异麦芽糖合酶的基因缺失的真菌类微生物的制作方法

专利名称：异麦芽糖合酶的基因缺失的真菌类微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产蛋白质的微生物。更具体些，涉及可用作制备蛋白质生产用的微生物宿主的微生物、用于生产蛋白质的微生物以及使用该微生物生产蛋白质的方法。
背景技术：
众知周知，丝状真菌可在菌体外分泌产生各种蛋白酶。利用丝状真菌所具有的这种特性，自古以来，在黄酱、酱油、清酒制造等酿造领域和酶制剂的生产中，已广泛使用包括曲霉属(Aspergillus)在内的各种丝状真菌。为提高菌体外酶的生产能力进行了长期育种，结果得到了每升培养液可生产数十克酶蛋白的菌株。
另一方面，近年来通过应用基因重组技术，使生产更为多样的蛋白质成为可能。在利用基因重组菌合成酶蛋白中，作为大量生产目的酶的手段，基于提高基因的转录能力关系到高产的想法，正在探索和利用具有更强转录能力的启动子。基于该观点，到目前为止，已报道了多种利用分离自丝状真菌的启动子的蛋白质生产体系。例如，米曲霉(Aspergillus Oryzae)的淀粉酶基因的启动子(例如参考特开昭62-272988号公报和Biotechnology，5，368(1987))、黑曲霉(Aspergillus Nigar)的葡萄糖淀粉酶基因的启动子(例如参考Biotechnology，6，1419(1988))等已被分离供利用。进而，也进行了通过导入增强子和/或改变调控区域等，来提高启动子的能力的尝试。基于依赖于上述启动子能力的基因产物的生产，与以往的育种法所产生的能力增强比较，能够有效提高生产能力。尽管如此，为提高作为绝对产量的菌体外蛋白酶的产量，对适用以往的育种法的宿主菌株进行了进一步育种改良。

发明内容
本发明鉴于以上背景，目的在于提供在导入编码目的蛋白质的基因后能够有效增强该基因表达的宿主微生物。此外，本发明的另一目的在于，提供可高效生产目的蛋白质的转化体。进而，本发明的又一目的在于，提供可以高生产率生产目的蛋白质的生产方法。
为解决以上问题本发明人进行了各种探讨，同时针对曲霉菌Taka-淀粉酶A进行了研究。曲霉菌Taka-淀粉酶A是被淀粉或麦芽糖诱导、而被葡萄糖抑制的典型的诱导酶。详细分析了曲霉菌Taka-淀粉酶A基因的诱导机制，通过AmyR控制转录诱导，从而弄清了，真正的转录诱导物质是异麦芽糖。已澄清，淀粉或麦芽糖对曲霉菌Taka-淀粉酶A基因的转录诱导作用源于，淀粉或麦芽糖在α-葡糖苷酶的作用下生成异麦芽糖。
本发明人，在阐明曲霉菌Taka-淀粉酶A基因的诱导机制的过程中，着眼于构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的主要异麦芽糖合酶，即α-葡糖苷酶B，培育了缺失该酶的突变株(ΔagdB株)。接着，将Taka-淀粉酶A基因导入相应的缺失突变株。在由此得到的转化体中，使用作为异麦芽糖源的淀粉和麦芽糖，对Taka-淀粉酶A基因的诱导效果进行调查后发现，和对照(以野生株作为宿主，导入Taka-淀粉酶A后的转化体)比较，Taka-淀粉酶A表达显著增强。由该结果可得到如下发现在以生产受异麦芽糖诱导表达的基因所编码的蛋白质为目的时，使用主要的异麦芽糖合酶基因缺失的微生物作为宿主就成为非常有效的手段。本发明基于这样的发现而完成，提供下面的各组成。
一种真菌类微生物，其特征在于，其主要的异麦芽糖合酶的基因缺失。
根据[1]所述的微生物，其被分类为丝状真菌。
一种构巢曲霉，其特征在于，其α-葡糖苷酶B基因缺失。
一种转化体，其特征在于，其是通过将受异麦芽糖诱导而表达的外源基因导入主要的异麦芽糖合酶的基因缺失的真菌类微生物而制得。
根据[4]所述的转化体，其中，所述微生物是被分类为丝状真菌的微生物。
一种转化体，其特征在于，其是通过将受异麦芽糖诱导而表达的外源基因导入α-葡糖苷酶B基因缺失的构巢曲霉而制得。
根据[4]～[6]中任一项所述的转化体，其中，所述外源基因含有下面的经修饰的启动子即向可在丝状真菌中行使功能的启动子中，插入包含CCAATNNNNNN(第1碱基序列序列号1)的第1DNA片段和包含CGGNNNNNNNNNGG(第2碱基序列序列号2)的第2DNA片段而得到的经修饰的启动子。
蛋白质的生产方法，其包含在所述外源基因能够表达的条件下，培养[4]～[7]中任一项所述的转化体的步骤，以及回收产生的蛋白质的步骤。


图1是Taka-淀粉酶A基因(米曲霉)的启动子区域的序列的示意图。
图2是Taka-淀粉酶A基因(米曲霉)的启动子区域的模式图，显示转录调控因子结合序列(CCAAT序列·SRE)的位置和突变导入部分；通过位点特异性突变而导入的限制性酶位点以下划线表示，CCAAT表示CCAAT序列(广域转录活化因子(HAP复合体)的结合因子)，SRE表示淀粉分解酶基因群的转录活化因子(AmyR)的结合因子，TATA表示TATA-box，+1表示转录起始位点。
图3是实施例3中的淀粉酶基因表达载体的制备过程的示意图。
图4是实施例4中的淀粉酶活性测定结果的总结表，其中，N.D.表示未确定。
具体实施例方式
下面，详细说明本发明的构成。本发明的第一个方面提供主要的异麦芽糖合酶的基因缺失的真菌类微生物。在制备用于生产特定蛋白质的转化体时，该微生物被用作宿主。本发明中的“真菌类微生物”没有特别限定，例如可以是，米曲霉或构巢曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、里氏木霉(Trichoderma ressei)等丝状真菌(包括壶菌门、接合菌门、子囊菌门、霉菌类、半知菌类)。此外，本发明中的丝状真菌表示广义的丝状真菌，包括酵母(子囊菌类、担子菌类、半知菌类)。
