个不完全酵母属中之一，这些酵母并不进行有性生殖或者未被发现进行有性生殖，并且该酵母属根据种系发生分类学的观点仅仅是一个搭顺风车(pickup)的酵母属(“Kobo Kenkyu Giho No Shintenkai”，pp.124-125(ISBN4-7622-4670-0))。假丝酵母属的酵母与酿酒酵母相比具有通常独特的特征。例如，产朊假丝酵母具有从产生吡啶碱的戊糖磷酸循环中获得能量(Biotechnology，3，30(1993)(ISBN3-527-25765-9))、弱代谢抑制(Biotechnology，3，30(1993))等等特征。进一步，由于酿酒酵母通常被用作为研究性酵母，因此有关产朊假丝酵母的发现很少。在这种情况下，没有产朊假丝酵母如何合成谷胱甘肽的报道，仅有报道称，一种利用锌抗性等获得的特异产朊假丝酵母株可在某一温度下产生大量的谷胱甘肽等，该温度比正常情况下所观察到的温度低5℃或更多(日本专利号(KOKOKU)No.03-18872)。
这样，谷胱甘肽合成酶活性与γ-谷氨酰基半胱氨酸在产朊假丝酵母中的积累之间的关联仍属未知，并且γ-谷氨酰基半胱氨酸是否可通过降低谷胱甘肽合成酶的活性而进行积累也不清楚。
发明公开据报道产朊假丝酵母的每单位糖类的生长优于酿酒酵母(Biotechnology，3，30(1993))。进一步，由于其在严格的有氧条件下并不表现出乙醇副产物(Kondo et al.(J.Bacteriology，Dec.，1995，pp.7171-7177))，因此较少需要注意其培养物中的乙醇副产物。因此，本发明的发明人认为使用富含γ-谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母所产生的酵母提取物应比使用酿酒酵母所产生的酵母提取物更为廉价并且因此而对于工业生产是优良的。
本发明通过上述观点而实现，并且本发明的一个目的在于提供富含γ-谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母、使用该酵母而产生的酵母提取物、通过使用它们而含有γ-谷氨酰基半胱氨酸或者半胱氨酸的食品以及产生这些物质的方法。
本发明的发明人为达到该目的而进行了不懈地研究。结果，他们成功地在产朊假丝酵母中实现了γ-谷氨酰基半胱氨酸的生产，方法是基于与其他生物体中的基因片段的同源性，获得预计编码产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶的基因片段，并且利用该片段降低谷胱甘肽合成酶活性。进一步，他们成功地获得了一种基因片段，该基因片段预计编码产朊假丝酵母的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶，并且由此而实现了本发明。
本发明主要提供了以下方面
(1)在最低培养基中进行培养时，处于对数生长期的干细胞中含有1％或更多γ-谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母。
(2)(1)的产朊假丝酵母，其中最低培养基为SD培养基。
(3)(1)或(2)的产朊假丝酵母，该酵母所表现出的谷胱甘肽合成酶活性为0.005微摩尔GSH/mg蛋白质/小时或者更低。
(4)(1)到(3)中任一项的产朊假丝酵母，其中编码谷胱甘肽合成酶的一种基因经修饰而使细胞内的谷胱甘肽合成酶活性被降低。
(5)(1)到(4)中任一项的产朊假丝酵母，该酵母经修饰而使编码γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的基因的表达量被降低。
(6)食品或者饮料，该食品或饮料含有通过在适当条件下培养(1)到(5)中任一项的产朊假丝酵母而获得的培养物、包含γ-谷氨酰基半胱氨酸的所述培养物的级分，或者通过热处理而产生了半胱氨酸的所述培养物或级分。
(7)(6)的食品或者饮料，其为发酵的食品调料。
(8)通过使用在适当条件下培养(1)到(5)中任何一个的产朊假丝酵母而获得的培养物所产生的酵母提取物。
(9)一种用于产生含有γ-谷氨酰基半胱氨酸或者半胱氨酸的食品的方法，该方法包括在适当条件下培养(1)到(5)中任何一个的产朊假丝酵母以及将所获得的培养物或其组分，或者经过热处理的该培养物或其组分与食品或者饮料的原材料进行混合，从而产生食品或者饮料。
(10)一种DNA，该DNA编码下文(A)或(B)所定义的蛋白质(A)具有SEQ ID NO43的氨基酸序列的蛋白；(B)具有SEQ ID NO43的氨基酸序列，并含有一个或者几个氨基酸的替换、缺失、插入或者添加的蛋白质，并且该蛋白质具有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性。
(11)(10)的DNA，该DNA为下文(a)或(b)所定义的DNA(a)一种DNA，该DNA含有SEQ ID NO42的第110到2101个核苷酸的核苷酸序列；(b)一种DNA，该DNA在严苛的条件下与含有SEQ ID NO42的第110到2101个核苷酸的核苷酸序列的DNA或者与由该核苷酸序列制备的探针进行杂交，并且该DNA编码有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的蛋白。
附图简述附图简述
图1所示为用于产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶基因破坏盒(disruption cassette)的构建(前半部分)。
图2所示为用于产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶基因破坏盒的构建(后半部分)。
图3所示为用于产朊假丝酵母的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因替换盒(substitution cassette)的构建。
图4所示为经过γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因取代的产朊假丝酵母菌株的构建。
图5所示为来自产朊假丝酵母的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶类似物的表达载体的构建。
实施本发明的最佳模式下面将对本发明进行详细描述。
<1>本发明的产朊假丝酵母本发明的产朊假丝酵母在最低培养基中进行培养时，处于对数生长期的干细胞中含有重量比1％或更高的γ-谷氨酰基半胱氨酸，在优选的情况下重量比1.5％或者更高，更为优选的情况下重量比2.0％或者更高。
至于最低培养基，可以是SD培养基，该培养基含有下列成分。
葡萄糖2％氮源(nitrogen base)1倍浓度(10倍浓度的氮源通过将1.7克BactoYeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco)与5克硫酸铵进行混合并将该混合物溶于100ml无菌水中，将该溶液调节至pH约5.2并经过滤灭菌而获得)
术语“对数生长期”指的是一段时期，该时期内培养基中的细胞数量相对培养时间呈对数增加。尽管该培养物可为振荡培养物或者静止培养物，但是振荡培养物较为优选。
γ-谷氨酰基半胱氨酸的含量是根据干酵母细胞重量即细胞固体成分的γ-谷氨酰基半胱氨酸含量(％)，例如经105℃热处理4小时的细胞。
前述的γ-谷氨酰基半胱氨酸含量无须在整个对数生长期进行维持，上述数值在该对数生长期的任何一点出现便足够了，在优选的情况下出现在下列状态下的对数生长期。即，上述状态为一种对数生长期，在该状态下该培养物肉汤所表现的吸光度高于紧随对数生长期之后的静止期的培养物肉汤的吸光度的一半。
本发明的产朊假丝酵母在优选的情况下表现出0.005μmolGSH/mg蛋白/小时或更低的谷胱甘肽合成酶活性，更为优选的情况下表现出0.001μmol GSH/mg蛋白/小时或更低(“GSH”为谷胱甘肽)。进一步优选的情况下该谷胱甘肽合成酶活性应低于检出限定。该谷胱甘肽合成酶活性可通过Gushima等人的方法进行测量(T.Gushima etal.，J.Appl.Biochem.，5，210(1983))。
本发明的产朊假丝酵母可通过对适当的产朊假丝酵母菌株(例如野生型菌株)进行修饰而获得，该修饰通过诱变处理或者基因重组技术(例如，下述出版物中公开的技术可以采用FEMS MicrobiologyLetters，165，335-340(1998)；J.Bacteriology，Dec.1995，PP.7171-7177；Curr.Genet.10(8)573-578(1986)；WO98/14600)从而使细胞内的谷胱甘肽合成酶活性被降低。谷胱甘肽合成酶活性的降低包括失去谷胱甘肽合成酶活性。进一步，含有γ-谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母还可通过对菌种进行修饰而产生，该修饰使细胞内的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性被提高。γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性可通过Jackson的方法进行测量(R.C.Jackson，Biochem.J.，111，309(1969))。
诱变处理可以是通过紫外射线照射或者使用诱变药物进行的处理，所述诱变药物被用于通常的诱变处理，例如MNNG、乙基甲磺酸盐(EMS)或者甲基甲磺酸盐(MMS)。
进一步，作为通过利用基因重组技术而降低谷胱甘肽合成酶活性的方法，可以是这样一种方法，该方法对编码谷胱甘肽合成酶的一种基因进行修饰从而使该谷胱甘肽合成酶活性被降低。编码产朊假丝酵母ATCC15239菌株谷胱甘肽合成酶的基因的一部分的核苷酸序列见SEQ ID NO17。假丝酵母属的酵母的任何谷胱甘肽合成酶基因先前不为人知。本发明的发明人检索多种生物体的谷胱甘肽合成酶的氨基酸以求高度保守的区域，并且发现了SEQ ID NO1-8的区域。随后，他们成功地扩增了一种基因片段，该片段预计编码来自产朊假丝酵母的染色体DNA的谷胱甘肽合成酶，该扩增通过使用与上述区域中的SEQ ID NO6-8的氨基酸序列对应的引物而进行。至于用于获得该基因片段的引物，可以是SEQ ID NO15和16的引物。进一步，尽管该产朊假丝酵母菌株不受特定的限制，可以提及诸如ATCC 15239这样的菌株。这一菌株可以获自American Type Culture Collection(地址10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，UnitedStates of America)。
