专利名称：修饰的admts4分子及其使用方法
技术领域：
本申请涉及修饰的聚集蛋白聚糖酶，编码这种酶的核苷酸和制备这些酶的方法。本发明进一步涉及该修饰的聚集蛋白聚糖酶的抑制剂以及其抗体的开发。该抑制剂和抗体可以有效治疗各种聚集蛋白聚糖酶相关病症，包括骨关节炎。
背景技术：
聚集蛋白聚糖是关节软骨主要的胞外成分。它是一种负责给软骨提供压缩性和弹性的机械性能的蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖的损失牵连关节疾病如骨关节炎中关节软骨的退化。
聚集蛋白聚糖含有两个N末端球形结构域，G1和G2，被蛋白水解敏感性球间结构域分隔开，随后是糖胺聚糖附着区域和C末端球形结构域，G3。在聚集蛋白聚糖的球间结构域内已经鉴定了至少两个酶切割位点。已经观察到聚集蛋白聚糖的球间结构域内的一个酶切割位点(asn341-phe342)被几种已知金属蛋白酶切割。在聚集蛋白聚糖内的第二个聚集蛋白聚糖切割位点(glu373-ala374)断裂是由于聚集蛋白聚糖酶活性。因此该切割位点(glu373-ala374)称作聚集蛋白聚糖酶切割位点。
近年来已经克隆了很多聚集蛋白聚糖酶。这些酶属于称作“ADAMTS”的锌金属蛋白酶的亚家族，ADAMTS是一种含血小板反应蛋白I型基序的解联蛋白样金属蛋白酶结构域(ADisintegrin-likeAndMetalloprotease domain withThromboSpondin type I motifs)的缩写。现在ADAMTS家族由基于它们共同结构域结构彼此相关的19个成员组成。典型的ADAMTS蛋白含有前蛋白序列末端上游弗林蛋白酶切割位点中的典型信号序列、在家族成员中非常保守的金属蛋白酶结构域、功能相关性仍未知的解联蛋白样基序和至少一个血小板反应蛋白I型(TSP1)结构域。ADAMTS家族成员在它们含有的TSP-1数量上不同，可以从1至15的范围(Cal等.，2002；Somerville等.，2003)。ADAMTS序列最多变的区域是位于含有10个结构保守半胱氨酸残基的富含半胱氨酸区域下游的“间隔”结构域。ADAMTS蛋白通过间隔结构域和TSP-1基序内的相互作用能够与胞外基质成分结合(Kunoand Matsushima，1998；Tortorella等.，2000)。
ADAMTS4(聚集蛋白聚糖酶-1)由IL-1刺激的软骨合成(Tortorella，等.，Science，2841664-1666，1999)并与退形性关节疾病如骨关节炎过程中聚集蛋白聚糖降解有关(Abbaszade等.，JBiol Chem，27423443-23450，1999)。ADAMTS4也参与脑部富含的hyaluranan结合(BEHAB)/brevican-一种在人神经胶质瘤中戏剧性增加的蛋白的切割(Matthews等.，J.Biol.Chem.27522695-22703，2000)。因此通过抑制ADAMTS4的聚集蛋白聚糖酶活性可能使骨关节炎和任何其它ADAMTS4相关疾病好转。然而，对ADAMTS4作用的研究被纯化的ADAMTS4蛋白的不稳定性所阻碍。
发明概述本发明基于对全长弗林蛋白酶加工的ADAMTS4分子能够接受自身催化C末端截短的观察。自身消化ADAMTS4分子显示出结合硫酸化糖胺聚糖(GAGs)的亲和力显著降低，但是保留了聚集蛋白聚糖酶活性。进一步研究显示具有修饰的结构域结构的ADAMTS分子可能有酶活性，同时与天然酶相比具有提高的稳定性。例如，发现具有截短间隔结构域或无间隔结构域的修饰ADAMTS4有生物活性并且比它们的全长蛋白更稳定。修饰的ADAMTS蛋白可以大量表达和分离，因此允许进一步的蛋白特性研究，如结晶学和酶动力学研究。该纯化、稳定的蛋白也将促进制备抗ADAMTS的抗体和ADAMTS酶的抑制剂的开发。
本发明的一个方面涉及修饰的ADAMTS4(mTS4)蛋白；编码mTS4蛋白的核苷酸序列；和制备mTS4蛋白的方法。优选，本发明的mTS4蛋白比相应的全长蛋白更稳定和可以以更高水平表达。更优选，本发明的mTS4蛋白更稳定并具有生物学活性。
在一个实施方案中，本发明提供了具有生物学活性的分离的mTS4蛋白。可以用标准重组DNA技术或用弗林蛋白酶对全长ADAMTS4分子的自身消化制备mTS4蛋白。该实施方案特别包括具有SEQ ID NOS17，19，22，24，26，27和46-49中所述的氨基酸序列的mTS4蛋白，以及其变异体和片段。这些蛋白可以用于例如ADAMTS4酶的特性研究、制备抗ADAMTS4的抗体，和筛选ADAMTS4抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了无生物学活性，但是比天然蛋白更稳定的分离的mTS4蛋白。该实施方案特别包括具有SEQ ID NOS29，31，32，40和50-53中所述的氨基酸序列的mTS4蛋白，以及其变异体和片段。这些蛋白可以用于例如结晶学研究。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含ADAMTS4部分和非ADAMTS4部分的分离的mTS4蛋白。mTS4蛋白的非ADAMTS4部分可以用作标记以促进免疫识别或蛋白纯化，或作为增加分泌的信号序列。含非ADAMTS4的mTS4蛋白可以用于例如在受试者中产生抗mTS4抗体，纯化ADAMTS4配体，和鉴定筛选试验中抑制ADAMTS4蛋白与ADAMTS4底物相互作用的分子。
在另一个实施方案中，本发明的特征是编码本发明mTS4蛋白的核酸分子。该实施方案特别包括包含编码多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子，该多肽包含选自SEQ ID NOS17，19，22，24，26，27，29，31，32，40和46-53的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码本发明mTS4蛋白的核酸分子的载体。这些载体可以用于制备本发明mTS4蛋白的新方法。
本发明的另一个方面涉及抗mTS4抗体，mTS4抑制剂，和使用抗mTS4抗体或mTS4抑制剂治疗聚集蛋白聚糖酶相关疾病的方法。
在一个实施方案中，本发明的mTS4蛋白用于治疗聚集蛋白聚糖酶相关疾病如骨关节炎的聚集蛋白聚糖酶抑制剂和聚集蛋白聚糖酶的抗体的开发。该实施方案特别包括鉴定和开发阻断酶活性的聚集蛋白聚糖酶抑制剂的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了抑制聚集蛋白聚糖酶活性的药物组合物，其中该组合物包含本发明的抗mTS4抗体和/或mTS4抑制剂，和药用载体。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制哺乳动物的聚集蛋白聚糖酶活性的方法，包括给该哺乳动物施用有效量的包含本发明抗mTS4抗体和/或mTS4抑制剂的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗罹患以聚集蛋白聚糖降解为特征的病症的患者或预防这种病症的方法。这些方法需要给需要这种治疗的患者施用有效量的包含本发明抗mTS4抗体和/或mTS4抑制剂的药物组合物。
本文的另外方面将在说明书中部分陈述，部分由说明书可以显而易见，和/或可以从实施本发明中学到。本发明在权利要求中陈述和部分指出，和公开内容不应解释为限制权利要求的范围。下列的详细说明包括本发明各种实施方案的示例性陈述，它们不限制要求保护的本发明。附图组成本说明书的一部分，并且连同说明书用于阐明实施方案并且不限制本发明。
图1是显示自身消化的ADAMTS4同工型(图A)和切割位点(图B)的图。
图2是显示修饰的mTS4分子的各种实施方案的图(构建体B-I)。
发明详述I.定义为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。另外的定义在详述全文中描述。
术语“聚集蛋白聚糖酶活性”是指因聚集蛋白聚糖酶结合聚集蛋白聚糖而打断或启动的至少一个细胞过程。通常，聚集蛋白聚糖酶活性是指在glu373-ala374对聚集蛋白聚糖的蛋白水解切割。聚集蛋白聚糖酶活性包括但不限于聚集蛋白聚糖酶与聚集蛋白聚糖结合，和聚集蛋白聚糖被聚集蛋白聚糖酶切割。聚集蛋白聚糖酶活性也可以包括由本发明的修饰的聚集蛋白聚糖酶结合或切割聚集蛋白聚糖产生的生物学反应。
如这里使用的术语“修饰的聚集蛋白聚糖酶”是指通过与天然聚集蛋白聚糖酶相比至少一个氨基酸的置换、插入、缺失或修饰而改变的聚集蛋白聚糖酶。本发明修饰的聚集蛋白聚糖酶可以具有比相应天然聚集蛋白聚糖酶分子更大的稳定性。本发明修饰的聚集蛋白聚糖酶还可以在体内和体外以比相应天然聚集蛋白聚糖酶蛋白更高的水平表达。如果修饰的聚集蛋白聚糖酶保留至少一种前段中定义的聚集蛋白聚糖酶活性，那么它具有“生物学活性”。修饰的聚集蛋白聚糖酶也可以含有多个改变，如蛋白不同部分的氨基酸置换、修饰、插入和缺失。
如这里使用的术语“稳定性”一般是指蛋白降解速度降低，由此增加其半衰期、稳定性和/或表达水平。几种因素影响蛋白在体外和体内的稳定性，例如，pH、盐浓度、温度、蛋白降解，例如通过蛋白酶、金属离子、蛋白自身催化、疏水性等。使蛋白更稳定的条件通常包括维持蛋白比正常更长的时间处于折叠构象的条件，由此维持更长时间的生物学活性。蛋白稳定性增加通常增加其半衰期和表达水平，由此使得大量纯化蛋白用于治疗目的和开发抑制剂成为可能。
下列分部中进一步详细描述本发明的各个方面。这里指出的专利和科学文献建立了本领域技术人员可利用的知识。这里引用的出版的美国专利、允许的申请、公开的申请(美国和外国)和参考文献，包括GenBank数据库序列引入这里作为参考，其程度如同具体和单独指出每篇文献引入作为参考。
II、修饰的ADAMTS4(mTS4)分子及其实用性位于人染色体1的1q21-q23位点的人ADAMTS4基因编码837个氨基酸的前蛋白(pro-protein)(SEQ ID NO1)。该蛋白含有N末端前肽(氨基酸残基1-212)、金属蛋白酶催化结构域(氨基酸残基213-436)、解联蛋白样结构域(氨基酸残基437-519)、TSP-1基序(氨基酸残基520-576)、富含半胱氨酸结构域(氨基酸残基577-685)和间隔(氨基酸残基686-837)。不象ADAMTS家族的其它蛋白，ADAMTS4蛋白完全缺乏C末端TSP-1基序。
ADAMTS4前蛋白的N末端前肽可以被弗林蛋白酶或转运高尔基体内相关的前蛋白转换酶切割，导致缺乏前蛋白区域的成熟酶释放。弗林蛋白酶处理的ADAMTS4具有酶活性并且正常称作“全长”ADAMTS4酶。
ADAMTS4负责聚集蛋白聚糖-一种软骨的主要蛋白聚糖的降解，和brevican-一种脑部特异性胞外基质蛋白的降解。ADAMTS4对聚集蛋白聚糖和brevican的降解提示这种酶在关节疾病、在中枢神经系统功能和可能在神经胶质瘤中的关键作用。
ADAMTS4酶活性抑制可以预防聚集蛋白聚糖损失和改善与骨关节炎相关的软骨退化。然而，开发ADAMTS4抑制剂的努力被一种事实阻碍-由于通常该酶的表达水平低和稳定性差，难于大量分离和纯化ADAMTS4蛋白。因此，为了研究ADAMTS4在疾病状态中的作用，以及开发治疗涉及聚集蛋白聚糖切割的疾病的疗法和组合物，需要鉴定新形式的ADAMTS4和进一步开发大量分离和纯化ADAMTS4蛋白的方法。修饰的ADAMTS4分子可能具有切割聚集蛋白聚糖的生物学活性并可以以比它们的全长副本更高的水平表达。它们可以用于筛选ADAMTS4和其它聚集蛋白聚糖酶的抑制剂，和开发ADAMTS4的抗体。通过酶动力学和结晶学研究，更稳定的mTS4分子也允许ADAMTS4蛋白的更好生物化学和生物物理特性。
如以下使用的本发明的修饰的ADAMTS4(mTS4)分子包括分离的多肽和分离的多核苷酸。
分离的多肽本发明的一个方面涉及分离的mTS4蛋白。在一个实施方案中，mTS4蛋白具有聚集蛋白聚糖酶活性并可以用于筛选聚集蛋白聚糖酶抑制剂。在另一个实施方案中，mTS4蛋白用于开发聚集蛋白聚糖酶的抗体。
可以使用标准分子生物学和细胞生物学技术制备经修饰的ADAMTS4蛋白。通过筛选ADAMTS4片段的组合文库可以鉴定具有聚集蛋白聚糖酶活性的经修饰的ADAMTS4蛋白。ADAMTS4编码序列片段的文库可以用于产生多变的ADAMTS4片段，进行修饰的ADAMTS4的筛选和随后选择。在一个实施方案中，在每个分子仅发生大约一个缺口的条件下，用核酸酶处理ADAMTS4编码序列的双链PCR片段，双链DNA变性，DNA复性形成双链DNA，它可以包括来自不同缺口产物的正义/反义对，用S1核酸酶处理从再形成的双螺旋中除去单链部分，并将所产生片段文库连接到表达载体，可以产生编码序列片段文库。通过这个方法可以得到表达文库，它编码各种大小的ADAMTS4蛋白的N末端、C末端和内部片段。
本领域已知用于筛选由截短产生的组合文库的基因产物，和用于筛选cDNA文库得到具有选择性性能的基因产物的几种技术。服从于筛选大基因文库的高流通量分析的最广泛使用技术典型地包括将基因文库克隆到可复制表达载体中，用所产生的载体文库转化适当细胞，和在期望活性的检测促进编码其产物被检测的基因的载体条件下表达重组基因。递推集团诱变(REM)-一种增加文库中功能性突变体频数的技术，可以与筛选试验联合鉴定mTS4突变体(DeLagrave等.，ProteinEngineering，6327-331，1993)。
也可以用合成方法，使用本领域普通技术人员熟知的技术产生具有小于大约100个氨基酸，和通常小于大约50个氨基酸的ADAMTS4蛋白的部分。例如，可以使用任何市场上可得到的固相技术合成这种多肽，如Merrifield固相合成法，其中氨基酸顺序添加到生长的氨基酸链。
本发明也提供了mTS4融合蛋白。mTS4融合蛋白含有彼此符合读框融合的ADAMTS4相关多肽和非ADAMTS4多肽。ADAMTS4相关多肽对应于经修饰的ADAMTS4蛋白或其变异体的全部或部分。
可以采用肽接头序列通过足以确保每个多肽折叠为其二级和三级结构的距离将ADAMTS4相关多肽和非ADAMTS4多肽成分分隔开来。使用本领域熟知的标准技术将这种肽接头序列引入融合蛋白。可以基于下列因素选择合适的肽接头序列(1)它们采用灵活延伸构象的能力；(2)它们不能采用可以与ADAMTS4相关多肽和非ADAMTS4多肽上的功能性表位相互作用的二级结构的能力；和(3)缺乏可能与多肽功能性表位反应的疏水和带电荷残基。优选的肽接头序列含有gly、asn和ser残基。其它接近中性氨基酸，如thr和ala，也可以用在接头序列中。可以有效用作接头的氨基酸序列是本领域熟知的。接头序列通常长度可以从1至大约50个氨基酸。当ADAMTS4相关多肽和非ADAMTS4多肽具有可以用于分离功能性结构域和防止空间干扰的非必需N末端氨基酸区域时，不需要接头序列。
mTS4蛋白可以含有肽标记以促进mTS4蛋白的鉴定和/或纯化。该标记肽是很好鉴定的肽(如Poly-His、标记-表位、链球菌-标记、c-myc表位、HA-标记)或小蛋白(细菌谷胱苷肽s-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白等)的短片。标记序列可以位于蛋白序列的任何位置。优选，标记序列位于蛋白C末端或插在蛋白的两个结构域结构之间。标记序列通常与靶基因一起克隆并作为融合蛋白的一部分表达。通常，已经可利用这些融合-标记的抗体来监测融合蛋白表达和纯化。因此，融合-标记用作通用标记，很象二级抗体。很多标记具有它们自身的特性。Poly-His融合蛋白(6×His)可结合镍-琼脂糖凝胶或镍-HRP。GST融合蛋白可结合谷胱苷肽-琼脂糖凝胶。因此，仅一个亲核层析步骤可以达到高程度的融合蛋白纯化。融合蛋白的纯度可以由标记-抗体追踪。通常，融合蛋白直接注射给动物产生抗体。随后可以用酶处理除去有些融合标记产生无标记的重组蛋白。
优选，用标准重组DNA技术制备本发明的mTS4融合蛋白。用常规技术包括自动DNA合成仪可以合成融和基因。可供选择地，可以使用在两个连续基因片段之间产生互补突出端的固定引物实施基因片段的PCR扩增，该基因片段可以随后退火并再次扩增产生嵌合基因序列。而且，很多表达载体可以从市场上获得，它们已经编码了融合部分(如GST多肽)。ADAMTS4相关多肽可以克隆进入这种表达载体，使得融合部分符合读框地连接ADAMTS4相关多肽。
信号序列可以用来促进本发明的mTS4或mTS4融合蛋白的分泌和分离。信号序列典型的特征是通常在一个或多个切割事件中从分泌过程中的成熟蛋白切割的疏水氨基酸核心。这种信号肽含有允许通过分泌途径从成熟蛋白切割信号序列的加工位点。
本发明进一步包括经修饰的ADAMTS4蛋白的片段和变异体。已知例如很多保守氨基酸置换可能不显著改变蛋白的结构和构象，因此也保留了生物学性能。例如，认识到保守氨基酸置换可以在具有碱性侧链的氨基酸中进行，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；在具有酸性侧链的氨基酸中进行，如天冬氨酸和谷氨酸；在具有不带电荷极性侧链的氨基酸中进行，如天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；和在具有非极性侧链的氨基酸中进行，如丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。因此，原始mTS4蛋白的这些修饰和缺失可以用作原始mTS4蛋白的生物学活性替代物。通过两种蛋白(原始蛋白和变异体)接受实施例所述的生物学活性试验，可以容易确定给定的mTS4变异体或mTS4融合蛋白是否保留了原始蛋白的生物学活性。
象氨基酸的置换也可以基于亲水性进行，尤其是生物学功能等同的多肽或多肽片段有意用于免疫实施方案时。以下引入作为参考的美国专利4,554,101陈述了多肽的最大局部平均亲水性，由于由其相邻氨基酸亲水性控制，因此与其免疫原性和抗原性有关，即与多肽的生物学性能有关。应理解一个氨基酸可以取代具有类似亲水性值并仍获得生物学等同物，和尤其获得是免疫学等同多肽的另一个氨基酸。
在一个实施方案中，活性位点突变可以导入mTS4分子来有意阻断<p>表6
表7
表8
表9
实施例4(吸附和溶出试验)
在某些实施方案中，保守氨基酸置换也包括非天然存在的氨基酸残基，它们典型地通过化学肽合成引入，而不是通过生物系统合成。
这里描述的聚集蛋白聚糖酶蛋白序列的其它具体突变包括糖基化位点的修饰。这些修饰可以包括O-连接或N-连接的糖基化位点。例如，糖基化的缺乏或仅部分糖基化由天冬酰胺连接的糖基化识别位点的氨基酸置换或缺失造成。天冬酰胺连接的糖基化识别位点包含适当细胞糖基化酶特异性识别的三肽序列。这些三肽序列是天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬氨酸-X-丝氨酸，其中X通常是任何氨基酸。糖基化识别位点的第一个或第三个氨基酸位置之一或二者的各种氨基酸置换或缺失(和/或第二个位置的氨基酸缺失)导致修饰的三肽序列的非糖基化。另外，聚集蛋白聚糖酶相关蛋白的细菌表达也将导致非糖基化蛋白产生，即使糖基化位点保持未被修饰。
分离的多核核酸本发明的另一个方面涉及编码mTS4蛋白的分离的多核苷酸。可以使用标准分子生物学技术和这里提供的序列信息以及本领域已知的序列信息来制备包含mTS4分子的核苷酸序列的多核苷酸分子。可以使用cDNA、mRNA或可供选择地，使用基因组DNA作为模板，和适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增天然或修饰的ADAMTS4基因序列。如此扩增的多核苷酸可以克隆进入适当载体并用DNA技术分析来描述特性。此外，可以用标准合成技术制备与天然或修饰的ADAMTS4序列对应的寡核苷酸，如使用自动DNA合成仪。在一个实施方案中，mTS4序列可以包括修饰的Kozak序列以提高翻译效率。
本领域普通技术人员了解，由于遗传密码简并性的原因，存在编码相同多肽的很多多核苷酸变异体。这些多核苷酸变异体中的一些与原始多核苷酸具有很小的序列同源性。然而，由于密码子使用差异而变化的多核苷酸包括在本发明中。
本发明也涉及编码mTS4蛋白变异体的多核苷酸。通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失导入多核苷酸的核苷酸序列，使得一个或多个氨基酸置换、添加或缺失被导入编码的蛋白，可以产生编码mTS4蛋白变异体的分离的多核苷酸分子。这种技术是本领域熟知的。用标准技术也可以将突变导入mTS4蛋白，如定点诱变和PCR介导的诱变。可供选择地，突变可以连同mTS4蛋白编码序列的全部或部分一起随机导入，如通过饱和诱变，和可以筛选所产生突变体的生物学活性以鉴定能够抑制野生型蛋白活性的突变体(显性失活突变体)。诱变后，编码的蛋白可以重组表达并且可以确定该蛋白的活性。
可以进一步修饰多核苷酸以增加体内稳定性。可能的修饰包括但不限于在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2-o-甲基而不是磷酸二酯酶键；和/或内含非常规碱如肌苷、辨苷(queosine)和wybutosine，以及乙酰基、甲基、硫基和其它的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的修饰形式。
III、表达载体本发明的另一个方面包括用于表达mTS4蛋白的方法的载体。优选，本发明的载体含有上述编码mTS4或mTSr4活性位点突变体的DNA序列。载体可以含有允许本发明经修饰的ADAMTS4蛋白表达的适当表达控制序列。
在一个实施方案中，本发明的载体是包含编码mTS4的多核苷酸的表达载体，它是适合在宿主细胞中表达多核苷酸的形式。该载体通常具有一个或多个调节序列，根据待进行表达使用的宿主细胞来选择，它可操作地连接待表达的多核苷酸序列。本领域技术人员将领会到表达载体的设计可以根据这种因素如所选择的待转化宿主细胞、期望的蛋白表达水平等等。本发明的表达载体可以导入宿主细胞，由此产生这里所述的多核苷酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