本发明中的“主要的异麦芽糖合酶”表示在该微生物体内与异麦芽糖的生成最为相关的酶。即，在对象微生物具有不同种具有异麦芽糖生成活性的酶的情况下，这些多种酶中活性最高者就是此处所述的主要的异麦芽糖合酶。本发明可以至少缺失编码这样的酶的基因，也可以同时缺失例如与异麦芽糖的生成相关的其他酶(当存在2种或2种以上时，也可以是多种)。作为异麦芽糖合酶的具体例子，例如可以举出，α-葡糖苷酶A、α-葡糖苷酶B、转葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、异普鲁兰酶(isopullanase)。
在从自然界存在的微生物或从保藏机构等获得的微生物之中，选择适当的微生物，通过对其实施突变处理，使得其中编码主要的异麦芽糖合酶基因缺失，由此制备本发明的微生物。作为突变处理方法，例如可以使用如下方法，将包含对待缺失基因的相应序列预先突变而得的突变序列的载体，采用基因工程手段整合到宿主微生物的染色体上，由此破坏宿主微生物染色体上存在的目的基因的方法，位点特异性突变法等。
本发明的第二个方面涉及以上述微生物为宿主通过导入外源基因而得到的转化体，具体而言，提供将受异麦芽糖诱导而表达的外源基因导入主要的异麦芽糖合酶的基因缺失的真菌类微生物而得到的转化体。这样的本发明的转化体能够用于生产蛋白质。
制备本发明的转化体时所采用的转化方法并未特别限定，可以从公知的转化方法中适当选取。例如，可以采用使用了原生质化的菌体的Turner等人的方法(Gene，36，321-331(1985)。此外，也可以采用五味等的方法(Agric.Biol.Chem.，51，323-328(1987))等。
在使用载体进行转化的情况下，所使用的载体的种类并没有特别限定。例如可以使用，就其和宿主的关系而言适于转化的市售载体，再将目的基因插入上述市售载体而得到的载体。
优选在载体中连接有适用于在转化宿主微生物后选择转化体的选择标记。采用在和使用的宿主的关系上适当的选择标记。作为选择标记的具体例子，可以举出，鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argB)、硝酸还原酶基因(niaD)、乙酰胺酶基因(amdS)、色氨酸合酶基因(trpC)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等营养缺陷型的互补基因，以及针对寡霉素、越霉素、潮酶素等的耐药性基因等。
本发明中使用的外源基因，通常包含启动子和结构基因(编码区域)。但是，在能够利用待转化的宿主微生物的启动子的情况下(也包含在宿主微生物中预先导入适当的外源启动子的情况)，作为本发明的外源基因，也可以使用不含启动子区域的基因，即，只包含编码区域的基因或只包含编码区域和终止区域的基因等。
作为启动子，使用具有被异麦芽糖诱导的性质的启动子，另外，作为结构基因，使用整合到转化体后受所述启动子支配的结构基因。只要是满足这样的条件的启动子和结构基因，就不受特别限定，作为启动子，例如可以使用曲霉属、青霉属、木霉属等微生物的编码蛋白质的基因中的受异麦芽糖诱导的启动子。更为具体些，可以使用编码曲霉属的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶等的基因的启动子。其中，优选使用米曲霉的Taka-淀粉酶的启动子。这些启动子，可以利用限制性酶处理、PCR等基因工程手段从带有这些启动子的微生物获得。此外，在可以利用携带有目的启动子的载体的情况下，可以通过限制性酶处理、PCR法等获得所述启动子。另一方面，作为结构基因，例如可以使用编码α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、果胶酶等糖类关联酶的编码基因、编码凝乳酶等蛋白酶的基因、或编码脂酶的基因等。此外，可以是编码同源蛋白质的基因，也可以是编码异源蛋白质的基因。此处的同源蛋白质表示宿主微生物原本就产生的蛋白质。另一方面，异源蛋白质表示宿主微生物原本不产生的蛋白质，即，是通过导入外源编码基因而首次产生的蛋白质。
转化时，启动子和结构基因(编码区域)不需要来自同一载体。即，可以通过带有待导入的启动子的第1载体和带有待导入的结构基因的第2载体，用这两者进行转化，从而获得导入了目的外源基因的转化体。
也可以使用对自然界存在的启动子进行修饰而得到的经修饰的启动子。以下，显示经修饰的启动子的具体例子。此外，以下说明中，把能够提高启动子活性的功能称为“增强子功能”。
(1)一种经修饰的启动子，其是通过向可在丝状真菌中行使功能的启动子中，插入包含CCAATNNNNNN(第1碱基序列序列号1)的第1DNA片段和包含CGGNNNNNNNNNGG(第2碱基序列序列号2)的第2DNA片段而获得。
(2)根据(1)所述的经修饰的启动子，其中，所述第1碱基序列是CCAATTAGAAG(序列号3)。
(3)根据(1)或(2)所述的经修饰的启动子，其中，所述第2碱基序列是CGGHNWWWWNWHGG(序列号4)。
(4)根据(1)或(2)所述的经修饰的启动子，其中，所述第2碱基序列是CGGWWWWWWWWHGG(序列号5)。
(5)根据(1)或(2)所述的经修饰的启动子，其中，所述第2碱基序列是CGGAAATTTAAAGG(序列号6)、CGGAATTTAAACGG(序列号7)或CGGAAATTTAACGG(序列号8)。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的经修饰的启动子，其中，沿所述启动子的5’末端→3’末端的方向，依次并排插入第1DNA片段和第2DNA片段。
(7)根据(6)所述的经修饰的启动子，其中，所述第1DNA片段及所述第2DNA片段被插入在比所述启动子的CCAAT序列更靠近5’端的上游区域、或在比所述启动子的SRE区域更靠近3’端的下游区域。
(8)根据(1)～(7)中任意一项所述的经修饰的启动子，其中，多个所述第1DNA片段及多个所述第2DNA片段被插入。
