专利名称：产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌生物质、特别是本文中称作″细菌提取物″的生物质作为微生物生长基质的应用，所述的细菌生物质至少部分由包括甲烷营养菌(methanotrophic bacterium)的细菌培养物衍生。
背景技术：
微生物通常以商品和实验室等级生长，例如由天然产生所需物质的细菌菌株产生这类物质或已经遗传修饰以产生这类物质或测定细菌污染物的性质等。为了这些目的，微生物需要营养物且在这方面通常使用为广泛商购的酵母、肉膏或植物提取物，例如MRS(De Mann，Rogosa和Sharpe)、PCA(平板计数琼脂)、VRBD(紫红胆汁葡萄糖琼脂)、YM琼脂(酵母霉琼脂)、Baird-Parker琼脂基质、VRB琼脂(Violet Red Bile琼脂)、XLD琼脂(木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂)、CASO(酪蛋白胨大豆蛋白胨)、TSB(胰胨豆胨琼脂培养液)和NB(营养肉汤)。酵母提取物生长基质(例如包含在MRS、VRBD、VRB琼脂、PCA、Baird-Parker琼脂基质和XLD琼脂中)商购自Merck和Difco等。通常使用来自酵母培养物的生物质产生这类酵母提取物，已经使所述的酵母培养物自溶，即酵母细胞内天然出现的酶在细胞死亡后起分解细胞的作用。酵母自溶一般是缓慢的且需要几天，此后获得适宜程度的消化。因此，起自溶起始剂或刺激剂作用的添加剂、例如硫醇试剂一般用于加速自溶过程。当然，这类添加剂的应用为酵母自溶物的商业化生产增加了成本。为了得到自溶物，可以加入额外的营养物以使特定微生物的细胞生长最优化且实际上微生物的文库寄存物(library deposit)一般指定应最适合于寄存的微生物的生长培养基。
由于不同的微生物具有不同的营养需求，所以对可选和改进的微生物生长培养基当然存在不间断的需求，特别是对使那些攻击以便在体外生长的微生物(例如乳杆菌)有效生长的培养基和对可以适用于未知微生物的″广谱″生长培养基存在不间断的需求。
目前我们已经令人意外地发现可以使用从包括甲烷营养菌的培养基中获得的生物质、例如如WO 01/60974中所述产生的生物质生产特别有效的微生物生长培养基。
发明内容
因此，从一个方面来看，本发明提供了来源于包括甲烷营养菌的细菌培养物生物质且任选含有其它营养物的无菌营养物组合物作为微生物生长培养基的应用。
用于生产生物质的细菌培养物优选为至少50％、更优选至少60％、尤其是至少70％、特别是至少75％、例如75-95％、更特别的为75-80％重量的甲烷营养菌(占总细菌重量)。
从另一个方面来看，本发明提供了培养微生物的方法，包括使微生物与其生长培养基彼此接触的步骤，其特征在于所述的生长培养基为无菌营养物组合物或由其制备，该无菌营养物组合物来源于包括甲烷营养菌的细菌培养物的生物质且任选添加了其它营养物。
从另一个方面来看，本发明提供了微生物生长基质，包括无菌营养物组合物，该组合物来源于包括甲烷营养菌的细菌培养物的生物质、进一步含有至少一种无菌营养物且任选含有稀释剂。
制备生长培养基或基质的生物质优选为从至少一个种类的甲烷营养菌和至少一个种类的异养菌中产生的生物质，例如，优选使用可提供甲烷、氧、氨和无机原料的环式反应器使所述菌生长在相同的培养基中。用于生产生物质的适宜细菌组合例如描述在WO 01/60974中，将该文献的内容引入作为参考。一种特别合适的组合为荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB11132)、Ralstonia sp.DB3(菌株NCIMB 13287)、Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)和Brevibacillus agri DB5(菌株NCIMB 13289)(这些微生物中每一种在本专利期限内均可得自Norferm DA，Norway)。
