专利名称：用作抗原递送系统的抗原转导的t细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及T细胞形式的抗原递送系统，所述T细胞在检测免疫应答中的用途，以及制备所述T细胞的方法。
背景技术：
研究将基因转移入人细胞以治疗各种遗传和获得性人类疾病。由于单个基因缺陷的遗传疾病最初被作为基因治疗的主要靶。然而，到目前为止大多数许可的人类基因治疗实验涉及治疗获得性疾病，例如癌症或AIDS。肿瘤基因治疗的一个方法有赖于通过用遗传改造的肿瘤细胞免疫人类来激活宿主免疫系统对肿瘤抗原的抵抗力，所述遗传改造的肿瘤细胞中的转基因(细胞因子，异(allo)-HLA等)的目的是为了提高它们的免疫原性。可选的方法基于对回体产生的肿瘤特异性效应物的过继转移。输入的效应物通常是自体的或HLA-相容性淋巴细胞，所述通过特异性或非特异性刺激在体外激活从而增殖，EP 0 904 786公开了通过至少连续两次给药一种组合物来进行肿瘤免疫的方法，所述组合物基本上由能在患者体内呈递抗原的自体或HLA-相关的细胞组成，所述细胞是用外来基因转导的肿瘤细胞，或者是用肿瘤抗原和外来抗原转导的抗原呈递细胞。
WO97/19169公开了含有肿瘤细胞的肿瘤疫苗，所述肿瘤细胞中至少一部分在细胞表面具有至少一种患者的MHC-I单体型(hyplotype)并负载了抗原。
因此，现有技术利用肿瘤细胞作为抗原递送系统，或者利用将抗原直接呈递给T细胞的抗原呈递细胞。
然而，应理解仍需要提供疫苗和免疫方法。本发明提供了这种方法。
发明概述本发明涉及经过处理的T细胞，当其被导入患者时可以使抗原(例如肿瘤、细菌或病毒抗原)与专职的抗原呈递细胞(APC)相接触。更具体地，本发明提供了含有外源(或外来)基因的转导的T细胞，所述基因编码抗原以刺激针对该抗原的应答，还提供了负载了抗原多肽的T细胞以刺激应答。所述T细胞还可包含另外的抗原，例如HSV-Tk，其可用作检测疫苗接种的有效性。方便地，该T细胞可在体外制备，并且当被注入或导入体内时，其将转基因产物携带到专职的抗原呈递细胞，从而刺激针对所述转基因产物的免疫应答。本发明还提供了监测患者免疫状况的方法。本发明还提供了培养T细胞的方法。
因此，我们现在发现含有抗原的T细胞可将抗原递送给抗原呈递细胞(APC)，使得所述APC随后呈递所述抗原以产生免疫应答。本发明因此采用了区别于现有技术的不同策略。
发明内容
本发明一方面提供了包含T细胞的递送系统，该T细胞包含至少一种抗原并能够将所述抗原递送给淋巴结或者淋巴系统的其它部分。
换言之，本发明提供了包含T细胞的递送系统，该T细胞包含至少一种抗原，所述递送系统能够使抗原呈递细胞(APCs)负载该抗原。
所述抗原对T细胞而言是异源的。“异源”包括通常对于所述T细胞而言是异源的抗原。
所述抗原可作为编码该抗原的多核苷酸被导入T细胞，即，所述T细胞可用所述多核苷酸转染或转导，或者所述T细胞可负载多肽但也可是蛋白质形式的所述抗原。为了便于参照，术语多肽和蛋白质通常在全文中可互换使用。因此，通过包含所述抗原的T细胞，我们指所述抗原与所述T细胞相结合使得所述T细胞能够将所述抗原递送给淋巴结和/或APC。
根据本发明另一方面，提供了包含T细胞的递送系统，所述T细胞包含至少一种抗原并能够将所述抗原递送给APC，并随后由所述APC呈递该抗原。
一个实施方案中，异源抗原是细菌和病毒抗原。优选所述异源抗原是肿瘤抗原。
优选所述T细胞还包含至少一种其它异源多肽和多核苷酸序列。
一个实施方案中，所述其它异源基因是标记物，即标记和选择基因。
优选所述标记物是细菌抗性基因，例如赋予新霉素抗性的细菌抗性基因。
另一实施方案中，所述标记物是另一种抗原，优选HSV-Tk或CD20。该抗原是尤其优选的，这是由于它们可用于所谓的自杀系统中。
在另一实施方案中，所述递送系统还包括其它抗原和标记基因。
优选所述T细胞表达至少一种以下标记物HLA-I，HLA-II，CD80，CD86，CD27，CD40L，CD62L，CCR7，CD54和CD25。
因此，本发明另一方面提供了表达至少一种以下标记物的T细胞HLA-I，HLA-II，CD80，CD86，CD27，CD40L，CD62L，CCR7，CD54和CD25。
本发明另一方面提供了包含至少两种能够激发免疫应答的抗原的T细胞的用途，且针对其中一种抗原的免疫应答被用于监测针对另一种抗原的免疫应答。
本发明另一方面提供了监测对T细胞的免疫应答的方法，其中所述T细胞含有能够激发免疫应答的第一抗原，所述方法包括将第二抗原导入该T细胞。
本发明另一方面提供了在体内对APC进行负载的方法，包括将所述APC暴露于含有抗原的T细胞。
本发明另一方面提供了获得用于权利要求的方法的T细胞的方法，包括分离T细胞；活化所述T细胞；培养所述T细胞；将抗原导入所述T细胞。
优选所述T细胞用编码所述抗原的多核苷酸序列转导或转染。
优选所述T细胞用植物血凝素(phytoemoagglutine)、抗-CD3单克隆抗体或抗-CD3/CD28单克隆抗体-包被的珠活化。
优选所述T细胞在存在生长因子的条件下培养，所述生长因子例如hu-r-IL-2。
优选所述T细胞在含有5％自体血清的培养基中培养。
优选所述T细胞以1×106细胞/ml进行培养。
本发明另一方面提供了可通过本发明的方法获得的T细胞，其可用作本发明的递送系统。
发明详述各种优选的特征和本发明的实施方案将通过非限制性实例进行描述。
尽管通常本文所述的技术是本领域已知的，可参考Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Short Protocolsin Molecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley&Sons，Inc(以及完整版的Current Protocols in Molecular Biology)。
总体上本发明涉及体外操作T淋巴细胞(T细胞)，当所述T细胞注入体内时可携带抗原(例如肿瘤，细菌或病毒抗原)，使所述抗原于专职的抗原呈递细胞相接触。然而，本发明还包括T细胞的体内操作。更具体地，本发明涉及a)在体外转导/转染含有编码肿瘤抗原的外源基因的T淋巴细胞，以刺激针对所述肿瘤的免疫应答；和b)使T细胞在体外负载编码肿瘤抗原表位的肽。所述T细胞还可包含其它强的抗原，例如HSV-Tk，以监测接种有效性。
已报道T细胞是通过例如逆转录病毒载体进行基因转移的适宜靶。具体地，已经描述了表达肿瘤抗原的T细胞在肿瘤疫苗中的用途。然而，在例如EP 0 905 786中也报道了T细胞作为抗原呈递细胞(APC)而产生效果。与该观点相反，我们现在发现T细胞通过将APC暴露于转基因，然后所述APC呈递该转基因而起作用。换言之，T细胞将转基因产物暴露于APC从而用于抗原加工和呈递。“暴露”包括将转基因与APC接触使得转基因产物被结合和/或摄取。APC将所述抗原内化，并对其进行加工以便呈递。
“抗原加工”指将抗原降解成较短的肽序列，并将所述肽与MHC分子相结合。两种完全不同的MHC分子即I型MHC和II型MHC，分别对将抗原呈递给CD8+或CD4+T细胞进行调节。严格地说，抗原呈递是通过T细胞受体活化T细胞，所述受体特异性识别在APC表面与I型MHC和II型MHC分子相结合的抗原性肽；然而，B细胞也能识别并结合一些抗原。
我们也发现本系统提供了将抗原递送给淋巴系统具体为淋巴结的有效方法。所述T细胞可口服给予，但我们相信所述T细胞能够有效迁移到淋巴结，即使它们在远端位点给予时也是如此。淋巴结的功能为对已知为淋巴的体液进行免疫过滤。淋巴结见于整个机体。淋巴结主要由T细胞，B细胞，树突细胞和巨噬细胞组成，其引流主要来自组织的液体。在淋巴结中过滤去除淋巴液中的抗原，然后淋巴液回到循环中。在脾中，类似地，捕获抗原的巨噬细胞和树突细胞将这些异源物质呈递给T或B细胞，然后启动免疫应答。
本发明还提供了细胞依赖的抗原递送系统。在该系统中，所述抗原或编码所述抗原的多核苷酸被回体导入一或多个细胞，然后被导入患者。
本发明的T细胞可单独给予，但通常作为药物组合物给予。
APC和免疫应答如上所述，本发明涉及将抗原递送给抗原呈递细胞(APC)。APC包括巨噬细胞，树突细胞，B细胞和任何能够表达MHC分子的其它细胞类型。
巨噬细胞是单核细胞系统的吞噬细胞，其位于组织中，并尤其适于有效地呈递抗原。它们通常表达II类MHC分子，并由于其吞噬特性而在吞入大分子或微粒物质、消化它们并利用广泛的溶酶体系统将其加工成抗原性肽形式，并将其表达到细胞表面以便被T细胞识别方面尤其有效。
树突细胞是根据它们的高度分支的形态进行命名的，它们见于整个机体的器官中，其来自骨髓并通常表达高水平的II类MHC抗原。树突细胞的活动较活跃，并能在血流和组织之间反复循环(recirculate)。树突细胞是抗原呈递细胞，其具有独特的诱导初次免疫应答能力并由此允许建立免疫记忆。未成熟形式的树突细胞具有高的吞噬能力。未成熟形式的树突细胞在捕获抗原以后迁移到淋巴结，在淋巴结中成熟后，活化循环的抗原特异性淋巴细胞。可见它们也是重要的APC。朗格汉斯(Langerhans)细胞是位于皮肤的树突细胞的实例。
B淋巴细胞不具有活跃的吞噬能力，其是II类-阳性的并具有细胞表面抗原特异性受体，免疫球蛋白或抗体分子。由于其高亲合力的抗体结合，B细胞具有下述的独特能力在其表面浓缩低浓度抗原，内吞、加工所述抗原并将所述抗原作为与其表面的MHC抗原结合的抗原性肽进行呈递。通过这种方式，B细胞成为非常有效的APC。
因此，对外来抗原的免疫应答需要抗原-呈递细胞(APC)(通常为巨噬细胞或树突细胞)的存在，以及B细胞或T细胞。当APC将其表面的抗原呈递给B细胞时，所述B细胞收到信号而增殖，并产生与该抗原特异性结合的抗体。如果所述抗体与细菌或寄生虫上的抗原结合，所述抗体可起作用使多形核白细胞或巨噬细胞发生内吞(吞噬)，并杀死所述抗原细胞。抗体的另一重要功能为启动“补体破坏级联反应”。当抗体与细胞或细菌结合时，称为补体的血清蛋白与固定的抗体结合，并通过在所述细菌上产生孔而破坏该细菌。抗体可以对天然杀伤细胞和巨噬细胞发出信号以杀死病毒或细菌感染的细胞。
