专利名称：棉花高强纤维基因主效基因位点及其分子标记的制作方法
技术领域：
本发明公开了棉花高强纤维基因主效基因位点及其分子标记，属于新基因资源的发掘及利用方法。专用于快速棉花纤维比强度的分子标记辅助选择，开展棉花纤维品质的分子育种、生产与品质检测。
(二)技术背景棉纤维是重要的纺织工业原料，随着纺织技术的不断革新以大力降低成本提高纺织效率，气流转子纺、喷气纺和摩擦纺技术正迅速淘汰老式环锭纺技术，这些新的纺织技术由于不能充分利用棉纤维的内在品质潜力，对纤维品质则有更高的要求。因此迫切需要迅速提高我国棉花纤维品质。近15年来我国自育的棉花品种产量略高于美国，但纤维品质则有些差距。我国当家品种的纤维品质中等，基本能满足纺织工业的要求，但品质单一，纤维强度偏低，纺高支纱的优质棉需大量进口(项时康等，1999，论我国棉花质量现状，棉花学报，11(1)1-10)。我国的棉花育种工作者为了提高棉花纤维内在品质，做了大量研究，但进展缓慢一方面是因为缺乏大批量优质纤维的基因资源，同时也由于纤维品质与产量存在较大的负相关，培育的品系产量普遍较常规推广品种低一成以上，都未能在生产上推广种植。
美国棉花品质育种的研究已有50多年的历史。Culp等人从1946年开始PD种质改良计划，历时40余年，发放了30多个种质系和3个品种。这些种质系或品种的纤维品质，尤其是纤维强度较常规品种有较大的提高，产量达到推广品种的水平。1982年以来，为适应纺织工业设备的改造，美国加快了对棉花纤维品质的改良。仅1982-1986年度鼓励棉纤维强度育种的奖金就高达560万美元。从1980年起，美国纤维比强度每年提高0.25g/tex，到1991年平均达到了21.7cN/tex。
要提高现有陆地棉品种的纤维品质水平，首先要收集高强纤维种质系作亲本与现有高产推广品种进行一系列杂交和互交，以便打破强度与产量之间的负相关，但在每轮回交中，都要对纤维品质进行检测，成本很高，而且要等到收花期结束一段时间后才能知道结果，而且，要求育种群体大，盲目性也大。因此，品质育种的成本很高，难度较大，进展缓慢。
分子标记辅助选择可以将传统的表型选择转变为直接选择基因型，从而大大提高选择效率。为了提高棉花纤维品质育种的效率，从1994年起，美国已开展了高强纤维的分子标记研究。Jiang等利用海陆杂种F2群体识别出3个与比强度有关的QTLs，单个位点能解释9.7％～13.3％的表型变异。Kohel等同样在陆海杂种后代中找到4个QTLs与强度有关，单个位点的效应在10.4～23.1％之间；利用陆地棉杂种群体，Shapply等找到了6个与强度有关的QTLs，Ulloa等找到了3个与比强度有关的QTLs，能解释10.6～24.1％的变异。到目前为止，所发现单个QTL的效应在9.7％～24.0％之间。
发明内容技术问题 本发明棉花高强纤维基因主效基因位点及其分子标记目的是克服现有技术中品质育种的成本很高，难度较大，进展缓慢的缺陷，发掘出优质的纤维基因资源，为棉花的品质育种提供基因资源和标记辅助选择的技术，从而大大提高高强纤维的选择效率，尽快提高我国棉花品种的纤维品质，并应用于高强纤维棉花品种的生产与品质检测。
技术方案本发明所提供的棉花高强纤维基因主效基因位点，其特征在于主效基因位点QTLfs-2，有3个SSR标记与之连锁，由标记NAU/SSR/FS130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160定位，分别为NAU/SSR/Fs1，用SSR1017引物可扩增出130对核苷酸长的DNA片段；NAU/SSR/Fs2，用SSR1122引物可扩增出160对核苷酸长的DNA片段；NAU/SSR/Fs3，用SSR1395引物可扩增出160对核苷酸长的DNA片段；该主效基因位点位于棉花第16染色体上，以加性和隐性遗传效应为主，在高强纤维种质系HS427-10和遗传标准系TM-1进行杂交的F2群体中可解释12.5％的表型变异，在HS427-10×TM-1的F2:3中可解释16.9％的表型变异。