可以直接使用来自细菌培养物的生物质(不过，一般在脱水和灭菌之后)或例如可以首先将其通过匀化、水解或自溶进行处理以分解细菌细胞。这类处理描述在WO01/60974和2003年2月12日提交的国际专利申请PCT/GB03/000610和PCT/GB03/000640中，也将这些文献引入本文作为参考。(将这两篇国际专利申请的复印件也一起提交。)尽管细菌生物质的匀化物、水解产物和自溶物、尤其是干燥的匀化物且更特别的是干燥的自溶物是用于制备本发明微生物培养基的优选物质，但是也可以使用通过过滤(例如超滤)匀化、自溶或水解生物质得到的前体物质，即液体滤液自身和存留物。不过，最优选干燥的自溶物。
微生物生长培养基可以为细菌生物质产物自身或含有生物质产物和其它成分的组合物，所述的其它成分例如有液体或非液体载体或稀释剂(诸如水、凝胶(例如琼脂凝胶)或可胶凝液体)和诸如矿物、碳源(诸如糖类(例如单糖类、二糖类、寡糖类和多糖类，尤其是单糖类和二糖类))、氮源(例如硝酸盐、蛋白质或蛋白质片段、铵化合物、寡肽类、氨基酸(尤其是必需氨基酸，例如色氨酸))、核酸和核酸片段、脂类等这类物质。特别优选培养基含有葡萄糖和添加的硝酸盐和无机盐(例如钾、钙、镁、钠、钼、铁、锌、硼、钴、锰和镍化合物)，尤其是葡萄糖。所提供的组合物可以为备用或浓缩物形式的无菌固体(例如颗粒)、半固体或液体。尤其优选所提供的组合物为可以通过添加水或水胶凝剂组合物转化成生长培养基的无菌干颗粒浓缩物。
其中，该组合物含有添加的葡萄糖，以干物质为基准，其优选与生物质衍生成分的重量比为5∶1-1∶5(尤其是2∶1-1∶2)。如果该组合物含有添加的硝酸盐和无机盐，那么优选它与生物质衍生成分的重量比为0.01∶1-0.2∶1(尤其是0.05∶1-0.1∶1)。如果所提供的组合物不含添加的葡萄糖和/或无机硝酸盐，那么优选生长培养基制备包括添加上述特定重量比的这类成分中的一种或它们两种。
本发明的组合物特别适合于用作异养微生物的生长基质，尤其是异养藻类、酵母或细菌，特别是厌氧菌、诸如乳杆菌(例如植物乳芽孢杆菌、嗜酸乳芽孢杆菌)；需氧菌，诸如大肠杆菌；和藻类，诸如Crypthecodiniumcohnii。
附图简述现在参照下列非限制性实施例和附图进一步解释本发明，其中附
图1解释了在发酵罐中A)嗜酸乳芽孢杆菌和B)植物乳芽孢杆菌在MRS(-)和BP自溶物(...)上的发酵研究结果。添加25％NaOH(g)和OD620nm(就在MRS上发酵而言)-时间(小时)。
附图2解释了来自酵母提取物、BP提取物和BP自溶物上的大肠杆菌发酵研究的数据。
附图3解释了使用不同发酵的赖氨酸产量为时间的函数和添加的复合N-源的类型和用量。
具体实施例方式
实施例1生物质提取物如WO01/60974所述培养各自购自Norferm DA，Norway)的甲烷营养菌和异养菌(荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)、Ralstonia sp.DB3(菌株NCIMB 13287)、Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)和Brevibacillusagri DB5(菌株NCIMB 13289)并如WO01/60974中所述获得和处理所得生物质而产生喷雾干燥的匀化物(下文的″BPH匀化物″)、如国际专利申请PCT/GB03/000610中所述产生喷雾干燥的水解产物(下文的″BP水解产物″)且如国际专利申请PCT/GB03/000640(例如，参见实施例1)所述产生自溶物(下文的″BP提取物″)。如果不采用生产″BP提取物″中的自溶后超滤和蒸发步骤，那么产物在本文中称作″BP自溶物″。例如，在国际专利申请PCT/GB03/000640的实施例3和4中描述了这类产物的制备。称作″BP存留物″的产物为超高温处理的匀化的生物质。称作″BP渗透物″的产物基本上相当于生产″BP提取物″中超滤步骤的产物。