如果APC将抗原呈递给T细胞，所述T细胞被活化。活化的T细胞增殖并且如果是CD4+T细胞时成为分泌型的，或者如果所述T细胞是CD8+T细胞，它们被活化以杀死靶细胞，所述靶细胞特异性表达APC所呈递的抗原。抗体的产生以及CD8+杀伤T细胞的活性由CD4+辅助T细胞亚群高度调节。所述CD4+T细胞将生长因子或信号提供给这些细胞，使得它们接受信号而增殖并更有效地起作用。
T细胞T细胞或T淋巴细胞通常分为两个主要的亚群，其功能和表型(可辨别地)不同。所述T辅助细胞亚群也称为CD4+T细胞，是免疫调节的适宜协调物。T辅助细胞的主要功能是通过特定因子的分泌来增加或加强免疫应答，所述因子可活化其它白细胞以对抗感染。
另一种重要的T细胞类型是T杀伤细胞亚群或CD8+T细胞。这些细胞对于直接杀伤一些肿瘤细胞，病毒感染的细胞并在一些情况下杀伤寄生虫而言是重要的。它们通常依赖次级淋巴器官(淋巴结和脾)作为活化发生的位点，但它们也可见于机体的其它组织，主要是肝，肺，血液，肠道以及生殖道中。
当T细胞用于本发明的回体方法时，所述T细胞通常可以是从患者或供体血液中分离的T淋巴细胞。T细胞通过适宜的方法(如US-A-4663058所述)获得，并可通过包括抗体介导的分离在内的标准技术富集和/或纯化。所述T细胞可以和获自相同或不同个体的其它免疫细胞联用。可选地，可使用全血或白细胞富集的血液或纯化的血细胞作为T细胞和其它细胞类型的来源。尤其优选使用辅助T细胞(CD4+)。可选地，T细胞诸如CD8+细胞等可以被使用。可方便地使用如下的细胞系，诸如T细胞杂交瘤，外周或胸腺来源的未成熟T细胞和NK-T细胞。在优选的实施方案中，本发明所用T细胞可以是可将抗原特异性抑制转移到其它T细胞的T细胞。
将多肽和核酸序列导入T细胞抗原性多肽物质可以多肽本身的形式给予T细胞，或者通过在允许在所述T细胞中表达所述多肽的条件下，将编码所述多肽的核酸构建体/病毒载体导入细胞来进行。
优选，本发明所用载体中的多核苷酸与能够使所述宿主细胞表达所述编码序列的控制序列可操作地连接，即所述载体是表达载体。术语“可操作地连接”指所述元件的关系使得它们以目的方式起作用。调节序列与编码序列的可操作的连接使得所述编码序列在与该控制序列相容的条件下得以表达。
所述控制序列可通过例如通过加入其它转录调节元件被修饰，以使得由所述控制序列指导的转录水平对于转录调节物更具有反应性。
本发明的载体可如下述被转化或转染进入T细胞用于表达抗原。
本发明还包括导入了即负载了例如多肽形式的抗原的T细胞。
为了方便，将抗原性多肽和编码所述抗原性多肽的多核苷酸称为“抗原”。
将基因和多肽引入T细胞的适宜非限制性方法如下所述。
任何适宜的T细胞转化法都可被使用。目前可得的用于递送的机制的非限制性实例为，电穿孔，磷酸钙转化，或粒子轰击。然而，所述构建体的转移可通过任何通过物理或化学方法使得细胞膜通透的方法来进行。适宜的方法如下详述。
1.电穿孔在本发明一些优选的实施方案中，所述抗原通过电穿孔导入细胞。电穿孔涉及将细胞悬液和DNA暴露于高压电放电。
认为T细胞的电穿孔条件可以优化。具体可优化诸如电压，电容，时间和电穿孔介质组合物等参数。其它调节方法是本领域技术人员已知的。
2.粒子轰击将裸DNA构建体转入细胞的一种方法涉及粒子轰击。该方法有赖于将DNA包被的微轰击粒子(microprojectile)加到很高的速度，使得所述粒子透过细胞膜并进入细胞而不会杀死所述细胞。所用微轰击粒子包含生物惰性物质，例如钨，铂或金珠。
认为一些情况下，DNA在瞬间沉淀到金属颗粒上对于利用离子轰击将DNA递送到受体细胞而言不是必需的。认为所述粒子可含有DNA而不是由DNA包被。因此，认为所述DNA包被的粒子可增加通过粒子攻击递送的DNA水平，但这不是必需的。
已经研发出多种用于加速小粒子的仪器。这种仪器之一依赖高电压放电来产生电流，所述电流提供了驱动力。另一方法涉及利用基因枪微粒递送系统(Biolistic Particle Delivery System)，所述系统可用于推进用DNA包被的微粒通过屏障(screen)，诸如不锈钢或Nytex屏障，到达用悬浮细胞(cell insuspension)覆盖的过滤器表面。所述屏障使粒子分散，使得所述粒子不会以大的聚集体递送到受体细胞中。据信位于发射装置和待轰击细胞之间的屏障减小了轰击粒子聚集体的体积，并通过降低过大的轰击粒子对受体细胞的损伤而有助于高频转化。
对于攻击而言，悬浮细胞优选在过滤器上浓缩，或者可选在固体培养基上浓缩。待轰击的细胞位于微轰击粒子阻挡板下方的适当位置。如需要，可将一或多个屏障置于加速器和待轰击细胞之间。
认为希望在小范围研究中调节各个轰击参数以使条件充分优化。尤其希望调节物理参数，例如间隙距离(gap distance)，飞行距离，组织距离和氦压力。也可通过调节影响受体细胞物理状态从而影响转化和整合效率来优化创伤降低因素(trauma reduction factors)。例如，可调节渗透状态，组织水化和受体T细胞的传代阶段或细胞周期来优化转化。其它途径的调节是本领域技术人员已知的。
3.病毒转化a.腺病毒感染递送所述核酸构建体的一种方法涉及利用腺病毒表达载体。尽管已知腺病毒载体整合入基因组DNA的能力较低，这些载体的高效基因转移可弥补这一特点。“腺病毒表达载体”包括含有腺病毒序列的构建体，所述序列足以(a)支持所述构建体的包装并(b)最终表达该序列已被克隆于其中的构建体。
所述载体包含遗传改造形式的腺病毒。已知腺病毒遗传结构为36kb，线型，双链的DNA病毒，允许用达7kb的外来序列取代较大的腺病毒DNA片段。与逆转录病毒相反，腺病毒感染宿主细胞不导致染色体整合，这是由于腺病毒DNA可以游离染色体的方式进行复制而无潜在的基因毒性。此外，腺病毒的结构稳定，且在大量扩增后没有检测到基因组重排。
由于腺病毒为中等大小的基因组，易于操作，滴度较高，靶细胞的范围广泛以及高度感染力而尤其适合用作基因转移载体。腺病毒基因组的两端都含有100-200个碱基对的反转重复(ITRs)，它们是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区含有不同的转录单元，所述单元通过病毒DNA复制的起始来划分。E1区(E1A和E1B)编码负责调控病毒基因组转录的蛋白以及一些细胞基因。E2区(E2A和E2B)的表达导致负责病毒DNA复制的蛋白合成。这些蛋白参与DNA复制，晚期基因表达和宿主细胞关闭(shut-off)。晚期基因的产物，包括大多数病毒衣壳蛋白，仅在对源自主要晚期启动子(MLP)的单个最初转录物进行明显的加工以后才表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期尤其有效，并且源自该启动子的所有mRNA都具有5’三联前导(TRL)序列，所述前导序列可使所述mRNA称为翻译所优选的mRNA。
在目前的系统中，重组腺病毒通过穿梭载体和原病毒载体之间的同源重组产生。由于两种原病毒载体之间的可能重组，野生型腺病毒可从该过程中产生。因此，从独立的空斑分离单个克隆的病毒并检测其基因组结构是重要的。
目前的复制缺陷型腺病毒载体的产生和增殖，有赖于独特的辅助细胞系即293，其是通过Ad5 DNA片段从人胚肾细胞转化而来的，并构成性表达E1蛋白。由于所述E3区对于腺病毒基因组而言是可有可无的，目前的腺病毒载体在293细胞的辅助下在E1和/或D3区中携带外来DNA。在自然界中，腺病毒可组装约105％的野生型基因组，其可额外容纳约2kb的DNA。与E1和E3区中可取代的大约5.5kb的DNA相结合，目前的腺病毒载体的容量在7.5kb以下，或者为总载体长度的约15％。该腺病毒载体基因组的80％以上保持在载体骨架中。
辅助细胞系可来自人细胞例如人胚肾细胞，肌肉细胞，造血细胞或其它人胚间质或上皮细胞。可选地，所述辅助细胞源自与人腺病毒相容的其它哺乳动物种类的细胞。这种细胞可包括，例如Vero细胞或其它猴胚间质细胞或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。
除了腺病毒载体可以是复制缺陷的、或至少是条件性缺陷的要求以外，认为腺病毒载体的性质对本发明成功的实施是不重要的。所述腺病毒可以是42种不同已知血清型或亚组A-F之一。亚组C的5型(type 5)腺病毒是获得本发明所用条件复制-缺陷型腺病毒载体的优选起始物质。这是由于5型腺病毒是人腺病毒，其许多生化和遗传信息是已知的，且所述病毒曾用于大多数采用腺病毒作为载体的构建体。
如上述，本发明常用的载体是复制缺陷的，并不具有腺病毒E1区。因此，可非常方便地将转化型构建体导入去除了E1编码序列的位置。然而，腺病毒内构建体的所述插入位置对于本发明而言不是关键性的。编码目的基因的多核苷酸可被插入以取代E3取代载体中缺失的E3区，或者插入E4区中，而辅助细胞系或者辅助病毒弥补了所述E4缺陷。
腺病毒生长和操作是本领域技术人员已知的，并在体外和体内显示广泛的宿主范围。可获得高滴度的该组病毒，例如10.sup.9-10.sup.11空斑形成单位/ml，并且所述病毒是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主细胞基因组。通过腺病毒载体递送的外来基因可为游离的，并因此对宿主细胞的基因毒性较低。在用野生型腺病毒进行的预防接种研究中没有报道任何副作用，显示它们作为体内基因转移载体时是安全的并且有治疗效力。
b.AAV感染腺伴随病毒(AAV)是用于本发明的有吸引力的载体，这是由于其具有高频整合并且可感染非分裂细胞，由此使其可用于在组织培养中将基因递送到哺乳动物细胞中。AAV可感染的宿主范围广泛。涉及产生和利用rAAV载体的详细内容见美国专利5,139,941和美国专利4,797,368，上述文献均包含于本文中作为参考。
重组AVV载体可成功用于在体外和体内转导标记基因以及人类疾病中涉及的基因。最近，已经许可AAV载体用于囊性纤维化治疗的I期人体实验。
