专利名称：检测突变的方法
技术领域：
本发明涉及检测生物体基因变异的方法。基因分析用于疾病的危险性评估、诊断、预后或疾病治疗。例如，针对特定人的特定基因的突变分析使得预测疾病危险性成为可能，由此促进疾病的预防。通过突变分析，能够检测引起疾病的病毒是否已对药物产生了耐药性，从而可进行有效的治疗。
背景技术：
人类基因组计划使我们能够更全面的衡量疾病的危险性、诊断或预后以及预测对药物治疗的反应。大量个体的核苷酸序列的分析呈现出多态性位点，将其称为SNPs(单核苷酸多态性)。SNP是以特有的频率出现在生物体的染色体的核苷酸序列中的变异。在人体中，大约每1,000个碱基出现SNP。考虑到人类基因组的大小，数百万的SNP存在于人体中。由于将SNP视作解释个体之间特征性差别的手段，因此，SNP可通过诊断病因，用于疾病的预防或治疗。
由人类基因组计划发现的SNP仅表明多态性存在于人体中，但并未表明那些多态性是怎样与疾病相联系的。为了揭示SNP与疾病之间的关系，需要比较分析表现在健康人和患者中的多态性模式，即SNP计分。为了准确检验SNP和疾病之间的关系，应当正确分析大量的SNP。
SNP计分法(SNP scoring method)包括DNA测序、PCR-SSCP(多聚酶链反应-单链构象多态性)、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接(oligo-ligation)、微测序(mini-sequencing)和酶切法。使用DNA芯片的方法也被提出，但除了使用固定寡核苷酸探针的载体外，该方法与等位基因特异性杂交在原理上是没有区别的。
用于进行DNA测序的两种传统方法是Maxam & Gilbert化学测序法，以及近来使用的Sanger法。DNA测序法是为了弄清楚整个或部分基因的核苷酸序列，而不是检测特定位点的基因变异。由于可通过检测核苷酸序列来识别特定位点的基因变异，DNA测序法可用于SNP计分中。然而，由于用靶SNP可读出不需检测的相邻的核苷酸序列，DNA测序法并不十分有效。
在PCR-SSCP(ORITA，M.et al.，Genomics，1989，58874-8879)中，通过PCR扩增待分析的包含SNP的序列，然后将其分成单链。此后，在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。由于序列的差别改变了DNA的二级结构，因此可通过由结构差异所导致的电泳迁移速度的差别，检测序列中的突变。
等位基因特异性杂交是通过调节例如温度的杂交条件，使用放射性同位素标记的DNA与附着在尼龙膜上的探针杂交，来检测突变。
寡核苷酸连接(Nucleic Acid Research 24，3728，1996)是通过在一定条件下进行反应来检测序列突变，在该条件下，如果靶DNA不与模板DNA互补，则反应不会发生，从而确认连接是否发生。
微测序(Genome Research 7606，1997)是为SNP计分而开发的。该方法在仅可聚合一个目标碱基的条件下进行DNA聚合，然后识别聚合碱基是什么。
由于PCR-SSCP、等位基因特异性杂交、寡核苷酸链接均使用了聚丙烯酰胺凝胶，因此，这些方法在分析许多样品时不是十分有效的方法。并且，这些方法并不能够识别由探针与非目标位点错配所导致的错误。
尽管微测序在分析许多样品时是简单而有效的，但仍不能识别错配的错误所导致的不正确的结果，而且微测序不能够发现碱基的缺失和插入。
为了SNP计分，还开发了酶切法(WO 01/90419)。在酶切法中，使用例如PCR的适当方法扩增待分析的序列。该扩增产物包括可被两种限制性内切酶酶切或识别的序列。酶切法是通过用两种限制性内切酶酶切扩增产物并检测酶切片段的分子量来检测序列变异。由于在用PCR扩增基因后，由限制性内切酶反应所得片段的分子量可通过质谱分析检测得到，因此酶切法具有简单、快速的优点。然而，在专利WO 01/90419中描述的酶切法并不能识别由错误导致的不正确的分析。尽管在PCR期间，当引物结合在非目标位点上时，可能导致不正确的分析，但并不能识别该不正确的分析。例如，用于检测CYP2C9的多态性的引物可以与CYP2C8相结合。在这种情况下，由于并不能识别除了CYP2C9以外，引物是否还与CYP2C8结合，因此，很难发现是否发生了错误。该方法可以检出一个碱基的取代，但不能检出碱基缺失或插入。而且，该方法还不能同时检出相邻的两个或两个以上碱基的取代。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于准确而有效的检测生物体突变的方法。
为了实现上述目的，在本发明的具体实施方式
中，提供了一种用于准确而有效的检测生物体突变的方法。
本发明能够简单而快速的检测出许多样品中的突变，而且能够通过识别由引物在错误区域的结合而导致的错误而准确检测突变。而且，本发明提供了检测两个或两个以上突变位点的方法，该突变位点在32个碱基之内同时相邻；本发明还提供了检出缺失或插入的方法。特别是，当在个体中有不同的基因型时，本发明方法可识别出不同位点的突变是在一个基因型中同时存在，还是在不同的基因型中混合存在。例如，人具有包含相同基因信息的一对(两条)染色体。当突变出现时，它可能或者出现在两条染色体中(纯合子)，或者出现在一条染色体中(杂合子)。当两个或两个以上相邻碱基的突变均是杂合的时，那些突变可能同时存在于一条染色体中，或者可能存在于不同的染色体中。由于这两种情形可能对生命有不同的作用，因此应当将它们区分开。在人受到病毒感染的情况下，各种基因型混合。当两个以上相邻碱基的突变均是杂合的时，应当区分那些突变是同时存在于一个基因型中，还是存在于不同基因型中。
为了分析突变，本发明的方法扩增目标序列，以包含可被限制性内切酶酶切的所得产物的位点，而且将由限制性内切酶酶切的片段中的碱基数控制为少于32个，且它们之中的至少一个碱基是由模板而不是引物本身的复制所产生的，用限制性内切酶将扩增片段酶切后，检测片段的分子量以分析突变。
在本发明的一个具体实施方式
中，提供了检测突变的方法，包括a)使用正向引物和反向引物扩增靶多核苷酸；b)通过用限制性内切酶酶切扩增的靶多核苷酸，生成两个或两个以上单链多核苷酸片段，该片段包含长度为2～32个碱基的一个或多个突变序列；以及c)检测酶切片段(cleaved fragment)的分子量。