上述棉花高强纤维基因主效基因位点，是通过以下方法获得标记定位的1)选出纯合稳定的陆地棉株系HS427-10，纤维强度42.3g/tex，纤维长度32.6mm，纤维细度5.18，陆地棉遗传标准系TM-1，纤维强度31.33g/tex，纤维长度30.7mm，纤维细度5.39；2)将株系HS427-10与TM-1进行杂交，F1种子自交产生F2种子，用CTAB法提取F2分离群体的单株DNA，吐絮后，单株收花、取样、进行纤维品质测定；3)检验HS427-10×TM-1 F3株行中单株的纤维强度，以便用平均值来估算HS427-10×TM-1F2的单株水平；4)利用P1、P2、F1、F2和F2:3五世代的纤维品质数据，采用主基因与多基因混合遗传模型的多世代联合分析的方法，估算棉纤维品质的最适模型为多基因加性——显性遗传模型，所检测的多基因以加性遗传效应为主，负向显性；5)用487对SSR引物首先对HS427-10和TM-1亲本的DNA多态性进行初步分析，PCR反应体积为10ul67mM of Tris-Hcl(PH8.8)，16mM(NH4)SO4，2.5mM of Mgcl2，0.2mM of dNTPs，0.6uM of primer，0.5 unit of Taqase和基因组DNA 20ng，PCR反应程序为94℃预变性2分钟后，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，循环35次，最后72℃延伸7分种；在PE9600扩增仪上进行扩增，扩增产物在PAGE胶上电泳，然后银染；分子标记初步筛选结果表明，有37对SSR引物在双亲上有差异，将这37对引物分析182个F2分离单株，共获得44个多态性位点，用MAPMAKER/EXP 3.0构建HS427-10×TM-1F2群体的连锁图谱，共获得7个连锁群，利用MAPMAKER/QTL 3.0进行纤维品质性状QTL检测，筛选到两个与纤维比强度有关的QTL，其中一个QTL位于染色体16，有3个SSR标记与之连锁，分别为NAU/SSR/Fs1，NAU/SSR/Fs2，NAU/SSR/Fs3，该QTL在HS427-10×TM-1 F2群体中可解释12.5％的表型变异，在HS427-10×TM-1 F2:3中可解释16.9％的表型变异。
利用NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS31603个分子标记辅助筛选发现，基因QTLfs-2在二倍体野生种和一般常规品种中都不存在，只出现在大部分的高强纤维种质系中，QTLfs-2在不同年份，不同环境表现稳定。
本发明主效基因位点QTLfs-2的分子标记为NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160或NAU/SSR/FS3160。
有益效果本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果1.通过高强纤维种质系HS427-10和遗传标准系TM-1进行杂交，F2、F2:3的遗传研究，发现HS427-10高强纤维的遗传方式为加性遗传效应为主，负向显性；2.在F2、F2:3遗传分析的基础上，通过分子标记的基因组扫描，发现在第16染色体上有一个能显著提高棉花纤维强度的主效基因位点QTLfs-2，其中有3个SSR标记，NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160与之紧密连锁(图1)，该主效基因位点以加性和隐性遗传效应为主，在HS427-10×TM-1的F2群体中可解释12.5％的表型变异，在HS427-10×TM-1的F2:3中可解释16.9％的表型变异。
3.利用NAU/SSR/FS1130等3个分子标记辅助筛选发现，这一标记的基因或QTL在4个二倍体野生种和一般常规品种中都不存在，但出现在大部分的高强纤维种质系中(图2)，说明大多数的高强纤维种质系都有QTLfs-2这一相同的基因，因此它具有很高的利用价值。
4.育种实践证明QTLfs-2在不同年份，不同环境表现稳定。这为尽快提高我国棉花品种的纤维品质水平打下了基础。
5.本发明不但有助于打破强度与产量之间的负相关，而且克服了现有育种技术对纤维品质进行检测成本很高，要求育种群体大，盲目性大，棉花种子产业发展迟缓的问题，利用本发明棉花高强纤维基因主效基因位点及其分子标记，大大提高高强纤维的选择效率，尽快提高我国棉花品种的纤维品质，并应用于高强纤维棉花品种的生产与品质检测，大大加快我国高强纤维棉花品种种子产业化。