(9)根据(8)所述的经修饰的启动子，其中，所述第1DNA片段和所述第2DNA片段被以相同数目插入。
(10)根据(9)所述的经修饰的启动子，其中，在所述启动子中插入有所述第1DNA片段和所述第2DNA片段，使得一个第1DNA片段和一个第2DNA片段构成一组，并且在各组中第1DNA片段位于所述启动子的5’末端侧。
(11)一种经修饰的启动子，其是由向可在丝状真菌中行使功能的启动子中插入具有增强子功能的一个到多个的DNA片段所获得的，所述的DNA片段是带有序列号9的碱基序列的DNA片段或对该DNA片段的一部分进行修饰而得到的DNA片段。
(12)根据(1)～(11)中任一项所述的经修饰的启动子，其中，所述可在丝状真菌中行使功能的启动子是米曲霉的Taka-淀粉酶的启动子。
而且，以上，N表示A、T、C、G中的任一种。
上面的经修饰的启动子中的第1DNA片段及第2DNA片段，例如可以使用市售的DNA合成仪来合成。此外，例如也可以通过以米曲霉的Taka-淀粉酶A的基因的启动子区域为模板，使用适当的引物，以PCR法来制备。
通过制备一个包含第1DNA片段和第2DNA片段的DNA片段，并将其插入到可在丝状真菌中行使功能的启动子中，可以制备经修饰的启动子。例如，从曲霉属等中的启动子中，选择包含相应于第1DNA片段以及第2DNA片段的序列的启动子，以其为模板，采用PCR法等，可以制备这样的DNA片段。适合作为模板的启动子的例子，可以举出，米曲霉的Taka-淀粉酶A基因的启动子(序列号12)。序列号9是用于启动子的修饰的DNA片段的碱基序列的一个例子。该DNA片段(CCAAT-SRE片段)是米曲霉的Taka-淀粉酶A基因的启动子区域的一部分(240位～367位(以转录起始位点为+1时，-312位～-185位))。此外，也可以是该DNA片段的一部分经过修饰而得到的DNA片段，只要其具有增强被插入的启动子的活性的功能(增强子功能)，就可以用于启动子区域的修饰。此处，一部分修饰指的是，构成DNA片段的一部分碱基被取代、缺失的情况，或者一个到多个碱基被添加或插入的情况。这样的修饰所允许的程度，因待修饰的DNA片段上的位点而异。由于担负增强子功能的重要部分是相应于第1DNA片段以及第2DNA片段的序列部分，因而，优选该序列部分的修饰程度小。此外，由于预想其他部分和增强子功能并非直接相关，因而认为上述其他部分中可以允许较大修饰。例如，可以进行1～20个左右，优选1～10个，更优选1～5个碱基的取代、缺失、添加等。此外，这样的修饰包含在5’末端、3’末端、或其他位点导入限制性酶切位点或插入编码信号肽的序列等。
上述经修饰的启动子，是向可在丝状真菌中行使功能的启动子中插入第1DNA片段以及第2DNA片段(以下将具有所述DNA片段以及包含所述DNA片段的DNA片段统称为“具有增强子功能的DNA片段”)构建而得，这些DNA片段的插入位点没有特别限定。但是，采用带有CCAAT序列以及SRE的启动子作为待修饰的启动子时，优选在这两个序列之间的序列之外的位点插入。即，优选在比CCAAT序列更靠近5’末端侧的位点或者在比SRE更靠近3’末端侧的位点插入带有增强子功能的DNA片段。
经修饰的启动子可以通过向可在丝状真菌中行使功能的启动子中插入多个第1DNA片段以及多个第2DNA片段来制备。在这种情况下优选使用相同数量的第1DNA片段和第2DNA片段。而且，优选使一个第1DNA片段和一个第2DNA片段构成一组将第1DNA片段和第2DNA片段插入到启动子中，并且使各组中第1DNA片段位于所述启动子的5’末端侧。
在使用含第1DNA片段和第2DNA片段的DNA片段的情况下，可以采用插入多个所述DNA片段来对启动子进行修饰。在此种情况下当采用带有CCAAT序列以及SRE的启动子作为待修饰的启动子时，优选在这两个序列之间的序列之外的位点插入。
能够期待通过插入多个具有增强子功能的DNA片段进行启动子的修饰使启动子活性的进一步提高。
作为供制备经修饰的启动子的可在丝状真菌中行使功能的启动子，只要具有在丝状真菌发挥功能的性质，就其种类没有特别限定。例如可以举出，曲霉菌属、青霉属、木霉属等微生物中的编码蛋白质的基因的启动子。具体而言，可以使用曲霉属的编码α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶等的基因的启动子。其中，优选使用米曲霉的Taka-淀粉酶的启动子。这些启动子，可以使用限制性酶处理、PCR等基因工程手段，从具有其的微生物中获得。此外，在能够利用携带有目的启动子的载体的情况下，可以利用限制性酶处理或PCR法等从该载体获得。
通过在能够表达导入的外源基因的条件下，培养本发明的转化体，可以生产目的蛋白质。可以根据所使用的转化体，选择使用适当的培养用的培养基。例如可以使用市售的各种培养基，或在其中添加有精氨酸、尿苷等促进转化体生长、选择、蛋白质表达等的必要成分的培养基等。
从经过规定时间培养后的培养液或菌体中，回收目的蛋白质。对于分泌型蛋白质从培养液中回收，除此以外，可以从菌体内回收。在从培养液回收的情况下，例如可以通过，过滤上清培养液，离心处理除去不溶物后，组合运用硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种色谱等多种方法，进行分离、纯化，从而获得目的蛋白质。在从菌体内回收的情况下，例如可以通过以加压处理、超声处理等破碎菌体后，同上述一样进行分离、纯化，从而获得目的蛋白质。此外，也可以在以过滤、离心处理等从预培养液回收菌体后，进行上述一系列工序(菌体的破碎、分离、纯化)。