优选的，将所述扩增的多核苷酸切成在一个单链多核苷酸片段中包含两个或两个以上不同突变中的一个突变，而在另一个单链核苷酸片段中包含所有的突变。例如，当在...ATG...中的A和G为突变序列时，第一个由限制性内切酶酶切得到的单链核苷酸片段仅包含两个突变序列中的A，而第二个单链核苷酸同时包含A和G。
为了分析突变，本发明的方法扩增目标序列，以使其包含这样的位点，在这些位点扩增得到的产物可被限制性内切酶酶切，并且酶切片段具有如下的结构。
所述“限制性内切酶识别序列”是指可被不同的限制性内切酶同时或邻近识别的序列，该序列可以不与酶切序列相对应。例如，FokI和BSTFSI均可识别序列GGATG。但是，所述酶切位点分别邻接于从识别序列的3’端起的第9位/第13位和第2位/第0位碱基。用于识别限制性内切酶识别序列的两种限制性内切酶可以具有相同或不同的最适温度。较好的是具有不同的最适温度。优选的，所述限制性内切酶为选自FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI、BaeI的具有较低最适温度的限制性内切酶和选自BSTF5I、TaqI、BsaBI、BtrI、BstAPI、FauI、BclI、PciI、Apo1的具有较高最适温度的限制性内切酶。更优选的，所述限制性内切酶是Fok1和BSTF5 I。
所述具有较低最适温度的限制性内切酶包括BaeI(25℃)、FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI、MmelI、AvaII(37℃)；所述具有较高最适温度的限制性内切酶是BSTF5I、TaqI(65℃)、BsaBI、BtrI、BstAPI(60℃)、BclI、PciI、ApoI(50℃)。
用于PCR扩增的两个引物之一包含引物结合序列1、限制性内切酶识别序列和引物结合序列2，而另一个引物包含引物结合序列3。
所述“引物结合序列”是与作为模板的核酸互补的序列，但所述限制性内切酶识别序列可以不与核酸互补。所述引物结合序列1、2和3的碱基数应当为至少四个或更多，以与模板DNA结合。由于所述引物在8～30个碱基长时可与模板DNA很好的结合，因此，优选的，碱基数为8～30个。所述“突变前序列”(front sequence from mutation)是朝向待检测的突变的5’端的序列。所述“突变序列”(mutation sequence)是与待检测的突变相对应的序列。碱基的取代、插入和缺失可能发生，其中碱基的数目通常为1个，也可以是两个或更多。所述“突变后序列”(sequence behind mutation)是朝向突变序列的3’端的序列。
优选的，所述突变前序列和突变后序列的碱基总数目为一个或多个。由限制性内切酶切成的片段应当包括突变序列，片段的长度优选为2～32个碱基。更优选的，长度为12个碱基。限制片段长度的原因是，在片段具有优选长度的情况下，质谱分析会有较好的结果。由于长度超过32个碱基的片段太长以至于不能通过使用质谱法测定分子量来检测突变，因此上述片段的碱基数目是优选的。而且，由于仅有一个突变序列的片段不能够识别引物在错误位点的结合，因此仅有一个碱基的片段不是优选的。由于所述两种限制性内切酶识别相同或者相邻的位点，优选的，当一种限制性内切酶与扩增产物反应时，另一种限制性内切酶没有活性。当用限制性内切酶酶切扩增片段时，考虑到两种限制性内切酶的最适温度，可以在不同的温度下连续进行反应。另外，可以将所述片段先用一种限制性内切酶酶切，然后再用另一种限制性内切酶酶切。在这里，经第一种限制性内切酶的酶切不应当消除或损坏存在于包含突变序列的片段中的第二种限制性内切酶的识别序列或酶切位点。
附图的简要说明从下述与附图相结合的详细描述中，可以更清楚的理解本发明优选实施方式的上述和其它特征、方面以及优点，其中
图1为当人maspin(serpinb5)基因的第4内含子的第2741位碱基为正常时，7mer的MALDI-TOF质谱图(C/C)；图2为当人maspin基因的第4内含子的第2741位碱基为正常时，13mer的MALDI-TOF质谱图(C/C)；图3为当人maspin基因的第4内含子的第2741位碱基为杂合时，7mer的MALDI-TOF质谱图(C/T)；图4为当人maspin基因的第4内含子的第2741位碱基为杂合时，13mer的MALDI-TOF质谱图(C/T)；图5为当人maspin基因的第4内含子的第2741位碱基全部变为T时，7mer的MALDI-TOF质谱图(T/T)；图6为当人maspin基因的第4内含子的第2741位碱基全部变为T时，13mer的MALDI-TOF质谱图(T/T)；图7为当人maspin基因的第4内含子的第3597位碱基为正常时，7mer和13mer的MALDI-TOF质谱图(C/C)；图8为当人maspin基因的第4内含子的第3597位碱基为杂合时，7mer和13mer的MALDI-TOF的质谱图(C/T)；以及图9为当人maspin基因的第4内含子的第3597位碱基全部变为T时，7mer和13mer的MALDI-TOF质谱图(T/T)。
本发明的最佳实施方式以下，将结合附图详细描述本发明的优选实施方式。
实施例1人maspin基因的第4内含子的第2741位碱基的突变检测已知为癌转移抑制基因的人maspin(serpinb5)基因的第2741位碱基(rs1509477，第18号染色体的第61001755位碱基)的突变。
1、PCR扩增和限制性内切酶酶切模板DNA的序列(5’→3’)如下所示GTTTCACTTGATAAAGCAATAAAATGCTATTCAcAGCTGCATGAGGCTACACCCTTCTTTTGAATGCAG(SEQ ID NO1)加下划线的序列为与下列引物1和2杂交的位点。用小写字母表示的碱基为“突变序列”。
引物15′-TCACTTGATAAAGCAATAAAAggatgGCTATTCA-3′(34mer)(SEQ ID NO2)引物25′-CATTCAAAAGAAGGGTGTAGCCTCATGC-3′(28mer)(SEQ ID NO3)用小写字母表示的序列为FokI和BSTF5I的识别序列。
将PCR缓冲液(1×)、2mM MgSO4、200mM三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、0.315U PlatinumTaq多聚酶(Invitrogen，10966-026)、0.5μM引物1和0.5μM引物2、以及36ng基因组DNA加至18μl总反应体积。然后，在下述条件下进行PCR反应。