图1 第16染色体，有3个SSR标记，NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160与基因QTLfs-2紧密连锁图2 基因QTLfs-2在二倍体野生种和一般常规品种中都不存在，只出现在大部分的高强纤维种质系中1.分子量标记，2.HS427-10，3.TM-1，4.Acala 3080，5.PD4381，6.7235，7.海7124，8.PD6992，9.苏棉12号，10.苏棉16号，11.中棉所35，12.泗棉3号，13.中棉所41，14.SGK321，15.743208，16.743209，17.低酚棉品系具体实施方式
本发明的实施程序是将引自美国农业部南方平原研究中心作物种质资源研究室的陆地棉高强纤维种质系HS427-10进行单株选择，并测定纤维品质，选出纯合稳定的株系HS427-10，据2000年和2001年的测定结果，株系HS427-10两年纤维品质平均数分别为纤维强度42.3g/tex，纤维长度32.6mm，纤维细度5.18，陆地棉遗传标准系TM-1(美国岱字棉14品种自交15代以上，由美国德克萨斯州大学城农业部南方平原农业研究中心的Kohel博士提供)为纤维强度31.33g/tex，纤维长度30.7mm，纤维细度5.39。
1999年将株系HS427-10与TM-1进行杂交，年底F1种子送到海南岛，自交产生F2种子。2000年将HS427-10×TM-1的F2分离群体种在南京农业大学江浦试验站。用CTAB法提取这一分离群体的单株DNA。吐絮后，单株收花、取样、进行纤维品质测定。2001年在南京农业大学江浦试验站种植(HS427-10×TM-1)F3株行，以便用F3株行中单株的纤维强度平均值来估算(HS427-10×TM-1)F2的单株水平。所有棉样均送到河南安阳农业部纤维品质和种子质量检测中心进行纤维品质检验。
利用P1、P2、F1、F2和F2:3五世代的纤维品质数据，采用盖均镒等提出的主基因与多基因混合遗传模型的多世代联合分析的方法(盖钧镒，王建康.利用回交或F2:3家系世代鉴定数量性状主基因-多基因混合遗传模型。作物学报，1998，24(4)402-409)，估算棉纤维品质的遗传方式，其理论基础是混合分布理论，将分离世代的分布看成为多个主基因型在多基因与环境修饰下形成的多个正态分布的混合分布，主要方法是通过极大似然法和EM算法对混合分布的有关成分分布参数做出估计，然后通过AIC值判别及适合性检验，从中选择最适遗传模型，并由此估计出相应的主基因与多基因效应值，方差及有关遗传参数，该方法的主要步骤为1样本似然函数与遗传模型的建立；2用迭代ECM算法估计模型的分布函数；3、用AIC准则和适合性检验选择最优模型；4、用最小二乘法估计入选模型的有关遗传参数。结果为纤维强度的最适模型为C0模型(多基因加性——显性遗传模型)，适合性检验全部通过，即由多基因加性——显性遗传模型控制，未能检测出主基因。所检测的多基因以加性遗传效应为主，负向显性。
用487对SSR引物首先对HS427-10和TM-1亲本的DNA多态性进行初步分析。301对微卫星(SSR)标记引物购自美国Research Genetics公司。186对微卫星(SSR)标记引物依据美国Reddy博士，美国农业部南方研究中心John博士，美国密西西比洲立大学Saha教授等提供的序列由上海生工生物技术公司合成。Taq酶、dNTPs等PCR反应试剂均购自Sigma公司。PCR反应体积为10ul，其中，67mM of Tris-Hcl(PH8.8)，16mM(NH4)SO4，2.5mM of Mgcl2，0.2mM ofdNTPs，0.6uM of primer，0.5 unit of Taqase和基因组DNA 20ng。PCR反应在Thermal Cycle 9600(Perkin-Elmer)和PTC-225(MJ Research)上扩增。