实施例以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1α-葡糖苷酶B(agdB)的纯化和agdB基因的克隆(1-1)α-葡糖苷酶B的纯化和酶学性质将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)ABPU1(pyrG89，biA1，wA3，argB2，pyroA4Mol.Gen.Genet.(1997)253520-528，Motoyama，T.，M.Fujisawa，N.Kojima，H.Horiuchi，A.Ohta and M.Takagi.)接种于2L含有2％淀粉作为碳源的基本培养基，使孢子数为106/ml，于37℃振荡培养24小时。通过过滤吸附分离菌体，并在液氮中冻干后，在液氮存在下粉碎菌体成粉末状。每1g湿菌体加入5ml提取缓冲液(含0.5％Triton X-100，1mM EDTA，2mM PMSF的0.2MMES-KOH缓冲液，pH5.5)并混悬，用聚钍射气(polythoron)匀浆。4℃、16,000×g离心分离30分钟，将得到的上清作为细胞培养液。如下所述从该细胞提取液纯化α-葡糖苷酶B。
将细胞提取液相对于含有1mM EDTA、0.5mM PMSF的20mM MES-KOH缓冲液(pH5.5)进行透析之后，供给预先以20mM MES-KOH缓冲液(pH5.5)平衡的DEAE-Tyopearl 650M柱(2.5×10cm)。用200ml 0～0.5M的线性浓度梯度NaCl溶液，将吸附于该柱的蛋白质洗脱。回收0.1MNaCl洗脱下来的主要的α-葡糖苷酶B活性部分，并将其相对于含有1.5M硫酸铵的20mM MES-KOH缓冲液(pH5.5)进行透析。将该活性部分吸附于以相同缓冲液平衡了的Phenyl Sepharose CL-4B柱(1×12cm)，然后用40ml 1.5～0M的线性浓度梯度硫酸铵溶液洗脱。回收0M硫酸铵洗脱下来的活性部分，并将其相对于20mM HEPES-KOH缓冲液(pH7.4)进行透析之后，以Centriprep YM-10浓缩为1ml。将该浓缩样品供给预先以相同缓冲液平衡了的Resource Q柱。用AKTAexplorer 10S系统进行Resource Q柱的色谱分析。用60ml 0～1M的线性浓度梯度NaCl溶液，将吸附于该柱的蛋白质洗脱。将0.3M NaCl洗脱下来的活性部分相对于20mM HEPES-KOH缓冲液(pH7.4)进行透析，得到纯化酶。
该纯化酶由74kDa和54kDa的亚单位构成，最适pH为5.5，pH稳定性位于pH5.0～8.5之间，此外，温度稳定性为，直到45℃，均保持90％或以上的酶活性，pH4.0或以下、pH11.0或以上，60℃或以上时酶活性完全丧失。
该酶除分解活性外，还具有位置选择性形成α-1，6葡萄糖苷键的糖转移活性。显示对麦芽寡糖的高水解活性，显示对麦芽三糖最高的反应性，对麦芽四糖和麦芽五糖的反应性依次降低，由此暗示，对聚合度高的麦芽寡糖的反应性低。该酶对异麦芽糖、黑曲糖、曲二糖、α，α’-海藻糖也显示水解活性。但是，对p-硝苯基葡萄糖苷以及蔗糖、淀粉，完全不显示活性。此外，利用该酶的糖转移活性，从麦芽糖合成了葡萄糖和多种糖转移产物。其主要糖转移产物是异麦芽糖和潘糖。反应进行6小时时，生成的糖转移产物的量约相当于作为基质添加的麦芽糖的50％，其中，60％为异麦芽糖。此外，当以曲二糖、黑曲糖为底物时，生成异麦芽糖，当以异麦芽糖为基质时，生成异麦芽三糖。
(1-2)α-葡糖苷酶B基因的克隆将上述纯化酶的标准品供给SDS-PAGE，分离出74kDa和55kDa亚单位，电泳印迹于Sequi-Blot PVDF膜。从膜中切出74kDa以及55kDa的对应各亚单位的条带，用Applied Biosystems model 473A蛋白测序仪测定N末端氨基酸序列。74kDa和55kDa亚单位的N末端氨基酸序列分别是SQAGVDPLDRPGNDYVKD和QSHRQLGAGRWRSAVRH。此外，为测定74kDa和55kDa亚单位的内部氨基酸序列，将纯化酶供给SDS-PAGE，分离出两个亚单位，然后分别从丙烯酰胺电泳洗脱。用赖氨酰内肽酶将各亚单位解离，得到的肽通过15％SDS-PAGE分离，并电泳印迹于PVDF膜。对于各自的主要条带，通过蛋白测序仪测定N末端氨基酸序列。来自74kDa亚单位的主要肽(30kDa)和来自55kDa亚单位的主要肽(15kDa)的N末端氨基酸序列分别是THLPQNPHLYGLGE和DVSHWLGDNISDWLSYRLSI。
基于74kDa亚单位的N末端以及内部氨基酸序列，设计N末端引物N1(5’-ARGCNGGNGTIGAYCCIYTNGA-3’)，N2(5’-YTNGAYMGICCNGGIAAYGA-3’)，以及内部氨基酸序列所对应的引物11(5’-CCRTANARRTGIGGRTTYTGNGG-3’)，12(5’-TGIGGRTTYTGNGGIARRTGNGT-3’)，用于PCR反应。以构巢曲霉染色体DNA为模板，N1，11为引物，进行PCR反应。用PCR反应物的一部分和引物N2，12，再次进行PCR反应，扩增agdB基因的一部分(440bp)的DNA片段。以HindIII消化构巢曲霉染色体DNA，以琼脂糖电泳将HindIII消化的DNA片段根据大小进行分离。将和上述440bpDNA片段杂交的5-7kbDNA片段连接于pBluescriptIIKS+(STRATAGENE公司)，转化大肠菌JM109(STRATAGENE公司)。接着，获得和440bpDNA片段杂交的转化体。该转化体带有包含agdB基因的5.6kb的HindIII DNA片段。将该质粒命名为pGBH6。使用LI-COR model 4000 DNA测序仪，以Sanger等的方法，测定克隆的DNA片段的碱基序列。agdB基因由包含3个57-72bp的短内含子的3,055bp构成，编码995个氨基酸残基。该基因的碱基序列(序列号27)登录于DDBJ/EMBL/GenBank。其登录号为AB057788。化学方法测定的74kDa和55kDa亚单位的N末端氨基酸序列和推测的氨基酸序列21到39位、515到531位氨基酸序列一致，此外，两亚单位的内部氨基酸序列也分别和167到187位、637到656位氨基酸序列一致。该结果显示，α-葡糖苷酶B作为一条多肽前体合成，经过加工而获得异二聚体结构。从N末端到20位的氨基酸序列具有信号肽的典型特征，暗示该酶是分泌酶。