94℃，2分钟，94℃，15秒 55℃，15秒 72℃，30秒(10个循环)，94℃，15秒 60℃，15秒 72℃，30秒(35个循环)从血中分离基因组DNA并纯化。例如，在从血中分离DNA时可使用“SDS/蛋白酶K”法(Maniatis，Molecular Cloning，A laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989)或者QIAamp DNA微量试剂盒250(Qiagen 51106)。当DNA的浓度较低时，可用下列方法浓缩该DNA。首先将1/10体积的3M醋酸钠(pH5.3)和2.5体积的乙醇添加入DNA溶液中，缓慢混合。将所得到的溶液在-20℃放置1小时以上，然后在4℃，以13000转/分钟离心15分钟。除去上清液后，加入70％的乙醇，将所得到的溶液在4℃，以13000转/分钟离心10分钟。然后，干燥除去乙醇，将预定体积的蒸馏水添加入所得溶液中。
由PCR得到的片段的序列如下所示(5’→3’)。
TCACTTGATAAAGCAATAAAAggatgGCTATTCA[C/T]AGCTGCATGAGGCTACACCCTTCTTTTGAATG(SEQ ID NO4)AGTGAACTATTTCGTTATTTTcctacCGATAAGT[G/A]TCGACGTACTCCGATGTGGGAAGAAAACTTAC(SEQ ID NO5)用小写字母表示的位点为FokI和BstF5I识别的序列，加下划线的位点为由限制性内切酶酶切产生的片段的序列，用方括号表示的碱基为“突变序列”。向反应物中添加1U FokI(NEB R109L)、1U BstF5I(NEB，V0031L)、50mM醋酸钾，20mM三(羟甲基)氨基甲烷乙酸盐(Tris-acetate)，10mM醋酸镁，1mM二硫苏糖醇(DTT)(pH7.9@25℃)。所得溶液在25℃时反应2小时，紧接着在45℃时反应2小时。
为了优化酶反应，在25℃、37℃、45℃、55℃和65℃时，使FokI和BstF5I与扩增产物反应。结果，在FokI存在的情况下，在25℃时，进行了70％的酶反应，在37℃时，进行了超过90％的酶反应。在BstFSI存在的情况下，在25℃时，酶反应不发生。因此，优选的，所述扩增产物首先在25℃时反应，此时只有FokI可以反应，然后，在超过37℃时反应，此时BstF5I可以反应。
2、纯化和脱盐优选的，从上述经限制性内切酶处理的溶液中纯化分离出DNA片段，然后，检测该片段的分子量。例如，可以使用Nucleave Genotyping试剂盒(Variagenics，USA)。将70μl 1M的TEAA(三乙基醋酸铵，pH7.6)添加到该限制性内切酶反应溶液中，放置1分钟。将70μl 1M的TEAA和90μl的上述混合溶液加入样品制备板(Sample preparation plate)上，然后用85μl1M的TEAA五次滤过样品制备板。将该样品制备板以1000转/分离心5分钟。此后，将该样品制备板放置到收集板(collection plate)上，然后将60μl的60％异丙醇添加入其中并滤过。当将流出液收集在收集板中时，将该收集板在115℃时干燥75分钟。
3、MALDI-TOF质谱分析将6μl MALDI基质(22.8mg柠檬酸钠、148.5mg羟基吡啶甲酸、1.12ml乙腈、7.8ml水)加入收集板中，然后将4μl MALDI基质和流出液的混合物放在MALDI-TOF的芯片底座板(Anchor chip plate，Biflex IV，Bruker)上。在37℃时干燥30分钟，放置于室温冷却一会儿，然后进行MALDI-TOF分析。该分析方法参照MALDI-TOF手册。
当第4内含子的第2741位碱基是正常的(C/C)，酶切后得到的片段的分子量是2135.4 D(道尔顿)(7mer)和4078.6 D(13mer)(见图1和2)。当第4内含子的第2741位碱基是杂合的(C/T)，片段的分子量为2135.4 D、2150.4 D(7mer)和4078.6 D、4062.6 D(13mer)(见图3和4)。当第4内含子的第2741位碱基全变为T(T/T)，片段的分子量为2150.4 D(7mer)和4062.6 D(13MER)(见图5和6)。
实施例2人maspin(serpinb5)基因的第四内含子的第3597位碱基的突变(rs1396782；人类第18号染色体的第61002611位碱基)，已知该基因为人癌转移抑制基因模板DNA的序列如下所示。
CTGGAGTATTATCCTTGCAGGCTTGATATGAAGcTTGAAATTTCTCCCCAAAGAGATTTAGTTAACAGGCAAA(SEQ ID NO6)加下划线的序列为与下述引物3和4杂交的位点。用小写字母表示的突变为“突变序列”。
引物35′-GAGTATTATCCTTGCAGGCTTggatgATATGAAG-3′(34mer)(SEQ ID NO7)引物45′-GCCTGTTAACTAAATCTCTTTGGGGAGAA-3′(29mer)(SEQ ID NO8)在上述引物中，用小写字母表示的位点为不存在于模板DNA中的序列，但FokI和BstF5I可识别它们。该包括PCR反应的实验方法与实施例1中所述的相同。
通过PCR得到的片段的序列如下所示(5’→3’)。
GAGTATTATCCTTGCAGGCTTggatgATATGAAG[C/T]TTGAAATTTCTCCCCAAAGAGATTTAGTTAACAGGC(SEQ ID NO9)CTCATAATAGGAACGTCCGAAcctacTATACTTC[G/A]AACTTTAAAGAGGGGTTTCTCTAAATCAATTGTCCG(SEQ ID NO10)上述序列中用小写字母表示的位点为限制性内切酶识别序列，加下划线的位点为由限制性内切酶酶切得到的片段的序列，用方括号([])表示的碱基为“突变序列”。将1U FokI(NEB R109L)、1U BstF5I(NEB，V0031L)、50mM醋酸钾、20mM Tris-acetate、10mM醋酸镁、1mM DTT(pH 7.9@25℃)。所得到的溶液在25℃时反应2小时，紧接着在45℃时反应2小时。