关于修饰谷胱甘肽合成酶的编码基因以降低谷胱甘肽合成酶活性的方法，举例来说，可以提到一种方法，该方法对该基因的表达调控序列进行修饰，以使谷胱甘肽合成酶的表达量降低，或者修饰基因的编码区以使具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白不能被表达。具体来说，例如，可以用含有去除了5’-和3’-末端的突变谷胱甘肽合成酶基因的重组DNA转化产朊假丝酵母，引起染色体上野生型基因和突变基因间发生重组，以此破坏染色体上的该基因。在该方法中，如果重组DNA中预先含有可利用宿主的特点比如营养缺陷型进行选择的标记基因的话，操作会变得更加容易。进而，如果重组DNA提前通过限制性酶等消化进行线性化，可以有效地得到在染色体中转入重组DNA的株系。
进一步，将含有去除了部分谷胱甘肽合成酶基因内部区域而仅能产生功能异常的谷胱甘肽的突变基因的重组DNA导入，并且诱导该突变基因与染色体上正常基因发生重组，也可使产朊假丝酵母染色体上的基因被破坏。
在上述染色体中并入了重组DNA的株系中，在染色体上原本存在的谷胱甘肽合成酶基因发生了重组，因而野生型谷胱甘肽合成酶基因和突变型谷胱甘肽合成酶基因的两个融合基因会插入染色体将重组DNA的其它部分(载体部分和标记基因)夹在中间。因此，野生型的谷胱甘肽合成酶基因在这种状态下发挥功能。
接下来，为了在染色体DNA上仅仅留下突变型谷胱甘肽合成酶，一个拷贝的谷胱甘肽合成酶基因连同载体部分(包含标记基因)一起通过两个谷胱甘肽合成酶基因重组的方式从染色体DNA上去除。此步之后，野生型的谷胱甘肽合成酶基因留在染色体DNA上，并且突变型谷胱甘肽合成酶基因被切除，或者相反，突变型的谷胱甘肽合成酶基因留在染色体DNA上，野生型谷胱甘肽合成酶基因被切除。由于标记基因在两种情况下都会去除掉，因此第二次重组的发生可以通过标记基因相应的表型来确认。进一步，可以通过PCR扩增谷胱甘肽合成酶基并检测其结构来挑选目标基因被替换的菌株。
对于用来破坏基因的谷胱甘肽合成酶基因或者其片段，除了具有SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA外，还包括在严苛条件下可与该DNA杂交的DNA和/或与SEQ ID NO17中核苷酸序列有90％或更多的同源性的DNA，优选的情况下95％或更多同源性，更优选的情况下99％或更多的同源性。严苛条件的例子如一种实验条件，该条件下DNA间以对应于Southern杂交洗涤的盐浓度条件进行杂交，该盐浓度为1×SSC，0.1％SDS，优选的情况下为0.1×SSC，0.1％SDS，60℃。
酿酒酵母谷胱甘肽合成酶基因的破坏披露于WO00/30474中。将重组DNA导入产朊假丝酵母的方法的实例包括电穿孔法(Luis et al.，FEMS Microbiology Letters，165，335-340(1998))。
谷胱甘肽合成酶活性有所降低的菌株可利用对甲基乙二醛敏感性作为表型进行筛选(Y.Ohtake et al.，Agri.Biol.Chem.，54(12)3145-3150(1990))。可合成一定量的谷胱甘肽的菌株(具有谷胱甘肽合成酶活性和γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的菌株)对甲基乙二醛表现出抗性。进一步，谷胱甘肽合成酶活性的降低也可以通过检测在不含有谷胱甘肽的培养基中的生长状态来确定。进一步，谷胱甘肽合成酶活性有所降低的株系可以利用MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)浓度梯度平板有效地得到。
谷胱甘肽合成酶活性的降低可按照以下例子而进行证实。将一张滤纸置于一个YPD琼脂平板的中央，并且将1mg MNNG溶于30μlDMSO的全部溶液浸过该滤纸以制备一种NMMG浓度梯度琼脂培养基，该培养基中离该中心点越远NMGG浓度越低。将在该YPD培养基上培养的酿酒酵母的单倍体Nα1菌株和Nα3菌株扩布于上述琼脂培养基中。在30℃下培养70个小时，测量从该琼脂培养基中心到酵母形成菌落的位置的距离。结果，对于Nα1该距离为2.3cm，，对于Nα3该距离为1.8cm。Nα3菌株通过以Nα1菌株作为亲本株进行修饰而获得，该修饰使从谷胱甘肽合成酶的第370精氨酸残基开始之后的序列被缺失。因此，Nα3的特征在于具有减弱的谷胱甘肽合成酶并且仅仅含有痕量的谷胱甘肽。
本发明的产朊假丝酵母除降低了谷胱甘肽合成酶活性之外可能具有增强的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性。γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的增强可通过向产朊假丝酵母引入可表达形式的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因来实现。γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的实例包括如来自酿酒酵母的基因以及来自产朊假丝酵母的基因，这些将在后文描述。
将γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因引入产朊假丝酵母的方法的实例包括，举例来说，用含有该基因和产朊假丝酵母染色体上存在的一段DNA序列的重组DNA转化产朊假丝酵母，将该重组DNA引入染色体(Kondo，K.et al.，J.Bacteriol.，1995，177，p7171-7177)。具体来说，该引入可以用与前述基因替换相同的方式来进行。
进一步，也可以利用含有存在于染色体DNA上的自主复制序列(ARS)的质粒来将目的基因引入产朊假丝酵母。产朊假丝酵母的ARS及利用它进行的转化在国际专利出版物WO95/32289中有所描述。
关于转化产朊假丝酵母的方法，可以使用转化酵母的常用方法，例如原生质体法、KU法(H.Ito et al.，J.Bacteriol.，153-163(1983))、KUR法(Hakko to Kogyo(Fermentation and Industry)，43，630-637(1985))以及电穿孔法。进一步，对酵母孢子形成的操作、单倍体酵母的分离等等在“Chemistry and Biology，Experiment Line，vol.31，Experimental Techniques for Yeast”，第一版，Hirokawa Shoten，“Biomanual Series 10，Genetic Experiment Using Yeast”，第一版，Yodosha等等中有所描述。
进一步，用于在产朊假丝酵母中增强该γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的方法的例子包括，用一种强转录启动子替换染色体上的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的启动子(Y.Ohtake et al.，Bioscience andIndustry，50(10)989-994(1992))的方法。
<2>假丝酵母的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因本发明的DNA为一种编码由以下(A)或(B)定义的蛋白质的DNA(A)一种具有SEQ ID NO43的氨基酸序列的蛋白；(B)一种具有SEQ ID NO43的氨基酸序列并且具有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的蛋白，该序列中包括有一个或者几个氨基酸的替换、缺失、插入或者添加。
术语“γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性”指的是一种催化反应的活性，该反应由半胱氨酸和谷氨酸产生了γ-谷氨酰基半胱氨酸。
由本发明的DNA所编码的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶可在SEQID NO43的氨基酸序列的的一个或者多个位点，只要上述的酶活性未被削弱即可。尽管“几个”氨基酸的数目在此根据氨基酸残基在该蛋白质的三维结构中的位置或者类型有所不同，但该数目具体可为2到15，在优选的情况下可为2到8，更为优选的情况下可为2到5。
编码基本上与上述γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶相同的蛋白质的一种DNA可通过对该核苷酸进行修饰而获得，例如，该修饰通过点突变而进行从而使一个特定位点的氨基酸残基包含有替换、缺失、插入、添加或者倒位。进一步，根据上文进行了修饰的这样一种DNA还可以通过已知的诱变处理而获得。该诱变处理的例子包括一种在体外使用羟胺等等处理DNA的方法，还包括使用紫外线照射或者诱变常用的诱变药物对含有编码γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的DNA的微生物体进行处理的方法，该微生物体的例子如埃希氏菌属，该诱变药物的例子如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NG)或EMS。
进一步，上述的氨基酸残基替换、缺失、插入、添加、倒位等等包括天然发生的突变(突变或者变动)，例如，由于含有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的产朊假丝酵母菌株的差异所造成的突变。
