专利名称：Gpr54敲除哺乳动物以及利用它们的筛选方法
技术领域：
本发明涉及已知受体的新功能。具体地，本发明涉及甘丙素(galanin)-样受体或其配体在操纵垂体激素轴和生殖系统中的用途。
编码GPR54的Harry potter位于人染色体19p13.3。
GPR54的cDNA为1197bp。研究显示GPR54与大鼠甘丙素受体GalR1，GalR2具有45％同一性，而与GalR3具有44％同一性。
甘丙素是神经肽，其不属于任何已知的神经肽家族。它在中枢和周围神经系统中表达并调节多种生理过程，包括学习和记忆，疼痛，进食，神经递质和激素的释放以及性行为，并被认为参与阿尔茨海默氏症(Alzheimers)的发病(Lee等1999 FEBS lett 446103-107)。然而，据报道甘丙素或甘丙素-样肽都不活化GPR54(Lee等1999 FEBS lett 446103-107；Ohtaki等2001Nature 411613-617)。
报道提示FMRF酰胺相关的肽(FaRP)是GPR54的低效激动剂(微摩尔范围)(Clements等2001 Biochem Biophys Res Commun 2841189-83)。FaRP是在无脊椎动物中广泛分布的神经肽，其功能为神经递质和神经调节物。
其它研究表明，GPR54的天然配体为kisspeptin(也称metastin)，其为Kiss-1基因的产物。具有常见RF-酰胺C末端的三种肽来自Kiss-1。有54，14和13氨基酸的kisspeptin。它们都以低纳摩尔亲和力与GPR54结合。Kisspeptin 54也称metastin。这些GPR54配体以低纳摩尔亲和力与GPR54结合(Muir等2001 J Biol Chem 27628969-75；Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-36)。
一些报道提示配体结合的GPR54具有多种功能。例如，已报道Kiss-1是黑素瘤和乳腺癌细胞的转移阻抑基因。然而，研究提示Kiss-1基因不影响致肿瘤性(tumorigenicity)。推定metastin通过诱导过量细胞粘附性表型降低细胞移动性。在足垫中注入了黑素瘤的小鼠中，通过输注给药metastin可显著减少转移(Ohtaki等2001 Nature 411613-617)。类似地，metastin抑制GPR54受体转染的B16-L16黑素瘤细胞的移动性，但不影响假-转染(mock-transfected)的细胞。
其它研究还显示GPR54(也称metastin受体)活化可刺激PIP2水解，钙动员(mobilization)，花生四烯酸释放，ERK1/2和p38 MAP激酶磷酸化，以及stress fibre形成，但抑制细胞增殖(Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-3)。有趣的是，向雌性大鼠静脉内注入kisspeptin-10刺激催产素分泌(Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-3)。催产素参与性行为/睾丸功能；催产素拮抗剂抑制雄性交配行为(Argiolas等1988 Eur J Pharmacol 149389-92)。然而，催产素KO小鼠显示正常性行为并是可生育的(Nishimori等1996 Proc Natl Acad Sci USA 9311699-704)。
在大鼠的以下组织中通过northern蛋白印迹检测GPR54脑(桥脑(pons，中脑(midbrain)，丘脑(thalamus)，下丘脑(hypothalamus)，海马(hippocampus)，杏仁核(amygdale)，皮质(cortex)，额叶(frontal)皮质和纹状体(striatum))，以及外周器官(肝和肠)(Lee等1999 FEBS lett 446103-107)。