当第4内含子的第3597位碱基是正常的(C/C)，由酶切得到的片段的分子量是2209.4 D(7mer)和3988.6D(13MER)(见图7)。当第4内含子的第3597位碱基是杂合的(C/T)，片段的分子量是2209.4 D、2224.4 D(7mer)、和3988.6 D、3972.6 D(13mer)(见图8)。当第4内含子的第3597位碱基全变为T(T/T)，片段的分子量为2224.4 D(7mer)和3972.6 D(13mer)(见图9)。
实施例3乙型肝炎病毒DNA聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)位点的碱基突变检测YMDD位点的突变，该突变位于引起人类乙型肝炎的乙型肝炎病毒的DNA聚合酶中。YMDD位点的突变可产生对用于乙型肝炎治疗的拉米夫定(lamivudine)的耐药性。已知的，当蛋氨酸(M)，即第552号密码子，变为缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)时，产生了对拉米夫定的耐药性。
1、PCR扩增和限制性内切酶酶切应用QIAamp血液试剂盒(Qiagen，CA)，从0.2ml血清中分离出乙型肝炎病毒DNA，然后将2μl DNA用于PCR扩增。
模板DNA的序列(5’→3’)如下所示。
TTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTA(SEQ ID NO11)加下划线的序列为与下列引物5和6杂交的位点。
引物5(SEQ ID NO12)5′-TTCCCCCACTGTTTGGCTggatgTCAGTTAT-3′(31mer)引物6(SEQ ID NO13)5′-TACAGACTTGGCCCCCAATACCACATGATC-3′(30mer)在引物5中用小写字母表示的序列为FokI和BstF5I的识别序列，该序列不包含在模板DNA中，而是人工插入的。在引物6中的加下划线序列是经人工改变的序列，以防止FokI的识别。
通过使用18μl包含20mM Tris盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH8.4)、50mM氯化钾、0.2mM dNTP、0.4U PlatinumTaq多聚酶(Invitrogen，10966-026)、10pmol引物5和10pmol引物6的反应液，在如下条件下进行PCR反应。
94℃，2分钟94℃，15秒 50℃，15秒 72℃，30秒 (10个循环)，94℃，15秒 55℃，15秒 72℃，30秒 (35个循环)由PCR得到的片段的序列(5’→3’)如下所示。
TTCCCCCACTGTTTGGCTggatgTCAGTTATATGGATCATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTA(SEQ ID NO14)AAGGGGGTGACAAACCGAcctacAGTCAATATACCTAGTACACCATAACCCCCGGTTCAGACAT(SEQ ID NO15)用小写字母表示的位点为FokI和BstF5I可识别的序列，加下划线的位点为由限制性内切酶酶切得到的片段的序列。将PCR产物与1U FokI(NEBR109L)、1U BstF5I(NEB，V0031L)和10μl反应液(50mM醋酸钾、20mMTris-acetate、10mM醋酸镁、1mM DTT)混合。该混合溶液在37℃时反应2小时，然后在45℃时反应2小时。首先，将该PCR产物在37℃时用FokI酶切2小时，然后在45℃时用BstF5I酶切2小时。
2、纯化和脱盐、以及MALDI-TOF质谱分析按照与实施例1相同的方法进行该实验。
由酶切得到的片段的理论长度精确符合于按照实际分子量分析检测的值，表现出低于0.1％的差别(见表1)。
表1由PCR产物的限制性内切酶酶切得到的低聚核苷酸质量的推测值和观测值
在上表中，分辨率(用推测质量除观测质量与推测质量之间的差值)低于0.1％。
实施例4丙型肝炎病毒(HCV)5’NCR(非编码区)位点的突变当干扰素用于慢性丙型肝炎的治疗时，表现的治疗效果的不同取决于人体中丙型肝炎的基因型。因此，在使用干扰素前应先检测人体中丙型肝炎病毒的基因型。为了发现基因型，5′NCR突变的检测是有用的。在本发明的一个具体实施方式
中，公开了用于分析丙型肝炎病毒的5′NCR位点突变的方法。
1、逆转录多聚酶链反应(RT PCR)应用QIAamp病毒RNA微量试剂盒(Qiagen，CA)从0.14ml血清中分离出丙型肝炎病毒的RNA，然后将10μl RNA用于RT PCR扩增。
包含0.2mM dNTP、0.4μM引物2和10μl RNA的反应液在65℃时反应5分钟，然后在冰上放置1分钟。将反应液与20mM Tris HCl(pH 8.4)、50mM KCl、4mM DTT、0.4μM引物1、100U SuperScript III核糖核酸酶H-逆转录酶(Invitrogen，18080-044)、20U RNaseOUT(Invitrogen，10777-019)、0.4U PlatinumTaq多聚酶(Invitrogen，10966-026)混合。然后，在下列条件下用25μl所得的溶液进行RT PCR。
50℃，45分钟，94℃，2秒，94℃，15秒 55℃，15秒 72℃，30秒(35个循环)72℃，5分钟模板DNA的序列(5’→3’)如下所示。
GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGT(略去)ACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAG(SEQ ID NO16)加下划线的序列是与引物7和8杂交的位点。
引物7(SEQ ID NO17)5′-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3′(24mer)引物8(SEQ ID NO18)5′-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′(24mer)2、巢式PCR(Nested PCR)和限制性内切酶酶切将上述RT PCR反应液稀释至原浓度的1/50。将2μl稀释液与18μl包含20mM Tris HCl(pH 8.4)、50mM KCl、0.2mM dNTP、0.4U PlatinumTaq多聚酶(Invitrogen，10966-026)、10pmol引物9和10、10pmol引物11和12以及10pmol引物13和14的反应液混合。用该混合溶液进行下列三种类型的PCR反应和限制性内切酶处理。引物9和10用于反应1，引物11和12用于反应2，引物13和14用于反应3。所述三种反应的PCR反应温度和时间如下所述。