编码基本上与γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶相同的蛋白质的DNA可通过在酿酒酵母等等的适当细胞中对具有上述的突变的DNA进行表达，并且在该细胞内检测γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性而获得。进一步，编码基本上与γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶相同的蛋白质的DNA还可以通过，例如，分离一种DNA来获得，该被分离的DNA可与一种具有SEQ ID NO42或者其一部分的探针在严苛的条件下进行杂交并且编码一种蛋白质，该蛋白质具有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性，该DNA来自一种编码γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的具有突变的DNA或者来自一种含有该DNA的细胞。“严苛条件”在此是指能使所谓的特异性杂交形成而非特异杂交不能形成的条件。使用量化数值很难清楚地表述该条件。但是，举例来说，严苛条件包括这样的条件，在此条件具有高同源性的DNA相互杂交，例如，该同源性为75％或更高，优选的情况下85％或更高，更优选的情况下95％或更高，但同源性低于上述数值的DNA之间不发生杂交。更具体说，严苛条件的例子如一种实验条件，该条件下DNA间在对应于普通Southern杂交洗涤的盐浓度条件进行杂交，该盐浓度为1×SSC，0.1％SDS，优选的情况下为0.1×SSC，0.1％SDS，60℃。
关于探针，还可以使用SEQ ID NO42的核苷酸序列的一部分。这样的探针可通过PCR进行制备，该PCR使用根据SEQ ID NO42的核苷酸序列而制备的寡核苷酸作为引物并且使用含有SEQ ID NO42的核苷酸序列的DNA片段作为模板而进行。当使用长约300bp的DNA片段作为模板时，杂交中的洗涤条件组成可为，例如，2×SSC，0.1％SDS，50℃。
在上述条件下进行杂交的基因包括在其中产生一种终止密码子的基因或者由于该突变而在缺乏活性的基因。但是，这些基因可通过检测表达产物的酶活性而被选出。
具有SEQ ID NO42的核苷酸序列的DNA被证实编码了γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶，这是因为，如下文实施例所示，通过将它引入γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶有所削弱的酿酒酵母而加速了谷胱氨肽的合成。
在数据库中对SEQ ID NO42的氨基酸序列进行的同源性检索的结果显示了与酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶之间分别具有50.93％和42.88％的同源性。
<3>本发明的酵母提取物和食品或饮料以及产生这些物质的方法通过在适当的条件下培养根据上述获得的产生γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的酵母从而获得的培养物或其级分含有γ-谷氨酰基半胱氨酸。该培养物可以是含有酵母细胞的培养基液体、从该培养物得到的细胞提取物(酵母提取物)。或者，含有谷胱甘肽或γ-谷氨酰基半胱氨酸的级分可由破碎的细胞或酵母提取物获得。
由于加热含有γ-谷氨酰基半胱氨酸的前述培养物或其级分时γ-谷氨酰基半胱氨酸分解成为半胱氨酸和吡咯烷酮羧酸。因而半胱氨酸被释放出。具体地，将培养物或其级分保持在酸性或中性的含水条件下可以产生半胱氨酸，具体的是指在pH值1到7，在50到120℃下3到300小时。
进一步，也可调节含有γ-谷氨酰基半胱氨酸的培养物或其级分的pH为3到9，加入γ-谷氨酰肽解酶(γ-谷氨酰基转移酶、γ-谷氨酰基环化转移酶(glutamylcyclotransferase)、谷氨酰胺酶等)并使其在15到70摄氏度下作用于γ-谷氨酰基半胱氨酸1到300分钟，从而生产半胱氨酸。
用于该培养物的培养基并无特定限制，只要本发明的酵母有利地生长并且γ-谷氨酰基半胱氨酸被有效地产生即可。如果需要，根据酵母的特性而向该培养基中加入必需的营养物。
培养的条件、酵母提取物的制备等可以按照一般培养酵母和制备酵母提取物的方式进行。该酵母提取物可以通过使用热水从酵母细胞中提取或者通过消化酵母细胞来获得。进而，本发明的酵母提取物可以在热处理或酶作用后使用，或者是在同其它原料一起加工进入食物或饮料的时候或其后再接受热处理。
具体地，酵母提取物的热处理如下进行实施。向酵母提取物粉末中加水，混合物用盐酸调pH值到5，从而制备成浓度为2％的含水溶液。接着将溶液98℃加热180分钟。
含有γ-谷氨酰基半胱氨酸或半胱氨酸的培养物或其级分可被用于食品或者饮料的生产。该食品或者饮料的例子包括酒精饮料、面包以及发酵的食品调味料。半胱氨酸通过热处理而从γ-谷氨酰基半胱氨酸的产生可在该食品或者饮料的生产期间进行实施。进一步，在该食品或者饮料产生之前，可以对该酵母培养物或其级分进行热处理。
前述的食品或者饮料通过将一种含有γ-谷氨酰基半胱氨酸或半胱氨酸的培养物或其级分与该食品或者饮料的原材料进行混合并且将该食品或者饮料进行加工而产生。本发明的食品或饮料可以使用与常用食品或饮料相同的原材料而产生，产生的方法除使用上述培养基或者级分之外其它部分与之相似。这样的原材料包括，大米、用于制作酒精饮料的玉米淀粉等、用于制作面包的小麦面粉、糖、盐、黄油、发酵酵母等，以及用于制作发酵的食物调味品的黄豆、小麦等。进一步，酵母提取物或其浓缩物，或它们的干的产物可用作发酵的食物调味品。
实施例本发明将参考以下实施例进行更为具体的解释实施例1产生γ-谷氨酰基半胱氨酸的假丝酵母的构建<1>预计编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的基因片段的获得在30℃下，产朊假丝酵母ATCC15239菌株在试管中用YPD培养基振荡培养，利用针对酵母的Dr.GenTLE(Takara Shuzo Co.，Code9084)从细胞中回收染色体。
葡萄糖2％蛋白胨1％酵母提取物1％(pH 5.0)在酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和大鼠的谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列中筛选出如下具有高度同源性的序列(参见Chris et al.，MolecularBiology of the Cell.，8，1699-1707(1997))。
(i)QEVAVVYYR(SEQ ID NO1)(ii)GSKKIQQ(SEQ ID NO2)(iii)VLKPQREGGGNN(SEQ ID NO3)(iV)ISELGIYG(SEQ ID NO4)(V)GGVAAGF(SEQ ID NO5)根据这些氨基酸序列设计简并引物，并且使用这些简并引物进行简并PCR，引物对应于以下组对，(i)和(ii)、(i)和(iii)、(i)和(iv)、(i)和(v)、(ii)和(iii)、(ii)和(iv)、(ii)和(v)、(iii)和(iv)、(iii)和(v)、(iv)和(v)。对各个PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下预期大小的区带部分来回收DNA。进一步，尽管通过使用这些回收的DNA作为模板进行了嵌套PCR，但未获得目标片段。
随后，参照产朊假丝酵母的密码子频度而设计了与以下氨基酸序列相对应的引物。
(vi)GSKKIQQ(SEQ ID NO6)(vii)EGGGNN(SEQ ID NO7)(viii)PQREGGG(SEQ ID NO8)用对应于上文氨基酸序列(vi)的引物(GGT TCY AAG AAG ATYCAR CA，SEQ ID NO9)和相应于上文氨基酸序列(vii)的引物(CCACCA CCY TCT CTY TGT GG，SEQ ID NO10)来做PCR。采用KODDash(TOYOBO Co.，Code LDP-101)按照产品说明书进行PCR，反应条件为94℃2分钟，接着94℃1分钟、55℃(每个循环后降低0.5℃)1分钟、74℃40秒进行22个循环，并且94℃1分钟、50℃1分钟、74℃40秒再进行15次重复循环反应。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(Nusieve 3∶1琼脂糖3％，1×TAE溶液(Takara Shuzo Co.，Code F5180A))。使用溴化乙锭溶液对凝胶染色，切下100到300bp的相应区域，使用MagExtractor(TOYOBOCo.，Code NPK-601)从凝胶中回收DNA。
当用此DNA作为模板进行嵌套PCR时，设计相应于(vi)的引物(SEQ ID NO9)和相应于(viii)的引物(GTT GTT ACC ACC ACCYTC，SEQ ID NO11)，在100到300bp的相应区域内检测出3个条带。在如上的条件下进行PCR。分别切出这三个条带并从胶中回收相应DNA。每个条带的DNA都用DNA连接试剂盒DNA LigationKit Ver.2(Takara Shuzo)与pGEM-T Easy载体(Promega)连接，用来转化大肠艾希氏杆菌JM109感受态细胞(Takar Shuzo，Code9052)。得到的转化子之一预计含有一种基因片段，该基因片段预计编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶。用常规的方法检测该转化子中含有的插入核苷酸序列。
在上面描述的核苷酸序列基础上使用3’-RACE System For RapidAmplification of cDNA Ends(Gibco BRL，目录号18373-027)进行cDNA的3’快速扩增(RACE)。cDNA初始链通过使用Rneasy Mini Kit(QIAGEN Co.，Cat.No.74104)从产朊假丝酵母中制备的mRNA中制得，并且进行三次PCR。所使用的引物如下所示。
第一次PCRAAG ATA TAC CCA TTG GAT GG(SEQ ID NO12)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRTCA GAT CTT GGT AAA GAG GC(SEQ ID NO13)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRAGA CTG GCA TTT GAG TCT CC(SEQ ID NO14)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物根据产品说明书使用KOD Dash(TOYOBO，Code LDP-101)进行PCR，反应条件为94℃2分钟反应，随后的反应94℃1分钟、50℃30秒、以及74℃40秒进行30个循环。
将PCR产物连接到pGEM-T Easy载体以转化大肠杆菌。分析所得转化子中插入的核苷酸序列以获取预计编码产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的基因片段的信息。