大鼠脑中的原位分析显示下丘脑和杏仁核区的表达最高。这些受体在以下区域高表达未定带(zona incerta)，腹侧背盖区(ventral tegmental area)，齿状回(dentate gyrus)，弓状核(arcuate nucleus)，背侧中间核(dorsomedialnucleus)，嗅(olfactory)皮质，缰外侧核(lateral habenular nucleus)，外侧下丘脑(lateral hypothalamus)，蓝斑(locus coeruleus)，杏仁核的皮质和中间核(cortical and medial nuclei of amygdala)，上丘(superior colliculus)，视前核(preoptic)，下丘脑前部和后部(anterior and posterior hypothalamus)，导水管周灰质(periaqueducal gray)，丘脑束旁核(parafascicular thalamic nucleus)，臂旁核(parabrachial nucleus)以及腹侧乳头体(ventral mamillary body)。GPR54表达与甘丙素受体相似(Lee等1999 FEBS lett 446103-107)。
在人组织中，northern分析显示在脑/神经系统(皮质，壳核(putamen)，延髓(medulla)，脊髓，在海马和丘脑中的表达较低)以及垂体，心，骨骼肌，肾，肝，胃，小肠，胸腺，肺，睾丸和胎盘中的表达(Clements等2001 BiochemBiophys Res Commun 2841189-93；Kotani等2001 J Biol Chem 27634631-36)。
GPR54也通过免疫细胞化学(ICC)在人脑的以下区中检测到大脑皮质(锥体细胞(pyramidal cell)及其在感觉运动皮质的第III层(laminar layer III)中的上行突(ascending process))，丘脑，脑桥-延髓(pons-medulla)(中缝核(raphe)，下橄榄核(inferior olive)，舌下神经核(hypoglossal nuclei))，小脑(蒲肯野细胞(purkinje cell)核周体(perikarya)及其上行顶树突(ascending apicaldendrite)。
然而，本领域没有关于GPR54在哺乳动物的总体作用以及其具体在脑内的作用的认识。
报告表明，FaRP(GPR54的低效激动剂，其在微摩尔范围起作用)的脊椎动物受体在氨基酸水平上与神经肽Y(NPY)受体非常相似(Clements等2001 Biochem Biophys Res Commun 2841189-93)。其它研究显示，FaRP与促性腺激素释放激素(GnRH)共定位(colocalise)，与穗状花序(locusta)中的受精囊(spermatheca)以及食血昆虫(blood feeding bug)的唾液腺共定位。
果蝇(Drosophila)FMRF酰胺基因通过其与首先在海蜗牛黑斑海兔(marine snail Aplysia)中测序的基因的同源性鉴定。FMRF酰胺基因最初作为来自蛤(clam)的中枢神经系统的心血管系统调节性四肽而纯化。在软体动物(molluscs)中，其调节心脏输出以及神经元的作用，并调节诱导的(evoked)肌肉张力。在牛(cattle)中，对相关龙虾激素具有免疫反应性的两种肽已经鉴定出；所述牛蛋白具有抗止痛活性。
尽管FMRF-酰胺肽的作用主要在无脊椎动物中研究，有3篇文献描述了FmRF酰胺在哺乳动物脑内的免疫反应性一种在兔、大鼠和豚鼠中(Duann等1995 Gaoxiong Yi Xue Ke Xue Za Zhi.11142-9)，一种在树鼯(treeshrew)中(Malz and Kuhn 2002 Dev Brain Res 13539-44)，还有一种在大褐蝙蝠(big brown bat)中(Oelschlager等1998 Brain Behav Evol 52139-47)。有趣的是，所有这些文献都描述了FmRF酰胺-样及GnRH免疫反应性的共表达。在蝙蝠和树鼯中，这种表达见于终末神经(terminal nerve)。所述终末神经是前颅神经(anterior cranial nerve)，其支配鼻腔的化学感受性上皮。该神经的功能未知，但据提示其具有神经调节作用。破坏该神经导致雄性仓鼠(hamster)的交配行为受损(Wirsig，and Leonard 1987 Brain Res 417293-303)。