94℃，5分钟，94℃，30秒 55℃，30秒 72℃，30秒(35个循环)72℃，5分钟1)反应1使用引物9和10，在RT-PCR溶液中进行该PCR扩增。模板DNA的序列(5’→3’)如下所示。
CGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCC...(略去)...CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGG(SEQ ID NO19)加下划线的序列为与下列引物9和10杂交的位点。
引物9(SEQ ID NO20)5′-CGTCTAGCCATGGCGTTAGggatgATGAGTGT-3′(32mer)引物10(SEQ ID NO21)5′-CCCTATCAGGCAGTACCACAAGGC-3′(24mer)由PCR扩增产生的片段的序列如下所示(5’→3’)。
CGTCTAGCCATGGCGTTAGggatgATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCC...(略去)GCAGATCGGTACCGCAATCcctacTACTCACAGCACGTCGGAGGTCCTGGG...(略去)...CTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGG(SEQ ID NO22)...GACGATCGGCTCATCACAACCCAGCGCTTTCCGGAACACCATGACGGACTATCCC(SEQ ID NO23)用小写字母表示的位点为FokI和BstF5I可识别的序列。加下划线的位点为由限制性内切酶产生的片段的序列(7mer和13mer)。将PCR产物与1U FokI(NEB R109L)、1U BstF5I(NEB，V0031L)和10μl反应液(50mM醋酸钾、20mM Tris-acetate、10mM醋酸镁、1mM DTT)混合。该混合溶液在37℃时反应2小时，然后在45℃时反应2小时。将PCR产物在37℃时用FokI酶切2小时，然后在45℃时用BstF5I酶切2小时。
2)反应2使用引物11和12，在RT-PCR溶液中进行该PCR扩增。模板DNA的序列(5’→3’)如下所示。
GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCC...(略去)...CCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGRGTTGGGTRGCGAA(SEQID NO24)
加下划线的序列为与下列引物11和12杂交的位点。
引物11(SEQ ID NO25)5′-GTGGTCTGtccaacCGGTGAGTACACCGGAAT-3′(32mer)引物12(SEQ ID NO26)5′-TTCGCRACCCAACRCTACtccaacggtcCGGCTAG-3′(35MER)R所表示的碱基为腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)。使用包含每个碱基的两种引物的混合物。
由该PCR产生的片段的序列如下所示(5’→3’)。
GTGGTCTGtccaacCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCC...(略去)CACCAGACaggttgGCCACTCATGTGGCCTTAACGGTCCTGCTGGCCCAGG...(略去)...CCCCGCAAGACTGCTAGCCGgaccgttggaGTAGRGTTGGGTRGCGAA(SEQ ID NO27)...GGGGCGTTCTGACGATCGGCctggcaacctCATCRCAACCCARCGCTT(SEQ ID NO28)用小写字母表示的位点为MmeI和AvaII可识别的序列，加下划线的位点为用限制性内切酶酶切产生的片段的序列(13mer、18mer、24mer、19mer)。将PCR产物与1.5U MmeI(NEB R0637L)、50μM SAM(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和10μl 1×反应液(50mM醋酸钾、20mM Tris-acetate，10mM醋酸镁、1mMDTT，pH7.9)混合。该混合液在37℃时反应2小时，然后将1.5U AvaII(NEB，R0153S)加入其中。所得的溶液在37℃时反应2小时。MmeI和AvaII可同时加入混合液中。
3)反应3使用引物13和14，在RT-PCR溶液中进行该PCR扩增。模板DNA的序列(5’→3’)如下所示。
GACIGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGC(SEQ ID NO29)加下划线的序列为与下列引物13和14杂交的位点。
引物13(SEQ ID NO30)
5′-GACIGGGTCCTggatgTCTTGGA-3′(23mer)引物14(SEQ ID NO31)5′-GCGGGGGCACggatgCCCAAAT-3′(22mer)I所表示的碱基为肌苷。
由该PCR产生的片段的序列如下所示(5’→3’)。
GACIGGGTCCTggatgTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGcatccGTGCCCCCGC(SEQ ID NO32)CTGICCCAGGAcctacAGAACCTAGTTGGGCGAGTTACGGACCTCTAAACCCgtaggCACGGGGGCG(SEQ ID NO33)用小写字母表示的位点为FokI和BstF5I可识别的序列，加下划线的位点为用限制性内切酶酶切产生的片段的序列。生成的片段为2个7mer，2个13mer，以及2个14mer。将PCR产物与1U FokI(NEB R109L)、1U BstF5I(NEB，V003 1L)和10μl反应液(50mM醋酸钾、20mM Tris-acetate、10mM醋酸钾、1mM DTT)混合。该混合液在37℃时反应2小时，然后在45℃时反应2小时。将该片段首先在37℃时用FokI酶切2小时，然后在45℃用BstF5I酶切2小时。