根据上述操作所获得的信息设计引物(GGT TCT AAG AAG ATTCAG CA，SEQ ID NO15以及CCC TCG GAA AAG GAG ACG AAGG，SEQ ID NO16)，使用从产朊假丝酵母菌株ATCC15239中回收的染色体DNA作为模板进行PCR，并且测定该扩增产物的核苷酸序列。PCR通过根据说明书使用Pyrobest(Takara Shuzo，code R0005A)进行，条件为首先进行98℃2分钟的反应，随后进行的反应为98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟重复40个循环。结果见SEQ ID NO17。谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列预计由SEQ ID NO18所示的核苷酸序列编码。
<2>用于产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶的基因破坏盒的产生通过使用产朊假丝酵母菌株ATCC15239的染色体DNA作为模板以及使用上述SEQ ID NO15和16的引物进行了PCR。PCR通过根据说明书使用Pyrobest(Takara Shuzo)进行，条件为首先进行98℃2分钟的反应，随后进行的反应为98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟重复40个循环。
使用QIA Quick PCR Purification试剂盒(QIAGEN，目录号28106)纯化扩增产物，并且在末端对该扩增产物添加腺苷酸并且降至连接进入pGEM-T Esay载体。腺苷酸的添加使用AmpliTaq(ABI，Code N808-0161)以2.5mM dATP代替dNTP通过72℃下10分钟的反应进行。随后，被克隆片段的两个位点处的核苷酸序列通过位点特异性重组而被置换，该重组使用QuickChange Site-DirectedMutagenesis试剂盒(STRATAGENE，目录号200518)进行，从而引入了HindIII和KpnI消化位点并且由此而获得了CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy载体。用于位点特异的重组的引物如下所示。
GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C(SEQ ID NO19)G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC(SEQ ID NO20)[突变的第二次导入(导入KpnI酶切位点)]CGA CCA ATC GAC TGG TAC CGT TAT CAA AAA CTC TG(SEQ ID NO21)CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG(SEQ ID NO22)进一步，使用产朊假丝酵母AATCC15239的染色体DNA为模板用如下引物进行PCR来扩增含有URA3基因的片段。依照产品说明书使用KOD Dash(TOYOBO，Code LDP-101)进行PCR，反应条件为首先进行94℃2分钟的反应，随后的反应为94℃1分钟、54℃30秒以及74℃40秒重复30个循环。
CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC(SEQ IDNO23)GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC(SEQ IDNO24)扩增的产物被引入pGEM-T Easy载体从而获得CURA3/pGEMT-Easy载体。CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy载体和CURA3/pGEMT Easy载体均用HindIII和KpnI进行消化。从CGSH2Ctermi/pGEMT-Easy载体制得含有CGSH2和pGEMT-Easy主要部分的片段，从CURA3/pGEMT-Easy载体制得含有CURA3的片段。将所回收的的片段相互连接并用来转化大肠艾希氏杆菌JM109感受态细胞。由此产生CURA3ΔCGSH2/pGEMT-Easy载体。
以限制酶NotI消化过的CURA3ΔCGSH2/pGEMT-Easy载体为模板用SEQ ID NO15及SEQ ID NO16的引物进行PCR。由此产生了产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶的基因破坏盒(图1和2)。
<3>产生γ-谷氨酰基半胱氨酸的尿嘧啶营养缺陷型产朊假丝酵母ATCC15239ura-菌株的获得用常规的方式获得ATCC15239ura-菌株，一种来源于ATCC15239的尿嘧啶营养缺陷型菌株(Luis等的技术，参考FEMS MicrobiologyLetters 165，335-340(1998))。由于ATCC15239 ura-如下述被URA3基因补足(complemented)，预计该菌株是ura3突变体。
<4>来源于产朊假丝酵母的产γ-谷氨酰基半胱氨酸酵母(ATCC15239Δgsh2菌株)的获得首先，在30℃下，将ATCC15239 ura-菌株在试管中用YPD培养基振荡培养过夜。将培养产物接种到摇瓶中的YPD培养基里(500ml的sakaguchi瓶加50ml培养基)并在30℃下振摇培养。在对数生长期收集细胞并用冷却到4℃的1M山梨醇溶液洗涤三次。洗过的细胞混悬在冷却的1M山梨醇溶液中。向悬浮液中加入50μl(2μg)的谷胱甘肽合成酶基因破坏盒，在0.2cm槽中混匀并用Gene Pulser System(BioRad)在电阻为200Ω、电容125μF、设定电压1.5kV条件下进行电转。向该槽中倒入1ml冷却的1M山梨醇溶液，将该槽冰浴10分钟。将细胞悬浮液涂在SD平板上30℃下作为静止培养物进行培养。
将在平板上生长的菌株扩增于SD平板和含有10mM甲基乙二醛的SD平板上并且在30℃下培养。筛选出7株对甲基乙二醛敏感的菌株。这7个菌株均在30℃下在YPD培养基试管中振摇培养过夜。将2％培养液接种到SD培养基(500ml的sakaguchi瓶加50ml培养基)并在30℃下振摇培养。在对数生长期收集细胞并用无菌水洗涤两次。洗过的细胞用70℃热水抽提10分钟并用HPLC对从酵母细胞中提取到的γ-谷氨酰半胱氨酸进行分离和定量。进而，将含有一定量的培养基的经洗涤的酵母细胞置于滤纸上，随后105℃加热4小时，称量剩余细胞的重量作为酵母细胞干重。这样，ATCC15239Δgsh2细胞株可作为产朊假丝酵母中γ-谷氨酰半胱氨酸含量占酵母细胞干重1％或更多的菌株而获得。
将ATCC15239Δgsh2菌株接种到SD培养基中并在30℃下振荡培养两天。向SD培养基中接种终浓度为2％的培养物并在30℃下振摇培养。在7小时和9小时后测得的γ-谷氨酰半胱氨酸含量分别为1.08％和1.12％。谷胱甘肽含量低于可检测的最低限。
<5>ATCC15239Δgsh2菌株谷胱甘肽合成酶活性的测定将ATCC15239Δgsh2菌株接种到YPD培养基中并在30℃下振摇培养。接种终浓度为2％的所得的培养物到SD培养基(2升锥形瓶加400ml)中并在30℃下振荡培养。在对数生长期搜集细胞并用冷却到4℃的1M山梨醇溶液洗涤两次。将洗后的细胞悬浮于0.5ml含有0.1mM苯甲磺酰氟(PMSF)的10mM Tris-HCL缓冲液(pH7.5)。向悬浮液中加入玻璃珠(425-600微米酸洗玻璃珠(SIGMA，Code G-8772))，用玻璃珠搅拌器(WAKENYAKU)破碎细胞。在显微镜下确认细胞的破碎。随后加入1ml上述的缓冲液，玻璃珠和细胞碎片通过离心的方法除去。这样就得到了细胞的粗提物。使用ULTRAFREE-15Biomax 10(MILLIPORE，目录号No.UFV2BGC40)纯化细胞粗提物从而得到酶溶液。采用Bradford法对所得酶溶液中的蛋白进行定量。使用Protein Assay CBB Solution(Nakarai，Code29449-15))进行显色，并测量595nm处的吸收值。使用AlbuminStandard(PIERCE Co.，No.23210)产生标准曲线。
根据上文而获得的酶溶液中的谷胱甘肽合成酶活性根据Gushima等的如下方法(T.Gushima et al.，J.Appl.Biochem.，5，210(1983))进行测定。
100mM γ-谷氨酰半胱氨酸100μl100mM MgCl2100μl50mM ATP 100μl100mM Gly 100μl1M Tris-HCl(pH 8.0)85.5μl160mM PEP 12.5μl1mg/ml PK 2μl酶溶液(1到10mg蛋白)纯水总计 2mlPEP磷酸烯醇式丙酮酸(SIGMA，Code P-7127)PK丙酮酸激酶(SIGMA，Code P-1903)在蛋白含量为1到10mg的酶存在的情况下，使具有如上组分的反应混合物在30℃下反应0到2小时。向反应混合物中加入1/5当量的甲基丙酸烯以终止反应，随即调pH值到8.0，测定生成的GSH含量。这时酶的活性低于可检测的下限而并未检测到。
随后，用类似方法检测ATCC15239Δgsh2菌株的亲代ATCC15239菌株的谷胱甘肽合成酶活性。结果ATCC15239株系的谷胱甘肽合成酶活性测定为0.383μmol-GSH/mg蛋白/小时。
实施例2γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的获得以下显示了高度同源性的序列选自酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Ohtake et al.，Yeast，7(9)953-961(Dec.，1991)；Mutoh et al.，J.Biochem.(Tokyo)，117(2)283-288(Feb.，1995))。
(i)MGFGMG(SEQ ID NO25)
(ii)GWRVEFR(SEQ ID NO26)根据各个氨基酸序列设计简并引物并和进行简并PCR。引物F1(ATG GGN TTY GGN ATG GG SEQ ID NO，ID NO27)被设计作为对应于(i)中区域的引物，引物R1(RAA YTC NAC NCK CCA，SEQ ID NO27)被设计作为对应于(ii)中区域的引物。根据产品说明书使用KOD Dash(TOYOBO，Code LDP-101)作为DNA聚合酶进行PCR，反应条件为94℃3分钟反应，随后的反应94℃1分钟、52℃1分钟、以及74℃1分钟重复30个循环。