根据Raffa(Raffa and Stone 1988 Peptides 191171-75)，FMRF酰胺或FMRF酰胺-相关肽(FaRP)存在于哺乳动物中枢神经系统和胃肠道，并对哺乳动物具有心脏激动作用(cardioexcitatory)，抑制吗啡-诱导的抗疼痛作用，以及阻断吗啡-、击败(defeat)-和剥夺(deprivation)诱导的进食(feeding)。它还抑制结肠推进性运动(colonic propulsive motility)，在鞘内注射时诱导对行为的影响，并据报道对啮齿类动物具有致失忆(amnesic)作用。具体地，FMRF酰胺在小鼠体内产生中枢介导的抗疼痛作用(Raffa and Stone 1998 Peptides191171-75，Gupta等1999 Peptides 20471-78)。
以前的研究表明，甘丙素敲除小鼠(至今没有关于受体敲除(receptorknock-out)的描述)是可得的，其可正常生长并繁殖但不能泌乳。它们的感觉神经元对损伤的反应被破坏，周围神经再生降低，并且神经性疼痛的出现明显减少。DRG神经元的亚群在突变小鼠中缺失，表明甘丙素在细胞存活中有作用(Wynick等1998 Ann NYAcad Sci，86322-47)。
研究表明GPR54与多步骤转移也有关，包括癌细胞从原发癌的脱离，侵入周围组织，通过循环扩散，再入侵远处器官并在其中增殖。然而，在本申请提交时，没有发现GPR54的其它作用。
因此，仍需要鉴定配体结合的GPR54在脑和其它组织内的功能，从而将其用于治疗或其它用途。
发明概述本发明人制成GPR54(Harry Potter)敲除(knockout)小鼠来研究GPR54的体内作用。本发明人还显示所述敲除小鼠与非突变体的生殖形态以及生理有差异，提示GPR54具有在控制性激素轴以及生殖区诸如控制生育力和性欲中的作用。此外，这种突变体的生理和形态提示GPR54在一些神经疾病和其它疾病例如肌肉消耗性疾病(muscle wasting)和炎症中的作用。
Harry Potter敲除小鼠可用作疾病模型以及鉴定用于治疗的GPR54拮抗剂和激动剂。
因此，本发明的第一方面提供了GPR54敲除哺乳动物，其包含一或多种细胞，所述细胞中GPR54多肽是功能失活的。
本发明人还发现本发明前述方面的GPR54敲除小鼠显示许多限定性性质，包括接触性翻正反射减少和Barnes maze表现降低，生殖激素水平和/或模式(包括周期)改变，生殖器官和相关器官的形态改变，性/生殖行为改变。
如上所述，生殖器官形态改变包括以下所述一或多种生殖器(genital)和相关器官萎缩，胃和上颌下唾液腺(sub maxillary salivary glands)萎缩，肌肉和褐色脂肪萎缩。
敲除哺乳动物的产生是本领域技术人员熟悉的并可利用本文所述涉及同源重组的标准实验室技术。
优选，所述转基因动物是选自下组的哺乳动物之一小鼠，大鼠，地鼠(shrew)，沙鼠(gerbil)，豚鼠，猴，仓鼠，猫或狗。本领域熟练技术人员理解所列举动物并非穷尽性的。最优选，所述哺乳动物是小鼠。
本文术语“功能失活的”(GPR54，通过同源重组)意思是与其中的GPR54不是功能失活的对照相比，通常由GPR54多肽在其天然环境(即在体内环境中)下发挥的一或多种功能被明显抑制。优选，术语“功能失活的”指与其中的GPR54不是功能失活的对照相比，GPR54在其天然环境(体内环境中)通常显示的一种以上的功能被明显抑制。更优选，本文术语“功能失活的”指与其中的GPR54不是功能失活的对照相比，GPR54在其天然环境(体内环境中)通常显示的所有功能被明显抑制。