2、纯化和脱盐、以及MALDI-TOF质谱分析采用与实施例1相同的方法纯化三种类型的PCR和限制性内切酶反应溶液，然后检测分子量。
由反应1(表2)、反应2(表3)和反应3(表4)生成的片段的长度如表2～4所示。根据由简便计算表得到的片段长度确定丙型肝炎的基因型，如表2～4所示。
表2
表3
表4
工业应用性在本发明的一个实施方式中，可以识别常规检测突变的方法中的错误导致的不当分析，而且可以同时检测32个以内相邻碱基的各种突变。当具有突变的个体有各种基因型时，可以区分出不同位点的突变是同时存在于一个基因型中，还是混合存在于两个以上的基因型中。另外，可以检测由基因缺失或插入导致的突变。
至此，已详细的描述了本发明。然而，应当理解，由于从该详细的描述中，对于本领域技术人员来说，不超出本发明精神和范围的各种变化和修改是显而易见的，因此，该表明了本发明优选实施方式的详细描述和具体实施例，仅仅是示例性的。
序列表<110>基因矩阵公司；刘王敦<120>检测突变的方法<130>PCT03-058<150>KR2002-0063832<151>2002-10-18<150>KR2003-0061066<151>2003-09-02<160>33<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>69<212>DNA<213>人<400>1gtttcacttg ataaagcaat aaaatgctat tcacagctgc atgaggctac acccttcttt60tgaatgcag69<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>maspin基因第4内含子的正向引物<400>2tcacttgata aagcaataaa aggatggcta ttca34<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>maspin基因第4内含子的反向引物<400>3cattcaaaag aagggtgtag cctcatgc 28<210>4<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>4tcacttgata aagcaataaa aggatggcta ttcactagct gcatgaggct acacccttct60tttgaatg 68<210>5<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>5agtgaactat ttcgttattt tcctaccgat aagtgatcga cgtactccga tgtgggaaga60aaacttac 68<210>6<211>73<212>DNA<213>人<400>6ctggagtatt atccttgcag gcttgatatg aagcttgaaa tttctcccca aagagattta60gttaacaggc aaa 73<210>7<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>maspin基因第4内含子的正向引物<400>7gagtattatc cttgcaggct tggatgatat gaag34<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>maspin基因第4内含子的反向引物<400>8gcctgttaac taaatctctt tggggagaa 29<210>9<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>9gagtattatc cttgcaggct tggatgatat gaagctttga aatttctccc caaagagatt60tagttaacag gc72<210>10<211>72<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>10ctcataatag gaacgtccga acctactata cttcgaaact ttaaagaggg gtttctctaa60atcaattgtc cg72
<210>11<211>60<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<400>11ttcccccact gtttggcttt cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta6060<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎病毒的正向引物<400>12ttcccccact gtttggctgg atgtcagtta t 31<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>乙型肝炎病毒的反向引物<400>13tacagacttg gcccccaata ccacatgatc30<210>14<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>14ttcccccact gtttggctgg atgtcagtta tatggatcat gtggtattgg gggccaagtc 60tgta64<210>15<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>15aagggggtga caaaccgacc tacagtcaat atacctagta caccataacc cccggttcag 60acat64<210>16<211>244<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>丙型肝炎病毒的5’非编码区