对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将对应于预期大小的约700bp的区带切下，并使用MagExtractor(TOYOBO，Code NPK-601)从凝胶中回收DNA。
进一步，使用该回收DNA作为模板进行了嵌套PCR。根据上述方式进行PCR。对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并使用溴化乙锭溶液进行染色，切下约700bp的区带并使用MagExtractor从该凝胶中回收DNA。将该回收DNA用DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo)与pGEM-T Easy载体(Promega)连接，并用来转化大肠艾希氏杆菌JM109感受态细胞。所获得的转化子中之一被认为含有预计编码产朊假丝酵母的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的基因片段。该转化子所含的插入物的核苷酸序列通过传统方式进行测定。
根据上文测定的核苷酸序列使用3’-RACE System For RapidAmplification of cDNA Ends(Gibco BRL)进行cDNA的3’RACE。cDNA初始链通过使用Rneasy Mini Kit(QIAGEN Co.，Cat.No.74104)从产朊假丝酵母中制备的mRNA中制得，并且进行三次PCR。
所使用的引物如下所示。
第一次PCRTGA ACA GAG CTC GTT ACC TC(SEQ ID NO29)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRTCA TGG GCT AAT TTT GCA CC(SEQ ID NO30)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRTTC CTA GCA TTG ACG GCA GC(SEQ ID NO31)和3’RACE试剂盒附带的AUAP引物根据产品说明书使用KOD Dash进行PCR，反应条件为94℃2分钟反应，随后的反应94℃1分钟、50℃30秒、以及74℃40秒重复30个循环。将该PCR产物连接到pGEM-T Easy载体以转化大肠杆菌。分析所得转化子中插入物的核苷酸序列以获取预计含有产朊假丝酵母γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的基因片段的信息。
随后根据前述核苷酸序列进行5’RACE。所使用的试剂盒为5’-RACE System For Rapid Amplification of cDNA Ends Reagent AssemblyVersion 2.0(Gibco BRL)。
下文所示为用于制备cDNA初始链的的RT(反转录)的引物。
AGC ACC AGA AAT GAC GTT C(SEQ ID NO32)使用根据说明书构建的cDNA文库以及下列引物进行3次PCR。根据产品说明书使用KOD Dash进行PCR，反应条件为94℃2分钟反应，随后的反应94℃1分钟、50℃30秒、以及74℃40秒进行30个循环。
所使用的引物如下所示。
第一次PCRCCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG(SEQ ID NO33)和试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRGTC AGC TAA GTG GCC TTT G(SEQ ID NO34)和试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRCAC TGG CGC TGC TGC CGT C(SEQ ID NO35)和试剂盒附带的AUAP引物将该PCR产物连接到pGEM-T Easy载体以转化大肠杆菌。分析所得转化子中插入物的核苷酸序列以获取预计含有产朊假丝酵母γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的基因片段的信息。根据其它生物体的这些基因的同源性认为未克隆出全部长度，并且进一步实施了5’RACE。
下文所示为用于制备cDNA初始链的的RT的引物。
TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT(SEQ ID NO36)使用根据说明书构建的cDNA文库进行3次PCR。
所使用的引物如下所示。
第一次PCRCTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC(SEQ ID NO37)和试剂盒附带的AUAP引物第二次PCRCAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG(SEQ ID NO38)和试剂盒附带的AUAP引物第三次PCRAGC CAG CGG TGT CGC CTC(SEQ ID NO39)和试剂盒附带的AUAP引物将该PCR产物连接到pGEM-T Easy载体以转化大肠杆菌。分析所得转化子中插入物的核苷酸序列以获取预计含有产朊假丝酵母γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的基因片段的信息。
根据如上所述获得的信息设计引物，进行PCR并且测定扩增产物的核苷酸序列。PCR通过根据说明书使用Pyrobest(Takara Shuzo)进行，条件为首先进行98℃2分钟的反应，随后进行的反应为98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟重复40个循环。
所使用的引物如下所示。
引物F2GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG(SEQ ID NO40)引物R2AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT(SEQ ID NO41)如上所述扩增出的PCR产物的核苷酸序列使用传统方法进行测定。结果示于SEQ ID NO42。进一步，预计由该核苷酸序列所编码的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO43。由此获得了产朊假丝酵母γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的同源物。
实施例3γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因在酿酒酵母中的表达<1>具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的酿酒酵母关于具有降低的谷胱甘肽合成酶活性的酿酒酵母，所使用的为在国际专利出版物WO01/90310中所描述的酿酒酵母Nα3菌株。
该Nα3菌株是作为一种削弱的谷胱甘肽合成酶基因取代菌株而被构建的，该构建通过使用酿酒酵母Nα1菌株(国际专利出版物WO01/90310中所描述)作为亲代菌株而进行，该Nα1菌株是一种单倍体的尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母。
<2>具有降低的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的酿酒酵母的获得(1)GSH1基因替换盒的产生首先，以前述Nα1菌株染色体DNA为模板进行PCR以扩增γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因中部区域到3’末端的片段(SEQ IDNO44)。根据产品说明书使用KOD Dash(TOYOBO)进行PCR，反应混合物组成见下文，反应条件为94℃进行1分钟反应，随后94℃ 30秒、60℃ 40秒、74℃ 1分钟重复30个循环。引物采用GF1(gtg gacgac cgt act ccg aag，SEQ ID NO46)和GR1(acc caa atc gat aat gtc aac，SEQ ID NO47)。
如上所述扩增得到的GSH1基因片段根据产品说明书与质粒pGEM-T Easy(Promega)相连得到GSH1dash/pGEM。
随后，通过定点突变用终止密码子替代GSH1dash/pGEM所含的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因(SEQ ID NO44)对应于第372和373位氨基酸，即丝氨酸和赖氨酸的密码子。该操作使用Quick ChangeSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE)根据产品的使用方案来进行。引物为QCF1(ctt ttc ttg ggt ggg tag taa ttt ttc aat agg act，SEQID NO48)和QCR1(agt cct att gaa aaa tta cta ccc acc caa gaa aag，SEQID NO49)。这样得到了GSH1Mdash/pGEM质粒。
如上所述引入的突变γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶具有弱酶活性(减弱的谷胱甘肽合成酶，国际专利出版物WO01/90310)。
随后，国际专利出版物WO01/90310中描述的质粒pYES2dash(通过从质粒pYES2(Invitrogen)中去除2μori获得的质粒)和上述GSH1Mdash/pGEM质粒均用限制性酶SacI和SphI消化。从pYES2dash切得含有URA3基因的片段，从GSH1Mdash/pGEM切得含有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶部分基因序列的区域，将它们连接制得质粒GSH1Mdash/pYES2dash。用限制性酶BbeI消化GSH1Mdash/pYES2dash得到基因替换盒(图3)。