AAV是依赖性的细小病毒，其需和其它病毒(腺病毒或疱疹病毒家族的成员)共感染，从而在培养的细胞中进行生产性感染(productive infection)。不和辅助病毒共感染时，野生型AVV基因组通过其末端整合到人染色体19中并作为原病毒处于潜伏期。然而rAAV并非限于染色体19来进行整合，除非所述AAVRep蛋白也被表达。当携带AAV原病毒的细胞由辅助细胞超感染时，AAV基因组从染色体或重组质粒中被“拯救”出来，并建立了正常的生产性感染。
通常，重组AAV(rAAV)病毒通过共感染含有目的基因的质粒和含有野生型AAV编码序列而没有末端重复的表达质粒例如pIM45而制备，所述目的基因与两个AAV末端重复侧接。所述细胞也可用腺病毒或携带AAV辅助功能所需的腺病毒基因的质粒来感染或转染。以这种方式制备的rAAV病毒贮备液(stocks)被腺病毒污染，所述腺病毒必须用物理方法从rAAV颗粒分离(例如通过氯化铯密度离心)。可选地，含有AAV编码区的腺病毒载体或者含有AAV编码区的细胞系以及一些或全部腺病毒辅助基因可以使用。也可使用通过作为整合的原病毒来携带rAAV DNA的细胞系。
c.逆转录病毒感染本发明一种优选的方法涉及使用逆转录病毒。本发明的逆转录病毒载体可源自任何适宜的逆转录病毒。已经鉴定了大量不同的逆转录病毒。实例包括小鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，猴免疫缺陷病毒，人T-细胞白血病病毒(HTLV)，马感染性贫血病毒(EIAV)，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，Rous肉瘤病毒(RSV)，Fujinami肉瘤病毒(FuSV)，莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(Mo-MLV)，FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)，莫洛尼(Moloney)鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)，Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)，鸟类髓细胞瘤病(Avian myelocytomatosis)病毒-29(MC29)，和鸟类幼红细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表见Coffin et al.，1997，″retroviruses″，ColdSpring Harbour Laboratory Press EdsJM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp758-763。
一些逆转录病毒的基因组结构的详述可见于本领域。通过实例，关于HIV和Mo-MLV的详述可自NCBI Genbank(基因组登录号分别为AF033819和AF033811)。
逆转录病毒在广义上可分为两种类型即“简单”和“复杂”。逆转录病毒甚至可分为7组。其中的5组代表具有致癌潜力的逆转录病毒。余下的两组是慢病毒和泡沫病毒(spumavirus)。这些逆转录病毒的综述见Coffin等，1997(出处同上)。
慢病毒(lentivirus)组可进一步分为“灵长类的”和“非灵长类的”。灵长类慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)，其是人免疫缺陷综合症(AIDS)的致病因子，和猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒(slow virus)”visna/maedi病毒(VMV)，以及相关的公山羊关节炎-脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis Virus)(CAEV)，马感染性贫血病毒(EIAV)以及最近所述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒科和其它类型的逆转录病毒之间的区别在于所述慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞的能力。反之，其它逆转录病毒-例如MLV-不能感染非分裂细胞，诸如构成肌肉，脑，肺和肝组织的那些细胞。
每种逆转录病毒基因组包含称为gag，pol和env的基因，其编码病毒粒子的蛋白和酶。在原病毒中，这些基因的两端侧接称为长末端重复(LTR)的区域。LTR负责原病毒整合以及转录。LTR也作为增强子-启动子序列，并可控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的壳体化通过位于病毒基因组5’末端的psi序列而发生。
LTR本身是可分成三个元件的相同序列，所述三个元件称为U3，R和U5。U3源自所述RNA 3’末端的独特序列。R源自该RNA两个末端的重复序列，且U5源自该RNA 5’末端的独特序列。三个元件的大小在不同的逆转录病毒中有显著差异。
感染性逆转录病毒RNA基因组的基本分子结构是(5′)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3′)。在缺陷性逆转录病毒载体基因组中，gag，pol，和env基因可以缺失或无功能。该RNA两个末端的R区是重复序列。U5和U3分别代表所述RNA基因组5’和3’末端的独特序列。
为了构建逆转录病毒载体，编码目的基因的核酸分子被插入该病毒基因组中以取代某些病毒序列，从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建含有gag、pol和env基因但不含有LTR以及包装组分的包装细胞系(Mann等，1983)。当含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR以及包装序列一起被导入该细胞系中时(例如通过磷酸钙沉淀)，所述包装序列允许将所述重组质粒的RNA转录物包装入病毒颗粒，然后将其分泌入细胞培养基。收集含有重组逆转录病毒的培养基，可选地进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒能感染多种细胞类型。然而，整合与稳定的表达需要宿主细胞的分裂。
利用缺陷型逆转录病毒载体所关心的问题是在包装细胞中可能出现野生型、有复制能力的病毒。这可由于重组事件造成，其中来自重组病毒的完整序列插入整合在所述宿主细胞基因组中的gag，pol，env序列的上游。然而，现在可以获得新的包装细胞系，所述细胞系可极大降低重组的可能性。
d.其它病毒载体其它病毒载体可用作本发明的方法和组合物中的构建体。可利用衍生自诸如痘苗病毒和疱疹病毒等病毒的载体。
4.磷酸钙共沉淀或DEAE-Dextran处理在其它优选的实施方案中，利用磷酸钙共沉淀法将抗原导入细胞。在另一实施方案中，所述表达构建体用DEAE-葡聚糖然后用聚乙二醇来递送到细胞内。
5.直接微注射或超声负荷(Sonication Loading)其它实施方案包括通过直接微注射或超声负荷导入抗原。
6.脂质体介导的转化另一实施方案中，所述抗原被包裹于脂质体中。脂质体是泡状结构，其特征是磷脂双层膜和内侧的含水介质。多层脂质体可具有被含水介质分离的多层脂质层。当磷脂悬浮于过量水溶液中时，所述多层脂质体可自发形成。在形成封闭的结构前，所述脂质成分进行自我重排，并将水和溶解的溶质包陷在脂质双层之间。还涉及与Lipofectamine(Gibco BRL)复合的核酸构建体。
在本发明一些实施方案中，所述脂质体可以和凝血病毒(hemagglutinating Virus)(HVJ)进行复合。这可促进与细胞膜的融合，并促进脂质体包裹的DNA进入细胞。在其它实施方案中，所述脂质体可以是复合的，并与细胞核非-组蛋白染色体蛋白(HMG-1)联合使用。在另一实施方案中，所述脂质体可以是复合的，并与HVJ和HMG-1联用。
7.腺病毒支持的转染一些实施方案中，所述核酸构建体利用腺病毒支持的转染导入细胞。在利用腺病毒偶联的系统中，报道了转染效率的提高，且本发明人考虑使用相同的技术来增加转染效率。
培养本发明还提供了培养用于本发明的T细胞的方法。
具体地，从外周血分离的外周血单个核细胞(PBMC)可在体外活化并增殖。促有丝分裂刺激可通过使用例如植物血凝素的化合物(PHA；2μg/ml)或抗-CD3 mAb(OKT3；30ng/ml)获得。
活化的T细胞可以以1×106细胞/mL，在补充了5％自体血清的培养基中，在生长因子例如hu-rIL-2(例如100U/ml)的条件下进行培养。
一个优选实施方案中，所述T细胞可以在存在磁性珠并优选存在hu-rIL-2(例如100U/ml)的条件下培养，所述磁性珠由CD-3和CD28的抗体包被。方便地，所述珠可以三个珠/T细胞的比例使用。
所述T细胞可通过例如利用编码抗原的病毒载体暴露所述活化的T细胞而被转导/转染。所述转基因的表达可用于评估转导效率。基因和标记物的选择将在以下详细描述。可选地，淋巴细胞可如上述进行培养，但不进行转导/转染。而活化的T细胞在给药患者之前加载上抗原，所述抗原可以是例如合成肽的形式，编码例如已知的肿瘤、细菌或病毒抗原。
整个操作过程通常持续5-15天。
经过操作的T细胞可被冷冻保存。
培养期末，所述操作的T细胞可表达至少一种选自下组的标记物HLA-I HLA-II，CD80，CD86，CD27，CD40L CD62L CCR7，CD54和CD25。因此，我们发现了T细胞的表型是重要的。
疫苗本发明涉及在个体中诱导免疫反应的方法，所述个体具体为哺乳动物，优选为人，所述方法包括用本发明含有抗原的T细胞接种所述个体，使得所述抗原产生抗体和/或T细胞免疫反应以保护所述个体，使得所述个体不受到例如肿瘤或感染，诸如病毒或细菌感染的攻击。还提供了一种方法，其中所述免疫反应减慢肿瘤生长或病毒或细菌复制。