PCR反应程序为94℃预变性2分钟后，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，循环35次，最后72℃延伸7分种；在PE9600扩增仪上进行扩增，扩增产物在PAGE胶上电泳，然后银染，银染过程为固定(10％酒精，0.5％冰醋酸)12分钟，0.2％AgNO3中染色12分钟，水洗2次，每次2分钟，显色液(1.5％NaOH，％HCHOH)中显色，记录结果。分子标记初步筛选结果表明，有37对SSR引物在双亲上有差异。将这37对引物分析182个F2分离单株，共获得44个多态性位点。用MAPMAKER/EXP 3.0构建(HS427-10×TM-1)F2群体的连锁图谱，共获得7个连锁群，其中6个分别定位于棉花染色体23(含有11个位点)、染色体16(3个位点)(图1)、染色体12(4个位点)、染色体9(3个位点)、染色体5(2个位点)和染色体20(2个位点)利用MAPMAKER/QTL 3.0进行纤维品质性状QTL检测，筛选到两个与纤维比强度有关的QTL，其中一个QTL位于染色体16，有3个SSR标记与之连锁，分别为NAU/SSR/Fs1(用SSR1017引物可扩增出130对核苷酸长的DNA片段)，NAU/SSR/Fs2(用SSR1122引物可扩增出160对核苷酸长的DNA片段)，NAU/SSR/Fs3(用SSR1395引物可扩增出160对核苷酸长的DNA片段)。该QTL在(HS427-10×TM-1)F2群体中可解释12.5％的表型变异，在(HS427-10×TM-1)F2:3中可解释16.9％的表型变异。该QTL以加性和隐性遗传效应为主。因此，用分子标记辅助选择可有效地开展棉花的高强纤维育种。美国学者在陆地棉第16染色体上均没有发现能提高纤维强度的基因(R.J.Kohel等.Molecular mapping and characterization of traitscontrolling fiber quality in cotton.Euphytica，2001，121163-172.C X Jiang etal，Polyploid formation created unique avenues for response to selection inGossypium(cotton)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，954419-4424.)另外，我们选择了四个棉属二倍体野生种(分别为异常棉、瑟伯氏棉和陆地棉的两个供体亲本非洲草棉、雷蒙德氏棉)，5个陆地棉高强纤维种质系(分别为7235、Acala3080、PD4381、PD6992和渝棉1号，1个海岛棉(海7124)，10个陆地棉常规品种(分别为苏棉12、苏棉16、中棉所35、中棉所41、泗棉3号、SGK321、徐棉6号、湘杂棉2号的两个亲本和1个低酚棉品种)以及本试验的两亲本HS427-10和TM-1，用三个SSR引物SSR1017、SSR1122、SSR1395分析这些材料，以研究与之相连锁的纤维基因的QTLfs-2起源以及不同高强纤维种质(7235、Acala3080、PD4381和渝棉1号)中是否存在该标记。结果为这三个标记在四个二倍体野生种中都不存在，而出现在6个高强纤维种质的5个(7235、Acala3080、PD4381和渝棉1号)中，而在所有供试的10个常规品种中都不存在该标记(图2)，说明与SSR1122连锁的高强纤维基因可能来源于Acala或PD种质，目前大多数的高强纤维种质可能有相同的起源，该标记可能是纤维比强度的通用标记，因此具有很高的利用价值。
利用SSR1395共显性分子标记，对(泗棉3号×7235)BC1F6分离群体中的443株DNA进行了分子标记的检测。发现分子标记纯合的190株棉株的纤维强度为24.87cN/tex，显著高于没有分子标记的棉株的23.62cN/tex(表1)。这说明，利用我们筛选出的分子标记可显著提高棉花纤维强度的选择效率。
表1 (泗棉3号×7235)BC1F6分离群体SSR1395分子标记辅助选择QTLFS-2的效果标记 基因型 植株数 纤维比强度 差异 T值 P(cN/tex)SSR1395 ++ 190 24.87 1.25 6.07**＜0.01-- 207 23.62++ 190 24.87 0.27 0.84＞0.05+- 46 24.60+- 46 24.60 0.98 2.78**＜0.01-- 207 23.62+有QTLFS-2的分子标记-无QTLFS-2的分子标记