(2)γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因取代菌株的构构建使用如上所述而产生的基因替换盒而在Nα1菌株中进行γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的取代。预培养该Nα1菌株，并且在50ml的YPD培养基中对该培养物进行亚克隆直至细胞达到对数生长期。在1M的山梨醇中悬浮培养的细胞，将其与基因替换盒进行混合并且进行电转化。在含有1mM谷胱甘肽的SDE平板上培养该转化子菌株并对生长的菌株进行筛选。通过PCR证实该基因替换盒已被引入该基因组的目标位置，并将所获得的菌株命名为Nα4中间体。随后进行以下的操作以使该染色体上仅仅留有突变的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因。在含有1mM的谷胱甘肽的YPD培养基中培养该Nα4中间体，将培养产物接种于一个含有1mM谷胱甘肽的SPFDA平板之上。对该平板上生长的菌株的谷胱甘肽合成酶基因进行测序以证实该位置上的序列已被正确地取代，并且由此而获得了Nα4菌株(图4)。
(3)在Nα4菌株中γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的削弱的证实随后，对上文所获得的Nα4菌株的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性是否被削弱进行了测定。Ohtake等人测定了通过诱变处理酿酒酵母YNN27菌株而获得的YH1细胞株中γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的活性(Agric.Biol.Chem.，54(12)3145-3150(1990))。根据此方法进行活性检测。结果是Nα4株系的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性低于可检测限度。随后在SD培养基中培养Nα4细胞株，并且简册在对数生长期的细胞中γ-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。然而，未检测到γ-谷氨酰基半胱氨酸并且谷胱甘肽浓度为0.01％。进一步，因为Nα4株系对2mM甲基乙二醛显示出敏感性，可以确认在YH1细胞株的情形下γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因已经进行了取代。
<2>源自产朊假丝酵母的γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶同源物的表达载体的构建以产朊假丝酵母染色体DNA为模板进行PCR以扩增产朊假丝酵母γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因同源物的ORF区域。根据产品说明书用Pyrobest(Takara Shuzo)进行PCR，反应条件为首先进行98℃2分钟的反应，随后的反应为98℃20秒、55℃30秒、72℃2分钟进行40个循环。使用加入了一个KpnI消化位点的N-末端引物CGS1F1(GAG TAC GGT ACC ATG GGG CTG CTA TCA TTA GGGAC，SEQ ID NO50)以及加入了一个XbaI消化位点的C-末端引物CGS1R1(CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TATC，SEQ ID NO51)在上述条件下进行PCR，并使用QIAquick PCRpurification kit纯化扩增的产物。纯化后的PCR产物以及pAUR123载体(Takar Shuzo)用限制酶KpnI和XbaI进行消化，而后互相连接并用以转化大肠杆菌JM109感受态细胞。由此制得CGSH1/pAUR123载体。随后，用限制酶BamHI消化CGSH1/pAUR123载体和pYES2载体。由CGSH1/pAUR123载体得到一段含有CGSH1的ORF和源自pAUR123载体的启动子的区域，该区域与pYES2载体进行连接并且用来转化大肠杆菌JM109感受态细胞，该pYES2载体的消化末端被去磷酸化。由此而产生了产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶同源物的表达载体CGSH1/pYES2载体(图5)。
<3>互补(complementation)测试随后将CGSH1/pYES2载体导入Nα3菌株和Nα4菌株而获得转化子。预先培养Nα3菌株和Nα4菌株并亚克隆于50ml的液体培养基中(含1mM谷胱甘肽的YPD培养基)直到细胞到达对数生长期。培养的细胞混悬在1M山梨醇中，与CGSH1/pYES2载体混合并进行电转化。将转化的菌株在含1mM谷胱甘肽的SD平板上培养，选出生长的菌株。Nα3细胞株和Nα4细胞株表现为尿嘧啶营养缺陷型并且只有当含有CGSH1/pYES2载体时才能在该SD培养基中生长。得到的转化子通过传统的方法被确认含有CGSH1/pYES2载体。
由此而获得了转化子Nα3/CGSH1菌株和Nα4/CGSH1菌株。Nα3/CGSH1对2mM甲基乙二醛显示出敏感性，然而Nα4/CGSH1株系对2mM甲基乙二醛不显示出敏感性。进一步，当在SD培养基中时，Nα3/CGSH1菌株在对数生长期几乎不含谷胱甘肽，而Nα4/CGSH1菌株在对数生长期含0.4％的谷胱甘肽。Nα3株系的谷胱甘肽合成能力降低是由于酿酒酵母谷胱甘肽合成酶发生的突变，而Nα4株系的谷胱甘肽合成能力降低是由于酿酒酵母γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶发生的突变。因此证明了CGSH1与酿酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶互补。
工业应用本发明提供了富含γ-谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母。通过使用本发明的产朊假丝酵母，可以低成本地生产可用来改善食物的风味、味道等等的酵母提取物。
序列表<110>味之素公司<120>含有γ-谷氨酰基半胱氨酸的产朊假丝酵母<130>C075MKOP1520<140>
<141>2003-03-26<150>JP 2002-85058<151>2002-03-26<160>51<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<400>1Gln Glu Val Ala Val Val Tyr Tyr Arg1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<400>2Gly Ser Lys Lys Ile Gln Gln1 5<210>3<211>12
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<223>人工序列描述共有序列<400>3Val Leu Lys Pro Gln Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn1 5 10<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<400>4Ile Ser Glu Leu Gly Ile Tyr Gly1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<400>5Gly Gly Val Ala Ala Gly Phe1 5<210>6<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
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70 75 80ctg gca cag ttg tct gtg gac aat gat ctc aac ttc cac ccg gaa tat406Leu Ala Gln Leu Ser Val Asp Asn Asp Leu Asn Phe His Pro Glu Tyr85 90 95ggc cgc ttc atg ctg gag gcg aca ccg ctg gct ccg tac aac ggt gat454Gly Arg Phe Met Leu Glu Ala Thr Pro Leu Ala Pro Tyr Asn Gly Asp100 105 110 115tcg ctg gag aac tac ttg tac gtg gag agg aac atg aac agc aga aga502Ser Leu Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Glu Arg Asn Met Asn Ser Arg Arg120 125 130tca gtg gcg cag act gcg att gct gac ggc acc atc aag ccg ttg acc550Ser Val Ala Gln Thr Ala Ile Ala Asp Gly Thr Ile Lys Pro Leu Thr135 140 145ata acg gtg tac cca ttg atg ggc atc aac acc ttc acc ttc cca tca598Ile Thr Val Tyr Pro Leu Met Gly Ile Asn Thr Phe Thr Phe Pro Ser150 155 160gcg gtg gct aac ggc gag gca tca caa tcg ctg ttc tta ccg gat gag646Ala Val Ala Asn Gly Glu Ala Ser Gln Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu165 170 175atc atc aac aga cat gcg aga ttc cca aca ttg acg gcc aac att cgg694Ile Ile Asn Arg His Ala Arg Phe Pro Thr Leu Thr Ala Asn Ile Arg180 185 190 195aaa cgc cgt ggt gag aag gtg gcc atc aac gta ccg ctc tac aag gat742Lys Arg Arg Gly Glu Lys Val Ala Ile Asn Val Pro Leu Tyr Lys Asp200 205 