因此，本发明涉及一种免疫组合物，其中当所述组合物被导入个体优选人(可在其中诱导免疫反应)的时候，所述组合物能在所述个体体内诱导免疫反应。所述免疫反应可用于治疗或预防，并可采用抗体免疫和/或细胞免疫的形式，诸如CTL或CD4+细胞产生的细胞免疫。
包含免疫原性多肽作为活性组分的疫苗的制备是本领域熟练技术人员已知的。通常，这种疫苗被制备为可注射的液体溶液或悬液；适合在注射前溶解或混悬于液体的固体形式也可制备。所述制备物也可被乳化，或者将所述蛋白包在脂质体中。活性免疫原性成分通常和赋形剂混合，所述赋形剂是可药用的并与所述活性成分相容。适宜的赋型剂为，例如水，盐水，右旋糖，甘油，乙醇等或其组合。
此外，如需要，所述疫苗可含有较小量的辅助物质，例如湿润或乳化剂，pH缓冲剂，和/或可提高所述疫苗有效性的佐剂。
本发明的疫苗配制剂优选涉及和/或包括可增强所述配制剂的免疫原性的佐剂系统。优选所述佐剂系统激发TH1型反应。
广义上可将免疫反应分为两种极端的类型，即体液或细胞介导的免疫反应(传统上分别以抗体或细胞的效应器机制来定义)。这些反应的分类称为TH1型反应(细胞介导的反应)和TH2型免疫反应(体液反应)。
极端的TH1型免疫反应的特征为抗原特异性的，单体型限制的细胞毒T淋巴细胞的产生，和自然杀伤细胞反应。小鼠中的TH1型反应的常见特征为产生IgG2a亚型的抗体，而在人体所述抗体为IgG1型抗体。TH2-型免疫反应的特征为产生较广范围的免疫球蛋白同种型，包括小鼠IgG1，IgA和IgM。
认为这两种免疫反应发展的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子有利于诱导对给定抗原的细胞介导的免疫反应，而高水平的TH2型细胞因子倾向于有利于诱导对所述抗原的体液免疫反应。
免疫调节物，例如疫苗可从T细胞中制备，所述T细胞包含一或多种本发明的多肽甚或核苷酸序列。制备含有作为活性成分的免疫原性多肽的免疫调节物是本领域技术人员已知的。通常，所述免疫调节物被制备成可注射形式的液体溶液或悬液；也可制备适合在注射前溶解或混悬于液体中的固体形式。所述制备物也可被乳化，或者将所述蛋白包于脂质体中。所述活性组分通常与可药用并与所述活性成分相容的赋形剂混合。适宜的赋形剂为，例如水，盐水，右旋糖，甘油，乙醇等或其组合。
此外，如果需要，所述免疫调节物可含有少量的辅助剂，例如湿润或乳化剂，pH缓冲剂，和/或可提高所述免疫调节物有效性的佐剂。所述有效佐剂包括但不限于氢氧化铝，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正(nor)-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正(nor)-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰(isogluaminyl)-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)，和RIBI，其含有从细菌提取的三种组分，即2％鲨稀/Tween 80乳液中的单磷酰脂质A，海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate)和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
佐剂和其它试剂的实例包括氢氧化铝，磷酸铝，硫酸钾铝(明矾)，硫酸铍，硅，高岭土，碳，油包水乳液，水包油乳液，胞壁酰二肽，细菌内毒素，脂质X，小棒杆菌(Corynebacterium parvum)，疮疱丙酸杆菌(Propionobacterium acnes)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，多聚核糖核苷酸，藻酸钠，羊毛脂，溶血卵磷脂，维生素A，皂角苷，脂质体，左旋四咪唑，DEAE-右旋糖，嵌段共聚物(blocked copolymer)或其它合成佐剂。
这样的佐剂可购自各种来源，例如Merck Adjuvant 65(Merck andCompany，Inc.，Rahway，N.J.)或Freund′s Incomplete Adjuvant and CompleteAdjuvant(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)。
通常，可使用佐剂诸如Amphigen(水包油的)，Alhydrogel(氢氧化铝)，或Amphigen和Alhydrogel的混合物。仅许可将氢氧化铝用于人。
免疫原和佐剂的比例可在广泛的范围内变化，只要它们都以有效量存在。例如，氢氧化铝的量可以是免疫调节物的混合物的约0.5％(基于Al2O3)。方便地，所述免疫调节物可配制成免疫原终浓度为0.2-200μg/ml，优选5-50μg/ml，最优选15μg/ml。
配制以后，免疫调节物可掺入无菌容器内，随后将所述容器密封并储存在低温，如4℃，或者所述免疫调节物可以是冷冻-干燥的。冻干允许以稳定的形式长期保存。
所述免疫调节物通常通过注射经胃肠外给药，例如经皮下或肌肉内。适合其它给药方式的其它配制剂包括，栓剂，以及一些情况下为口服配制剂。对于栓剂，传统的连接物和载体可包括，例如聚乙二醇或甘油三酯；这种栓剂可由混合物制成，所述混合物含有0.5％-10％，优选1％-2％的活性组分。口服配制剂包括通常采用的赋形剂，例如药用级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。这些组合物可以是溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放的配制剂或粉剂的形式，并含有10％-95％的活性成分，优选25％-70％。如果免疫调节物组合物是冻干的，所述冻干物质在给药前可重新溶解为例如悬液。重新溶解优选在缓冲液中进行。
本发明的多肽可以配制成中性或盐形式的免疫调节物。可药用的盐包括酸加成盐(利用肽的游离氨基基团形成)，所述酸加成盐可与诸如盐酸或磷酸的无机酸或者诸如乙酸，草酸，酒石酸和马来酸等的有机酸形成。与游离羧基基团形成的盐可衍生自无机碱和有机碱，所述无机碱包括诸如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁，所述有机碱诸如异丙胺，三甲胺，2-乙基氨基乙醇，组氨酸和普鲁卡因(procaine)。
抗原概括地说，抗原是任何能够与抗原受体反应的物质。抗原与特定抗体的结合提供了所述抗原可以以下述方式被识别和灭活的机制所述抗原与特定抗体发生复合使得所述复合物可将其自身附着于特定的免疫细胞，所述免疫细胞或者内化所述复合物以破坏它，或者释放生物介质诸如组胺以产生过敏/炎症反应。免疫原是活化免疫细胞以产生针对其自身的免疫反应的抗原。因此，免疫原是抗原，但抗原不一定是免疫原。然而，为便于参考，术语抗原和免疫原通常可互换使用。
本发明总体上涉及将抗原呈递给免疫系统的新方法。一些因素决定抗原的免疫效力并由此决定所述抗原引发免疫反应的能力，包括抗原表位被免疫细胞识别的可能性，以及抗原给药的途径。本发明提供了改善这些因子的系统，使得抗原的免疫原性被优化。结果，人们可在仅一次疫苗给药中获得相当于2或3个剂量。因此，不仅改善了疫苗效力，还增加了患者的依从性。
本发明可用于任何能被导入T细胞并呈递给免疫系统的抗原，所述免疫系统尤其为APC。在尤其优选的实施方案中，所述抗原以能在T细胞中表达的多核苷酸的形式被导入T细胞。
已知多种适宜的抗原。它们的序列可基于文献中已知的多肽序列进行选择。对于具有免疫原活性的蛋白的部分序列的多肽，可通过序列比较确定那种肽适合作为候选物。优选的候选物是这样的多肽，其免疫原性已经得到证实，即来自已知免疫原的多肽，诸如病毒或细菌蛋白。这种类型的多肽由于其免疫原性而在MLC检测中显示强的反应。术语“蛋白”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物(multiple-polypeptide complex)，在所述复合物中单个的构成性多肽通过共价或非共价方式相连。术语“多肽”包括长度为2或2个以上氨基酸的肽，通常具有5，10或20个以上的氨基酸。
应理解用于本发明的多肽序列不限于具体的序列或其片段或者获自具体蛋白的序列，且所述多肽序列还包括获自任何来源例如相关病毒/细菌蛋白的同源序列，细胞同源物和合成肽，以及其变体或衍生物。本发明的多肽序列还包括本发明的多核苷酸编码的多肽。
因此，本发明包括抗原氨基酸序列的变体，同源物或衍生物，以及本发明的多核苷酸序列所编码的氨基酸序列的变体，同源物或衍生物。
在本发明中，同源序列包括与具体序列的氨基酸序列具有至少60，70，80或90％同一性，优选至少95或98％同一性的氨基酸序列。具体地，同源性通常应涉及序列中已知对于抗原性必不可少的那些区域，而不是非必要的邻近序列。在家族成员之间保守的区需要具有相对较高的同源性得分-这有助于确定功能性分子。在家族成员之间为独特性的或者保守性较低的区域应当/可以具有较低的得分，是以各种情况(case by case)为基础的-这有助于新颖性的建立。这种渐进法(bit by bit approach)通常比整体同源性得分更有用。尽管同源性也可认为是相似性(具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明中，优选以序列同一性表达同源性。
同源性比较可通过肉眼，或更常见地通过容易得到的序列比较程序来进行。这些可购得的计算机程序可计算两种或两种以上序列的％同源性。