上述所有物质均购自Norferm DA，Norway。
通过以1g/L的浓度向软化水中添加BP匀化物、BP自溶物、BP提取物、BP残留物和BP渗透物生产微生物生长培养基。然后直接使用这些培养基或通过添加0.1g/L葡萄糖和/或32.4mL/L无机硝酸盐介质(NMS)使用。
NMS包括1.0g KNO30.2g CaCl2.2H2O1.0g MgSO4.7H2O0.1mL微量元素溶液*0.1mL钼酸钠溶液(5g/L在软化水中的NaMoO4.2H2O)0.1mL EDTA溶液(45g/L在水中的FeNaDTA.2H2O)
水-加至1L加入10mL/L无菌磷酸盐缓冲液(35.6g Na2HPO4.2H2O，26.0g KH2PO4且水加至1L)。
*6.4g ZnSO4.7H2O150mg H3BO3600mg CoSO4.7H2O130mg MnCl2100mg NiCl2.6H2O软化水加至1L所有培养基均在高压灭菌后使用。
还制备了基于琼脂的微生物生长培养基，其含有32.2g/L BP提取物20.0g/L葡萄糖34mL/LNMS培养基14.0g/L脂软水加至1L将该养基在高压灭菌后使用。
实施例2微生物生长试验使需氧和厌氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生长在使用实施例1的液体生长培养基的振摇烧瓶中并将为细菌菌株推荐的生长培养基用作对照。将培养物的光密度监测为获得细菌生长的指示剂(即具有最高细胞数量的″平稳期″或稳定期)。将结果列在下表1中。
表1
---没有BP衍生物的组合优于对照基质。
+BP衍生物的某些组合与对照基质同样好。
+++BP衍生物的某些组合明显优于对照基质。
就大肠杆菌而言，添加了葡萄糖的BP提取物显然提供了最佳生长。就植物乳芽孢杆菌而言，所有的BP提取物的组合均显著使生长最佳。就铜绿假单胞菌而言，BP提取物的所有组合均得到了最佳生长，特别是添加了葡萄糖的BP提取物。就枯草芽孢杆菌而言，添加了葡萄糖的BP提取物和既添加了葡萄糖又添加了NMS的BP提取物均显然得到了生长最佳。
实施例3未知细菌的生存力使琼脂凝胶(PCA、MRS-琼脂和含有琼脂的BP提取物(实施例1)pH6.0和7.1)与取自大量切碎的肉的未知微生物一起扩散。将培养物在25℃下保温72小时并记录总平板计数。就BP提取物而言，log(CFU/g)为5-约6.6，而就MRS而言，该值小于1。就PCA而言，log(CFU/g)约为6.7，即几乎不更高。
实施例4乳芽孢杆菌属的生存力使乳芽孢杆菌属的菌株鼠李糖乳杆菌(菌株ATCC 7469)、德氏乳杆菌亚种(菌株ATCC 7830)、发酵乳杆菌(L.fermentum)(菌株CCUG 30138)、加氏乳杆菌(菌株ATCC 19992)和植物乳芽孢杆菌(菌株ATCC 8014)生长在需氧条件下的MRS琼脂和BP提取物琼脂(实施例1)上。在所有情况中，测定为log(CFU/mL)的存活力与对BP提取物所述的相同或大于它。这一结果对德氏乳杆菌而言最为显著。还使相同的菌株生长在厌氧条件下的这些培养基上且在所有情况中，存活力也与对BP提取物所述的相同或优于它。
实施例5多不饱和脂肪酸的生产使Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky(菌株ATCC 30772)生长在包括在软化水中的9g/L葡萄糖、25g/L海盐和2g/L酵母提取物(YE)或BP提取物的培养基上。2天保温后，收集细胞并测定了总脂肪酸、细胞干重(CDW)和22∶6(二十二碳六烯酸)含量。将结果列在下表2中。