210aca aat acg tta tcc att gac gag tca att cca aag gga cgc tcc ctg790Thr Asn Thr Leu Ser Ile Asp Glu Ser Ile Pro Lys Gly Arg Ser Leu215 220 225ttc aag cac gac gaa gaa cca gag ctc ggt gca gca ctg cca ggg cat838Phe Lys His Asp Glu Glu Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Pro Gly His230 235 240ata tac atg gac tcc atg gga ttc ggt atg gga tgc tca tgt cta caa886Ile Tyr Met Asp Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gln245 250 255gta aca gtg caa gca cca aac ttg aac aga gct cgt tac ctc tat gat934Val Thr Val Gln Ala Pro Asn Leu Asn Arg Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp260 265 270 275tca tgg gct aat ttt gca cca ttg ttc cta gca ttg acg gca gca gcg982Ser Trp Ala Asn Phe Ala Pro Leu Phe Leu Ala Leu Thr Ala Ala Ala280 285 290cca gtg ttc aaa ggc cac tta gct gac cag gat gtc aga tgg aac gtc1030Pro Val Phe Lys Gly His Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg Trp Asn Val295 300 305att tct ggt gct gtt gat gat cgt act gcc tac gag cgt gat gtt aag1078
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att gtc aat ggc tgc gat agc ttt atc gga ttg atg gca ctt gtg aag1798Ile Val Asn Gly Cys Asp Ser Phe Ile Gly Leu Met Ala Leu Val Lys550 555 560aag cac ttg gaa tct cgc ttt gga att act ggt gac gac tta tcg cca1846Lys His Leu Glu Ser Arg Phe Gly Ile Thr Gly Asp Asp Leu Ser Pro565 570 575aag ggt aca cac gct agg atc tac tac tac ttg gaa ttg atc tcc aag1894Lys Gly Thr His Ala Arg Ile Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu Ile Ser Lys580 585 590 595aga gcc agt ggc gag cta cca act gct gct aaa ttc ata aga agg ttc1942Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe Ile Arg Arg Phe600 605 610ttg ctc gac cat aag gac tat caa cac gac tcc aaa ata act gct aga1990Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gln His Asp Ser Lys Ile Thr Ala Arg615 620 625atg aat tac gat ttg ttg aac acg ttg aat agc att tca gaa ctt ggc2038Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr Leu Asn Ser Ile Ser Glu Leu Gly630 635 640gaa gat gtt aga cag ttg ttg ggt gat gac att ggc aac tac ttg ata2086Glu Asp Val Arg Gln Leu Leu Gly Asp Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Ile645 650 655aac aac cca aag gct taatgacact aagggggagg aaactcgcca ttttgcatat2141Asn Asn Pro Lys Ala660aaacatagac aacgtcctat acagtattta attataaaag agttcagctc gtgatatcga 2201tggatatgac gaccaagaca gct 2224<210>43<211>664<212>PRT<213>产朊假丝酵母<400>43Met Gly Leu Leu Ser Leu Gly Thr Pro Leu Pro Trp Glu Gln Thr Arg1 5 10 15Glu Tyr Ala Glu His Val Arg Thr Glu Gly Ile Glu Gln Leu Ile Lys20 25 30Met Phe Lys Ala Ala Tyr Ala Arg Thr Gly Asp Gly Tyr Leu Trp Gly35 40 45Asp Glu Val Glu Tyr Thr Leu Val Lys Phe Asp His Gly Arg Gly Leu50 55 60Ala Leu Leu Ser Ile Asp Lys Asp Ser Val Leu Ala Asp Leu Asn Glu65 70 75 80Gly Gly Ser Leu Ala Gln Leu Ser Val Asp Asn Asp Leu Asn Phe His
85 90 95Pro Glu Tyr Gly Arg Phe Met Leu Glu Ala Thr Pro Leu Ala Pro Tyr100 105 110Asn Gly Asp Ser Leu Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Glu Arg Asn Met Asn115 120 125Ser Arg Arg Ser Val Ala Gln Thr Ala Ile Ala Asp Gly Thr Ile Lys130 135 140Pro Leu Thr Ile Thr Val Tyr Pro Leu Met Gly Ile Asn Thr Phe Thr145 150 155 160Phe Pro Ser Ala Val Ala Asn Gly Glu Ala Ser Gln Ser Leu Phe Leu165 170 175Pro Asp Glu Ile Ile Asn Arg His Ala Arg Phe Pro Thr Leu Thr Ala180 185 190Asn Ile Arg Lys Arg Arg Gly Glu Lys Val Ala Ile Asn Val Pro Leu195 200 205Tyr Lys Asp Thr Asn Thr Leu Ser Ile Asp Glu Ser Ile Pro Lys Gly210 215 220Arg Ser Leu Phe Lys His Asp Glu Glu Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu225 230 235 240Pro Gly His Ile Tyr Met Asp Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser245 250 255Cys Leu Gln Val Thr Val Gln Ala Pro Asn Leu Asn Arg Ala Arg Tyr260 265 270Leu Tyr Asp Ser Trp Ala Asn Phe Ala Pro Leu Phe Leu Ala Leu Thr275 280 285Ala Ala Ala Pro Val Phe Lys Gly His Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg290 295 300Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala Val Asp Asp Arg Thr Ala Tyr Glu Arg305310 315 320Asp Val Lys Pro Leu His Ser Asp Gly Ala Phe Gly Gly Met Thr Asp325 330 335Glu Ala Lys Ala Arg Ala Gln Lys Ile Pro Lys Ser Arg Tyr Asp Gly340 345 350Ile Asp Ser Phe Leu Gly Asp Ile Gln Asn Asp Phe Ala Lys Asp Gly355 360 365Glu Ala Val Phe Lys Tyr Phe Ser Pro Glu Leu Asn Asp Ile Ser Pro370 375 380Pro Ile Asn Glu Arg Thr Leu Gln Arg Leu Ala Gln Glu Pro Gln Phe385 390 395 400Asp Pro Val Leu Ala Arg His Phe Ala His Leu Tyr Val Arg Asp Pro405 410 415Ile Val Ile Phe Glu Glu Arg Ile His Gln Asp Asn Asp Asp Glu Thr420 425 430Asp His Phe Glu Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Leu Arg Phe