本发明术语氨基酸序列的“变体”或衍生物”包括所述序列的一(或多个)氨基酸的取代(substitution)，变异，修饰，替代(replacement)，缺失或添加，条件是产生的氨基酸序列优选具有抗原活性，优选具有序列表中所示多肽的活性的至少25％-50％，更优选具有至少基本相同的活性。
因此，本发明的具体序列可被修饰以用于本发明。通常，可在保持序列抗原性的条件下进行修饰。因此，在一个实施方案中，氨基酸取代可例如为1，2或3到10，20或30个取代，条件是修饰后的序列保持至少约25％到50％或基本相同的活性。然而，在可选的实施方案中，本发明多肽氨基酸序列的修饰可有目的地进行，以降低所述多肽的生物活性。例如，保持与靶分子结合的能力但缺乏功能性效应器结构域的截短的多肽可用作全长分子生物活性的抑制物。
通常，优选与序列表中所示的相应区域相比，变体或衍生物的氨基酸残基有少于20％，10％或5％发生变异。
氨基酸取代可包括利用非天然存在的类似物，例如为增加治疗用多肽的血浆半寿期(治疗用的肽衍生物的制备详见下文)。
可例如根据下表进行保守性取代。在第二栏相同区内并优选在第三栏同一行内的氨基酸可互相取代；
本发明的多肽还包括全长多肽的片段及其变体。优选的片段包括含有表位的那些。适宜的片段的长度至少约5，例如10，12，15或20个氨基酸。它们还可以为少于200，100或50个氨基酸的长度。所述蛋白的多肽片段及其等位基因和物种变体可含有一或多种(例如2，3，5，或10)取代，缺失，或插入，包括保守取代。进行取代，缺失和/或插入时(例如通过重组技术)，优选序列表中所述的氨基酸残基中低于20％，10％或5％的残基发生变异。
尤其优选的片段包括具有抗原结构域的那些。
用于本发明的多核苷酸包括编码本发明的序列的核酸序列。熟练技术人员应理解多种不同的多核苷酸可由于遗传密码的简并性而编码相同的多肽。此外，应理解，熟练技术人员可利用常规技术进行氨基酸取代，而不影响本发明多核苷酸所编码的多肽序列，从而反映了任何具体宿主有机体(本发明的多肽将在其中表达)的密码子应用。
本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们可以是其中含有合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。本领域已知对寡核苷酸的多种不同类型的修饰。所述修饰包括甲基膦酸酯(methylphosphonate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)主链，在分子的3’和/或5’末端加入吖啶或多赖氨酸链。为本发明的目的，应理解本文所述的多核苷酸可通过本领域已知的任何方法进行修饰。可进行这种修饰以增强本发明的多核苷酸的体内活性或半寿期。
术语核苷酸序列的“变体”，“同源物”或“衍生物”包括，所述序列的一个(或多个)氨基酸的取代，变异，修饰，替代，缺失或添加，条件是产生的氨基酸序列优选具有抗原活性。
如上所述，其与本文序列表中所示序列的序列同源性，优选为至少75％，更优选为至少85％，更优选为至少90％。更优选同源性为至少95％，更优选为至少98％。可如上述进行核苷酸同源性比较。优选的序列比较程序为GCGWisconsin Bestfit程序，见上文。每个相同的核苷酸的默认得分矩阵(defaultscoring matrix)的匹配值为10，而每个错配为9。每个核苷酸的默认缺口产生罚分为-50，且默认缺口延伸罚分为-3。
本发明还包括能够选择性地与抗原序列或其变体，片段或衍生物杂交，或者与上述序列的互补序列杂交的核苷酸序列。核苷酸序列的长度优选为至少15个核苷酸，更优选至少20，30，40或50个核苷酸。
本文术语“杂交”包括“核酸链与互补链通过碱基配对而结合的过程”以及聚合酶链反应技术中所进行的扩增过程。
能够与本文的核苷酸序列或其互补体杂交的本发明的多核苷酸，与相应的核苷酸序列的至少20，优选至少25或30，例如至少40，60或100个或以上的连续核苷酸的区域通常具有至少70％，优选至少80或90％，更优选至少95％或98％的同源性。
术语“可选择性杂交的”指用作探针的多核苷酸在本发明的靶多核苷酸与该探针的杂交水平明显高于本底的条件下使用。由于存在其它多核苷酸，例如存在于cDNA或待筛选的基因组DNA文库中，而可能出现本底杂交。在这种情况下，本底表示探针和文库非特异性DNA成员之间的相互作用产生的信号水平，所述水平比所观察到的靶DNA的特异性反应的水平低10倍，优选低100倍。所述反应的强度例如通过用32P放射性标记所述探针来测定。
杂交条件基于核酸结合复合物的熔点(Tm)，如下文Berger and Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol152，Academic Press，San Diego CA)，and confer adefined″stringency″中所述。
最高严谨度通常出现在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨度为约低于Tm 5℃-10℃；中等严谨度为约低于Tm 10℃-20℃；且低严谨度为约低于Tm 20℃-25℃。本领域熟练技术人员应理解可利用最高严谨度杂交鉴定或检测相同的多核苷酸序列，而可利用中等(或低)严谨度杂交来鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
在优选的方面，本发明覆盖了在严谨条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15 MNaCl，0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})与抗原性核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸为双链时，双链复合体的两条链无论是单独还是结合的，都包含在本发明中。当所述多核苷酸为单链时，应理解该多核苷酸的互补链也包含在本发明的范围内。
与本发明的序列并非100％同源但包含在本发明范围内的多核苷酸可通过多种方法获得。本文所述序列的其它变体可例如通过对来自一定范围的个体例如来自不同群体的个体制备的DNA文库进行探测来获得。此外，可获得其它病毒/细菌，或细胞同源物尤其是哺乳动物细胞(例如大鼠，小鼠，牛和灵长类动物细胞)中的细胞同源物，而且通常所述同源物及其片段能够与本文序列表中所示的序列选择性杂交。这种序列可通过对来自其它动物物种的cDNA文库或基因组DNA文库进行探测，并且利用包含全部或部分已知序列的探针在中到高严谨度条件下探测所述文库来获得。类似的考虑也适用于获得物种同源物和等位基因变体。
变体和菌株/物种同源物也可利用简并PCR获得，所述简并PCR利用指向变体和同源物中的靶序列的引物，所述靶序列编码本发明的序列中保守的氨基酸序列。保守的序列可通过例如对来自数个变体/同源物的氨基酸序列进行比对来预测。序列比对可利用本领域已知的计算机软件来进行。例如，GCG Wisconsin PileUp程序是广泛用到的。
用于简并PCR的引物含有一或多个简并位点并可在这样的严谨度条件下使用，该严谨度低于利用针对已知序列的单序列引物进行序列克隆的严谨度。
可选地，这种多核苷酸可通过对已经定性的序列的定点诱变来获得。这对于一些情况是有用的，例如序列需要沉默密码子改变以优化具体宿主细胞的密码子优选性，其中在所述宿主细胞中表达所述多核苷酸序列。其它序列改变可用于导入限制酶识别位点，或改变所述多核苷酸所编码多肽的性质或功能。
多核苷酸诸如DNA多核苷酸和本发明的探针可通过重组，合成或其它本领域熟练技术人员已知的方法来制备。它们可利用标准技术克隆。
当使用蛋白或蛋白片段时，加工后的终产物的同一性可通过化学分析或生物分析(APC对加工后片段特异的T细胞的刺激能力)来证实。
原则上，肽候选物的选择可根据在多个阶段其作为外源肽的适合性来选择；通常首先在肽结合实验中优选通过一系列实验检测所述候选物与MHC-I分子的结合能力。
研究的一种适宜方法为，例如基于流式细胞仪的FACS分析。该肽用荧光染料例如用FITC(荧光素异硫氰酸盐)进行标记，然后用于表达MHC-I分子的肿瘤细胞。在细胞流中，单个的细胞通过特定波长的激光激发；测定激发的荧光并且所述荧光有赖于与细胞结合的肽的量。
测定结合的肽的量的另一方法是Scatchard印迹。用I125或稀土金属离子(例如铕)标记的肽用于该方法。在4℃用各种确定浓度的肽在30-240分钟使所述细胞带电。为了测定肽与细胞的非特异性反应，将过量的未标记肽加入一些样品中，阻止标记的肽的特异性反应。然后洗涤所述细胞，以去除任何非特异性的细胞结合物质。随后在液闪计数仪中利用发射的放射活性，或者在适合测定寿命较长的荧光的光度计中测定与细胞结合的肽的量。获得的数据用标准方法评估。
在第二步中，检测具有良好结合特性的候选物的免疫原性。
可检测来自免疫原活性未知的蛋白的异种肽的免疫原性，例如通过MLC实验。在该实验中激发尤其强烈反应的肽适合本发明的目的，所述反应优选利用不同肽进行一系列反应，所述不同的肽用作免疫原活性已知的标准肽。
检测MHC-I-结合肽候选物的免疫原性的另一可能方法为研究所述肽与T2细胞的结合。一种这样的实验基于T2细胞或RMA-S-细胞的特殊性质，即它们的TAP肽转运机制缺陷，并且当将它们用于在MHC-1背景中呈递的肽时其仅呈递稳定的MHC-1分子。稳定地转染了HLA基因例如HLA-A1和/或HLA-A2基因的T2细胞或RMA-S细胞，可用于该实验。如果所述细胞与作为MHC-I的良好配体的肽发生反应，即通过在MHC-I背景中呈递所述肽使得其作为外来物质而被免疫系统识别，这些肽使得细胞表面出现大量HLA分子。检测细胞表面的HLA，例如通过单克隆抗体，使得可能鉴定适宜的肽。此外，已知具有良好的HLA或MHC结合能力的标准肽可适当地使用。