可以设计用于在原核或真核细胞中表达mTS4的本发明的表达载体。例如，mTS4可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。可供选择地，该表达载体可以在体外转录和翻译，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白在原核细胞中的表达最常在大肠杆菌中，用含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体来实施。融合载体将很多氨基酸添加到其中编码的蛋白，通常添加到重组蛋白的氨基末端。这种融合载体典型地起着三个目的1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；和3)通过用作亲合纯化中的配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的接头导入蛋白水解切割位点，使该重组蛋白能够随后与融合部分分离，纯化融合蛋白。这种酶和它们的同族识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Piscataway，NJ)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们将GST、MBP或蛋白A分别与靶重组蛋白融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc和pETlld。PTrc载体的靶基因表达依靠从杂交trp-lac融合启动子转录宿主RNA聚合酶。pET11d载体的靶基因表达依靠由共表达病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的从T7 gn10-lac融合启动子转录。这个病毒聚合酶由含有lacUV5启动子转录控制下的T7 gn1基因的定居噬菌体的BL21(DE3)或HSLE174(DE3)宿主菌种提供。
增加重组蛋白在大肠杆菌中表达的一个策略是在蛋白水解切割能力受损的宿主细菌中表达该蛋白。另一个策略是改变待插入表达载体的多核苷酸的多核苷酸序列，使得每个氨基酸的各个密码子是大肠杆菌中优先利用的密码子。可以用标准DNA合成技术实施本发明多核苷酸序列的这种改变。
在另一个实施方案中，mTS4表达载体是酵母表达载体。在啤酒酵母中表达的载体实例包括pYepSecl、pMFa、pJRY88、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和picZ (InvitrogenCorp，San Diego，CA)。
可供选择地，mTS4可以在昆虫细胞中表达，使用杆状病毒表达载体。可利用用于在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达蛋白的表达杆状病毒表达载体包括pAc系列和pVL系列。
仍在另一个实施方案中，mTS4在哺乳动物细胞中表达，使用哺乳动物表达载体。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8、pMT2PC和pHTop。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。例如，普遍使用的启动子得自多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40。可供选择地，表达载体的控制功能可以由天然ADAMTS4启动子或组织特异性调节元件提供。
本发明进一步提供了将多核苷酸传递到细胞、组织或哺乳动物进行表达的基因传递载体。例如，本发明的多核苷酸序列可以在基因传递载体中局部或全身给予。这些构建体可以利用体内或非体内形式的病毒或非病毒载体方法。可以使用内源性哺乳动物或异源启动子诱导编码序列的表达。编码序列在体内的表达可以是组成型或调节型。本发明包括能够表达预想的多核苷酸的基因传递载体。该基因传递载体优选病毒载体，和更优选逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、疱疹病毒或甲病毒载体。病毒载体也可以是星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、细小核糖核酸病毒、痘病毒或披膜病毒病毒载体。
本发明的mTS4构建体传递给细胞不限于上面提及的病毒载体。可以利用其它传递方法和介质，例如核酸表达载体、单独连接或未连接灭活腺病毒的聚阳离子浓缩DNA、脂质体、配体连接DNA、真核细胞传递载体、光聚合水凝胶材料沉淀、把握基因传递颗粒枪、电离辐射、核酸电荷中和或与细胞膜融合。可以采用颗粒介导的基因传递。例如，序列可以插入含有为高水平表达的常规控制序列的常规载体中，然后与合成基因传递分子孵育，如聚合DNA结合阳离子样聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白，与细胞靶配体连接如脱唾液酸血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或转铁蛋白。也可以采用裸DNA。使用可生物降解的乳胶珠可以提高裸DNA的摄取效率。
IV.聚集蛋白聚糖酶蛋白的制备通过培养上述表达载体转化或感染的细胞可以制备本发明经修饰的ADAMTS4蛋白。可以用标准蛋白纯化技术纯化蛋白。纯化的mTS4蛋白基本上不含与其共同产生的其它蛋白物质，也不含其它污染物。通过切割聚集蛋白聚糖，回收的纯化蛋白显示出蛋白水解作用的聚集蛋白聚糖酶活性。因此，本发明的蛋白可以进一步以它们在确定降解聚集蛋白聚糖分子存在的试验中证明具有聚集蛋白聚糖蛋白水解活性的能力为特征。这些试验或其开发在本领域技术人员知识范围内。这种试验可以包括聚集蛋白聚糖底物接触聚集蛋白聚糖酶分子和监测聚集蛋白聚糖片段的产生(见例如Hughes等.，Biochem.J.305799-804，1995；Mercuri等，J.Bio.Chem.27432387-32395，1999)。
合适的细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。合适哺乳动物宿主细胞和转化、培养、扩增、筛选、制备产物和纯化方法的选择是本领域已知的。所附实施例中描述的另一个合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1细胞系。哺乳动物细胞系CV-1也可能合适。
细菌细胞也可以是合适的宿主。例如，各种大肠杆菌(如HB101，MC1061)在生物技术领域中是熟知的宿主细胞。在这个方法中也可以采用各种枯草芽孢杆菌、假单胞菌、其它杆菌等等。对于在细菌细胞中表达本发明的mTS4蛋白，通常不是必需编码聚集蛋白聚糖酶前肽的DNA。
本领域技术人员已知的很多酵母细胞菌种也可以用作表达本发明多肽的宿主细胞。另外，根据需要，在本发明方法中也可以利用昆虫细胞作为宿主细胞。如见Miller等.，Genetic Engineering，8277-298(Plenum Press 1986)和其中引用的参考文献。
用合适的纯化方案使用标准蛋白纯化技术可以从宿主细胞分离在宿主细胞中产生的经修饰的ADAMTS4蛋白。标准纯化技术包括电泳、分子、免疫学和层析技术，包括离子交换、疏水性、亲和性和反向HPLC层析和层析聚焦。例如，可以使用抗mTS4抗体柱纯化mTS4蛋白。超滤和渗滤技术结合蛋白浓度也有效。需要纯化的程度将根据修饰ADAMTS蛋白的用途而变化。在一些情况下，无需纯化。
V.抗体的产生根据本发明的另一个方面，制备了对mTS4 ADAMTS4或其它ADAMTS4相关蛋白特异的抗体，抗mTS4抗体包括阻断mTS4的聚集蛋白聚糖酶活性的和不能阻断的两种抗体。抗mTS4抗体也包括“新表位”，它是指特异性识别ADAMTS4或mTS4蛋白水解切割而暴露的新的N或C末端氨基酸序列的抗体，但是该抗体不结合原始(未切割)分子上的这种表位。抗mTS4抗体也可以有效检测和/或纯化聚集蛋白聚糖酶或相关蛋白，或抑制或阻碍聚集蛋白聚糖酶的作用。
mTS4蛋白或mTS4蛋白的抗原片段可以用作免疫原。mTS4蛋白的抗原肽包含mTS4氨基酸序列的至少8个氨基酸，并包含mTS4蛋白的表位，使得产生的抗该肽的抗体与mTS4蛋白形成特异性免疫复合物。优选，抗原肽包含至少8个氨基酸残基，更优选至少12个氨基酸残基，甚至更优选至少16个氨基酸残基，和最优选至少20个氨基酸残基。
通过用免疫原免疫合适受试者(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)，mTS4免疫原(如mTS4蛋白，其片段，或mTS4融合蛋白)典型地用于制备抗体。适当免疫原制剂可以含有例如重组表达的mTS4免疫原或化学合成的mTS4免疫原。该制剂可以进一步包括佐剂，如弗氏究全或不完全佐剂，或类似免疫刺激试剂。用免疫原试剂免疫合适受试者诱导抗mTS4抗体反应。制备、分离和使用单克隆和多克隆抗mTS4抗体的技术是本领域熟知的。
因此，本发明的另一个方面涉及单克隆或多克隆抗mTS4抗体。本发明提供了结合mTS4蛋白的单克隆或多克隆抗体。
抗mTS4抗体可以用于分离mTS4蛋白或mTS4相关蛋白，采用标准技术，如亲和层析或免疫沉淀。抗mTS4抗体可以促进从细胞纯化mTS4蛋白或mTS4相关蛋白，如全长ADAMTS4蛋白、mTS4融合蛋白或其变异体和突变体。而且，为了估计蛋白表达的丰富度和模式，抗mTS4抗体可以用于检测mTS4蛋白或mTS4相关蛋白。与ADAMTS4蛋白交叉反应的抗mTS4抗体可以用于诊断性监测组织中ADAMTS4蛋白水平，作为一部分临床监测程序，例如确定给定治疗方案的功效。抗体与可检测物质偶合(即物理连接)可以促进检测。可检测物质实例包括各种酶、辅基基团、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基基团复合物实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料实例包括7-羟基香豆素、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、碱性蕊香红、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括发光氨；生物发光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；和合适放射性材料的实例包括125I，131I，35S和3H。
与ADAMTS4蛋白交叉反应的抗mTS4抗体也可有效将治疗剂对准ADAMTS4表达升高的细胞或组织。例如，为了将治疗剂对准ADAMTS4表达升高的细胞或组织，治疗剂如小分子ADAMTS4拮抗剂可以与抗修饰的ADAMTS4抗体连接。
治疗剂可以直接或间接(如通过连接基团)偶合(如共价结合)合适的单克隆抗体。当它们每种都具有能够与另一个反应的取代基时，试剂和抗体之间的直接反应是可能的。例如，一个上面的亲核基团，如氨基或巯基，可能能够与另一个上面的含羰基的基团如酸酐或酰基卤反应，或与含良好的离去基团(如卤化物)的烷基反应。
可供选择地，可能期望通过连接基团将治疗剂和抗体偶合。连接基团可以起着抗体与试剂距离间隔的作用，为了避免结合能力的干扰。连接基团也可以用于增加试剂或抗体上取代基的化学反应性，和因此增加偶合效率。化学反应性增加也可以促进试剂或试剂上、官能团的使用，否则将不可能。
对本领域技术人员来说将很明显可以采用同种和异种官能的各种双官能或多官有试剂(如the Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill目录中描述的那些)作为连接基团。例如通过氨基、羧基、巯基或氧化碳水化合物残基可以进行偶合。
当治疗剂不含本发明免疫结合的抗体部分更有效的情况下，可能期望使用在内在化到细胞的过程中或之后可切割的连接基团。已经描述了很多不同可切割连接基团。该试剂从这些连接基团细胞内释放的机制包括二硫键还原、照射不耐光键、衍生氨基酸侧链水解、血清补体介导的水解和酸催化的水解引起的切割。
可能期望一个以上试剂和抗体偶合。在一个实施方案中，多分子的试剂可以偶合一个抗体分子。在另一个实施方案中，一个以上类型的试剂可以偶合一个抗体。不管特定实施方案，与一个以上试剂免疫结合可以用各种方法进行。例如，一个以上试剂可以直接与抗体分子偶合，或可以使用提供进行连接的多位点的连接体。
VI.抑制剂的开发本发明的mTS4蛋白以用于ADAMTS4和其它聚集蛋白聚糖酶抑制剂的开发。聚集蛋白聚糖酶抑制剂可以用于治疗聚集蛋白聚糖酶相关疾病。例如，聚集蛋白聚糖破坏增加与骨关节炎的发展有关。两个软骨聚集蛋白聚糖酶，ADAMTS4和ADAMTS5主要负责明显聚集蛋白聚糖代谢和组织完整性破坏之前关节炎关节疾病早期来自关节软骨的聚集蛋白聚糖的分解代谢和损失(Caterson等.，Matrix Biol.19333-44，2000)。因此抑制ADAMTS4和ADAMTS5活性是骨关节炎的有效治疗方法。
已经进行了各种努力开发聚集蛋白聚糖酶抑制剂。金属蛋白酶3(TIMP-3)的内源性组织抑制剂的N末端抑制结构域是人ADAMTS4和ADAMTS5的强烈抑制剂，K(i)值在亚纳摩尔范围(Kashiwagi等.J.Biol.Chem.27612501-12504，2001)。进一步研究显示其它TIMPs也可以抑制ADAMTS4活性。例如，TIMP-3抑制ADAMTS4活性最有效具有7.9nM的IC(50)值，比TIMP-1(350nM)和TIMP-2(420nM)至少低44倍和比TIMP-4(2μM抑制35％)至少低250倍(Hashimoto等.，FEBS Lett.494192-195，2001)。
有证据表明环孢菌素A可抑制关节软骨移植中IL-1诱导的聚集蛋白聚糖酶介导的蛋白水解代谢(Little等.，Arthritis Rheum.46124-129，2002)。特异性单克隆抗体和一些金属蛋白酶抑制剂，包括TIMP-2和3(Rodriguez-Manzaneque等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.293501-508，2002)也可以完成ADAMTS1活性的抑制。
稳定性和表达水平增加的经修饰的ADAMTS4蛋白使得可能产生大量聚集蛋白聚糖酶分子，为了开发聚集蛋白聚糖酶的抑制剂。因此，本发明也提供了鉴定聚集蛋白聚糖酶抑制剂的方法(这里也称作“筛选试验”)。这种方法典型地包括mTS4蛋白和一种或多种检测成分之间的反应。其它成分可以是测试化合物本身，或检测混合物和mTS蛋白的结合伙伴的组合。
本发明的一个方面提供了筛选干扰mTS4蛋白与其结合伙伴如聚集蛋白聚糖和brevican结合的化合物的方法。在一个实施方案中，使用闪烁亲近试验。在这个试验中，用同位素如125I标记mTS4蛋白。用邻近放射性衰退时(即当mTS4蛋白结合其结合伙伴时)发射光的闪烁剂标记结合伙伴，光发射减少表明化合物干扰两种蛋白的结合。
可供选择地可以使用荧光能量转移(FRET)试验。在FRET试验中，荧光能量供体包括一种蛋白(如mTS4蛋白)和荧光能量受体包括在第二种蛋白上(如mTS4蛋白的结合伙伴)。如果受体分子的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱重叠，那么供体发射的荧光被受体吸收。供体分子可以是蛋白上的荧光残基(如内在荧光如色氨酸或酪氨酸残基)，或与蛋白共价接合的荧光团(如荧光素异硫氰酸酯，FITC)。接着用意想的上面的受体/供体光谱必要条件选择适当的供体分子。
因此，在这个实施例中，用荧光分子(即供体荧光团)标记mTS蛋白和用淬火分子(即受体)标记其结合伙伴。当mTS4蛋白及其结合伙伴结合时，荧光发射相对于单独mTS4蛋白将淬火或减少。类似地，可以分解mTS蛋白-伙伴复合物的相互作用的化合物将导致荧光发射增加。荧光发射增加表明该化合物干扰mTS4蛋白与其结合伙伴的结合。
在另一个实施方案中，组成聚集蛋白聚糖酶易感蛋白序列的FRET肽用作聚集蛋白聚糖酶的底物。当聚集蛋白聚糖酶切割该肽时，在相同肽上淬火剂释放氟并产生荧光。判断化合物对这个荧光的产生的抑制是阳性结果。
检测两种蛋白的结合或分开的另一个试验是荧光极化或备向异性。在这个试验中，用具有适当荧光活期的荧光团标记检测的蛋白(如mTS4蛋白)。接着用垂直极化光激发蛋白样品。接着通过确定水平和垂直急性发射光的强度来确定各向异性值。接下来，标记的蛋白(mTS4蛋白)与mTS4蛋白结合伙伴混合并再次测定备向异性。因为荧光各向异性强度与标记蛋白的旋转自由度有关，蛋白在溶液中旋转越快，各向异性值越小。因此，如果标记的mTS4蛋白是复合物(如mTS4蛋白-伙伴)的一部分，那么mTS4蛋白在溶液中旋转更慢(相对于游离的未结合mTS4蛋白)和各向异性强度增加。随后，可分开mTS4蛋白-伙伴复合物相互作用的化合物将导致各向异性降低(即标记的mTS4蛋白旋转更快)，它表明该化合物干扰mTS4蛋白与其结合伙伴的结合。
更多常规试验包括用同位素如125I标记mTS4蛋白-结合伙伴，与mTS4蛋白孵育，接着免疫沉淀mTS4蛋白。增加游离mTS4蛋白的化合物将降低沉淀量。为了避免使用放射性，可以用酶结合抗体代替标记mTS4蛋白-结合伙伴。
可供选择地，mTS4蛋白-结合伙伴可以固定在试验板表面和可以用放射性标记来标记mTS4蛋白。计数量升高将鉴定干扰mTS4蛋白和其结合伙伴的结合的化合物。
可以使用Biacore技术进一步实施结合相互作用的估计，其中mTS4蛋白或其结合伙伴结合微芯片，通过化学修饰直接结合或通过抗体-表位联合限制(如mTS4蛋白的抗体)、针对表位标记(如His标记的)的抗体或融合蛋白(如GST)结合。接着通过在“芯片”上流动而应用第二种蛋白并检测信号改变。最后，通过在“芯片”上流动而应用测试化合物并检测信号改变。
本发明的测试化合物通常是小分子或活质分子。小分子包括但不限于无机分子和小有机分子。活质分子包括但不限于在哺乳动物中有生物活性的天然存在的和合成的化合物，如脂类、类固醇、多肽、多糖和多核苷酸。在一个优选实施方案中，测试化合物是小分子。在另一个优选实施方案中，测试化合物是活质分子。
本发明的测试化合物可以从任何可获得来源而获得，包括天然和/或合成化合物的系统文库。也可以用本领域已知的组合文库方法中的任何很多方法获得测试化合物，包括生物文库；类胨文库(具有肽的功能性，但是具有新的非肽主链的分子文库，该分子对酶降解有抗性，但是尽管如此仍保留了生物活性)；空间可寻址平行固相或溶液固相文库；需要去褶合的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；和使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库和类肽文库方法限于肽文库，而其它四个方法适用于肽、非肽低聚物或化合物的小分子文库。如这里使用的术语“结合伙伴”是指用作mTS4蛋白底物的分子，或可替换地作为具有mTS4蛋白的结合亲和力的配体。
在另一个实施方案中，该试验包括在细胞/组织接触测试化合物之前和之后确定聚集蛋白聚糖酶在细胞或组织中的表达水平。可以使用标准技术如ELISA、western印迹、RT-PCR和实时PCR，在蛋白水平或RNA水平确定聚集蛋白聚糖酶表达。
本发明提供了指导高流通量筛选能够抑制本发明mTs4蛋白活性或表达的测试化合物的方法。在一个实施方案中，高流通量筛选方法包括将测试化合物与mTS4蛋白组合并检测测试化合物对mTS4蛋白的作用。
本领域熟知的各种高流通量功能性试验可以与筛选和/或研究不同类型活化测试化合物的反应性联合使用。由于偶合系统通常很难预测，可能需要形成很多试验来检测广泛范围的偶合机制。各种基于荧光的技术是本领域熟知的并且能够高流通量和超高流通量筛选活性，包括但不限于BRET或FRET(都由Packard Instrument Co.，Meriden，CT)。高敏感性筛选具有大体积和各种测试化合物的能力允许分析本发明的治疗目标以进一步提供聚集蛋白聚糖酶的强效抑制剂。
通过测试化合物与本发明的经修饰的ADAMTS4蛋白组合并确定它们之间的结合活性，可以实施诊断分析以阐明偶合系统。使用细胞传感器微生理测量仪的一般试验也可以用于测定代谢活动，同时可以使用基于荧光的技术如FlIPR(Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)检测钙流量的改变。此外，TUNEL试验可以确定调亡细胞的存在，它利用流式细胞计数法来检测调亡期间基因组DNA切割造成的游离3-OH末端。如上提及，本领域熟知的各种功能性试验可以与筛选和/或研究不同类型活化测试化合物的反应性联合使用。优选，本发明的高流通量筛选试验利用标记-游离胞质团共振技术，如BIACORE系统(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)提供。当在金属/液体交界面激发表面胞质团波时发生游离胞质团共振。接触样品引起表面反射定向光线，表面胞质团共振引起表层折射指数改变。对于很多生物活性试剂(包括蛋白、肽、脂类和多核苷酸)而言，针对表层质量浓度给定改变的折射指数改变是类似的，并且由于BIACORE传感器表面可以被功能化而结合这些生物活性试剂，因此可以完成测试化合物的广泛选择检测。
Peppard等.(Peppard等.，J.Biomol.Screen.8149-156，2003)最近开发了使用发光氧通道的聚集蛋白聚糖切割抑制剂的高流通量筛选试验。该试验利用了AlphaScreenTM技术。在这个技术中，“供体”珠和“受体”珠通过特异性生物相互作用达到接近并用激光刺激通过发光氧通道产生信号。筛选试验使用聚集蛋白聚糖的碳水化合物侧链的特异性抗体而产生支架结构，由此聚集蛋白聚糖可以形成供体和受体珠之间的交联，因此使珠接近而产生基于激光启发的信号。消化的聚集蛋白聚糖将不能形成这种交联并且不产生信号。消化抑制剂可被检测为信号恢复。
聚集蛋白聚糖酶抑制剂的鉴定和开发试验也可以包括例如聚集蛋白聚糖和抑制剂的混合物接触mTS4蛋白，随后测定聚集蛋白聚糖酶活性抑制的程度；例如，通过聚集蛋白聚糖酶易感位点切割产生的聚集蛋白聚糖片段进行检测和测定。抑制剂可以是蛋白、肽、抗体或化学化合物。在一个实施方案中，抑制剂是结合聚集蛋白聚糖酶分子上活性位点的肽分子。例如，mTS4的活性位点突变体可以用于肽抑制剂的开发。
VII.疾病治疗和诊断聚集蛋白聚糖酶抑制剂和阻断聚集蛋白聚糖酶活性的抗体可以用于聚集蛋白聚糖酶相关疾病的治疗。认为使用本发明的聚集蛋白聚糖酶抑制剂或抗体可治疗的各种疾病包括但不限于骨关节炎、神经胶质瘤、癌症、炎性关节疾病、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、牙周疾病、角膜溃疡、蛋白尿症、来自冠状动脉粥样硬化斑块破裂的冠状动脉血栓形成、主动脉瘤疾病、炎性肠病、节段性回肠炎、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、慢性梗阻性肺病、阿耳茨海默氏疾病、脑和造血系统恶性肿瘤、骨质疏松症、帕金森氏病、偏头痛、抑郁症、外周神经病变、杭廷顿氏舞蹈病、多发性硬化症、眼血管形成、黄斑变性、主动脉瘤、心肌梗塞、自身免疫紊乱、创伤性关节损伤后退形性软骨损失、头部创伤、dystrophobic大疱性表皮松解、脊柱损伤、急性和慢性神经变性疾病、骨质减少、颞下颌关节病变、神经系统脱髓鞘病变、器官移植毒性和排斥、恶病质、变态反应、组织溃疡、再狭窄、和以聚集蛋白聚糖酶活性改变或聚集蛋白聚糖酶水平改变为特征的其它疾病。