实施例2经修饰的启动子的制备(2-1)启动子区域的亚克隆以包含米曲霉JCM02239株的Taka-淀粉酶A基因(taaG2)3164bp(Gene，84，319-327(1989))的pTG-taa[Mol.Gene.Genet.，254，199-126(1997)]为起始材料，制备Taka-淀粉酶A基因启动子区域和Taka-淀粉酶A基因的编码区域。
首先，从pTG-taa获得包含Taka-淀粉酶A(taaG2)启动子区域的750bp EcoRI-SaII片段，将该片段插入质粒pKF18K(东洋纺绩株式会社)的多克隆位点的EcoRI-SaII位点，获得包含Taka-淀粉酶启动子的质粒pKF-taaP。使用该质粒，进行向启动子区域的导入突变操作并构建经修饰的启动子区域。
(2-2)包含转录调控因子结合序列的DNA片段的获得如下获得包含已报道的广域转录活化因子(HAP)的结合因子CCAAT序列(Mol.Gen.Genet.，237，251-260(1993))和淀粉分解酶基因群的转录活化因子(AmyR)的结合因子SRE(Mol.Gen.Genet.，262，668-676(1999))的片段。
首先，在CCAAT序列的5’末端侧连接上XhoI位点、在3’末端侧连接上NotI位点，从而获得合成DNA即XNF(5’-CCGCTCGAGGCACCATCCAATTAGAAGCGCGGCCGCTAAACTAT-3’序列号13)，并合成该序列的互补链XNR(5’-ATAGTTTAGCGGCCGCGCTTCTAATTGGATGGTGCCTCGAGCGG-3’序列号14)，接着将这些合成DNA和其互补链相互混合，98℃加热10分钟后，经过2小时冷却至30℃，之后冷却至4℃，退火而获得仅包含CCAAT序列的DNA片段。
另一方面，在SRE的5’末端侧连接上SpeI位点、3’末端侧添加HincII位点，从而获得合成DNA即SREf(5’-GACTAGTTAACCTAGGGGCGGAAATTTAACGGGATGTTAACTAGTC-3’序列号15)，并合成该序列的互补链SREr(5’-GACTAGTTAACATCCCGTTAAATTTCCGCCCCTAGGTTAACTAGTC-3’序列号16)，以和上述同样的方法，获得仅包含SRE的DNA片段。此后，将此处制备的仅包含CCAAT序列的DNA片段和仅包含SRE的DNA片段分别称为“CCAAT片段”和“SRE片段”。
接着，使用下面的引物和以(2-1)中配制的pKF-taaP作为模板，以94℃ 30秒、54℃ 30秒、72℃ 1分30秒为一个循环，进行30个循环的PCR反应，从而获得包含从CCAAT序列到SRE的区域的DNA片段(序列号9，以下称为“CCAAT-SRE片段”)。此外，还制备下面两种片段，即包含PstI位点的片段(序列10，以下称为“CCAAT-SRE(PstI)片段”)和包含XhoI-NotI位点的片段(序列号1，以下称为“CCAAT-SRE(XhoI-NotI)片段”)。
带有PstI位点的上游引物、CSPf5’-AAACTGCAGACCACCTCTAGGCATCGGACG-3’(序列号17)带有PstI位点的下游引物、CSPr5’-TTTCTGCAGTGTTGATTTGTGGTTGAGTGG-3’(序列号18)带有XhoI位点的上游引物、CSXf5’-CGGCTCGAGGCATCGGACGCACCATCC-3’(序列号19)带有NotI位点的下游引物、CSNr5’-ATAGTTTAGCGGCCGCCGACTGTGATTTGTGGTTGAGTGG-3’(序列号20)(2-3)包含经修饰的启动子的质粒的构建如下进行Taka-淀粉酶A基因启动子区域的突变导入。首先，为将启动子区域修饰用的限制性酶位点导入(2-1)中制备的pKF-taaP，使用如下所示引物和Mutan-Super Express Km Kit(TAKARA公司)，进行针对pKF-taaP的位点特异性突变导入。此外，野生型启动子的序列(序列号12)示于图1，导入的限制性酶位点示于图2。
用于向下游区域(序列号12所示的Taka-淀粉酶启动子的存在位置465)导入NotI位点的引物、Not-b5’-CGCTTGGATTCCCCGCCCGCGGCCGCAGAGCTTAAAGTATGTCCC-3’(序列号21)用于向下游区域(序列号12所示的Taka-淀粉酶启动子的存在位置440)导入XhoI位点的引物、Xho-b5’-GAATGCAATTTAAACTCTTCCTCGAGTCGCTTGGATTCCCCGCCC-3’(序列号22)用于向上游区域(序列号12所示的Taka-淀粉酶启动子的存在位置153)导入NotI位点的引物、Not-a5’-GTAGTAAAACCCCGGAGTCAGCGGCCGCCAAGCCCAAGTCCTTCACG-3’(序列号23)用于向上游区域(序列号12所示Taka-淀粉酶启动子的存在位置128)导入XhoI位点的引物、Xho-a5’-CGTCAAGGGATGCAAGACTCGAGTAGTAAAACCCCGGAGTC-3’(序列号24)用于向CCAAT序列和SRE之间所夹的区域(序列号12所示Taka-淀粉酶启动子的存在位置252)导入NotI位点的引物、Not5’-GCACCATCCAATTAGAAGCGCGGCCGCGAAACAGCCCAAGAAAAAGG-3’(序列号25)用于向下游区域(序列号12所示Taka-淀粉酶启动子的存在位置490)导入Spe1位点的引物、STATA5’-TAAAGTATGTCACTAGTCGATGCGAT-3’(序列号26)接着，将(2-2)中制备的CCAAT片段以XhoI和NotI切断，进行琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化。