表2
表2表明CDW和多不饱和脂肪酸22∶6的百分比在使用BP提取物时较高。
实施例6乳芽孢杆菌属在含有BP自溶物的培养基中的生长在烧瓶和发酵中将乳芽孢杆菌属菌株植物乳芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌在含有被BP自溶物取代的复合成分的培养基上的生长(实施例1)与使用标准MRS-培养基上的生长进行比较。
烧瓶中的实验使乳芽孢杆菌属生长在厌氧烧瓶中以比较BP自溶物与市售的现有产品的特性。用表4中的BP自溶物取代MRS-培养基中的复合成分(参见表3)，使得总氮含量保持恒定。
表3复合培养基成分中的总氮(％)
表4复合培养基成分
发酵罐中的实验对每种菌株进行两种发酵；一种使用标准培养基MRS，而在另一种中，用BP自溶物取代MRS中的复合成分(在烧瓶实验中使用培养基CA-4)。
在厌氧烧瓶中进行的实验方法接种物将1ml接种批量的植物乳芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌用于接种80ml MRS-肉汤(Oxoid)并在37℃下保温20小时。就菌株嗜酸乳杆菌而言，将MRS-肉汤调节至pH5.5。
培养条件按照表4使用复合培养基基质，而使其它培养基成分保持恒定(表5)。将除葡萄糖外的所有成分混合并分别将pH调节至6.0和pH5.5且在121℃下高压灭菌20分钟。对葡萄糖单独进行高压灭菌。用氮气冲洗烧瓶，此后进行接种。
给两烧瓶接种并将一个用作对照。每个烧瓶使用0.5ml接种物。在37℃下分别在20小时和24小时内以100rpm给烧瓶侧向接种。分析样品的pH和CFU/ml。
表5用于在厌氧烧瓶中的实验的培养基组合物
发酵方法接种物将相同条件用作烧瓶实验将1ml接种批量的植物乳芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌用于接种80mlMRS-肉汤(Oxoid)并在37℃下保温20小时。就菌株嗜酸乳杆菌而言，将MRS-肉汤调节至pH5.5。
培养条件所有发酵实验均在7.5-LChemap发酵罐内进行。给7L批量的试验体系接种70ml接种物。按照MRS和CA-4使用复合培养基基质并保持作为烧瓶实验中的剩余成分，但将(Na)3-柠檬酸(2.40g/l)改变成(NH4)3-柠檬酸(2.00g/l)(表6)。将除葡萄糖外的所有成分混合并分别将pH调节至6.0和pH5.5且在121℃下高压灭菌20分钟。对葡萄糖单独进行高压灭菌。
发酵在37℃下进行且通过添加25％NaOH使pH保持恒定，就植物乳芽孢杆菌而言为pH5.8，而就嗜酸乳杆菌而言，为pH5.5。当终止添加NaOH时，停止发酵。注意应使混入培养基中的空气最少。分析终产物在MRS琼脂(Oxoid)上的CFU和在血液-琼脂和TSA(Difco)上的污染。
表6发酵用培养基组合物
烧瓶中的实验结果表7生产植物乳芽孢杆菌的烧瓶实验。
相应于37℃下20小时后的生长基质(g/l)、植物乳芽孢杆菌的生存力(CFU/ml)和pH的培养基组成。MRS-培养基的其它成分没有改变。将pH调节至6.0。对每次实验而言平行进行两次。
表8生产嗜酸乳杆菌的烧瓶实验。
相应于37℃下24小时后的生长基质(g/l)、嗜酸乳杆菌的生存力(CFU/ml)和pH的培养基组成。MRS-培养基的其它成分没有改变。将pH调节至5.5。对每次实验而言平行进行两次。
发酵罐中的实验结果就两种菌株而言，CFU和氢氧化钠的利用表明在含有BP自溶物的培养基上的生长等于或优于在MRS中的标准复合成分上的生长。两种菌株的发酵时间在BP自溶物上均短于在MRS上的发酵时间。将结果概括在表9和附图1中。在任何时间时均没有观察到污染。