抑制聚集蛋白聚糖酶和/或降低聚集蛋白聚糖酶表达的本发明的抑制剂和抗体可以用于治疗哺乳动物的包括胞外基质降解的任何疾病。有效量的抗聚集蛋白聚糖酶抗体或聚集蛋白聚糖酶抑制剂，或二者都可以用于治疗疾病，如骨关节炎，或公开的以聚集蛋白聚糖酶和聚集蛋白聚糖酶相关蛋白造成的基质蛋白如聚集蛋白聚糖降解为特征的其它疾病。
VIII.药物组合物本发明的另一个方面提供了包含(1)mTS4抑制剂或抗mTS4抗体和(2)药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的组合物可以用于治疗以聚集蛋白聚糖酶或具有聚集蛋白聚糖酶样活性的蛋白造成的聚集蛋白聚糖降解为特征的疾病。
如这里使用的语言“药学上可接受的载体”是指包括与适合给予药物的任何和所有溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸收剂、基质、缓冲剂、润滑剂、控制释放载体、稀释剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、分散介质、糖衣、抗菌或抗真菌剂、等渗和延迟吸收剂等等。这种用于药物活性物质的介质和试剂的使用氏本领域熟知的。除可想到的不适合活性化合物的任何常规介质或试剂之外，其它的都适用于组合物。补充试剂也可以引入组合物。本发明的药物组合物可以配制得与其意欲的给药途径相适合。给药途径的实例包括肠胃外，如静脉内、真皮内、皮下、口服(如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮剂可以包括下列成分无菌稀释剂如注射用水、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以包入玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。
适合注射使用的药物组合物包括无菌含水溶液(如果是水溶的)或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，可注射组合物应该无菌并且应该是达到容易注射程度的流体。它在制备和保存条件下应该稳定并且应该抵抗微生物的污染活动，如细菌和真菌。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如通过使用糖衣如卵磷脂，和在分散剂情况下通过维持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂可以维持适当的流动性。微生物活动的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来完成，例如羟苯甲酸甲酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒等等。在很多情况下，优选组合物中包括等渗剂，如氯化钠、糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇等)。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如一硬脂酸铝和明胶可以导致可注射组合物的吸收延长。
无菌注射液可以通过将需要量的聚集蛋白聚糖酶抑制剂或抗聚集蛋白聚糖酶抗体引入、含上面列举成分的一种或组合的适当溶剂，如果需要，过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物引入含有基础分散介质和需要的上面列举的其它成分的无菌载体中而制备分散体。在是制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，后者产生活性成分加来自其前面无菌过滤的溶液的任何另外期望成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包入明胶胶囊或压缩成片剂。为了口服治疗给药，活性化合物可以与赋形剂合并和以片剂、锭剂或胶囊形式使用。也可以使用用作漱口剂的流体载体制备口服组合物，其中流体载体中的组合物经口应用和嗖嗖挥动和咳出或吞咽。可以包括药物适用的粘合剂，和/或佐剂物质作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等等可以含有任何下列成分，或类似性质的化合物粘合剂如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；分解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Stertes；助流剂如二氧化硅胶体；甜味剂如蔗糖或糊精；或矫味剂如薄荷、水杨酸甲酯或甜橙矫味剂。
对于吸入给药，化合物可以以气雾喷雾形成传递，气雾喷雾来自含有合适推进剂如二氧化碳气体的压缩容器或分配器，或喷雾器。
在一个实施方案中，可以含有生物活性化合物的治疗部分与将保护化合物对抗其在体内被快速消除的载体一起制备，如控制释放制剂，包括植入和微胶囊传递系统。也可以使用生物可降解、生物相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙二酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。也可以从市场上购买到该物质，如Alza Corporation and NovaPharmaceuticals，Inc。脂质体悬浮剂(包括对准抗病毒抗原的单克隆抗体感染的细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。可以根据本领域技术人员已知方法来制备，例如美国专利4,522,811所述。
特别有利的是口服或肠胃外组合物配制成易于给药和剂量均匀性的剂量单位形式。这里使用的剂量单位形式包括适合作为给予待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有联合需要的药物载体的预计产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格标准受控并直接依赖于活性化合物的独特特征和待达到的特定治疗效果以及化合治疗个体的这种活性化合物的领域固有限制。
药物组合物连同给药工具可以包括在容器、包装或分配器中。
IX.给药本发明包括治疗罹患以聚集蛋白聚糖降解为特征的病症的患者的方法。这些方法需要给需要这种治疗的患者施用有效量的包含聚集蛋白聚糖酶抑制剂或抑制蛋白水解活性的抗聚集蛋白聚糖酶抗体的组合物。预想本发明的聚集蛋白聚糖酶抑制剂可以通过抑制聚集蛋白聚糖酶活性或简单通过调节疾病状态中聚集蛋白聚糖酶水平来起作用。
本发明的抗聚集蛋白聚糖酶抗体和聚集蛋白聚糖酶抑制剂对诊断或治疗人或动物中的各种医学紊乱有效。在一个实施方案中，本发明的抗体可以用于相对于不被相同抗体结合的聚集蛋白聚糖酶蛋白来说，抑制或降低与聚集蛋白聚糖酶蛋白相关的至少一种活性。通常，本发明的组合物给予患者，使得抗体或它们的结合片段以范围从1μg/kg至大约100mg/kg，大约1μg/kg至大约10mg/kg，大约1μg/kg至大约1mg/kg，大约10μg/kg至大约1mg/kg，大约10μg/kg至大约100μg/kg或大约100μg/kg至大约1mg/kg的剂量给予。抗体作为大丸剂量给予，以增大抗体给予患者后可在患者体内循环的间隔时间。初次大丸剂量后也可以使用连续灌注。
在另一个实施方案中，本发明涉及给予聚集蛋白聚糖酶抑制剂，如生物分子和化学化合物。抑制剂的有效量是有效降低聚集蛋白聚糖酶活性而达到期望生物结果的剂量。通常，给予抑制剂的适当治疗剂量可以在例如大约1ng/kg至大约100mg/kg，大约1ng/kg至大约1μg/kg，大约1μg/kg至大约1mg/kg，或大约1mg/kg至大约100mg/kg的范围。抑制剂可以一次剂量给予，或间隔给予，如每天一次，每周一次，或每月一次。给予聚集蛋白聚糖酶抑制剂的剂量方案可以根据例如抑制剂与其聚集蛋白聚糖酶靶的亲和力、抑制剂的半衰期和患者情况的严重性来调整。通常，抑制剂以大丸剂量给予，以增大它们的循环水平。大丸剂量后也可以使用连续灌注。
这种化合物的毒性和治疗功效可以用细胞培养或实验动物模型中标准药物程序来确定，如确定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数并且它可以表示为LD50/ED50比率。通常优选抑制大治疗指数的抑制剂。
细胞培养试验和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的剂量范围。这种化合物的剂量可以处于显示ED50并且毒性小或无的循环浓度范围内。该剂量可以在这个范围内变化，根据采用的剂量形式和利用的给药途径。对于根据本发明使用的任何抑制剂，可以从细胞培养试验初步估计治疗有效量。可以在动物模型中配制剂量以达到显示IC50的循环血浆浓度范围(即达到症状最大抑制的一半的测试抗体浓度)，如细胞培养试验测定。可以测定血浆水平，例如用高压液相色谱。用合适生物试验可以监测任何特定剂量的效果。合适生物试验的实例包括测定聚集蛋白聚糖酶活性的试验，如使用抗体试剂如BC-3来监测滑膜流体中聚集蛋白聚糖新表位的存在或减少(Roberts等.，Arthritis Rheum.442586-98，2001)以及实施例7所述试验、DNA复制试验、基于转录的试验和免疫试验。
本发明的治疗方法包括局部、全身或作为植入物或装置局部性给予聚集蛋白聚糖酶抑制剂组合物。给予组合物的剂量方案将由照料医师根据改变聚集蛋白聚糖蛋白活动的各种因素、病变部位、疾病严重性、患者年龄、性别和饮食、任何炎症的严重性、给药时间和其它临床因素来确定。通常，全身或注射给药以最低有效的剂量开始，并且该剂量将在预先选择的时间过程中增加直到观察到正效果。随后，剂量增加将限制至产生相应增加效果的水平，同时考虑可能出现的任何副作用。其它已知因子加到最终组合物也可以影响剂量。
通过周期性估计疾病进展监测进展。例如可以通过X线、MRI或其它图像形式、滑膜流体分析和/或临床检查来监测进展。
X.检测试验和方法本发明的抑制剂和抗体可以用于检测试验和方法来确定样品中聚集蛋白聚糖酶的存在与否，或它的量。本发明的抑制剂和抗体也可以用于体内或体外检测聚集蛋白聚糖酶蛋白。通过这些蛋白的存在或水平与疾病关联，一个本领域技术人员可以诊断相关疾病或确定其严重性。上面列出了用当前公开的抑制剂和抗体可以诊断的疾病。
使用抗体的检测方法是本领域熟知的并且包括ELISA、放射免疫测定法、免疫印迹、western印迹、免疫荧光、免疫沉淀，和其它类似技术。该抗体可以进一步提供于诊断试剂盒中，它包括这些技术中至少一个来检测蛋白(如聚集蛋白聚糖酶蛋白)。这种试剂盒可以含有其它成分、包装、指导或辅助聚集蛋白聚糖酶蛋白检测的其它材料，和关于该试剂盒使用的指导。当蛋白抑制剂，例如，肽抑制剂用于这种诊断试验时，可以采用蛋白-蛋白相互作用试验。
当将抑制剂用于诊断目的时，最好对其进行修饰；例如，带上配体基团(如生物素)或可检测标记基团(如荧光基团、放射性同位素或酶)。需要时可以使用常规技术标记抗体(多克隆或单克隆)。合适的标记包括荧光团、发色团、放射活性原子、电子密集试剂、酶和具有特异性结合伙伴的配体。典型地，用酶的活性来检测该酶。例如，通过辣根过氧化物酶将四甲基联苯胺(TMB)转变为蓝色染料的能力可以检测它，用分光光度计定量。其它合适结合伙伴包括生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，IgG和蛋白A，和本领域已知的很多受体-配体偶合。
下列实施例以表达、分离和表征ADAMTS4和mTS4蛋白的方式阐述本发明的实施。
XI.实施例实施例1全长人ADAMTS4的克隆和纯化使用PCR策略克隆人ADAMTS4 cDNA。设计两组寡核苷酸引物扩增cDNA的5’和3’一半的重叠部分。用作PCR模板的七个人多组织cDNA文库中，仅子宫cDNA文库产生了适当大小的PCR产物(1294bp(SEQ IDNO2)的5′-扩增物和1421bp(SEQ ID NO3)的3′-扩增物)。用EcoRI和BamHI(5’产物)或BamHI和NotI(3’产物)消化PCR扩增片段，连接到EcoRI和NotI消化的COS表达载体pED6-dpc2，并转化ElectroMAXDH10B细胞(Invitrogen)。对ADAMTS4的克隆PCR片段进行测序，发现与公开的ADAMTS4 cDNA(SEQ ID NO4)的核苷酸序列(Tortorella等.，Science2841664-1666，1999)相比，具有三个沉默改变。这些改变是SEQ ID NO4的碱基对466的C变为T，碱基对2131的A变为G，和碱基对2758的A变为G。5’引物组是5′-AAATGGGCGAATTCCCACCATGTCCCAGACAGGCTCGCATCC-3′(SEQ IDNO5)(这个引物在ATG起始密码子上游引入了8-bp尾(AAATGGGC)(SEQ ID NO6)，EcoRI位点(GAATTC)(SEQ ID NO7)，和优化Kozak序列(CCACC)(SEQ ID NO8))和5′-TAAGAGACAGTGCCCATAGCCATTGT-3′(SEQ ID NO9)。3’引物组是5′-CTCCAAGCCATGCATCAGTTTGAATG-3′(SEQ ID NO10)和5′-GACTGACTGCGGCCGCATAGTGAGGTTATTTCCTGCCCGCC-3′(SEQ ID NO11)(这个引物在ADAMTS4的TAA终止密码子下游引入了8-bp尾(GACTGACT)(SEQ ID NO12)和NotI位点(GCGGCCGC)(SEQ ID NO13))。
含有完整ADAMTS4编码序列的EcoRI-NotI片段(SEQ ID NO14)亚克隆入pHTop。这个质粒来自pED(Kaufinan等.，Nucleic AcidsRes.194485-4490，1991)，通过去除大部分腺病毒主要晚期启动子和插入tet操纵子的六个重复(Gossen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551，1992)。稳定表达ADAMTS4的CHO细胞系通过pHTop/ADAMTS4转染CHO/A2细胞和在0.05μM氨甲蝶呤中选择克隆而得到。CHO/A2细胞系来自CHO DUKXBll细胞(Urlaub等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220，1980)，通过稳定整合转录活化剂，tet抑制子和疱疹病毒VP16转录活化结构域之间融合(Gossen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551，1992)。
收获CHO细胞条件培养基并用缓冲液A(20mM Tris(pH7.2)，5mMCaCl2，和10μM ZnCl2)稀释3倍并添加到50μPoros HQ柱(PEBiosystems，Foster City，CA)。用缓冲液B(20mM Tris(pH7.2)，50mM NaCl，5mM CaCl2和10μM ZnCl2)洗涤该柱，用含50mM至1.0M NaCl的缓冲液B线性梯度洗脱蛋白。用缓冲液C(20mM Tris(pH6.8)，50mM NaCl，5mM CaCl2和10μMZnCl2)10倍稀释后，施用50μPoros HS柱进一步纯化含ADAMTS4的部分，用10倍柱体积洗涤该柱。用含50mM至1.0M NaCl的缓冲液C线性梯度从柱中洗脱蛋白，280nm下计算的消光系数用于确定蛋白浓度，如Gill和von Hippel所概括(Gill and von Hippel，Anal.Biochem.182319-326，1989)。
实施例2用自身消化产生截短的ADAMTS4分子纯化的重组人ADAMTS4在SDS-PAGE凝胶上迁移，主要以68kD条带，连同少量(小于总蛋白的5％)53kD的物质。自身催化消化在37℃实施，通过在含5mM CaCl2和0.1-1.0M NaCl的50mMTris-醋酸盐，pH7.3中以10pg/ml至569pg/ml范围的浓度孵育纯化的ADAMTS4。通过考马斯兰染色，银染，或L9026抗体的western免疫印迹分析看到自身消化产物。
在37℃，各种时间至多16h下孵育后，检测ADAMTS4是68kD(ADAMTS4(p68))、53kDa(ADAMTS4(p53))和40kD(ADAMTS4(p40))同工型。使用浓度范围从10pg/ml至569pg/ml的ADAMTS4，和盐浓度至多达到1.0M的条件实施孵育的结果基本上等同。在相同条件下孵育ADAMTS4 ASM未产生可检测的同工型，因此证实ADAMTS4的加工是自身催化(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。
实施例3自身消化的ADAMTS4同工型的氨基酸测序和质谱分析对于N末端序列分析，在10％Bis-Tris NuPage SDS-PAGE凝胶上分离等份的自身消化的ADAMTS4同工型并转移到考马斯兰染色的PVDF膜上。相当于ADAMTS4(p68)、ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)的切除条带在PEBiosystems 491A Pulsed-Liquid测序仪上在线使用PE-Biosystemsl40S PTH分析仪(Procise-HT)接受自动测序。
对于C末端序列分析，在Poros HQ柱上分部分离自身消化的ADAMTS4同工型。随后用等梯度的含0.05-1.0MNaCl的25mM HEPES，pH6.8，5mM CaCl2和5pM ZnCl2洗脱Poros HQ柱，分部分离未结合的ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)。用Micromass LCT(LC-TOF-MS)分析仪(Micromass UK，Ltd，Manchester，U.K.)实施质谱分析。使用ABI ProSorb药筒浓缩样品并除去盐分。在Mayo Protein CoreFacility，Rochester，MN，ABI Procise C仪器上，使用乙内酰硫脲衍生化学实施C末端序列分析。
图1显示了弗林蛋白酶处理的全长ADAMTS4成熟酶(ADAMTS4(p68))和自身消化的同工型ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)的结构的图解表示。全长ADAMTS4成熟酶含有625个氨基酸(phe213-lys837，SEQ ID NO15，由对应于SEQ ID NO14的648-2522位的核苷酸序列(SEQ ID NO16)编码)。自身消化的同工型ADAMTS4(p53)含有482个氨基酸(phe213-lys694，SEQ ID NO17，由对应于SEQID NO14的648-2093位的核苷酸序列(SEQ ID NO18)编码)。自身消化的同工型ADAMTS4(p40)含有369个氨基酸(phe213-thr581，SEQ ID NO19，由对应于SEQ ID NO14的64 8-1754位的核苷酸序列(SEQ ID NO20)编码)。
ADAMTS4(p68)的序列含有Winked寡糖的非一致附着位点，并且很明显本研究使用的重组ADAMTS4实际上是非糖基化的。因此，测定ADAMTS4(p53)的分子量52,356道尔顿(LC-TOF-MS测定)与-Phe-Arg-Lys694-OH的检测C末端序列一致，表明Lys694-Phe695肽键的自身催化切割。类似地，检测ADAMTS-4(p40)的C末端序列Ser-Ala-Leu-Thr581-OH表明在Thr581-Phe582自身催化切割，计算的Phe213-Thr581的分子量(39,757道尔顿)与LC-TOF-MS测定的分子量40,040道尔顿很好地一致。
实施例4自身催化产生的ADAMTS4同工型与硫酸化GSGs的亲和力在非还原条件下用SDS-PAGE分离纯化的ADAMTS4和自身催化的ADAMTS4同工型并转移到硝酸纤维素膜上。该膜与含bHep(Calbiochem，San Diego，CA，0.05pg/ml)的含0.5M NaCl的20mM Tris，pH7.4孵育实施与生物素化的肝素(bHep)-市场上可买到的硫酸化GAG的亲和杂交。对于结合竞争实验，膜与未标记的肝素(0.5-50pg/ml)预先孵育1小时。使用牛关节软骨D1聚集蛋白聚糖实施另外的竞争实验，它是用如前所述的氯化铯平衡密度离心分馏的4M胍基HCl提取物制备的，并如前所述用或不用软骨酶ABC、角蛋白酶和karatanase II处理。也使用含0.1-1.0M NaCl的10mM磷酸钠，pH7.0的逐步梯度洗脱的肝素琼脂糖亲和柱(Amersham Pharmacia Biotech)制备ADAMTS4自身催化同工型。
亲和杂交实验揭示在0.5M NaCl存在，ADAMTS4(p68)结合生物素化的肝素，而ADAMTS4(p53)或ADAMTS4(p40)没有观察到这种结合。同样，ADAMTS4 ASM C末端缺失突变体(Metl-phe575)，缺乏“间隔”结构域，在这些条件下不结合bHep(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。自身催化ADAMTS4同工型也显示与肝素-琼脂糖结合减少。与在0.8M NaCl存在下从肝素-琼脂糖柱洗脱的ADAMTS4(p68)相比，ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)分别在0.3M NaCl和0.4M NaCl洗脱。在结合竞争实验中，与未标记肝素的亲和印迹的预孵育以剂量依赖性方式阻断bHep与ADAMTS4(p68)的结合。此外，牛聚集蛋白聚糖也阻断bHep与ADAMTS4(p68)的结合，并且这种结合竞争依赖于聚集蛋白聚糖GAGs的存在(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。由于两个截短同工型都保留了TSP-1基序(见图1)，很明显位于ADAMTS4 “间隔”结构域内的另外位点有助于GAG结合和与糖基化聚集蛋白聚糖的相互作用(Flannery等.，J.Biol.Chem.27742775-42780)。