<400>16gcagaaagcg tctagccatg gcgttagtat gagtgtcgtg cagcctccag gaccccccct60cccgggagag ccatagtggt ctgcggaacc ggtgagtaca ccggaattgc caggacgacc120gggtcctttc ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac180tgctagccga gtagtgttgg gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg240cgag 244<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>丙型肝炎病毒5’非编码区的正向引物<400>17gcagaaagcg tctagccatg gcgt 24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>丙型肝炎病毒5’非编码区的反向引物<400>18ccc tatcagg cagtaccaca aggc 24<210>19<211>226<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>19cgtctagcca tggcgttagt atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag 60agccatagtg gtctgcggaa ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt 120tcttggatca acccgctcaa tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcaag actgctagcc 180gagtagtgtt gggtcgcgaa aggccttgtg gtactgcctg ataggg 226<210>20<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>20cgtctagcca tggcgttagg gatgatgagt gt 32<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>反向引物<400>21ccctatcagg cagtaccaca aggc 24<210>22<211>230<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR引物<400>22cgtctagcca tggcgttagg gatgatgagt gtcgtgcagc ctccaggacc ccccctcccg60ggagagccat agtggtctgc ggaaccggtg agtacaccgg aattgccagg acgaccgggt120cctttcttgg atcaacccgc tcaatgcctg gagatttggg cgtgcccccg caagactgct180agccgagtag tgttgggtcg cgaaaggcct tgtggtactg cctgataggg 230<210>23<211>230<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>23gcagatcggt accgcaatcc ctactactca cagcacgtcg gaggtcctgg gggggagggc60cctctcggta tcaccagacg ccttggccac tcatgtggcc ttaacggtcc tgctggccca120ggaaagaacc tagttgggcg agttacggac ctctaaaccc gcacgggggc gttctgacga180tcggctcatc acaacccagc gctttccgga acaccatgac ggactatccc 230<210>24<211>133<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>模板DNA<400>24gtggtctgcg gaaccggtga gtacaccgga attgccagga cgaccgggtc ctttcttgga60tcaacccgct caatgcctgg agatttgggc gtgcccccgc aagactgcta gccgagtagr120gttgggtrgc gaa 133<210>25<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>25gtggtctgtc caaccggtga gtacaccgga at 32
<210>26<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>26ttcgcraccc aacrctactc caacggtccg gctag35<210>27<211>142<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>27gtggtctgtc caaccggtga gtacaccgga attgccagga cgaccgggtc ctttcttgga60tcaacccgct caatgcctgg agatttgggc gtgcccccgc aagactgcta gccggaccgt120tggagtagrg ttgggtrgcg aa 142<210>28<211>142<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<400>28caccagacag gttggccact catgtggcct taacggtcct gctggcccag gaaagttcct60agttgggcga gttacggacc tctaaacccg cacgggggcg ttctgacgat cggcctggca120acctcatcrc aacccarcgc tt 142<210>29<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>模板DNA<220>
<221>修饰的碱基<222>(4)<223>i<400>29gacngggtcc tttcttggat caacccgctc aatgcctgga gatttgggcg tgcccccgc59<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物