将得到的DNA片段如上插入到启动子下游区域导入的XhoI-NotI位点，制备包含经修饰的启动子PCCAATb的质粒pKF-CCAATb。同样地，将(2-2)中制备的SRE片段以HincII切断，将得到的DNA片段插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，制备包含经修饰的启动子PSREb的质粒pKF-SREb；将(2-2)中制备的CCAAT-SRE(PstI)片段以PstI切断，将得到的DNA片段插入到启动子下游区域的PstI位点，制备包含经修饰的启动子PCSP的质粒pKF-PCSP；将(2-2)中制备的CCAAT-SRE(XhoI-NotI)片段以XhoI、NotI切断，将得到的DNA片段插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，制备包含经修饰的启动子PCSb的质粒pKF-PCSb。此外，通过将CCAAT-SRE(XhoI-NotI)片段以XhoI、NotI切断，并将回收并纯化了的片段插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，然后再将CCAAT-SRE(PstI)片段插入到PstI位点，从而制备在两处插入有CCAAT-SRE片段的含有经修饰的启动子PCSPb的质粒pKF-PCSPb。
实施例3淀粉酶基因表达载体的构建淀粉酶基因表达载体的制备过程示于图3。首先，将质粒pUC18用SalI消化(东洋纺绩株式会社)后，通过Klenow处理使其末端平滑，并通过进行自连而获得SalI位点缺失的质粒pUC18(S-)。另外，从质粒pTG-taa中，分离Taka-淀粉酶A基因的EcoRI片段，并将该片段插入到pUC18(S-)的多克隆位点EcoRI位点，从而获得pUC-taa(S-)。将该质粒pUC-taa(S-)以EcoRI部分裂解，获得taaG2基因的3’末端侧EcoRI位点缺失的质粒pUC-taa。同样地，获得缺失pBluescript II KS(+)的XhoI、SalI、BamHI的质粒pBlue(XSE-)。
接着，从pUC-taa分离包含taaG2的EcoRI-HindIII片段，将该片段插入到质粒pBlue(XSE-)的多克隆位点EcoRI-HindIII位点，获得包含taaG2的质粒pBlue-taa。
接着，从包含(2-3)中得到的经修饰的启动子的质粒pKF-taaPM系列(pKF-CCAATb、pKF-SREb、pKF-PCSP、pKF-PCSb、或pKF-PCSPb)分离经修饰的启动子区域的EcoRI-SalI片段，并插入到pBlue-taa的多克隆位点EcoRI-SalI处，经修饰的启动子区域和taaG2基因相连接而获得质粒pBlue-taaM。从pBlue-taaM分离含有经修饰的启动子的taaG2基因的XbaI-BamHI片段，重组于质粒pBAR7(在pBluescriptIIKS(+)中插入来源于米曲霉的C末端缺失的argB基因而得到的质粒)的多克隆位点XbaI-BamHI处，将其作为启动子活性测定用质粒pBAR-taaM系列(pBAR-CCAATb、pBAR-SREb、pBAR-PCSP、pBAR-PCSb以及pBAR-PCSPb)。此外，以同样的方式，制备含有野生型启动子的质粒，将其作为pBAR-taa。
实施例4以α-葡糖苷酶B基因缺失株为宿主的转化体的获得(4-1)α-葡糖苷酶B基因破坏株的构建将(1-2)中得到的质粒pGBH6所包含的agdB基因的一部分(4.9kb)的SacI片段(-3,132到+1,689)亚克隆到pBluescriptIIKS(+)，构建pGBS5。由pGBH6的ClaI-HindIII 4.9kb片段(+222到+4,726)和pGBS5制备ApaI-ClaI 3.1kb片段(-2,834到+221)连接到经ApaI、ClaI消化的pBluescriptII KS+，从而构建pGBA8。以包含粗糙脉孢菌(N.crassa)pyr4基因的BspI 2.0kb片段取代pGBA8的SalII片段(对应于agdB基因的-181到+3,435)，构建agdB基因破坏用质粒pGBΔP2。BspI 2.0kb片段是从包含pyr4基因的pTG1(Mol.Gen.Genet.(1997)254119-126，M.Kato，A.Aoyama，F.Naruse，T.Kobayashi，and N.Tsukagoshi)制备得到。接着，制备包含从pGBΔP2破坏的agdB基因的5.9kb KpnI-SpeI片段，转化构巢曲霉ABPU1，获得agdB株DBP9。通过Southern blot分析，确认在agdB位点已插入pyr4基因。此外，该菌株如下保藏。