实施例5自身催化产生的ADAMTS4同工型的聚集蛋白聚糖酶活性用实施例7所述方法确定自身催化产生的ADAMTS4同工型-ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)的聚集蛋白聚糖酶活性。简言之，牛聚集蛋白聚糖与纯化的ADAMTS4(p53)和ADAMTS4(p40)在37℃孵育16小时。消化产物用软骨素ABC和角蛋白酶除去糖基化，SDS-PAGE分离，并用使用单克隆抗体BC-3的Western印迹观察，该抗体特异性检测聚集蛋白聚糖酶切割聚集蛋白聚糖球间结构域内的glu373-ala374肽键而产生的新表位序列37ARGXX(SEQ ID NO21)。结果表明两个同工型都具有聚集蛋白聚糖酶活性(FlanHery等.，J.Biol. Chem.27742775-42780)。
实施例6修饰的人ADAMTS4分子的产生和纯化图2显示了天然未处理的ADAMTS4分子(构建体A)和各种修饰的人ADAMTS4分子(构建体B-I)的图。如构建体A所示，未处理的ADAMTS4前蛋白(SEQ ID NO1)含有信号肽(sp)、前肽(pro)、催化结构域、解联蛋白样结构域、TSP-1结构域、富含半胱氨酸的结构域和间隔结构域。
构建体B-D是用标准分子生物学技术产生的ADAMTS4构建体。构建体B(SEQ ID NO.22)是缺乏解联蛋白样结构域、TSP-1结构域、富含半胱氨酸的结构域和间隔结构域的截短的ADAMTS4分子，但是含有His标记(HHHHHH，SEQ ID NO23)。由这个构建体用弗林蛋白酶处理蛋白酶学上失活(SEQ ID NO46)。构建体C(SEQ ID NO24)含有标记序列(GSAWSHPQFEK，SEQ ID NO25)和去除了大部分间隔区域的C末端缺失。构建体D(SEQ ID NO26)是未标记的构建体C的形式。构建体C和D都可以在CHO细胞中表达。弗林蛋白酶处理的成熟蛋白构建体C和D(分别是SEQ ID NOS47和48)具有聚集蛋白聚糖酶活性。
构建体E(SEQID NO27)是在ADAMTS4的催化结构域和解联蛋白样结构域之间符合读框地插入氨基酸-GSGSGDDDDK-(SEQ ID NO28)的编码序列，连同C末端上Strep标记得到的。-GSGSG-组成易曲氨基酸间隔，DDDDK构成高度特异性蛋白酶肠激酶的识别位点。在图2的构建体B获得结果后制备这个构建体表明去除催化结构域之后的C末端结构域的编码序列产生失活的蛋白。适当处理(弗林蛋白酶切割前结构域)由构建体B得到的蛋白，但是前肽保持与催化结构域的关联。可能C末端解联蛋白样、TSP-1、富含半胱氨酸和间隔结构域的存在促进被切割前肽的催化结构域的折叠和/或移位而产生活性酶。构建体E的意图是允许全长ADAMTS4蛋白被翻译和折叠，依靠C末端标记(GSAWSHPQFEK，SEQ ID NO25)纯化，然后用外源添加的肠激酶切割产生完整催化结构域，服从活性试验和结构确定。
构建体F-I是携带活性位点突变(ASM)的修饰的ADAMTS4分子。使用快速改变定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)将单个碱基对改变(1084位G变为C)导入野生型ADAMTS4产生全长ASM构建体G(SEQ ID NO29)。该核苷酸改变导致362位glu变为gln的单个氨基酸改变(E362Q)。如实施例1所述也含有FlAG标记(VDYKDDDDK，SEQ ID NO30)的构建体G在CHO细胞中表达和纯化。E362Q突变使构建体G成熟蛋白(SEQ ID NO50)丧失了的聚集蛋白聚糖酶活性。然而该成熟蛋白比天然ADAMTS4蛋白更稳定。
截短的ASM构建体H(SEQ ID NO31)和I(SEQ ID NO32)是用引入限制性位点的PCR引物由PCR扩增构建体G的一部分产生的。构建体H缺乏间隔结构域并含有C末端FLAG表位标记。构建体I缺乏间隔结构域和TSP-1结构域并含有C末端FIAG表位标记。对于构建体H，5’引物是AglB1F5′TAAATCGAATTCCCACCATGTCCCAGACAGGCTCGCATCCCG 3′(SEQID NO33)。3’引物是AglB2R5′TATTATGTCTACTGGGCAGTCCTCAGTGTTGCAGGAG 3′(SEQ ID NO34)。对于构建体I，5’引物是AglBlF5′TAAATCGAATTCCCACCATGTCCCAGACAGGCTCGCATCCCG 3′(SEQ ID NO33)。3’引物是AglB1R5′TATTATGTCTACAGCCTGTGGAATATTGAAGTCCTGG 3′(SEQ ID NO35)。
使用BD Biosciences BDAdvantageTM-GC2 Polymerase Mix所述的标准条件实施PCR扩增。5’末端含有独特限制性位点EcoRI和3’末端含有AccI的扩增产物两步亚克隆进入含C末端FLAG标记的pHTop。简言之，用含限制性酶EcoRI和AccI在标准条件消化PCR产物。消化产物在琼脂糖凝胶上分离并从凝胶上切下相当于预测大小的条带。利用来自BioRad的Prep-A-Gene试剂盒，根据制造商的指导从凝胶上回收DNA。回收的DNA正向克隆(EcoRI-AccI)进入中间载体pTAdv-FLAG，后者是两条合成寡核苷酸Flag1 5′AATTCCTATGCTAGTGCTATCGTAGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAAG C 3′(SEQ ID NO36)和Flag2 5′GGCCGCTTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCTACGATAGCACTAGCATAGG 3′(SEQ ID NO37)一起退火并正向(EcoRI-NotI)克隆进入ClontechpTAdv载体而构建的。pTAdv-FLAG克隆载体的完整核苷酸序列如SEQID NO38中所示。
然后使用标准技术扩增证实重组质粒的序列并用限制性酶EcoRI和NotI消化。接着如上所述凝胶纯化EcoRI-NotI片段并正向克隆进入pHTop载体(SEQ ID NO39)。
在CHO/A2细胞中表达两个构建体，并使用抗FLAG亲和凝胶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)从条件培养基中纯化。在HiTrap蛋白G HP亲和柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上纯化多克隆兔抗人ADAMTS4抗血清L9026，它是用从该酶的所有结构域得到的八个不同合成肽的免疫混合物产生的。在10％SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上蛋白分离后，western免疫印迹中使用1.5pg/ml浓度的抗体并用ECL试剂(Amersham PharmaciaBiotech)在Hybond硝酸纤维素膜上检测。弗林蛋白酶处理的构建体H(SEQ ID NO51)和构建体I(SEQ ID NO52)缺乏聚集蛋白聚糖酶活性，但是比野生型ADAMTS4蛋白更稳定。
也构建含插入物的全长ADAMTS4 ASM构建体(构建体F，SEQ ID NO40)。构建体含有插入解联蛋白样结构域和TSP-1基序之间的strep标记(WSHPQFEK，SEQ ID NO41)。消化构建体F，试图解决遇到的纯化的全长ADAMTS4产量低的问题。证明ADAMTS4的C末端标记次佳，因为自身催化C末端处理造成标记丧失。在构建体F中，在解联蛋白样和Tsp结构域之间从内部去除strep标记。在这个位置，富含半胱氨酸和间隔结构域内的任何自身催化将不释放strep标记。
实施例7表达的聚集蛋白聚糖酶的生物活性根据下列试验检测表达的聚集蛋白聚糖酶蛋白的生物活性，如本发明的修饰的聚集蛋白聚糖酶。
荧光肽试验表达蛋白与包含聚集蛋白聚糖的聚集蛋白聚糖酶切割位点的氨基酸的合成肽一起孵育。合成肽的N末端或C末端中的一个用荧光团标记，另一个末端包括猝灭剂。该肽的切割使荧光团和猝灭剂分开并引起荧光。从这个试验确定表达的聚集蛋白聚糖酶蛋白可在聚集蛋白聚糖酶位点切割聚集蛋白聚糖，由相对荧光确定表达蛋白相对活性。
新表位western印迹表达的聚集蛋白聚糖酶蛋白与完整聚集蛋白聚糖孵育。所得样品的几种生物化学操作(透析、软骨酶处理、冷冻干燥和重新组成)后，样品在SDS-PAGE凝胶上泳动。凝胶与对聚集蛋白聚糖上的位点特异性的抗体孵育，该位点仅在聚集蛋白聚糖酶切割后暴露。凝胶转移到硝酸纤维素纸上并用第二抗体显影(称作western试验)，随后产生分子量与聚集蛋白聚糖酶切割聚集蛋白聚糖产生产物相同的产物的条带模式标志。这个试验得到发现-表达的聚集蛋白聚糖酶蛋白在聚集蛋白聚糖酶切割位点切割天然聚集蛋白聚糖，并且也产生切割产物的分子量。条带的相对密度可给出相对聚集蛋白聚糖酶活性的指示。
在一个实施方案中，牛关节软骨聚集蛋白聚糖与纯化的ADAMTS4或经修饰的ADAMTS4蛋白在含100mM NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris，pH7.3中，37℃孵育16小时。在软骨酶ABC(Seikagaku America，Falmouth，MA；1mU/μg聚集蛋白聚糖)、角蛋白酶(Seikagaku；1mU/μg聚集蛋白聚糖)和角蛋白酶II(Seikagaku；0.02mU/μg聚集蛋白聚糖)存在下，37孵育消化产物2小时而除去糖基化。在4-12％Bis-TrisNuPAGE SDS PAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上分离消化产物，接着电泳转移到硝酸纤维素上。用单克隆抗体(Mab)AGG-C1(0.04μg/ml)或MAb BC-3(由Dr.C.Hughes和Prof.B.Caterson，Cardiff University，UK大量提供；1∶100杂交瘤培养上清液)的western印迹检测免疫反应产物。随后膜与碱性磷酸酶结合的第二山羊抗小鼠IgG(Promega Corp.，Madison，WI；1∶7500)一起孵育，NBT/BCIP底物(Promega)用于使免疫反应条带可见。所有抗体孵育在室温实施1小时，免疫印迹与底物在室温孵育5-15分钟获得最佳显色。
聚集蛋白聚糖ELISA表达的蛋白与以前粘附塑料孔的完整聚集蛋白聚糖孵育。洗涤该孔，然后与检测聚集蛋白聚糖的抗体一起孵育。用第二抗体使该孔显影。如果孔中保留原始量的聚集蛋白聚糖，那么抗体染色浓密。如果聚集蛋白聚糖被表达的聚集蛋白聚糖酶消化，那么聚集蛋白聚糖脱离板，随后抗体对聚集蛋白聚糖包被的孔的染色减少。这个试验表明表达蛋白是否能够切割聚集蛋白聚糖(在蛋白中任何地方，不仅仅在聚集蛋白聚糖酶位点)，此外能够进一步确定相对聚集蛋白聚糖切割。
简言之，用透明质酸(ICN)包被微量滴定板(Costar)，随后用软骨酶(Seikagaku Chemicals)处理的牛聚集蛋白聚糖包被。来自表达修饰的聚集蛋白聚糖酶的CHO细胞的条件培养基添加到聚集蛋白聚糖包被的板中。洗掉在球间结构域内glu373-ala374切割的聚集蛋白聚糖。用3B3单克隆抗体(ICN)，随后是抗小鼠IgM-HRP第二抗体(Southern Biotechnology)检测剩余的未切割聚集蛋白聚糖。用3，3″，5，5″四甲基联苯胺(TMB，BioPx Laboratories)进行最后的显色。可供选择地，可以合成失活的前体形式的修饰聚集蛋白聚糖酶并可以用弗林蛋白酶处理产生成熟种。
实施例8修饰的聚集蛋白聚糖酶的表达载体的构建本领域技术人员可以通过将编码聚集蛋白聚糖酶的序列插入已知哺乳动物表达载体中，如pCD(Okayama等.，Mol.Cell Biol.2161-170，1982)，pJL3，pJL4(Gough等.，EMBOJ.4645-653，1985)和pMT2 CXM构建修饰的聚集蛋白聚糖酶的表达载体。
哺乳动物表达载体pMT2 CXM是p91023(b)(Wong等.，Science228810-815，1985)的衍生物，不同于后者，因为它含有氨苄青霉素抗性基因，代替了四环素抗性基因，并进一步含有XhoI位点以插入cDNA克隆。已经描述了pMT2 CXM的功能元件(Kaufman，等.，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA82689693，1985)包括腺病毒VA基因、包括72bp增强子的SV40复制起点、包括5’剪接位点和腺病毒晚期mRNAs上存在的大部分腺病毒三部分引导序列的腺病毒主要晚期启动子、3’剪接受体位点、二氢叶酸还原酶(DHFR)插入物、SV40早期多腺苷化位点(SV40)，和在大肠杆菌中增殖所需的pBR322序列。
质粒pMT2 CXM是由EcoRI消化pMT2-VWF得到的，pMT2-VWF已经保藏在美国典型微生物保藏中心(ATCC，Rockville，Maryland，USA)，保藏号ATCC67122。EcoRI消化切除pMT2-VWF中存在的cDNA插入物，产生线性形式的pMT2，它可以连接并用于转化对氨苄青霉素有抗性的大肠杆菌HB101或DH-5。可以用常规方法制备质粒pMT2DNA。然后使用环出/入诱变法构建pMT2 CXM(Morinaga，等.，Biotechnology 84636，1984)。去除的第1075至1145位碱基涉及SV40复制起点和pMT2的增强子序列附近的Hind III位点。此外，在核苷酸1145处它插入了下列序列5′-CATGGGCAGCTCGAG-3′(SEQ IDNO42)。这个序列含有限制性内切酶XhoI的识别位点。pMT2CXM的衍生物，术语称作pMT23，含有限制性内切酶PstI，EcoRI，SaII和XhoI的识别位点。可以用常规方法制备质粒pMT2 CXM和pMT23 DNA。
由pMT21得到的pEMC281也可以合适地实施本发明。pMT21是由pMT2得到的，pMT2是由pMT2-VWF得到的。如上所述EcoRI消化切除pMT2-VWF中存在的cDNA插入物，产生线性形式的pMT2，它可以连接并用于转化对氨苄青霉素有抗性的大肠杆菌HB101或DH-5。可以用常规方法制备质粒pMT2 DNA。
pMT21是通过下列两个修饰由pMT2得到的。第一，删除76bp的DHFR cDNA的5’非翻译区，其包括来自用于cDNA克隆的G/C标记的19个G残基。在这个过程中，插入XhoI位点，就在DHFR上游获得下列序列5′CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG 3′(SEQ ID NO43)PstI EcoRI XhoI第二，用EcoRV和Xba I消化引入单独的ClaI位点，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，并与ClaI接头(CATCGATG，SEQ ID NO44)连接。此操作删除了来自腺病毒相关RNA(VAI)区域的250bp片段，但是没有干扰VAI RNA基因表达或功能。用EcoRI和XhoI消化pMT21，并用于驱动载体pEMC2B1。
EMCV引导序列的一部分是从pMT2-ECAT1(S.K.Jung，等，J.Virol.631651-1660，1989)获得的，通过用EcoRI和PstI消化，产生2752bp片段。用TaqI消化这个片段，产生508bp的EcoRI-TaqI片段，在低熔点琼脂糖凝胶上电泳纯化它。合成带有5’TaqI突出末端和3’XhoI突出末端的68bp接头及其互补链，它具有下列序列5′CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTaqITTTGAAAAACACGATTGC3′(SEQ ID NO46)XhoI这个序列与EMC病毒引导序列的763至827核苷酸配对。也可以将EMC病毒引导序列内第10位的ATG变为ATT，随后是XhoI位点。pMT21 EcoRI-16hol片段、EMC病毒EcoRI-TagI片段，和68bp寡核苷酸接头TagI-16hol接头三个连接产生了载体pEMC2/61。
这个载体含有SV40复制起点和增强子、腺病毒主要晚期启动子、大部分腺病毒三部分引导序列的cDNA拷贝、小杂合插入序列、SV40聚腺苷酸信号和腺病毒VAI基因、DHFR和Q-内酶胺标记和EMC序列，以适当关系指导期望cDNA在哺乳动物细胞中高水平的表达。
表达载体的构建可以包括聚集蛋白聚糖酶相关DNA序列的修饰。例如，通过去除编码区5’和3’末端的非编码核苷酸，可以修饰编码聚集蛋白聚糖酶的cDNA。可以用已知有益于表达的其它序列取代删除的非编码核苷酸，也可以不进行此种取代。这些载体转化到合适宿主细胞进行聚集蛋白聚糖酶或聚集蛋白聚糖酶样蛋白的表达。另外，通过删除编码聚集蛋白聚糖酶前肽的序列并用编码其它聚集蛋白聚糖酶完全前肽的序列取代它们，可以对聚集蛋白聚糖酶序列进行操作而表达聚集蛋白聚糖酶或聚集蛋白聚糖酶样蛋白。也可能用来自不同聚集蛋白聚糖酶(如修饰的ADAMTS5)的相应结构域取代修饰的聚集蛋白聚糖酶(如修饰的ADAMTS4)中的蛋白结构域。
本领域技术人员也可以对表达载体的序列进行操作，通过消除编码序列侧翼的哺乳动物调节序列或用细菌序列取代它们而产生修饰的聚集蛋白聚糖酶分子胞内或胞外表达的细菌载体。例如，可以进一步操作编码序列(如与其它已知接头连接或通过从那里删除非编码序列或用其它已知技术改变其中的核苷酸而修饰)。使用如Taniguchi等人，(Taniguchi等.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，775230-5233，1980)所述的程序，接着可以将修饰的编码聚集蛋白聚糖酶的编码序列插入已知细菌载体中。然后这个示例的细菌载体可以转化细菌宿主细胞而表达本发明的聚集蛋白聚糖酶蛋白。对于细菌细胞中胞外表达聚集蛋白聚糖酶相关蛋白的策略，见如欧洲专利申请EP177,343。
可以对用于在昆虫细胞中表达的昆虫载体的构建实施类似的操作(见如公开的欧洲专利申请EP155,476中所述程序)。采用被酵母细胞胞内或胞外表达本发明因子的酵母调节序列也可以构建酵母载体。(见如公开的PCT申请WO86/00639和欧洲专利申请EP123,289中所述程序)。
在哺乳动物、细菌、酵母或昆虫宿主细胞系统中产生高水平的本发明聚集蛋白聚糖酶相关蛋白的方法可以包括构建含有多拷贝异源聚集蛋白聚糖酶相关基因的细胞。异源基因与可扩增标记连接，如二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，用于选择在浓度不断增加的氨甲喋呤(MTX)中增殖的含有拷贝数增加的细胞(Kaufman and Sharp，J.Mol.Biol.，159601-629，1982)。这个方法可以采用很多不同细胞类型。
例如，用各种方法包括磷酸钙共沉淀法和转染、电穿孔或原生质体融合，含有修饰的聚集蛋白聚糖酶的编码序列的表达质粒和DHFR表达质粒pAdA26SV(A)3(Kaufman and Sharp，Mol.Cell.Biol.，21304，1982)可以共导入DHFR缺陷型CHO细胞-DUKX-1311中。选择在含透析胎牛血清的alpha培养基中生长的表达DHFR的转化体，随后选择在浓度不断增加的MTX(如以0.02、0.2、1.0和5pM MTX的循序步骤)中生长的细胞进行扩增(Kaufman等.Mol.Cell Biol.，51750，1983)。克隆转化体，用上述至少一个试验监测生物活性修饰的聚集蛋白聚糖酶的表达。聚集蛋白聚糖酶蛋白表达应该随MTX抗性水平的不断增加而增加。使用本领域已知的标准技术检测修饰的聚集蛋白聚糖酶多肽的特征，如用35S甲硫氨酸或半胱氨酸脉冲标记和聚丙烯酰胺凝胶电泳。可以后续类似的程序来产生其它修饰的聚集蛋白聚糖酶或聚集蛋白聚糖酶样蛋白。
实施例9抗体的的制备制备了抗本发明修饰的聚集蛋白聚糖酶的抗体。为了开发能够抑制聚集蛋白聚糖酶活性的抗体，用与弗氏完全佐剂混合的修饰的聚集蛋白聚糖酶蛋白作为前两次免疫，其后用不完全佐剂，每隔两周免疫一组小鼠。贯穿免疫期间，对血液进行采样并测试循环抗体的存在。在第9周，选择具有循环抗体的动物，免疫连续三天并杀死。取出脾脏并匀浆成细胞。用已建立方法(Oi and Herzenberg，SelectedMethods in Cellular Immunology，W.J. Freeman Co.，SanFrancisco，CA，351，1980)使用50％PEG1500将脾细胞与骨髓瘤融合伙伴(P3-x63-Ag8.653系)融合。融合细胞以2×105个细胞/孔的密度铺在96孔微量滴定板上。24小时后，细胞接受HAT选择(Littlefleld等.，Science，145709，1964)，有效杀死未融合和无产出的融合骨髓瘤细胞。
固相和液相ELISA鉴定分泌抗聚集蛋白聚糖酶抗体的成功融合的杂交瘤细胞。如上所述从CHO细胞制备修饰的聚集蛋白聚糖酶蛋白并包裹在聚苯乙烯上(对于固相试验)或被生物素化(对于液相试验)。也可以采用中和试验，其中聚集蛋白聚糖酶包裹在聚苯乙烯板上，添加杂交瘤上清液抑制聚集蛋白聚糖酶活性。培养表达杂交瘤的聚集蛋白聚糖酶抗体并扩增进行进一步研究。通过限制性稀释克隆选择的杂交瘤并低温保存。使用小鼠免疫球蛋白同种型试剂盒(ZymedTmLaboratories，Inc.，San Francisco，CA)确定由杂交瘤产生的同种型抗体。
实施例10用抗聚集蛋白聚糖酶抗体治疗患者的方法根据实施例10开发的抗体可以给予罹患聚集蛋白聚糖损失或聚集蛋白聚糖酶活性过度相关的疾病或紊乱的患者。患者一次或间隔服用该组合物，如每天一次，并且它们的疾病或紊乱的症状和迹象改善。例如，聚集蛋白聚糖损失减少或停止和和关节软骨降解减少或停止。骨关节炎的症状减少或消失。这表明本发明的组合物对治疗聚集蛋白聚糖损失或聚集蛋白聚糖酶活性过度相关的疾病或紊乱有效。抗体也可以对易感骨关节炎的患者使用，如具有该疾病家族史或标志物，但是尚未开始遭受其影响的那些人。表2显示了试验性实验设计。
表2.用抗聚集蛋白聚糖酶抗体治疗骨关节炎
前面说明书详述了本发明目前优选的实施方案。本领域技术人员在本说明书的教导下可以预期在实践所述技术方案的过程中出现的很多改变和变型。这些改变和变型包括在关于此所附的权利要求内。本申请中引用的所有文件的全部内容引入作为参考。此外，公开的数据库和所有参考文献中引用的所有序列的全部内容引入作为参考。
序列表<110>Wyeth<120>修饰的ADAMTS4分子<130>AM101378<160>53<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>837<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Va1 Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu
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<223>这是PCR扩增克隆的人工DNA序列<220>
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<213>Homo sapiens<400>4cacagacaca tatgcacgag agagacagag gaggaaagag acagagacaa aggcacagcg60gaagaaggca gagacagggc aggcacagaa gcggcccaga cagagtccta cagagggaga120ggccagagaa gctgcagaag acacaggcag ggagagacaa agatccagga aaggagggct180caggaggaga gtttggagaa gccagacccc tgggcacctc tcccaagccc aaggactaag240ttttctccat ttcctttaac ggtcctcagc ccttctgaaa actttgcctc tgaccttggc300aggagtccaa gcccccaggc tacagagagg agctttccaa agctagggtg tggaggactt360ggtgccctag acggcctcag tccctcccag ctgcagtacc agtgccatgt cccagacagg420ctcgcatccc gggaggggct tggcagggcg ctggctgtgg ggagcccaac cctgcctcct480gctccccatt gtgccgctct cctggctggt gtggctgctt ctgctactgc tggcctctct540cctgccctca gcccggctgg ccagccccct cccccgggag gaggagatcg tgtttccaga600gaagctcaac ggcagcgtcc tgcctggctc gggcacccct gccaggctgt tgtgccgctt660gcaggccttt ggggagacgc tgctactaga gctggagcag gactccggtg tgcaggtcga720ggggctgaca gtgcagtacc tgggccaggc gcctgagctg ctgggtggag cagagcctgg780cacctacctg actggcacca tcaatggaga tccggagtcg gtggcatctc tgcactggga840tgggggagcc ctgttaggcg tgttacaata tcggggggct gaactccacc tccagcccct900ggagggaggc acccctaact ctgctggggg acctggggct cacatcctac gccggaagag960tcctgccagc ggtcaaggtc ccatgtgcaa cgtcaaggct cctcttggaa gccccagccc1020cagaccccga agagccaagc gctttgcttc actgagtaga tttgtggaga cactggtggt1080ggcagatgac aagatggccg cattccacgg tgcggggcta aagcgctacc tgctaacagt1140gatggcagca gcagccaagg ccttcaagca cccaagcatc cgcaatcctg tcagcttggt1200ggtgactcgg ctagtgatcc tggggtcagg cgaggagggg ccccaagtgg ggcccagtgc1260
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<223>PCR引物<400>5aaatgggcga attcccacca tgtcccagac aggctcgcat cc 42<210>6<21 1>8<212>DNA<213>人工<220>
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<220>
<223>EcoRI位点<400>7gaattc 6<210>8<211>5<212>DNA<213>人工<220>
<223>Kozak序列<400>8ccacc 5<210>9<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>9taagagacag tgcccatagc cattgt 26<210>10<211>26<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>10ctccaagcca tgcatcagtt tgaatg 26
<210>11<211>41<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR片段<400>11gactgactgc ggccgcatag tgaggttatt tcctgcccgc c 41<210>12<211>8<212>DNA<213>人工<220>
<223>8-bp尾序列<400>12gactgact8<210>13<211>8<212>DNA<213>人工<220>
<223>NotI位点<400>13gcggccgc8<210>14<211>2542<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR克隆的ADAMTS4 cDNA
<400>14gaattcccac catgtcccag acaggctcgc atcccgggag gggcttggca gggcgctggc60tgtggggagc tcaaccctgc ctcctgctcc ccattgtgcc gctctcctgg ctggtgtggc120tgcttctgct actgctggcc tctctcctgc cctcagcccg gctggccagc cccctccccc180gggaggagga gatcgtgttt ccagagaagc tcaacggcag cgtcctgcct ggctcgggcg240cccctgccag gctgttgtgc cgcttgcagg cctttgggga gacgctgcta ctagagctgg300agcaggactc cggtgtgcag gtcgaggggc tgacagtgca gtacctgggc caggcgcctg360agctgctggg tggagcagag cctggcacct acctgactgg caccatcaat ggagatccgg420agtcggtggc atctctgcac tgggatgggg gagccctgtt aggcgtgtta caatatcggg480gggctgaact ccacctccag cccctggagg gaggcacccc taactctgct gggggacctg540gggctcacat cctacgccgg aagagtcctg ccagcggtca aggtcccatg tgcaacgtca600aggctcctct tggaagcccc agccccagac cccgaagagc caagcgcttt gcttcactga660gtagatttgt ggagacactg gtggtggcag atgacaagat ggccgcattc cacggtgcgg720ggctaaagcg ctacctgcta acagtgatgg cagcagcagc caaggccttc aagcacccaa780gcatccgcaa tcctgtcagc ttggtggtga ctcggctagt gatcctgggg tcaggcgagg840aggggcccca agtggggccc agtgctgccc agaccctgcg cagcttctgt gcctggcagc900ggggcctcaa cacccctgag gactcggacc ctgaccactt tgacacagcc attctgttta960cccgtcagga cctgtgtgga gtctccactt gcgacacgct gggtatggct gatgtgggca1020ccgtctgtga cccggctcgg agctgtgcca ttgtggagga tgatgggctc cagtcagcct1080tcagtgctgc tcatcaactg ggtcatgtct tcaacatgct ccatgacaac tccaagccat1140gcatcagttt gaatgggcct ttgagcacct ctcgccatgt catggcccct gtgatggctc1200atgtggatcc tgaggagccc tggtccccct gcagtgcccg cttcatcact gacttcctgg1260acaatggcta tgggcactgt ctcttagaca aaccagaggc tccattgcat ctgcctgtga1320
ctttccctgg caaggactat gatgctgacc gccagtgcca gctgaccttc gggcccgact1380cacgccattg tccacagctg ccgccgccct gtgctgccct ctggtgctct ggccacctca1440atggccatgc catgtgccag accaaacact cgccctgggc cgatggcaca ccctgcgggc1500ccgcacaggc ctgcatgggt ggtcgctgcc tccacatgga ccagctccag gacttcaata1560ttccacaggc tggtggctgg ggtccttggg gaccatgggg tgactgctct cggacctgtg1620ggggtggtgt ccagttctcc tcccgagact gcacgaggcc tgtcccccgg aatggtggca1680agtactgtga gggccgccgt acccgcttcc gctcctgcaa cactgaggac tgcccgactg1740gctcagccct gaccttccgc gaggagcagt gtgctgccta caaccaccgc accgacctct1800tcaagagctt cccagggccc atggactggg ttcctcgcta cacaggcgtg gccccccagg1860accagtgcaa actcacctgc caggcccggg cactgggcta ctactatgtg ctggagccac1920gggtggtaga tgggaccccc tgttccccgg acagctcctc ggtctgtgtc cagggccgat1980gcatccatgc tggctgtgat cgcatcattg gctccaagaa gaagtttgac aagtgcatgg2040tgtgcggagg ggacggttct ggttgcagca agcagtcagg ctccttcagg aaattcaggt2100acggatacaa caatgtggtc actatccccg cgggggccac ccacattctt gtccggcagc2160agggaaaccc tggccaccgg agcatctact tggccctgaa gctgccagat ggctcctatg2220ccctcaatgg tgaatacacg ctgatgccct cccccacaga tgtggtactg cctggggcag2280tcagcttgcg ctacagcggg gccactgcag cctcagagac actgtcaggc catgggccac2340tggcccagcc tttgacactg caggtcctag tggctggcaa cccccaggac acacgcctcc2400gatacagctt cttcgtgccc cggccgaccc cttcaacgcc acgccccact ccccaggact2460ggctgcaccg aagagcacag attctggaga tccttcggcg gcgcccctgg gcgggcagga2520aataacctca ctatgcggcc gc 2542
<210>15<211>625<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp
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500 505 510Ile Tyr Leu Ala Leu Lys Leu Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Leu Asn Gly515 520 525Glu Tyr Thr Leu Met Pro Ser Pro Thr Asp Val Val Leu Pro Gly Ala530 535 540Val Ser Leu Arg Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser Glu Thr Leu Ser545 550 555 560Gly His Gly Pro Leu Ala Gln Pro Leu Thr Leu Gln Val Leu Val Ala565 570 575Gly Asn Pro Gln Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg580 585 590Pro Thr Pro Ser Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg595 600 605Arg Ala Gln Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg610 615 620Lys625<210>16<211>1875<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16tttgcttcac tgagtagatt tgtggagaca ctggtggtgg cagatgacaa gatggccgca60ttccacggtg cggggctaaa gcgctacctg ctaacagtga tggcagcagc agccaaggcc120
ttcaagcacc caagcatccg caatcctgtc agcttggtgg tgactcggct agtgatcctg180gggtcaggcg aggaggggcc ccaagtgggg cccagtgctg cccagaccct gcgcagcttc240tgtgcctggc agcggggcct caacacccct gaggactcgg accctgacca ctttgacaca300gccattctgt ttacccgtca ggacctgtgt ggagtctcca cttgcgacac gctgggtatg360gctgatgtgg gcaccgtctg tgacccggct cggagctgtg ccattgtgga ggatgatggg420ctccagtcag ccttcagtgc tgctcatcaa ctgggtcatg tcttcaacat gctccatgac480aactccaagc catgcatcag tttgaatggg cctttgagca cctctcgcca tgtcatggcc540cctgtgatgg ctcatgtgga tcctgaggag ccctggtccc cctgcagtgc ccgcttcatc600actgacttcc tggacaatgg ctatgggcac tgtctcttag acaaaccaga ggctccattg660catctgcctg tgactttccc tggcaaggac tatgatgctg accgccagtg ccagctgacc720ttcgggcccg actcacgcca ttgtccacag ctgccgccgc cctgtgctgc cctctggtgc780tctggccacc tcaatggcca tgccatgtgc cagaccaaac actcgccctg ggccgatggc840acaccctgcg ggcccgcaca ggcctgcatg ggtggtcgct gcctccacat ggaccagctc900caggacttca atattccaca ggctggtggc tggggtcctt ggggaccatg gggtgactgc960tctcggacct gtgggggtgg tgtccagttc tcctcccgag actgcacgag gcctgtcccc1020cggaatggtg gcaagtactg tgagggccgc cgtacccgct tccgctcctg caacactgag1080gactgcccga ctggctcagc cctgaccttc cgcgaggagc agtgtgctgc ctacaaccac1140cgcaccgacc tcttcaagag cttcccaggg cccatggact gggttcctcg ctacacaggc1200gtggcccccc aggaccagtg caaactcacc tgccaggccc gggcactggg ctactactat1260gtgctggagc cacgggtggt agatgggacc ccctgttccc cggacagctc ctcggtctgt1320gtccagggcc gatgcatcca tgctggctgt gatcgcatca ttggctccaa gaagaagttt1380gacaagtgca tggtgtgcgg aggggacggt tctggttgca gcaagcagtc aggctccttc1440
aggaaattca ggtacggata caacaatgtg gtcactatcc ccgcgggggc cacccacatt1500cttgtccggc agcagggaaa ccctggccac cggagcatct acttggccct gaagctgcca1560gatggctcct atgccctcaa tggtgaatac acgctgatgc cctcccccac agatgtggta1620ctgcctgggg cagtcagctt gcgctacagc ggggccactg cagcctcaga gacactgtca1680ggccatgggc cactggccca gcctttgaca ctgcaggtcc tagtggctgg caacccccagl740gacacacgcc tccgatacag cttcttcgtg ccccggccga ccccttcaac gccacgcccc1800actccccagg actggctgca ccgaagagca cagattctgg agatccttcg gcggcgcccc1860tgggcgggca ggaaa 1875<210>17<211>482<212>PRT<213>Homo sapiens<400>17Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80
Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 l90Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu His Leu Pro Val210 215 220Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala245 250 255
Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr260 265 270Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala275 280 285Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu Gln Asp Phe Asn290 295 300Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys305 310 315 320Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr325 330 335Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr340 345 350Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr Gly Ser Ala Leu355 360 365Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His Arg Thr Asp Leu370 375 380Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro Arg Tyr Thr Gly385 390 395 400Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln Ala Arg Ala Leu405 410 415Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp Gly Thr Pro Cys420 425 430
Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg Cys Ile His Ala435 440 445Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met450 455 460Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe465 470 475 480Arg Lys<210>18<211>1446<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18tttgcttcac tgagtagatt tgtggagaca ctggtggtgg cagatgacaa gatggccgca60ttccacggtg cggggctaaa gcgctacctg ctaacagtga tggcagcagc agccaaggcc120ttcaagcacc caagcatccg caatcctgtc agcttggtgg tgactcggct agtgatcctg180gggtcaggcg aggaggggcc ccaagtgggg cccagtgctg cccagaccct gcgcagcttc 240tgtgcctggc agcggggcct caacacccct gaggactcgg accctgacca ctttgacaca300gccattctgt ttacccgtca ggacctgtgt ggagtctcca cttgcgacac gctgggtatg360gctgatgtgg gcaccgtctg tgacccggct cggagctgtg ccattgtgga ggatgatggg420ctccagtcag ccttcagtgc tgctcatcaa ctgggtcatg tcttcaacat gctccatgac480aactccaagc catgcatcag tttgaatggg cctttgagca cctctcgcca tgtcatggcc540cctgtgatgg ctcatgtgga tcctgaggag ccctggtccc cctgcagtgc ccgcttcatc600actgacttcc tggacaatgg ctatgggcac tgtctcttag acaaaccaga ggctccattg660
catctgcctg tgactttccc tggcaaggac tatgatgctg accgccagtg ccagctgacc720ttcgggcccg actcacgcca ttgtccacag ctgccgccgc cctgtgctgc cctctggtgc780tctggccacc tcaatggcca tgccatgtgc cagaccaaac actcgccctg ggccgatggc840acaccctgcg ggcccgcaca ggcctgcatg ggtggtcgct gcctccacat ggaccagctc900caggacttca atattccaca ggctggtggc tggggtcctt ggggaccatg gggtgactgc960tctcggacct gtgggggtgg tgtccagttc tcctcccgag actgcacgag gcctgtcccc1020cggaatggtg gcaagtactg tgagggccgc cgtacccgct tccgctcctg caacactgag1080gactgcccga ctggctcagc cctgaccttc cgcgaggagc agtgtgctgc ctacaaccac1140cgcaccgacc tcttcaagag cttcccaggg cccatggact gggttcctcg ctacacaggc1200gtggcccccc aggaccagtg caaactcacc tgccaggccc gggcactggg ctactactat1260gtgctggagc cacgggtggt agatgggacc ccctgttccc cggacagctc ctcggtctgt1320gtccagggcc gatgcatcca tgctggctgt gatcgcatca ttggctccaa gaagaagttt1380gacaagtgca tggtgtgcgg aggggacggt tctggttgca gcaagcagtc aggctccttc1440aggaaa 1446<210>19<211>369<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30
Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Va1 Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala lle Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 190Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205
Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu His Leu Pro Val210 215 220Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala245 250 255Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr260 265 270Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala275 280 285Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu Gln Asp Phe Asn290 295 300Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys305 310 315 320Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr325 330 335Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr340 345 350Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr Gly Ser Ala Leu355 360 365Thr
<210>20<211>1107<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20tttgcttcac tgagtagatt tgtggagaca ctggtggtgg cagatgacaa gatggccgca60ttccacggtg cggggctaaa gcgctacctg ctaacagtga tggcagcagc agccaaggcc120ttcaagcacc caagcatccg caatcctgtc agcttggtgg tgactcggct agtgatcctg180gggtcaggcg aggaggggcc ccaagtgggg cccagtgctg cccagaccct gcgcagcttc240tgtgcctggc agcggggcct caacacccct gaggactcgg accctgacca ctttgacaca300gccattctgt ttacccgtca ggacctgtgt ggagtctcca cttgcgacac gctgggtatg360gctgatgtgg gcaccgtctg tgacccggct cggagctgtg ccattgtgga ggatgatggg420ctccagtcag ccttcagtgc tgctcatcaa ctgggtcatg tcttcaacat gctccatgac480aactccaagc catgcatcag tttgaatggg cctttgagca cctctcgcca tgtcatggcc540cctgtgatgg ctcatgtgga tcctgaggag ccctggtccc cctgcagtgc ccgcttcatc600actgacttcc tggacaatgg ctatgggcac tgtctcttag acaaaccaga ggctccattg660catctgcctg tgactttccc tggcaaggac tatgatgctg accgccagtg ccagctgacc720ttcgggcccg actcacgcca ttgtccacag ctgccgccgc cctgtgctgc cctctggtgc780tctggccacc tcaatggcca tgccatgtgc cagaccaaac actcgccctg ggccgatggc840acaccctgcg ggcccgcaca ggcctgcatg ggtggtcgct gcctccacat ggaccagctc900caggacttca atattccaca ggctggtggc tggggtcctt ggggaccatg gggtgactgc960tctcggacct gtgggggtgg tgtccagttc tcctcccgag actgcacgag gcctgtcccc1020cggaatggtg gcaagtactg tgagggccgc cgtacccgct tccgctcctg caacactgag1080gactgcccga ctggctcagc cctgacc1107
<210>21<211>5<212>PRT<213>人工<220>
<223>新肽<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(5)<223>X可以是任何氨基酸<400>21Ala Arg Gly Xaa Xaa1 5<210>22<211>435<212>PRT<213>人工<220>
<223>原始催化构建体<400>22Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45
Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 l05 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His lie Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220
Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400
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<223>His标记<400>23His His His His His His1 5<210>24<211>697<212>PRT<213>人工<220>
<223>截短的ADAMTS4分子<400>24Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30
Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205
Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380
Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro515 520 525Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser530 535 540Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu545 550 555 560
Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr565 570 575Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His580 585 590Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro595 600 605Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln610 615 620Ala Arg Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp625 630 635 640Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg645 650 655Cys Ile His Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe660 665 670Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser Gly Ser675 680 685Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys690 695<210>25<211>11<212>PRT<213>人工<220>
<223>构建体C标记序列
<400>25Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5 10<210>26<211>686<212>PRT<213>人工<220>
<223>截短的ADAMTS4构建体D<400>26Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110
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Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460
Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro515 520 525Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser530 535 540Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu545 550 555 560Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr565 570 575Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His580 585 590Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro595 600 605Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gln Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln610 615 620Ala Arg Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp655 630 635 640
Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg645 650 655Cys Ile His Ala Gly Cys Asp Arg Ile Ile Gly Ser Lys Lys Lys Phe660 665 670Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Gly Cys Ser675 680 685<210>27<211>858<212>PRT<21 3>人工<220>
<223>修饰的ADAMTS4分子<400>27Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Ash Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95
Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro As n Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270
Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Gly Ser Gly420 425 430Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Leu His Leu Pro Val Thr Phe435 440 445
Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr Phe Gly450 455 460Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala Ala Leu465 470 475 480Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr Lys His485 490 495Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala Cys Met500 505 510Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu Gln Asp Phe Asn Ile Pro515 520 525Gln Ala Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg530 535 540Thr Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr Arg Pro545 550 555 560Val Pro Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr Arg Phe565 570 575Arg Ser Cys Asn Thr Glu Asp Cys Pro Thr Gly Ser Ala Leu Thr Phe580 585 590Arg Glu Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His Arg Thr Asp Leu Phe Lys595 600 605Ser Phe Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro Arg Tyr Thr Gly Val Ala610 615 620
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Pro Gln Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg Pro Thr805 810 815Pro Ser Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg Arg Ala820 825 830Gln Ile Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg Lys Gly835 840 845Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys850855<210>28<211>10<212>PRT<213>人工<220>
<223>构建体E插入序列<400>28Gly Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys1 5 10<210>29<211>846<212>PRT<213>人工<220>
<223>具有活性位点突变的ADAMTS4<400>29Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15
Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190
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<223>FLAG标记序列<400>30
Val Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>31<211>584<212>PRT<2I3>人工<220>
<223>截短的ADAMTS4 ASM<400>31Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125
Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300
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<223>截短的ADAMTS4 ASM<400>32Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15
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<210>33<211>42<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>33taaatcgaat tcccaccatg tcccagacag gctcgcatcc cg 42<210>34<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400>34tattatgtct actgggcagt cctcagtgtt gcaggag 37<210>35<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>PCR引物<400> 35tat tatgtct acagcctgtg gaatattgaa gtcctgg 37<210>36<211>53<212>DNA<213>人工<220>
<223>Flag1序列
<400>36aattcctatg ctagtgctat cgtagactac aaggatgacg atgacaagta agc 53<210>37<211>53<212>DNA<213>人工<220>
<223>Flag2序列<400>37ggccgcttac ttgtcatcgt catccttgta gtctacgata gcactagcat agg 53<210>38<211>3916<212>DNA<213>人工<220>