435 440 445Lys Pro Pro Thr Gln Gln Ala Thr Pro Asp Asn Lys Ser Val Pro Gly450 455 460Trp Arg Val Glu Phe Arg Thr Met Glu Ile Gln Leu Thr Asp Phe Glu465 470 475 480Asn Ala Ala Phe Ser Ile Phe Ile Val Leu Leu Gly Gln Ala Ile Leu485 490 495Ala Thr Asp Ser Asn Trp Tyr Ile Pro Ile Ser Lys Ile Glu Asp Asn500 505 510Met Lys Arg Ala His His Arg Asp Ala Val Leu Lys Asp Lys Phe His515 520 525Phe Lys Ala Asp Ile Ser Ser Pro Ala Phe Asp Thr Val Glu Leu Ser530 535 540Leu Asp Glu Ile Val Asn Gly Cys Asp Ser Phe Ile Gly Leu Met Ala545 550 555 560Leu Val Lys Lys His Leu Glu Ser Arg Phe Gly Ile Thr Gly Asp Asp565 570 575Leu Ser Pro Lys Gly Thr His Ala Arg Ile Tyr Tyr Tyr Leu Glu Leu580 585 590Ile Ser Lys Arg Ala Ser Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Lys Phe Ile595 600 605Arg Arg Phe Leu Leu Asp His Lys Asp Tyr Gln His Asp Ser Lys Ile610 615 620Thr Ala Arg Met Asn Tyr Asp Leu Leu Asn Thr Leu Asn Ser Ile Ser625 630 635 640Glu Leu Gly Glu Asp Val Arg Gln Leu Leu Gly Asp Asp Ile Gly Asn645 650 655Tyr Leu Ile Asn Asn Pro Lys Ala660<210>44<211>2160<212>DNA<213>酿酒酵母<220>
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<400>44atg gga ctc tta gct ttg ggc acg cct ttg cag tgg ttt gag tct agg48Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gln Trp Phe Glu Ser Arg1 5 10 15
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<213>酿酒酵母<400>45Met Gly Leu Leu Ala Leu Gly Thr Pro Leu Gln Trp Phe Glu Ser Arg1 5 10 15Thr Tyr Asn Glu His Ile Arg Asp Glu Gly Ile Glu Gln Leu Leu Tyr20 25 30Ile Phe Gln Ala Ala Gly Lys Arg Asp Asn Asp Pro Leu Phe Trp Gly35 40 45Asp Glu Leu Glu Tyr Met Val Val Asp Phe Asp Asp Lys Glu Arg Asn50 55 60Ser Met Leu Asp Val Cys His Asp Lys Ile Leu Thr Glu Leu Asn Met65 70 75 80Glu Asp Ser Ser Leu Cys Glu Ala Asn Asp Val Ser Phe His Pro Glu85 90 95Tyr Gly Arg Tyr Met Leu Glu Ala Thr Pro Ala Ser Pro Tyr Leu Asn100 105 110Tyr Val Gly Ser Tyr Val Glu Val Asn Met Gln Lys Arg Arg Ala Ile115 120 125Ala Glu Tyr Lys Leu Ser Glu Tyr Ala Arg Gln Asp Ser Lys Asn Asn130 135 140Leu His Val Gly Ser Arg Ser Val Pro Leu Thr Leu Thr Val Phe Pro145 150 155 160Arg Met Gly Cys Pro Asp Phe Ile Asn Ile Lys Asp Pro Trp Asn His165 170 175Lys Ash Ala Ala Ser Arg Ser Leu Phe Leu Pro Asp Glu Val Ile Asn180 185 190Arg His Val Arg Phe Pro Asn Leu Thr Ala Ser Ile Arg Thr Arg Arg195 200 205Gly Glu Lys Val Cys Met Asn Val Pro Met Tyr Lys Asp Ile Ala Thr210 215 220Pro Glu Thr Asp Asp Ser Ile Tyr Asp Arg Asp Trp Phe Leu Pro Glu225 230 235 240Asp Lys Glu Ala Lys Leu Ala Ser Lys Pro Gly Phe Ile Tyr Met Asp245 250 255Ser Met Gly Phe Gly Met Gly Cys Ser Cys Leu Gln Val Thr Phe Gln260 265 270Ala Pro Asn Ile Asn Lys Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Ala Leu Val Asn275 280 285Phe Ala Pro Ile Met Leu Ala Phe Ser Ala Ala Ala Pro Ala Phe Lys290 295 300Gly Trp Leu Ala Asp Gln Asp Val Arg Trp Asn Val Ile Ser Gly Ala305 310 315 320
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<223>人工序列描述引物
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<223>人工序列描述引物<400>50gagtacggta ccatggggct gctatcatta gggac35<210>51<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>51cccttatcta gattaagcct ttgggttgtt tatc 3权利要求
1.产朊假丝酵母，该产朊假丝酵母在最低培养基中培养时，在对数生长期的干细胞中含有1％重量或者更多的γ-谷氨酰基半胱氨酸。
2.权利要求1的产朊假丝酵母，其中最低培养基为SD培养基。
3.权利要求1或2的产朊假丝酵母，该产朊假丝酵母表现出的谷胱甘肽合成酶活性为0.005μmol GSH/mg蛋白/小时或者更低。
4.权利要求1到3中任一项的产朊假丝酵母，其中编码谷胱甘肽合成酶的基因经修饰从而使细胞内谷胱甘肽合成酶的活性被降低。
5.权利要求1到4中任一项的产朊假丝酵母，该产朊假丝酵母经修饰从而使编码γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶的基因的表达量被提高。
6.食品或饮料，所述培养物含有通过在适当条件下培养权利要求1到5中任一项的产朊假丝酵母而获得的培养物，包含γ-谷氨酰基半胱氨酸的所述培养物级分，或者通过热处理产生了半胱氨酸的所述培养物或级分。
7.权利要求6的食品或饮料，该食品或饮料为发酵的食品调料。
8.酵母提取物，该酵母提取物通过使用在适当条件下培养权利要求1到5中任一项的产朊假丝酵母而获得的培养物所产生。
9.一种产生含有γ-谷氨酰基半胱氨酸或者半胱氨酸的食品的方法，该方法包括在适当条件下培养权利要求1到5中任一项的产朊假丝酵母，并且将所获得的培养物或其级分，或经过热处理的该培养物或其级分与食品或者饮料的原材料进行混合，从而加工食品或者饮料。
10.一种DNA，该DNA编码下述(A)或(B)所定义的蛋白质(A)一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO43的氨基酸序列；(B)一种具有SEQ ID NO43的氨基酸序列，并含有一个或者几个氨基酸的替换、缺失、插入或者添加的蛋白质，并且该蛋白质具有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性。
11.权利要求10的DNA，该DNA定义于下述(a)和(b)中(a)一种DNA，该DNA含有SEQ ID NO42的第110到2101位核苷酸的核苷酸序列；(b)一种DNA，该DNA在严苛的条件下与含有SEQ ID NO42的第110到2101位核苷酸的核苷酸序列的DNA或者由所述的核苷酸序列而制备的探针进行杂交，并且该DNA编码有γ-谷氨酰基半胱氨酸合成酶活性的蛋白质。
全文摘要
通过对产朊假丝酵母在适当的条件下进行培养并将所获得的培养物或其级分或者经热处理的培养物或其级分与食品或饮料的原材料进行混合以加工食品或饮料，从而产生了含有γ－谷氨酰基半胱氨酸或者半胱氨酸的食品，该产朊假丝酵母在最低培养基中培养时，在对数生长期的干细胞中含有1％重量或者更多的γ－谷氨酰基半胱氨酸，该产朊假丝酵母的例子如，编码谷胱甘肽基因经过修饰从而降低了细胞内谷胱甘肽合成酶活性的产朊假丝酵母。
文档编号C12N1/16GK1774505SQ03807160
公开日2006年5月17日 申请日期2003年3月26日 优先权日2002年3月26日
发明者西内博章, 西村康史, 黑田素央 申请人:味之素株式会社