表9在MRS上发酵的概括(使用复合培养基成分细菌用胨10(g/l)、牛肉膏10(g/l)。酵母提取物5(g/l))并用BP自溶物32(g/l)交换复合培养基成分。
结论烧瓶和发酵实验证实在包括BP自溶物的培养基上的生长至少等于标准MRS上的生长或比它改善。
实施例7用于β-半乳糖苷酶产生的大肠杆菌发酵本研究的目的在于测试可选BP自溶物作为大肠杆菌发酵中的氮源。测试BP提取物和BP自溶物(实施例1)并与标准酵母提取物进行比较。
方法将氧饱和保持在20％以上。温度为37℃且pH为6.8。开始以批量方式进行发酵并添加矿物作为50％C-源和50％N-源。在OD620为10时，在1小时期限内加入剩余的N-源。在葡萄糖浓度低于0.7gL-1时，添加葡萄糖。另外通过pH监测葡萄糖1)pH＞6.8时，葡萄糖进料增加；和2)pH＜6.75时，葡萄糖进料减少并加入NaOH。
原料1.作为葡萄糖的C-源；和2.N-源a.酵母提取物b.BP提取物c.BP自溶物(浓度为酵母提取物和BP提取物的1.5倍)。
4.5小时后，加入ITPG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)作为半乳糖苷酶的诱导物。
结果如附图2中所示且证实对三种N-源类似而言酶的产量相似。
实施例8对作为复合N-源用于超量产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌RRL B-11470菌株的BP自溶物的分析本研究的目的在于比较BP自溶物(实施例1)与大豆水解产物(Bactosoytone)作为复合N-源在通过用超量产生赖氨酸的谷氨酸棒杆菌突变体发酵的赖氨酸产量。
将在3升玻璃发酵罐与使用谷氨酸棒杆菌NRRL B-11470的1升培养基进行的发酵中的赖氨酸产量进行比较。在所有发酵中培养基组成是相同的，但复合N-源为BP自溶物或soytone(14、21或28g/升)。
结果将发酵的主要结果概括在表10中。赖氨酸产量为还在附图3中所示的发酵时间的函数。
一般来说，赖氨酸产率随复合N-源的浓度增加而增加，这可能是因为细胞浓度随添加的复合N-源增加而增加所导致的。然而，加入BP自溶物的培养物中的产率明显高于添加相同量的soytone的培养物中的产率。由于BP自溶物中的颗粒浓度较高，所以不能测定使用BP自溶物发酵中的光密度。因此，我们没有估计这些发酵中的细胞质量。然而，较高的产率可能是由于使用BP自溶物发酵中的细胞浓度高于相应使用soytone发酵中的细胞浓度所导致的。
表10使用谷氨酸棒杆菌NRRL B-11470的赖氨酸产量。发酵结果的概括。
表10
A消耗的葡萄糖。总计加入132g，但在终止发酵时，仍有7g/升。
B在本计算中考虑到了在发酵过程中的体积增加(5-15％)。
C尽管在终止发酵时对培养物的显微镜检查没有显示出培养物中存在任何污染的微生物，但是分析结果清楚地表明存在污染的微生物。不过，这些微生物看起来没有对赖氨酸产量有较大程度的影响。
E在这种发酵中，在最后的样品中测定的赖氨酸浓度低于倒数第二份样品中的浓度。这是因为Chinard法具有相当大的标准偏差。主要基于倒数第二份样品估计最终的体积产率。
最终的赖氨酸产率/单位葡萄糖在大部分发酵中基本上相同，为0.17-0.19g赖氨酸HCl/g葡萄糖，与添加的复合N-源的类型和量无关。可能的情况是，在使用21g/升添加的BP自溶物中的发酵，产率稍高，0.21-0.22g赖氨酸HCl/g葡萄糖。
结论发酵研究显然证实BP自溶物是soytone的另一种良好的选择且看起来在发酵罐中的产率方面优于soytone。产率增加可能是使用BP自溶物的发酵中的细胞浓度高于使用相同量的soytone的发酵中的细胞浓度导致的。对其原因尚不了解，但可能的情况是BP自溶物因其细菌来源而对细胞生长要求在诸如核糖核酸、细胞壁构成成分、脂类等这类成分方面的适应性上优于soytone。
权利要求