<223>克隆载体<400>38agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcct atgctagtgc 300tatcgtagac tacaaggatg acgatgacaa gtaagcggcc gctcgagcat gcatctagag 360ggcccaattc gccctatagt gagtcgtatt acaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 420gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 480ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 540tgaatggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 600
cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc660cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt720tagggttccg atttagagct ttacggcacc tcgaccgcaa aaaacttgat ttgggtgatg780gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca840cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atcgcggtct900attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga960tttaacaaat tcagggcgca agggctgcta aaggaaccgg aacacgtaga aagccagtcc1020gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa1080cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg1140ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt1200tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcagl260gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg1320attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca1380acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt1440tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg1500gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga1560agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctcg1620ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct1680tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac1740tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc1800gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt1860gatccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt1920
caacgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggatacccg1980tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat2040cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat2100tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg2160gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa2220gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt2280gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt2340catacactat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg ggcgcggtat2400tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg2460acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta2520cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat2580catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag2640agtgacacca cgatgcctgt agcaatgcca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa2700ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca2760ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc2820ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt2880atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc2940gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat3000atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt3060tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac3120cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc3180ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca3240
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 3300gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3360ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3420gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 3480acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcat 3540tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 3600gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 3660cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 3720cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 3780ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 3840gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgagcga ccgagcgcag cgagtcagtg 3900agcgaggaag cggaag 3916<210>39<211>5676<212>DNA<213>人工<220>
<223>克隆载体<400>39aagctcgagc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg cgctgaatcc cgcggacgac60ccctctcggg gccgcttggg agtctctcgt ccccttctcc gtctgccgtt ccagccgacc120acggggcgca cctctcttta cgcggtctcc ccgtctgtgc cttctcatct gccggtccgt180gtgcacttcg cttcacctct gcacgttgca tggagaccac cgtgaacgcc catcagatcc240tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc aatgtcaacg accgaccttg300
aggcctactt caaagactgt gtgtttaagg actgggagga gctgggggag gagattaggt360taaaggtctt tgtattagga ggctgtaggc ataaattggt ctgcgcacca gcaccatgca420actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg tacatgtccc actgttcaag cctccaagct480gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgacccttat aaagaatttg gagctactgt540ggagttactc tcgtttttgc cttctgactt ctttccttcc gtcagctcga gtttaccact600ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga660aaagtgaaag tcgaggtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc720gaggtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact780ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gaggtcgagt ttaccactcc ctatcagtga840tagaaaagtg aaagtgaaag tcgaggtcga gtcgaggggg gctataaaag ggggtggggg900cgcgttcgtc ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tgggctcgcg960gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc1020cgaacggtac tccgccaccg agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga tcggaaaacc1080tctcgactgt tggggtgagt actccctctc aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt1140gtcagtttcc aaaaacgagg aggatttgat attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag1200ggtggccgcg tccatctggt cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tgaggtgtgg1260caggcttgag atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc1320acaggtgtcc actcccaggt ccaactgcag acttcgaatt ctactgagtc gacacttcta1380gactacccgg gaatgcggcc gccgcaaatt ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat1440aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg1500tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc1560tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt1620
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ttgcaagtcc gcaccaggta ctgatcatcg atgctagacc gtgcaaaagg agagcctgta3000agcgggcact cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg3060gggttcgaac cccggatccg gccgtccgcc gtgatccatc cggttaccgc ccgcgtgtcg3120aacccaggtg tgcgacgtca gacaacgggg gagcgctcct tttggcttcc ttccaggcgc3180ggcggctgct gcgctagctt ttttggcgag ctcgaattaa ttctgcatta atgaatcggc3240caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac3300tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata3360cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa3420aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct3480gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa3540agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg3600cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca3660cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa3720ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg3780gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg3840tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg3900acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc3960tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag4020attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac4080gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc4140ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag4200taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt4260
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag4320ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca4380gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact4440ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca4500gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg4560tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc4620atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg4680gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca4740tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt4800atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc4860agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc4920ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca4980tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa5040aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat5100tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa5160aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa5220accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc5280gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca5340gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt5400ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac5460catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat5520tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta5580
cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 5640tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgcc5676<210>40<211>845<212>PRT<213>人工<220>
<223>具有插入的ADAMTS4 ASM<400>40Met Ser Gln Thr Gly Ser His Pro Gly Arg Gly Leu Ala Gly Arg Trp1 5 10 15Leu Trp Gly Ala Gln Pro Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Pro Leu Ser20 25 30Trp Leu Val Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ser35 40 45Ala Arg Leu Ala Ser Pro Leu Pro Arg Glu Glu Glu Ile Val Phe Pro50 55 60Glu Lys Leu Asn Gly Ser Val Leu Pro Gly Ser Gly Ala Pro Ala Arg65 70 75 80Leu Leu Cys Arg Leu Gln Ala Phe Gly Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu85 90 95Glu Gln Asp Ser Gly Val Gln Val Glu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Leu100 105 110
Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ala Glu Pro Gly Thr Tyr Leu115 120 125Thr Gly Thr Ile Asn Gly Asp Pro Glu Ser Val Ala Ser Leu His Trp130 135 140Asp Gly Gly Ala Leu Leu Gly Val Leu Gln Tyr Arg Gly Ala Glu Leu145 150 155 160His Leu Gln Pro Leu Glu Gly Gly Thr Pro Asn Ser Ala Gly Gly Pro165 170 175Gly Ala His Ile Leu Arg Arg Lys Ser Pro Ala Ser Gly Gln Gly Pro180 185 190Met Cys Asn Val Lys Ala Pro Leu Gly Ser Pro Ser Pro Arg Pro Arg195 200 205Arg Ala Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val210 215 220Val Ala Asp Asp Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg225 230 235 240Tyr Leu Leu Thr Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro245 250 255Ser Ile Arg Asn Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu260 265 270Gly Ser Gly Glu Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr275 280 285
Leu Arg Ser Phe Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp290 295 300Ser Asp Pro Asp His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp305 310 315 320Leu Cys Gly Val Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly325 330 335Thr Val Cys Asp Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly340 345 350Leu Gln Ser Ala Phe Thr Ala Ala His Gln Leu Gly His Val Phe Asn355 360 365Met Leu His Asp Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu370 375 380Ser Thr Ser Arg His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro385 390 395 400Glu Glu Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu405 410 415Asp Asn Gly Tyr Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu420 425 430His Leu Pro Val Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln435 440 445Cys Gln Leu Thr Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro450 455 460
Pro Pro Cys Ala Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala465 470 475 480Met Cys Gln Thr Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly485 490 495Pro Ala Gln Ala Cys Met Gly Gly Arg Cys Leu His Met Asp Gln Leu500 505 510Gln Asp Phe Asn Ile Pro Gln Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ala515 520 525Gly Gly Trp Gly Pro Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys530 535 540Gly Gly Gly Val Gln Phe Ser Ser Arg Asp Cys Thr Arg Pro Val Pro545 550 555 560Arg Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Arg Arg Thr Arg Phe Arg Ser565 570 575Cys Asn Thr Glu Asp Cys ProThr Gly Ser Ala Leu Thr Phe Arg Glu580 585 590Glu Gln Cys Ala Ala Tyr Asn His Arg Thr Asp Leu Phe Lys Ser Phe595 600 605Pro Gly Pro Met Asp Trp Val Pro Arg Tyr Thr Gly Val Ala Pro Gln610 615 620Asp Gln Cys Lys Leu Thr Cys Gln Ala Arg Ala Leu Gly Tyr Tyr Tyr625 630 635 640
Val Leu Glu Pro Arg Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser645 650 655Ser Ser Val Cys Val Gln Gly Arg Cys Ile His Ala Gly Cys Asp Arg660 665 670Ile lle Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly675 680 685Asp Gly Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe Arg Lys Phe Arg690 695 700Tyr Gly Tyr Asn Asn Val Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr His Ile705 710 715 720Leu Val Arg Gln Gln Gly Asn Pro Gly His Arg Ser Ile Tyr Leu Ala725 730 735Leu Lys Leu Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Leu740 745 750Met Pro Ser Pro Thr Asp Val Val Leu Pro Gly Ala Val Ser Leu Arg755 760 765Tyr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ser Glu Thr Leu Ser Gly His Gly Pro770 775 780Leu Ala Gln Pro Leu Thr Leu Gln Val Leu Val Ala Gly Asn Pro Gln785 790 795 800Asp Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg Pro Thr Pro Ser805 810 815
Thr Pro Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg Arg Ala Gln Ile820 825 830Leu Glu Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg Lys835 840 845<210>41<211>8<212>PRT<213>人工<220>
<223>strep标记<400>41Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys1 5<210>42<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNA插入物<400>42catgggcagc tcgag 15<210>43<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>插入pMT21<400>43ctgcaggcga gcctgaattc ctcgagccat catg 34
<210>44<211>8<212>DNA<213>人工<220>
<223>Cla1接头<400>44catcgatg8<210>45<211>68<212>DNA<213>人工<220>
<223>DNA接头<400>45cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 60acgattgc 68<210>46<211>223<212>PRT<213>人工<220>
<223>弗林蛋白酶处理的构建体B<400>46Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30
Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly ProSer Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115c120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 190Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205
Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu His His His His His His210 215 220<210>47<211>485<212>PRT<213>人工<220>
<223>弗林蛋白酶处理的构建体C<400>47Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110
Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140Phe Thr Ala Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Leu His Asp145 150 155 160Asn Ser Lys Pro Cys Ile Ser Leu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Ser Arg165 170 175His Val Met Ala Pro Val Met Ala His Val Asp Pro Glu Glu Pro Trp180 185 190Ser Pro Cys Ser Ala Arg Phe Ile Thr Asp Phe Leu Asp Asn Gly Tyr195 200 205Gly His Cys Leu Leu Asp Lys Pro Glu Ala Pro Leu His Leu Pro Val210 215 220Thr Phe Pro Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Arg Gln Cys Gln Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Pro Asp Ser Arg His Cys Pro Gln Leu Pro Pro Pro Cys Ala245 250 255Ala Leu Trp Cys Ser Gly His Leu Asn Gly His Ala Met Cys Gln Thr260 265 270Lys His Ser Pro Trp Ala Asp Gly Thr Pro Cys Gly Pro Ala Gln Ala275 280 285
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<223>弗林蛋白酶处理的构建体D<400>48Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110
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<223>弗林蛋白酶处理的构建体E<400>49Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Ash Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110
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Gly Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Met Val Cys Gly Gly Asp Gly465 470 475 480Ser Gly Cys Ser Lys Gln Ser Gly Ser Phe Arg Lys Phe Arg Tyr Gly485 490 495Tyr Asn Asn Val Val Thr Ile Pro Ala Gly Ala Thr His Ile Leu Val500 505 510Arg Gln Gln Gly Asn Pro Gly His Arg Ser Ile Tyr Leu Ala Leu Lys515 520 525Leu Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Leu Asn Gly Glu Tyr Thr Leu Met Pro530 535 540Ser Pro Thr Asp Val Val Leu Pro Gly Ala Val Ser Leu Arg Tyr Ser545 550 555 560Gly Ala Thr Ala Ala Ser Glu Thr Leu Ser Gly His Gly Pro Leu Ala565 570 575Gln Pro Leu Thr Leu Gln Val Leu Val Ala Gly Asn Pro Gln Asp Thr580 585 590Arg Leu Arg Tyr Ser Phe Phe Val Pro Arg Pro Thr Pro Ser Thr Pro595 600 605Arg Pro Thr Pro Gln Asp Trp Leu His Arg Arg Ala Gln Ile Leu Glu610 615 620Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Ala Gly Arg Lys Gly Ser Ala Trp Ser625 630 635 640
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<223>弗林蛋白酶处理的构建体G<400>50Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125
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<223>弗林蛋白酶处理的构建体H<400>51Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Asp1 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60Glu Gly Pro Gln Val Gly Pro Ser Ala Ala Gln Thr Leu Arg Ser Phe65 70 75 80Cys Ala Trp Gln Arg Gly Leu Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Pro Asp85 90 95His Phe Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Val100 105 110Ser Thr Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp115 120 125Pro Ala Arg Ser Cys Ala Ile Val Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ser Ala130 135 140
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<223>弗林蛋白酶处理的构建体F<400>53Phe Ala Ser Leu Ser Arg Phe Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Aspl 5 10 15Lys Met Ala Ala Phe His Gly Ala Gly Leu Lys Arg Tyr Leu Leu Thr20 25 30Val Met Ala Ala Ala Ala Lys Ala Phe Lys His Pro Ser Ile Arg Asn35 40 45Pro Val Ser Leu Val Val Thr Arg Leu Val Ile Leu Gly Ser Gly Glu50 55 60
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权利要求
1.一种与天然存在的全长ADAMTS4蛋白相比稳定性提高的经分离并修饰的ADAMTS4蛋白，所述经修饰的ADAMTS4蛋白与天然存在的全长ADAMTS4蛋白有至少一个氨基酸的差异。
2.权利要求1的经修饰的ADAMTS4蛋白，其中天然存在的全长ADAMTS4蛋白包含SEQ ID NO15中所述的氨基酸序列。
3.权利要求1的经修饰的ADAMTS4蛋白，其中经修饰的ADAMTS4蛋白与天然存在的全长ADAMTS4蛋白的氨基酸序列的差异是通过选自置换、删除、插入和化学修饰氨基酸残基的方法，改变天然存在的全长ADAMTS4蛋白中的至少一个氨基酸而导入的。
4.权利要求1的经分离并修饰的ADAMTS4蛋白，包含全部或一部分ADAMTS4间隔结构域的缺失，其中经修饰的ADAMTS4蛋白具有聚集蛋白聚糖酶活性。
5.权利要求1的经分离并修饰的ADAMTS4蛋白，其中所述蛋白不具有自身催化活性。
6.权利要求1的经分离并修饰的ADAMTS4蛋白，其中所述蛋白包含肽标记。
7.权利要求1的经分离并修饰的ADAMTS4蛋白，其中所述蛋白包含ADAMTS4催化结构域中的突变，该突变消除了所述经修饰的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性。
8.权利要求7的经分离并修饰的ADAMTS4蛋白，进一步包含全部或一部分ADAMTS4间隔结构域的缺失。
9.一种与具有SEQ ID NO15所述的氨基酸序列的ADAMTS4蛋白相比稳定性提高的经分离并修饰的ADAMTS4蛋白，所述经修饰的ADAMTS4蛋白包含选自SEQ ID NOS17，19，22，24，26，27，29，31，32，40和46-53的氨基酸序列。
10.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1的经修饰的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列。
11.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求9的经修饰的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列。
12.一种载体，其包含与表达控制序列可操作性连接的权利要求10的多核苷酸。
13.一种载体，其包含与表达控制序列可操作性连接的权利要求11的多核苷酸。
14.一种制备经修饰的ADAMTS4蛋白的方法，所述方法包括将包含编码权利要求1所述的经修饰的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列的多核苷酸导入细胞；在允许由该多核苷酸表达经修饰的ADAMTS4蛋白的条件下培养所述宿主细胞；和从该宿主细胞纯化经修饰的ADAMTS4蛋白。
15.一种制备经修饰的ADAMTS4蛋白的方法，所述方法包括将包含编码权利要求9所述经修饰的ADAMTS4蛋白的核苷酸序列的多核苷酸导入细胞；在允许由该多核苷酸表达经修饰的ADAMTS4蛋白的条件下培养所述宿主细胞；和从该宿主细胞纯化经修饰的ADAMTS4蛋白。
16.一种鉴定权利要求1的经修饰的ADAMTS4蛋白的抑制剂的方法，所述方法包括步骤鉴定经修饰的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性；将经修饰的ADAMTS4蛋白与候选试剂接触；在所述候选试剂存在下，确定经修饰的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性；和确定所述候选试剂是否影响经修饰的ADAMTS4蛋白的活性。
17.一种治疗聚集蛋白聚糖酶相关疾病的药物组合物，包括(a)权利要求1的经修饰的ADAMTS4蛋白的抑制剂或权利要求1的经修饰的ADAMTS4蛋白特异性结合的抗体；和(b)药学上可接受的载体。
18.权利要求17的药物组合物，其中抗体抑制经修饰的ADAMTS4蛋白的聚集蛋白聚糖酶活性。
19.一种治疗哺乳动物中聚集蛋白聚糖酶相关疾病的方法，所述方法包括步骤给哺乳动物导入有效量的权利要求17的药物组合物。
20.权利要求19的方法，其中聚集蛋白聚糖酶相关疾病是骨关节炎。
全文摘要
本发明涉及与相应天然的未修饰蛋白相比稳定性提高的经修饰的ADAMTS4蛋白。该经修饰的ADAMTS4蛋白可以大量表达和分离，因此允许进一步研究该蛋白的特征，如结晶学和酶动力研究。纯化的稳定蛋白也将促进抗ADAMTS抗体的产生和ADAMTS酶抑制剂的开发。
文档编号C12Q1/37GK1681920SQ03818423
公开日2005年10月12日 申请日期2003年7月29日 优先权日2002年7月29日
发明者克里斯托弗·约翰·科科伦, 卡尔·R·弗兰纳里, 曾维兰, 利萨·A·拉塞, 托马斯·麦克多纳, 贝坦尼·A·弗里曼, 凯蒂·E·乔治亚迪斯, 爱德华·R·拉瓦利 申请人:惠氏公司