所述抗原可来源于真菌，寄生虫，细菌或病毒。因此，本发明的一个实施方案涉及预防或治疗感染性疾病。本发明可应用的感染性疾病的实例包括腺病毒，炭疽，霍乱，白喉，破伤风，百日咳，疟疾，流感包括B型嗜血流感病毒，甲型肝炎，乙型肝炎，脑炎，麻疹，腮腺炎，风疹，脑膜炎诸如A C，Y和W-135型球菌脑膜炎，瘟疫，肺炎球菌感染，狂犬病，天花，沙门氏菌感染，伤寒，水痘，黄热病，裂谷热(Rift Valley fever)。然而，本发明还可利用任何可得的新的免疫原。事实上，由于本发明改进了抗原向免疫系统的呈递，其尤其可用于通常据信对疫苗方法抵抗的疾病和感染，例如HIV。
在尤其优选的实施方案中，本发明提供了癌症疫苗。因此本发明可用于治疗肿瘤，诸如黑素瘤，前列腺癌，肺癌，乳腺癌和结肠癌以及淋巴瘤。
传统的癌症治疗诸如化疗和放疗的缺点为，在破坏癌细胞的同时，它们也破坏健康组织。癌症疫苗寻找改善这些问题的途径。本发明尤其适合使用肿瘤相关的抗原。尽管免疫系统不能将癌细胞识别为外来的，但发现癌细胞表面的确携带特定的抗原。这些对于各个肿瘤而言是独特的，由几种类型所共有，或者由肿瘤来源的正常组织所表达。本发明还可使用与肿瘤形成相关基因(例如原癌基因和肿瘤抑制基因)的产物结合的抗原。本发明还可利用与癌症有关的病毒，诸如乙肝病毒和EBV，早已表明乙肝病毒与肝癌的发病有关。
本发明还可在疾病诊断后或在初始治疗诸如手术或化疗后使用。
可用于本发明的肿瘤抗原的非限制性实例将在下文描述自从MAGE-1(据报道编码T细胞可识别的人肿瘤抗原的第一个基因)被克隆，主要对于黑素瘤实现了肿瘤抗原的分子鉴定和定性。主要原因是难以建立其它类型癌症的体外细胞系，所述细胞系对于产生用于遗传或生化方法中的肿瘤特异性CTL系或克隆必不可少，所述方法的目的是从分子水平上建立鉴定新的癌症抗原。而最近，发展出新方法来发现T细胞可识别的新抗原，即使对于黑素瘤以外的肿瘤而言也如此。各种抗原种类的实例见下文。然而，如上所述，类似物或人工修饰的表位也可用于本发明中。通过抗体鉴定的其它抗原也可使用，并且如通过Serex技术检测到的抗原的大的集合也见于the Institute for Cancer Research(www.licr.org/SEREXhtm)的数据库中。值得注意的是，许多肿瘤抗原(例如MAGE，NY-ESO-la)已知由相同癌症患者的T细胞和抗体识别。此外，利用最近的技术(例如负杂交(subtractive hybridization)，代表性差异分析(representational-differenceanalysis)，微阵列)，检测到数以百计的基因，与正常细胞中的所述基因相比，其在肿瘤细胞中被优选表达或过表达，或者在转移性但非原发性早期损伤(例如黑素瘤，乳腺癌，淋巴瘤等)中表达。通过使用适宜的计算机算法，多种可结合MHC分子的新表位将被鉴定。通过利用所述方法，可筛选大量基因产物阵列的潜在抗原功能。可通过适宜的功能分析选择免疫原性表位。所有这些也可用于本发明中。
肿瘤抗原的分类第1组I型HLA-限制性癌症/睾丸抗原肿瘤免疫学的里程碑当然是MAGE-1的克隆和一年后将其定性为第一个T细胞限定的抗原性表位。这些发现后，很快鉴定了该组的新成员。基因的MAGE，BAGE和GAGE基因家族产生了。属于该组的抗原现在还包括NY-ESO-1，称为癌症/睾丸(CT)抗原，因为其在组织学上不同的人肿瘤中和正常组织中表达，并在睾精母细胞/精原细胞中表达，而且有时还在胎盘中表达。这些抗原现在代表抗肿瘤疫苗发展的主要组分之一。CT抗原产生自通常在成人组织中沉默但在一些肿瘤中的转录被活化的基因的再活化。CT基因可能是最典型的一种。已经克隆的CT抗原组的新的基因包括CT9，CT10，LAGE，MAGE-B5，-B6，-C2，-C3和-D，HAGE，SAGE。
第2组.I型HLA-限制性分化抗原这些抗原是肿瘤和产生所述肿瘤的正常组织共有的；大多数见于黑素瘤和正常黑素细胞。这些黑素细胞系相关的蛋白中许多都参与黑色素的生物合成。由CD8+和CD4+T细胞识别的表位可来自黑素体(melanosome)蛋白。
第3组.I型HLA-限制性广泛表达的抗原编码广泛表达的肿瘤抗原的基因可在多种正常组织以及组织学上不同类型的肿瘤中检测到，其不是在一种特定类型的癌症中优选表达。正常组织上表达的许多表位低于T细胞识别的阈值是可能的，而所述表位在肿瘤细胞中的过表达可激发抗肿瘤反应，甚至是通过破坏已经建立的耐受性。这些广泛表达的基因产物揭示了广泛的机制谱，所述机制通过基因转录和翻译的改变而参与产生T细胞限定的表位。突出一些实例如，CEA的表位源自非-AUG-限定的可选ORF，而RU2基因通过反式链转录产生其表位。
第4组I型HLA-限制性、肿瘤特异性抗原独特肿瘤抗原来自正常基因的点突变(例如连环蛋白，CDK4)，其分子改变通常伴有肿瘤转化或进展。因此这些抗原仅在鉴定它们的单独的肿瘤中表达，这是由于相同突变不可能出现在两种不同的肿瘤中，除非涉及其突变的是肿瘤转化的必须步骤的基因(例如RAS)。在小鼠模型中，独特性抗原显示比其它共有抗原组的免疫原性更高；由于独特性抗原负责小鼠中肿瘤移植物的排异，它们被鉴定为肿瘤-特异性移植抗原。
其它肿瘤-特异性抗原已经描述，所述抗原通过在剪接机制中的变异产生，且出现于肿瘤而不见于正常细胞中，如TRP-2/INT2。
第5组II型HLA-限制性抗原肿瘤抗原对CD4+T辅助细胞的刺激在癌症患者中认为被损害或缺失，并且成为对肿瘤的免疫反应不充分的原因。因此，鉴定这种淋巴细胞所识别的肿瘤抗原表位对于提高可产生临床效果的抗肿瘤免疫反应而言是重要的步骤。II型HLA呈递并能激发CD4+T-细胞反应的的第一表位于1994年在黑素瘤酪氨酸激酶中鉴定。随后的4年中仅鉴定了一种其它的表位，然后才发现编码II型HLA-限制性肽的其它基因。然而，由于出现了鉴定肿瘤细胞CD4+T-细胞表位的技术和方法学方法，发现这种表位的报道呈指数增长。实际上，自1998年，已经利用Ii-cDNA融合文库，免疫的转基因小鼠和生化方法从分子水平鉴定了来自14种抗原的27种新的II型HLA-限制性表位。值得注意的是，甚至II型限制性抗原也包含突变的蛋白亚组，因此其代表真正的肿瘤特异性抗原。
第6组融合蛋白在多种恶性疾病尤其是白血病中，癌发生的分子机制涉及染色体转位，其导致间隔基因(distant gene)的融合。这通常导致产生融合蛋白，所述融合蛋白为各种类型疾病的特征(例如bcr-abl，pml-RAR分别见于CML和APL)，并产生可由T细胞(在I型或II型HLA限制中分别为CD8+或CD4+)识别的新表位。尽管这些表位在白血病患者体内的免疫原性较弱，这些肽或蛋白中的一些仍可用于脉冲刺激(pulse)树突细胞用于接种。
尤其可用于本发明的肿瘤抗原的非限制性实例包括MAGE，BAGE和GAGE，来自酪氨酸激酶的CTL识别表位，MelanAMart1，gp100me17和gap75TRP1。
基因或标记物的选择本发明的T细胞优选包含至少一种其它外来基因，所述外来基因为选择基因，或标记基因。已知选择基因可用于从未转化的细胞选择转化后的细胞。许多不同的可选标记可成功用于载体中，而且这些也可很好地用于本发明。适宜地，使用细菌或动物抗原。在优选的实施方案中，例如细菌抗原(例如β-半乳糖苷酶)，显示抗生素抗性的细菌基因或其它基因(例如neo，amp，Kan和tet)或自杀基因(例如HSV-Tk)。
在优选的实施方案中，所述T细胞包含至少自杀基因作为另外的外来抗原。利用这种自杀基因的优点在于该基因的活化可通过系统性给药另一种物质例如环孢素或5’-氟胞嘧啶来控制。自杀基因的实例包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(HSV Tk)，用更昔洛韦(ganciclovir)处理后，所述基因可杀死感染的或旁观细胞(bystander cell)。
其它自杀基因包括，例如胞嘧啶脱氨酶基因，其显示对5-氟胞嘧啶的致死敏感性；和人细胞表面分子CD20，其允许通过给药利妥西玛(rituximab)(Introna et al.HumGene The Y Il1.611，2000)杀死转导的细胞。CD20的优点在于作为人分子其为非免疫源性的。
利用自杀基因的具体优点在于其安全性，这是由于如果出现不良的副作用，该基因可用于杀死T细胞。
根据本发明具体优选的实施方案，选择或标记基因本身是免疫原性的或表达免疫原性蛋白。这种系统的优点在于能够使患者处于免疫状态，并由此使得所监测的接种治疗有效。这种适合的其它外来抗原的实例包括HSV-Tk和Neo，所述抗原均在有免疫能力的患者中引发免疫应答。例如，第一抗原对所述患者的免疫可通过检测抗-HSV-Tk的溶细胞活性来监测，如下文所详述。
为了安全，本发明的T细胞也可以是生长-停滞的(growth-arrested)，例如通过放射或用丝裂霉素处理。这种放射可在室温以100Rad/分钟的剂量进行。暴露于所述放射的细胞不再增殖，但由于其mRNA仍存在于所述细胞中，所述细胞仍能表达蛋白。
治疗治疗包括任何治疗应用，其可使人或非-人动物受益。哺乳动物的治疗是具体优选的。人和兽医治疗都在本发明的范围内。
治疗可以是针对现存的疾病或者可以是预防性的。可针对成年人，青少年，婴儿，胎儿，或前述任何部分(例如器官，组织，细胞，或核酸分子)。
通过本发明的方法制备的T细胞可给药患有恶性疾病的患者。
通常，在回体(ex Vivo)方法中，所述患者可以是被治疗的T细胞所来源的患者。可治疗的恶性疾病的实例包括乳腺，宫颈，结肠，直肠，子宫内膜，肾脏，肺脏，卵巢，胰腺，前列腺，皮肤，胃，膀胱，CNS，食管，头-或-颈，肝，睾丸，胸腺或甲状腺的癌症。血细胞，骨髓细胞，B-淋巴细胞，T-淋巴细胞，淋巴祖细胞或髓样细胞的祖细胞(myeloid cell progenitor)的恶性疾病也可被治疗。