<220>
<221>修饰过的碱基<222>(4)<223>i<400>30gacngggtcc tggatgtctt gga 23<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>31gcgggggcac ggatgcccaa at22<210>32<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<220>
<221>修饰的碱基<222>(4)<223>i<400>32gacngggtcc tggatgtctt ggatcaaccc gctcaatgcc tggagatttg ggcatccgtg60cccccgc 67<210>33<211>67<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>所得的PCR片段<220>
<221>修饰的碱基<222>(4)<223>i<400>33ctgncccagg acctacagaa cctagttggg cgagttacgg acctctaaac ccgtaggcac60gggggcg 6权利要求
1.一种检测突变的方法，包括a)使用正向引物和反向引物扩增靶多核苷酸；b)通过用限制性内切酶酶切扩增的靶多核苷酸，生成两个或两个以上单链多核苷酸片段，该片段包含长度为2～32个碱基的一个或多个突变序列；以及c)检测酶切片段的分子量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述多核苷酸切成仅在一个单链多核苷酸片段中包含两个或两个以上不同突变中的其中一个突变，而在另一个单链多核苷酸片段中包含所有的突变。
3.用于检测突变的方法，包括a)使用正向引物和反向引物扩增靶多核苷酸；b)用限制性内切酶酶切扩增的靶多核苷酸，其中，当第一个限制性内切酶与扩增的多核苷酸反应时，第二个限制性内切酶不反应；以及c)检测酶切片段的分子量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用具有不同最适温度的限制性内切酶进行所述限制性内切酶处理步骤。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用具有不同最适温度的限制性内切酶进行所述限制性内切酶处理步骤。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为选自FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI、BaeI的具有较低最适温度的限制性内切酶和选自BstF5I、TaqI，BsaBI、BtrI、BstAPI、FauI、BclI、PciI、ApoI的具有较高最适温度的限制性内切酶。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为选自FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI、BaeI的具有较低最适温度的限制性内切酶和选自BstF5I、TaqI，BsaBI、BtrI、BstAPI、FauI、BclI、PciI、ApoI的具有较高最适温度的限制性内切酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的多核苷酸包含酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸位点，该位点是乙型肝炎病毒的DNA聚合酶的活性位点。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增的多核苷酸包含酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸位点，该位点是乙型肝炎病毒的DNA聚合酶的活性位点。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增的多聚核苷酸包括丙型肝炎病毒的5’-非编码区位点。
11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增的多聚核苷酸包括丙型肝炎病毒的5’-非编码区位点。
12.用于分析基因突变的引物，包含引物结合序列1、限制性内切酶识别序列和引物结合序列，其中，用于识别限制性内切酶识别序列的由两个或两个以上限制性内切酶酶切的多核苷酸片段包含一突变序列，该片段的长度为2～32个碱基。
13.根据权利要求12所述的引物，其特征在于，正向引物为选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO20、SEQ ID NO25、SEQ ID NO30所示序列的引物。
14.根据权利要求12所述的引物，其特征在于，所述限制性内切酶具有不同的最适温度。
15.根据权利要求14所述的引物，其特征在于，所述限制性内切酶为选自FokI、BbvI、BsgI、BcgI、BpmI、BseRI、BaeI的具有较低最适温度的限制性内切酶和选自BstF5I、TaqI，BsaBI、BtrI、BstAPI、FauI、BclI、PciI、ApoI的具有较高最适温度的限制性内切酶。
16.根据权利要求12所述的引物，其特征在于，所述引物用于人maspin基因的第4内含子的第2741位或3597位碱基的突变分析，或者用于抗拉米夫定的乙型肝炎病毒的突变分析，或者用于丙型肝炎病毒的突变分析。
全文摘要
本发明提供了用于准确有效的检测生物体突变的方法。所述用于检测突变的方法包括下述步骤a)使用正向引物和反向引物扩增靶多核苷酸；b)通过用限制性内切酶酶切扩增的靶多核苷酸，生成两个或两个以上单链多核苷酸片段，该片段包含长度为2～32个碱基的一个或多个突变序列；以及c)检测酶切片段的分子量。
文档编号C12Q1/68GK101027407SQ200380101469
公开日2007年8月29日 申请日期2003年10月17日 优先权日2002年10月18日
发明者金楠根, 金锡俊, 金寿玉, 金恩玉, 文明顺, 刘王敦, 李昌弘, 郑贤在, 池美善, 黄圣奎, 洪璿杓 申请人:基因矩阵公司