保藏号FERM P-19070国际保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心、邮编305-8566茨城县筑波市东1丁目1番3号中央第6保藏日2002年(平成14年)10月18日(4-2)转化如下转化丝状真菌。首先，将实施例3中得到的各质粒pBAR-taa、pBAR-PCSb、pBAR-PCSPb分别用EcoRV消化后，用苯/氯仿提取，并用乙醇沉淀，将纯化后的质粒用于转化。按如下方式进行转化将(4-1)中得到的构巢曲霉的α-葡糖苷酶缺失株DBP9((pyrG89)biA1 wA3argB2 pyroA4 ΔagdB∷pyr4)和作为对照株的构巢曲霉ABPU1株(biA1 pyrG89 wA3 argB2 pyroA4)在添加了必要营养源(精氨酸、尿苷、吡哆醇和生物素)的复合培养基(2％麦芽提取物、2％葡萄糖、0.1％细菌用蛋白胨)中，37℃振荡培养一夜后，将得到的菌体混悬于细胞壁裂解液(20mg/ml Yatalase(宝酒造公司)，0.8M NaCl，10mM磷酸缓冲液(pH6.0))，30℃缓慢振荡1～2小时，从而原生质体化。将得到的原生质体以尼龙膜过滤，从而除去残存菌体。接着，使用该原生质体和上述纯化的各质粒，通过Turner等人的方法〔Gene，36，321-331(1985)〕，进行转化。分别对应于各自的质粒，各获得20到40株可在不含精氨酸的培养基(Czapek-Dox培养基(0.2％NaNO3、0.1％K2HPO4、0.05％KCl、0.05％MgSO47H2O、2％葡萄糖(pH5.5))生长的转化体。
(4-3)通过southern blot分析选择转化体如下从各转化体制备染色体DNA。首先，在添加了必要营养源(尿苷、吡哆醇和生物素)的复合培养基中，将转化体于37℃振荡培养一夜后，将得到的菌体用布氏漏斗和No.2滤纸(Advantech公司)收集，并用灭菌水洗净。除去剩余的水分后，于-80℃冷冻，用FREEZONE(LABCONCO公司)干燥。干燥后，添加1mm的玻璃珠，使用multibeadsShocker(安井器械公司)2000rpm破碎5分钟，成为微粉末状，在该菌体破碎物中加入提取溶液(1％十六烷基甲基溴化铵、0.7M NaCl、50mMTris-HCl、10mM EDTA、1％β-巯基乙醇搅拌后，于室温放置30分钟。得到的溶菌液用苯/氯仿抽提，除去混杂的蛋白质后，添加等量的异丙醇，使DNA沉淀。将该沉淀物溶解于含有0.1mg/ml的RNase的TE溶液，37℃反应30分钟后，再添加含有0.2mg/ml的蛋白酶K的TE溶液，37℃反应30分钟。将该溶液用苯/氯仿抽提后，用2.5倍体积的冷乙醇沉淀。将该沉淀物用70％乙醇洗涤，干燥后溶解于TE溶液，作为染色体DNA溶液。
就Southern blot分析而言，将染色体DNA以PvuII或EcoRV消化，通过琼脂糖电泳分离，印迹到尼龙膜(Roche公司)后，以taaG2的约1000bp的BglII-SmaI消化物作为探针进行检测。此时，使用DIG核酸检测试剂盒(Roche公司)进行探针的标记和信号检测。
根据Southern bot分析的结果，针对使用的质粒，任意选择2株或2株以上，下述适于比较宿主菌株的淀粉酶生产能力的转化体，所述的转化体是，将一个拷贝的质粒以相同方式整合于argB位点的菌株，能够比较淀粉酶生产能力而不受整合到染色体上的位置的影响和导入的基因的拷贝数的影响。
实施例5淀粉酶活性的比较使用分别重组了实施例4中得到的pBAR-taa、pBAR-PCSb和pBAR-PCSPb的各转化体，以下面的顺序，比较以α-葡糖苷酶B缺失株为宿主的情况和以ABPU1株为宿主的情况下的淀粉酶生产率。
首先，将各转化体呈放射状接种于琼脂培养基，该培养基是在MEM(0.9％NaNO3、0.05％KCl、0.15％KH2PO4、0.15％微量元素、0.05％MgSO47H2O、1％葡萄糖(pH6.5))中添加了必要营养源(尿苷、吡哆醇和生物素)的培养基，37℃培养3天后，由该琼脂培养基将分生孢子混悬于孢子混悬用溶液(0.01％吐温80、0.8％NaCl)，用棉花过滤，配制孢子混悬液。用该孢子混悬液将分生孢子1×108个接种于添加了精氨酸之外的必要营养源(尿苷、吡哆醇和生物素)的SP培养基(1％淀粉、1％多聚蛋白胨、0.5％KH2PO4、0.1％NaNO3、0.05％MgSO47H2O(pH6.5))或MP培养基(0.1％麦芽糖、1％多聚蛋白胨、0.5％KH2PO4、0.1％NaNO30.05％MgSO47H2O(pH6.5))100ml中，37℃振荡培养36小时后，用布氏漏斗和滤纸，分离菌体和上清，将上清作为酶溶液。
淀粉酶活性测定如下在20mM碳酸钠缓冲液、10mM CaCl2、2％可溶性淀粉(Nacalai tesque公司)中加入酶溶液，配制为150μl反应体系，在37℃反应20分钟，以Nelson-Somogyi法定量还原糖量。此外，将一分钟内游离1μmol葡萄糖的酶量作为1个单位。接着，由测定的淀粉酶活性值求出淀粉酶的生产量，并将以α-葡糖苷酶B缺失株为宿主的情况和以ABPU1株为宿主的情况下的淀粉酶生产力进行比较。
淀粉酶活性的测定结果示于图4。以ΔagdB株为宿主的taaG2基因的转化体在以淀粉为碳源的培养基上培养后，淀粉酶生产量是以ABPU1株为宿主时的约6倍。可以认为，这是由于，通过α-葡糖苷酶B的缺失，抑制了作为诱导物质的异麦芽糖的分解，诱导效果得以持续。由该结果能够确认，α-葡糖苷酶B的缺失对于增强淀粉酶生产能力非常有效。
接着，测定在以麦芽糖为碳源的MP培养基中培养后的淀粉酶的活性。使用以ΔagdB株为宿主的taaG2基因的转化体的情况下的淀粉酶生产量是以ABPU1株为宿主时的约7倍，ΔagdB株为宿主并带有经修饰的启动子(PCSb或PCSPb)的菌株的淀粉酶生产量是以ABPU1株为宿主时的约2倍。由该结果可知，当在培养基中以易合成异麦芽糖的麦芽糖等作为碳源时，通过使用agdB基因缺失的宿主，能够进一步增强淀粉酶的生产能力。还弄清了，通过使用经修饰的启动子，可得到更高的生产力。此外，如图4所示，本实施例的体系中，淀粉酶的生产最高为1g/L。
本申请作为根据文部省的科学技术振兴调整费的委托业务而实施的平成14年度“利用霉的酶高生产能力的环保型工业工艺技术的基础研究”的成果。
产业上利用的可能性本发明提供在导入外源基因时，可以有效提高该基因的表达的宿主微生物。如果使用将编码目的蛋白质的基因导入该宿主微生物所得到的转化体，能够以高生产率生产目的蛋白质。
序列表<110>AMANO ENZYME INC.