所述肿瘤可以是实体肿瘤或非实体肿瘤，且可以是原发肿瘤或扩散的转移(继发)肿瘤。非实体肿瘤包括骨髓瘤，白血病(急性或慢性，淋巴细胞性或髓细胞性)诸如急性成髓细胞性白血病，急性早幼粒细胞性白血病，急性骨髓单核细胞性白血病，急性单核细胞性白血病，红细胞性白血病；和淋巴瘤，诸如霍杰金氏淋巴瘤，非霍杰金氏淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤。实体瘤包括癌，结肠癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肾癌，腺癌，黑素瘤，基底或鳞状细胞癌，间皮细胞瘤，神经母细胞瘤，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肉瘤，骨肉瘤，横纹肌肉瘤，纤维肉瘤，成骨肉瘤，肝癌和精原细胞瘤。
通常，本发明的组合物将与肿瘤特异性抗原一起给药，所述抗原诸如在肿瘤细胞表面过表达的抗原。
所述T细胞可用于治疗正在发生的免疫应答(诸如过敏性疾病或自身免疫疾病)或可用于引发患者的耐受。因此，本发明的细胞可用于治疗和预防动物和人中以不适当的淋巴细胞活性为特征的疾病的治疗方法中。所述T细胞可用于赋予对单个或多个抗原的耐受性。
通常，从患者或供体获得T细胞，并如上述进行引发，然后将所述T细胞返回该患者(回体治疗(ex vivo therapy))。
药物组合物药物组合物为包含治疗有效量的药物活性剂或由所述药物活性剂组成的组合物。其优选包括可药用的载体，稀释剂或赋型剂(包括其组合)。治疗用的可接受的载体或稀释剂是制药领域已知的，并在例Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中描述。所选的药物载体，赋型剂或稀释剂可根据目的给要途径和标准药物操作来选择。所述药物组合物可包含作为载体，赋型剂或稀释剂的或除所述物质以外的任何适宜的粘合剂，润滑剂，混悬剂，包被剂，溶解剂。
“治疗有效量”指能有效达到其目的的治疗剂的量。虽然各个患者的需求不同，确定每种一氧化氮加合物有效量的适宜范围是本领域技术人员已知的。通常，用本发明的化合物和/或组合物治疗疾病的剂量方案根据多种因素选择并可由本领域熟练技术人员进行调节，所述因素包括所述患者的类型，年龄，体重，性别，饮食和用药情况，功能不良的严重程度，给药途径，药物特性诸如所用具体化合物的活性，效力，药物动力学和毒理学性质，是否利用药物递送系统，以及所述化合物是否作为药物组合物的一部分给药。因此，实际使用的剂量方案可变化很大并因此可偏离本文所述的优选剂量方案。
可药用载体的实例包括，例如，水，盐溶液，醇，硅酮，蜡，凡士林油，植物油，聚乙二醇，丙二醇，脂质体，糖，凝胶，乳糖，直链淀粉，硬脂酸镁，滑石，表面活性剂，硅酸，粘性石蜡，香料油，脂肪酸单甘油酯和二甘油酯，petroethral脂肪酸酯，羟甲基-纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等诸如此类的载体。
所需剂量范围有赖于肽的选择，给药途径，配方的性质，受体疾病的性质，和医师的判断。然而适宜的剂量为0.1-100μg/kg受体体重。
疫苗组合物可方便地为可注射的形式。传统的佐剂可用于增强免疫反应。接种的适宜单位剂量为0.5-5微克/kg抗原，且这种剂量优选间隔1-3周来给药1-3次。采用所示的剂量范围，本发明化合物不会出现不良毒性作用而不能给药适宜的个体。
由于可得的化合物多种多样，并且各种给药途径的效率各异，预期所需的剂量变化很大。例如，预期口服给药比静脉内注射需要的剂量要高。这些剂量水平的差异可通过利用标准经验途径进行调节来优化，这是本领域已知的。
本发明优选的特征和实施方案将参考以下实施例和附图进一步描述。
图1表示利用分离自接受输注的患者分离的效应细胞对刺激细胞(实心标记)和无关的靶(空心标记)进行的细胞溶解实验的结果。效应细胞通过刺激外周血单个核细胞(PBMC)来产生，该外周血单个核细胞分离自用自体转导的T细胞(圆形)和同种异体T细胞(方形)处理后的7名患者。转导利用编码HSK-TK蛋白以及细胞表面标记ΔLNGFr(缺失的人低亲和力神经生长因子受体)的载体来进行。
图2表示利用分离自治疗后患者的效应细胞对未修饰的细胞以及表达HSV-TK或ΔLNGFr的细胞进行的溶细胞实验的结果。
图3显示输注时间，注入的改造过的T细胞的数目，以及转基因特异性免疫应答的出现之间的关系。数据点表示可诱导(实心标记)或不可诱导(空心标记)免疫反应的细胞输注。
图4表示利用分离自两名健康供体的效应细胞对刺激细胞(实心标记)和无关的靶(空心标记)进行的溶细胞实验的结果。效应细胞通过用自体转导的T细胞(圆形)和同种异体T细胞(方形)刺激分离自2名健康供体的PBMC来产生。
图5为患者UPN-15的临床病史和随诊的图示。循环的经过诱导的T细胞的存在(实心圆)和缺失(空心圆)通过PCR利用HSV-TK-特异性引物在指定的时间点进行监测。免疫反应的出现通过用自体转导的和同种异体T细胞进行离体刺激循环淋巴细胞来监测。根据检测到的抗-HSV-TK溶细胞活性来判断患者是(实心星号)否(空心星号)对转基因产生免疫。
图6显示利用分离自治疗后的黑素瘤患者的新鲜淋巴细胞，对表达MAGE-3或HSV-Tk的自体细胞以及对未修饰的自体EBV及黑素瘤细胞系进行的ELISPOT实验的结果。
图7显示利用从治疗后的黑素瘤患者体外分离的效应细胞，对MAGE-3转导的或未转导的T细胞(即PHA-M3和PHA)以及自体的和无关的黑素瘤细胞系进行的IFNg释放实验的结果。效应细胞通过用自体MAGE-3转导的T细胞刺激分离自治疗后患者的PBMC来产生。
实施例实施例1在同种异体骨髓移植(allo-BMT)中输注供体淋巴细胞治疗白血病是控制肿瘤复发和病毒感染的已建立的策略。为了防止移植物-抗-宿主疾病(GVHD)的固有的危险性，BM-供体淋巴细胞可以被自杀基因转导而具有对药物的敏感性，从而允许为治疗和安全目的而选择性消除转导的细胞。
外周血单个核细胞(PBMC)通过Lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norvay)密度-梯度离心从所研究的所有BM供体和健康对照来分离。
活化利用两种不同的活化信号来活化T细胞(下文称T母细胞(T blasts))植物血凝素(PHA)2ug/ml(Boehringer Mannheim)；抗-CD3 mAb(OKT3)30ng/ml(Orthoclone，Milan，Italy)；ORT3(30ng/ml)。活化的T细胞以1×106细胞/ml在补充了5％自体血清的RPMI 1640中、存在hu-r-IL-2100U/ml(EuroCetus Italia S.r.l.，Milan，Italy)的条件下进行培养。每3-4天更换培养基。
转导利用两种淋巴细胞转导方法。1-共培养在接受致死放射量的包装细胞(packaging cells)(100 Grays；GIL RAD，Gilardoni，Mandello，Italy)的半汇合单层上，于组织培养瓶中、存在polybrene(8Rg/ml)的条件下，进行淋巴细胞活化。所述共培养进行72小时。2-旋转孵育(spinoculation)活化3-4天后，回收淋巴细胞，并在存在无细胞逆转录病毒上清和polybrene(8μg/ml)的条件下，对其进行两轮2小时的离心进行转导。
转导步骤以后，收集淋巴细胞并接种于新鲜培养基中(106/ml)。在第5天，通过FACS利用小鼠抗人LNGFR mAb 20.4(ATCC，Rockville，MD)，分析逆转录病毒转导的细胞的ΔLNGFr表达。
选择经过转导的细胞纯群体通过两种方法获得。淋巴细胞用编码HSV-TK/neo(TN)融合蛋白的SFCMM2载体进行转导，所述融合蛋白为赋予新霉素抗性和HSV-TK活性的双功能蛋白，转导后的细胞通过将新霉素(0.8μg/ml)加入培养基来进行选择。在培养第3，7和10天加入新鲜新霉素。用编码野生型HSV-TK和ΔLNGFr的SFCMM3载体转导的淋巴细胞通过磁性分选(magnetic sorting)利用mAb 20.4和大鼠抗-小鼠-IgG1包被的珠(Dynabeads M-450，Dynal A.S.N0212 Oslo，Norway)来进行免疫选择。
纯的转导后细胞群体被冷冻，给药患者或在离体条件下用作刺激物来监测抗原-特异性免疫反应。
PBMC样品取自7名治疗后的患者，并与来自各个BM供体的经放射处理的转导后T细胞或经过放射处理的同种异体T母细胞相接触。培养2天后，加入10U/ml的IL2。观察混合物中刺激细胞(stimulator cell)的溶解，其指示样品中针对转导的T细胞所表达的转基因产物或同种异体抗原的特异性T淋巴细胞(CTL)的存在。采用的溶解实验为铬释放实验。图1的结果显示，对转导的靶具有特异性的细胞毒T细胞获自所有患者。为评估所述患者的免疫能力，在所有反应者中检测并测定针对同种异体靶的特异性免疫反应。这提示输入在上述条件下转导的T母细胞能激发针对所述转导细胞的免疫反应。
实施例2进行进一步的研究以鉴定免疫反应的靶抗原。针对表达所述载体单个组分的自体T母细胞检测来自患者之一的效应细胞。表达HSV-TK的T母细胞被溶解，而表达ΔLNGFr的靶细胞根本没有被识别(图2)。自体细胞实验的结果利用分离自其它患者的效应细胞来获得。
实施例3分析实施例1的结果(即产生HSV-TK-特异性免疫)与输注时间以及输入的改造的T细胞数目之间的关系。显示了从骨髓移植起以月计算的输注时间(横坐标)，和注入的改造的T细胞数目(纵坐标)。针对转导的细胞的免疫应答的出现通过用自体转导的和同种异体的T细胞离体刺激PBL(如实施例1所述)来评估。存在阳性抗-同种异体免疫反应时，根据针对被转导细胞的溶细胞活性的存在，所述患者被认为对转基因产生免疫(实心标记)或不产生免疫(空心标记)。数据点表示细胞的输入可诱导(实心标记)或不可诱导(空心标记)免疫反应。对于患者UPN-15，显示了两个不同的时间点。这些结果表明体外操作的细胞诱导的免疫反应与输入的细胞数目无关，而与输注时功能性免疫系统的存在严格相关。