权利要求
1.棉花高强纤维基因主效基因位点，其特征在于主效基因位点QTLfs-2，有3个SSR标记与之连锁，由标记NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160，NAU/SSR/FS3160定位，分别为NAU/SSR/Fs1，用SSR1017引物可扩增出长度为130对核苷酸的DNA片段；NAU/SSR/Fs2，用SSR1122引物可扩增出长度为160对核苷酸的DNA片段；NAU/SSR/Fs3，用SSR1395引物可扩增出长度为160对核苷酸的DNA片段；该主效基因位点位于棉花第16染色体上，以加性和隐性遗传效应为主，在高强纤维种质系HS427-10和遗传标准系TM-1进行杂交的F2群体中可解释12.5％的表型变异，在HS427-10×TM-1的F23中可解释16.9％的表型变异。
2.根据权利要求1所述的棉花高强纤维基因主效基因位点，其特征在于这一主效基因位点是通过以下方法获得标记定位的1)选出纯合稳定的陆地棉株系HS427-10，纤维强度42.3g/tex，纤维长度32.6mm，纤维细度5.18，陆地棉遗传标准系TM-1，纤维强度31.33g/tex，纤维长度30.7mm，纤维细度5.39；2)将株系HS427-10与TM-1进行杂交，F1种子自交产生F2种子，用CTAB法提取F2分离群体的单株DNA，吐絮后，单株收花、取样、进行纤维品质测定；3)检验HS427-10×TM-1 F3株行中单株的纤维强度，以便用平均值来估算HS427-10×TM-1F2的单株水平；4)利用P1、P2、F1、F2和F23五世代的纤维品质数据，采用主基因与多基因混合遗传模型的多世代联合分析的方法，估算棉纤维品质的最适模型为多基因加性——显性遗传模型，所检测的多基因以加性遗传效应为主，负向显性；5)用487对SSR引物首先对HS427-10和TM-1亲本的DNA多态性进行初步分析，PCR反应体积为10ul67mM of Tris-Hcl(PH8.8)，16mM(NH4)SO4，2.5mM of Mgcl2，0.2mM of dNTPs，0.6uM of primer，0.5unit of Taqase和基因组DNA20ng，PCR反应程序为94℃预变性2分钟后，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，循环35次，最后72℃延伸7分种；在PE9600扩增仪上进行扩增，扩增产物在PAGE胶上电泳，然后银染；分子标记初步筛选结果表明，有37对SSR引物在双亲上有差异，将这37对引物分析182个F2分离单株，共获得44个多态性位点，用MAPMAKER/EXP 3.0构建HS427-10×TM-1F2群体的连锁图谱，共获得7个连锁群，利用MAPMAKER/QTL 3.0进行纤维品质性状QTL检测，筛选到两个与纤维比强度有关的QTL，其中一个QTL位于染色体16，有3个SSR标记与之连锁，分别为NAU/SSR/Fs1，NAU/SSR/Fs2，NAU/SSR/Fs3，该QTL在HS427-10×TM-1 F2群体中可解释12.5％的表型变异，在HS427-10×TM-1 F23中可解释16.9％的表型变异。
3.权利要求1或2所述棉花高强纤维基因主效基因位点的分子标记，其特征在于主效基因位点QTLfs-2的分子标记为NAU/SSR/FS1130，NAU/SSR/FS2160或NAU/SSR/FS3160。
全文摘要
本发明公开了棉花高强纤维基因主效基因位点及其分子标记，专用于快速棉花纤维比强度的分子标记辅助选择。主效基因位点QTLfs－2，有3个SSR标记与之连锁，由标记NAU/SSR/FS文档编号C12P19/00GK1528912SQ200310106110
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月21日 优先权日2003年10月21日
发明者张天真, 沈新莲, 郭旺珍 申请人:南京农业大学