SUZUKI，KanakoTSUKAGOSHI，Norihiro<120>异麦芽糖合酶的基因缺失成真菌类微生物<130>P0205201<150>JP P2002-307922<151>2002-10-23<160>27<170>PatentIn version3.1<210>1<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(11)<223>人代表任意碱基<400>1ccaatnnnnn n 11<210>2<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>人代表任意碱基<400>2cggnnnnnnn nngg 14<210>3<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列<400>3ccaattagaa g 11<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>人代表任意碱基<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>人代表任意碱基<400>4cgghnwwwwn whgg 14
<210>
<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列<400>5cggwwwwwww whgg 14<210>6<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列<400>6cggaaattta aagg 14<210>7<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列<400>7cggaatttaa acgg 14<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述增强子序列
<400>8cggaaattta acgg 14<210>9<211>128<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述包含CCAAT序列和SRE的DNA片段<400>9ccaattagaa gcagcaaagc gaaacagccc aagaaaaagg tcggcccgtc ggccttttct 60gcaacgctga tcacgggcag cgatccaacc aacaccctcc agagtgacta ggggcggaaa120tttaaagg 128<210>10<211>196<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述包含CCAAT序列和SRE的DNA片段<400>10ctgcagacca cctctaggca tcggacgcac catccaatta gaagcagcaa agcgaaacag 60cccaagaaaa aggtcggccc gtcggccttt tctgcaacgc tgatcacggg cagcgatcca120accaacaccc tccagagtga ctaggggcgg aaatttaaag ggattaattt ccactcaacc180acaaatcaca ctgcag196<210>11<211>193<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述包含CCAAT序列和SRE的DNA片段<400>11ctcgagaggc atcggacgca ccatccaatt agaagcagca aagcgaaaca gcccaagaaa 60aaggtcggcc cgtcggcctt ttctgcaacg ctgatcacgg gcagcgatcc aaccaacacc120ctccagagtg actaggggcg gaaatttaaa gggattaatt tccactcaac cacaaatcac180agtcggcggc cgc 193<210>12<211>615<212>DNA<213>米曲霉<220>
<221>启动子<222>(1)..(615)<223>
<400>12gaattcatgg tgttttgatc attttaaatt tttatatggc gggtggtggg caactcgctt60ccgggcaact cgcttaccga ttacgttagg gctgatattt acgtaaaaat cgtcaaggga 120tgcaagacca aagtagtaaa accccggagt caacagcatc caagcccaag tccttcacgg 180agaaacccca gcgtccacat cacgagcgaa ggaccacctc taggcatcgg acgcaccatc 240caattagaag cagcaaagcg aaacagccca agaaaaaggt cggcccgtcg gccttttctg 300caacgctgat cacgggcagc gatccaacca acaccctcca gagtgactag gggcggaaat 360ttaaagggat taatttccac tcaaccacaa atcacagtcg tccccggtat tgtcctgcag 420aatgcaattt aaactcttct gcgaatcgct tggattcccc gcccctggcc gtagagctta 480aagtatgtcc cttgtcgatg cgatgtatca caacatataa atactagcaa gggatgccat 540
gcttggagga tagcaaccga caacatcaca tcaagctctc ccttctctga acaataaacc600ccacagaagg cattt 615<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于扩增CCAAT序列的PCR引物<400>13ccgctcgagg caccatccaa ttagaagcgc ggccgctaaa ctat 44<210>14<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>16<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述用于扩增包含CCAAT序列和SRE的DNA片段的PCR引物<400>17aaactgcaga ccacctctag gcatcggacg 30<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于扩增包含CCAAT序列和SRE的DNA片段的PCR引物<400>18tttctgcagt gttgatttgt ggttgagtgg 30<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
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<223>人工序列描述用于扩增包含CCAAT序列和SRE的DNA片段的PCR引物<400>20atagtttagc ggccgccgac tgtgatttgt ggttgagtgg 40<210>21<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于定点诱变的引物<400>21cgcttggatt ccccgcccgc ggccgcagag cttaaagtat gtccc45<210>22<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于定点诱变的引物
<400>22gaatgcaatt taaactcttc ctcgagtcgc ttggattccc cgccc45<210>23<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于定点诱变的引物<400>23gtagtaaaac cccggagtca gcggccgcca agcccaagtc cttcacg 47<210>24<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于定点诱变的引物<400>24cgtcaaggga tgcaagactc gagtagtaaa accccggagt c41<210>25<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于定点诱变的引物<400>25gcaccatcca attagaagcg cggccgcgaa acagcccaag aaaaagg 47<210>26
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于定点诱变的引物<400>26taaagtatgt cactagtcga tgcgat 26<210>27<211>5640<212>DNA<213>构巢曲霉<400>27aagcttgttg aagccgtcaa tccgcagcct atctggttga gttcgccggt caaccgtact60gaaagtagca ttgaggggca gaacttattc gtttcgagac agcaatgaat tctcaagtga 120cacctatatc tgcccagctg ttgtctcttc attcttcttt ggaccaagtt tttactggag 180tacaatgacc ctgtaatcct accgggtggg cctgatctgg ccgtcggaga acgtagggtt 240tccctactgc cctactgccc tttactaggc cattatcctg tccaccacct ttcgcttccg 300gcttttcttt ctttcatact ttgctttcct ccttgaaatt gtttacttct accattgtct 360atcagtttct tgttaagcca cctctggtct cccgggtggg tatgggccga tcccaatttc 420gcagtcttgg cacttttact cgaagatgag ggaaggtcaa tcaggctcag cctcattgag 480cgataggccg ccaattctca acctagcgag tacgagctta agcagtttgg cggagcccct 540gttctagaag ctgtccagct cggtgtcctg tatcatgaag cgcattcgat cgcttggctg 600gcgtcagggt tcgtccaacg gcactgaatc cacgatcact actgggtaaa caccccgcaa 660gcgcctgggc agcgaccaag gtacggaagg tccgggcttt caaaaattac cgcgggacta 720ctccggagtc gaccgttaag cagggtcgat gattgggtag tgctggcgaa gcgttgcatt 780
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权利要求
1.一种真菌类微生物，其特征在于，其主要的异麦芽糖合酶的基因缺失。
2.根据权利要求1所述的微生物，其被分类为丝状真菌。
3.一种构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，其特征在于，其α-葡糖苷酶B基因缺失。
4.一种转化体，其特征在于，其是通过将受异麦芽糖诱导而表达的外源基因导入主要的异麦芽糖合酶的基因缺失的真菌类微生物而制得。
5.根据权利要求4所述的转化体，其中，所述微生物被分类为丝状真菌。
6.一种转化体，其特征在于，其是通过将受异麦芽糖诱导而表达的外源基因导入α-葡糖苷酶B的基因缺失的构巢曲霉而制得。
7.根据权利要求4所述的转化体，其中，所述外源基因含有下面的经修饰的启动子向可在丝状真菌中行使功能的启动子中，插入包含CCAATNNNNNN(第1碱基序列序列号1)的第1 DNA片段和包含CGGNNNNNNNNNGG(第2碱基序列序列号2)的第2 DNA片段而得到的经修饰的启动子。
8.蛋白质的生产方法，其包含在所述外源基因能够表达的条件下，培养权利要求4所述的转化体的步骤，以及回收产生的蛋白质的步骤。
全文摘要
提供在导入编码目的蛋白质的基因后能够有效增强该基因表达的宿主微生物。此外，提供能够高效率合成目的蛋白质的转化体。进一步，提供能够以高生产力生产目的蛋白质的方法。主要的异麦芽糖合酶的基因缺失的真菌类微生物。通过在相应微生物中导入编码目的蛋白质的基因而获得转化体。在被导入的基因能够表达的条件下，培养相应转化体，从而合成蛋白质。
文档编号C12N15/09GK1705742SQ200380101898
公开日2005年12月7日 申请日期2003年10月20日 优先权日2002年10月23日
发明者铃木哉子, 塚越规弘 申请人:天野酶株式会社