实施例4进行进一步的研究来鉴定转导的T母细胞激发体内转基因特异性免疫反应所利用的机制。从两名健康供体获取PBMC样品，并根据实施例1利用经过放射处理的自体转导的T母细胞或经过放射处理的同种异体T母细胞刺激所述样品。培养2天后，加入10U/ml的IL2。观察混合物中刺激细胞的溶解，其表明对转导的T细胞所表达的转基因产物或同种异体抗原特异的T淋巴细胞(CTL)存在于所述样品中。图4中的结果显示对转导的靶具有特异性的细胞毒T细胞不是获自健康对照的。因此提示，在我们的实验环境中，转导的T母细胞不能作为专职的抗原呈递细胞，初始T细胞前体不能自身活化。由固有(resident)APC介导的体内交叉-呈递可负责在接受输注的患者体内诱导转基因特异性免疫反应。
实施例5进行进一步实验来确定负责诱导转基因特异性免疫反应的细胞机制。在UPN-15患者的随诊过程中，评估产生有效免疫反应的能力以及循环的经过转导的T母细胞的存在(图5)。循环的经过转导的T母细胞的存在通过PCR利用HSV-TK-特异性引物，在新鲜血液样品上进行分析。如实施例1所述，评估免疫重建和HSV-TK-特异性免疫。移植后不久，在缺失功能性免疫系统的条件下，对患者UPN-15进行注射。通过PCR在循环中长时间检测输入的细胞(图5，实心环)，即使当所述患者的免疫系统完全重建时也如此。通过在缺失HSV-TK特异性免疫的条件下有活性的抗-同种异体免疫库的存在来证明免疫重建(图5，空心星号)。因此，由于所述患者产生适当的T细胞反应的能力(即抗原呈递和抗原应答能力)在很大程度上被损害，在注射时不出现免疫。随后，当免疫系统充分重建时，循环的经过转导的T母细胞不能提供活化信号，它们不作为APC起作用，因此不激发对转导细胞的特异性的细胞毒效应细胞。
UPN-15患者的免疫系统完全重建时第二次注入HSV-TK-改造的T母细胞，这可诱导HSV-TK-特异性免疫(图5，实心星号)，导致改造后细胞的破坏(图5，空心圆)。
因此，当如实施例1操作的T细胞递送到具有免疫能力的melieu中时出现免疫。具体地，T细胞在体内作为载体，其将抗原携带到诱导免疫反应的正确位置。生长因子(即IL2)的剥夺介导的注入细胞的部分细胞死亡，导致被携带的抗原的释放；随后宿主APC呈递释放的抗原物质，并活化初始HSV-TK-特异性T细胞前体。
前述实验描述了新的方法，通过所述方法T淋巴细胞可在体外修饰而成为靶抗原体内递送的载体。
实施例6T淋巴细胞可在体外修饰而变成用于靶抗原体内递送的载体。来自患MAGE-3阳性黑素瘤的患者的自体淋巴细胞通过逆转录病毒载体转导，所述载体编码肿瘤抗原MAGE-3和HSV-TK/neo(TN)融合蛋白，所述融合蛋白为赋予新霉素抗性和HSV-TK活性的双功能蛋白。
利用的活化转导和选择方法与实施例1中所报道的相同。在操作过程末，转导的细胞的纯群体被冷冻并根据接种的渐增型剂量方案来给药患者。转导的细胞也可离体用作刺激物来检测抗原特异性免疫反应。
PBMC样品取自治疗前和接种5次后的黑素瘤患者。收集的细胞立即与自体EBV黑素瘤细胞，以及MAGE-3或HSV-TK转导的EBV相接触。所述实验在用抗-IFNg mAb包被的ELISPOT-板上进行。培养24小时后，除去细胞并处理所述板以评估IFNg斑点(spot)的存在。图6中所述的结果显示，对转基因(即MAGE-3和HSV-TK)特异的IFNg-释放型T细胞在接种以后获得。检测到肿瘤特异性T细胞的频率明显增加。这表明输入在上述条件下转导的T母细胞能激发针对转导细胞的免疫反应。
实施例7PBMC取自免疫后的黑素瘤患者，并与经过放射处理的MAGE-3-转导的T细胞接触。培养两天后，加入10U/ml的IL2。观察所述混合物中存在刺激细胞时的IFNg释放，这表明样品中存在对转导的T细胞表达的MAGE-3转基因产物特异的效应细胞。图7中的结果显示获得了对MAGE-3以及自体肿瘤特异的效应T细胞。这进一步证实，输入在上述条件下转导的T母细胞能激发针对转基因产物的免疫反应。
实施例8为研究转基因特异性免疫效应物生成的动力学，根据输入的转导细胞的剂量，在治疗前和接种方案的数个时间点(即接种3，5和15天后(after 3，5and 15 Vaccination)从黑素瘤患者取PBMC。将收集的细胞与经过放射处理的MAGE-3转导的或HSV-TK-转导的T细胞接触。培养两天后，加入10U/mlIL2。在每个时间点，对数个独立的微量培养物进行铺板(从30-48)。数轮刺激后，存在刺激细胞时观察微量培养物的IFNg释放，其表明样品中存在对MAGE-3或HSV-TK特异的效应细胞。下表中总结的结果显示注入的转导的T细胞和针对所述转基因的免疫反应的出现之间存在相关性。观察到MAGE-3-反应性T细胞前体的量连续增加，这可由阳性微量培养物的数目显示。
负责诱导MAGE-3-特异性免疫反应的MAGE-3-表达型T细胞的体内输注
ND未进行上述说明书中涉及的所有公开出版物都包含在本文中作为参考。本发明所述方法和系统的各种修饰和改变对于本领域熟练技术人员而言都是显而易见的，并且不偏离本发明的范围和精神。尽管本发明涉及具体优选的实施方案，应理解所要求的发明不限于这些具体实施方案。实际上，分子生物学或相关领域技术人员已知的本发明实施模式的各种修饰意图包含在所附权利要求的范围内。
权利要求
1.递送系统，其包括包含至少一种抗原的T细胞且能将所述抗原递送到淋巴结。
2.递送系统，其包括含有至少一种抗原的T细胞且能够将所述抗原递送到APC，并随后通过该APC呈递该抗原。
3.权利要求1或2的递送系统，其中所述抗原是肿瘤抗原。
4.前述权利要求任一的递送系统，其中所述抗原是细菌或病毒抗原。
5.前述权利要求任一的递送系统，其中所述T细胞含有标记物。
6.权利要求5的递送系统，其中所述标记物为标记基因。
7.权利要求6的递送系统，其中所述标记物是细菌抗性基因。
8.权利要求7的递送系统，其中所述细菌抗性基因赋予新霉素抗性。
9.权利要求6的递送系统，其中所述标记物是另一种抗原。
10.权利要求9的递送系统，其中所述另一种抗原是HSV-Tk或CD20。
11.权利要求5-10之一的递送系统，还包括所述另一种抗原和细菌抗性基因。
12.前述权利要求之一的递送系统，其中所述T细胞表达至少一种选自下组的标记物HLA-I，HLA-II，CD80，CD86，CD27，CD40L，CD62L，CCR7，CD54和CD25。
13.与T细胞结合并包括至少一种能够激发免疫反应的其它抗原的抗原在监测对至少一种其它抗原的免疫应答中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述抗原是强免疫原性抗原。
15.权利要求14的用途，其中所述抗原是HSV-Tk或CD20。
16.权利要求13-15之一的用途，其中所述至少一种其它抗原为肿瘤抗原。
17.权利要求13-16之一的用途，其中所述至少一种其它抗原为病毒抗原。
18.权利要求13-17之一的用途，其中T细胞表达至少一种选自下组的标记物HLA-I，HLA-II，CD80，CD86，CD27，CD40L，CD62L，CCR7，CD54和CD25。
19.监测对T细胞的免疫应答的方法，包括将第二抗原引入所述T细胞，其中所述T细胞包含能够激发免疫反应的抗原。
20.权利要求19的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
21.权利要求19的方法，其中所述抗原为细菌或病毒抗原。
22.权利要求19-21之一的方法，其中所述第二抗原是强免疫原性抗原。
23.权利要求22的方法，其中所述第二抗原为HSV-Tk或CD20。
24.在体内使APC负载抗原的方法，包括将APC暴露于含有所述抗原的T细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
26.权利要求24的方法，其中所述抗原是细菌或病毒抗原。
27.权利要求24-26之一的方法，其中所述T细胞含有标记物。
28.权利要求27的方法，其中所述标记物是标记物基因。
29.权利要求28的方法，其中所述标记物是细菌抗性基因。
30.权利要求29的方法，其中所述细菌抗性基因赋予新霉素抗性。
31.权利要求28的递送系统，其中所述标记物是另一种抗原。
32.权利要求31的递送系统，其中所述另一种抗原是HSV-Tk或CD20。
33.权利要求27-32之一的递送系统，其中所述T细胞还包括所述另一种抗原和标记物。
34.权利要求24-33之一的递送系统，其中所述T细胞表达至少一种选自下组的标记物HLA-I，HLA-II，CD80，CD86，CD27，CD40L，CD62L，CCR7，CD54和CD25。
35.获得用于前述权利要求之一的方法的T细胞的方法，包括分离T细胞；活化所述T细胞；培养所述T细胞；并将抗原导入所述T细胞。
36.权利要求35的方法，其中所述T细胞用所述抗原转导。
37.权利要求35或36的方法，其中所述T细胞用植物血凝素、抗-CD3单克隆抗体，或抗-CD3/CD28单克隆抗体-包被的珠来活化。
38.权利要求35-37之一的方法，其中所述T细胞在生长因子存在的条件下培养。
39.权利要求38的方法，其中所述生长因子包括hu-r-IL-2。
40.权利要求35-39之一的方法，其中所述T细胞培养在含有5％自体血清的培养基中。
41.权利要求35-40之一的方法，其中所述T细胞以1×106细胞/ml进行培养。
42.可通过权利要求35-41之一的方法获得的T细胞。
43.负载了抗原的T细胞。
43.药物组合物，其包含权利要求1-20，42或43之一定义的T细胞。
44.权利要求43的药物组合物，其为疫苗形式。
45.权利要求1-20，42或43之一定义的T细胞在制备用于治疗或预防肿瘤或感染的药物中的用途。
全文摘要
包含T细胞的递送系统，所述T细胞含有至少一种抗原，所述抗原能够使抗原呈递细胞负载所述抗原。
文档编号C12N5/08GK1705739SQ200380101741
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月21日 优先权日2002年10月21日
发明者卡蒂亚·特拉弗萨里, 克劳迪奥·博迪格农 申请人:莫尔米德公司