1.来源于包括甲烷营养菌的细菌培养物的生物质且任选含有其它营养物的无菌营养物组合物作为微生物生长培养基的应用。
2.培养微生物的方法，包括使微生物与其生长培养基彼此接触的步骤，其特征在于所述的生长培养基为无菌营养物组合物或由其制备，该无菌营养物组合物来源于包括甲烷营养菌的细菌培养物的生物质且任选添加了其它营养物。
3.如权利要求1或权利要求2中所述的应用或方法，其中所述的营养物组合物包括所述生物质的水解产物、匀化物或自溶物，优选自溶物。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的应用或方法，其中所述的生长培养基进一步包括葡萄糖和/或硝酸盐和无机盐(例如钾、钙、镁、钠、钼、铁、锌、硼、钴、锰和镍化合物)。
5.如权利要求4中所述的应用或方法，其中在所述生长培养基中存在的葡萄糖与生物质衍生成分的以干物质计的重量比为5∶1-1∶5(尤其是2∶1-1∶2)。
6.如权利要求4或权利要求5中所述的应用或方法，其中所述生长培养基中存在的硝酸盐和无机酸与衍生生物质的成分的以干物质计的重量比为0.01∶1-0.2∶1(尤其是0.05∶1-0.1∶1)。
7.如上述任意权利要求中所述的应用或方法，其中用于产生生物质的细菌培养物至少为50％、优选至少为60％、尤其是至少为70％、特别是至少为75％、例如75-95％、更特别的是75-80％重量的甲烷营养菌(占总细菌重量)。
8.如上述任意权利要求中所述的应用或方法，其中所述的细菌培养物包括甲烷营养菌中的至少一个种类和异养菌中的至少一个种类。
9.如权利要求8中所述的应用或方法，其中所述的培养物包括荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB11132)、Ra1stonia sp.DB3(菌株NCIMB13287)和Brevibacillus agri DB5(菌株NCIMB 13289)任选与Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)的组合。
10.如上述任意权利要求中任意一项所述的应用或方法，其中所述的细菌培养物通过对烃级分或对天然气发酵而产生、优选通过对天然气发酵而产生。
11.包括如权利要求1-3和7-10中任意一项所定义的无菌营养物组合物的微生物生长基质，进一步含有至少一种无菌营养物且任选含有稀释剂。
12.如权利要求11中所述的基质，其中所述的无菌营养物选自葡萄糖、硝酸盐和无机盐(例如钾、钙、镁、钠、钼、铁、锌、硼、钴、锰和镍化合物)及其组合。
13.如权利要求12中所述的基质，其中所含的葡萄糖与生物质衍生成分的以干物质计的重量比为5∶1-1∶5(尤其是2∶1-1∶2)。
14.如权利要求12或权利要求13中所述的基质，其中所含的硝酸盐和无机酸与生物质衍生成分的以干物质计的重量比为0.01∶1-0.2∶1(尤其是0.05∶1-0.1∶1)。
全文摘要
本发明涉及包括无菌营养物组合物的微生物生长基质，所述的无菌营养物组合物来源于包括甲烷营养菌的细菌培养物的生物质且进一步含有至少一种无菌营养物。优选的生物质来源于微生物培养物，该培养物包括荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)、Ralstonia sp.DB3(菌株NCIMB 13287)和Brevibacillus agri DB5(菌株NCIMB 13289)任选与Aneurinibacillus sp.DB4(菌株NCIMB 13288)的组合。
文档编号C12N1/00GK1659272SQ03813386
公开日2005年8月24日 申请日期2003年4月17日 优先权日2002年4月19日
发明者艾纳·莫恩, 珍妮特·M·乔根森, 卡伦·M·詹森, 阿里尔德·约翰尼森 申请人:诺弗姆公司