同样，本文的“功能失活的(functionally inactivated)”GPR54核酸编码本文的功能失活的GPR54。
如上所述，术语“明显抑制的”(GPR54功能)指所述抑制(如上述通过同源重组对哺乳动物细胞中的至少一种GPR54功能而言)与适宜的对照相比被抑制至少20％。适宜对照的实例是相同或相似体内环境中的相同或相似细胞，其中GPR54没有如本文所述由于同源重组而功能失活。优选，术语“明显抑制的”(如上述通过同源重组对哺乳动物细胞中的GPR54功能而言)指至少一种GPR54功能与适宜的对照相比被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。最优选，术语“明显抑制的”(如上述通过同源重组对哺乳动物细胞中的GPR54功能而言)指至少一种GPR54功能与适宜的对照相比被抑制100％。
另一方面，本发明提供了产生一或多种哺乳动物细胞的方法，所述细胞包括一或多种功能失活的GPR54基因，所述方法包括选择一或多种包含一或多种功能活性内源GPR54基因的细胞。
利用功能失活的GPR54核酸转染步骤(a)的一或多种细胞，所述功能失活的GPR54核酸可通过同源重组与一或多种内源GPR54基因组合。
选择一或多种细胞，其中的一或多种内源GPR54基因已经和功能失活的GPR54核酸进行了同源重组。
优选，本发明的哺乳动物细胞根据本发明上述方法产生。在本发明该方面优选的实施方案中，所述哺乳动物细胞包含在哺乳动物内。即根据本发明上述方面的细胞将优选构成“敲除”哺乳动物。优选，本文的敲除哺乳动物是小鼠。
用功能失活的GPR54转染一或多种细胞的方法涉及利用标准分子生物技术以及本文所述技术。同样，选择一或多种细胞的方法利用标准实验室技术(在本文描述)进行，所述细胞中的一或多个内源GPR54基因与功能失活的GPR54核酸已经进行了同源重组。
另一方面，本发明提供核酸构建体，其适于宿主细胞中功能失活的一或多种内源GPR54基因，所述构建体包括(a)A非-同源置换区(replacement region)，(b)位于所述非-同源置换区上游的第一同源区，(c)突变的GPR54基因，其表达时不编码功能活性GPR54，(d)位于所述非-同源置部分下游的第二同源区，所述第二同源区位于该非-同源置换区的下游，并具有与第二GPR54基因至少90％相同的核苷酸序列。
本发明人鉴定了与GPR54相关的数种功能，由此他们认为GPR54多肽，或其一或多种结合蛋白或编码它们的核酸有治疗意义。
因此，另一方面，本发明提供包含GPR54多肽的组合物、或其一或多种结合蛋白、或编码它们的核酸，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本发明上述方面，优选所述组合物包含一或多种GPR54多肽结合蛋白。优选所述一或多种GPR54结合蛋白是GPR54的拮抗剂或激动剂。
GPR54结合蛋白可以是天然存在的或合成的。天然存在的结合蛋白可为多肽诸如本文所述的抗体或核酸。合成GPR54结合蛋白优选可为较小的分子并可通过筛选方法选择，所述筛选方法是本领域技术人员所熟悉的并在本文描述。
在本发明另一可选实施方案中，优选所述组合物包含编码GPR54结合蛋白的核酸或编码GPR54多肽的核酸。
本发明人吃惊地发现GPR54敲除小鼠与正常对照小鼠相比具有改变的神经元功能以及改变的生殖系统。此外，GPR54敲除小鼠具有其它形态学和解剖学异常。GPR54敲除小鼠垂体下丘脑轴的促性腺激素产生有缺陷。GPR54受体因此据信通过控制垂体-下丘脑的促性腺激素分泌参与控制该轴。本发明人还显示在GPR54敲除小鼠中(a)促性腺激素较低；(b)至少卵巢对给予外源性促性腺激素有反应，表明它们保持应答能力；和(c)外源性给予GnRH诱发至少部分FSH和LH分泌的反应，表明GPR54可能参与下丘脑-垂体中GnRH分泌的上游控制。
因此，本发明人认为GPR54的激动剂和/或拮抗剂或包含它们的组合物具体可用于治疗生殖激素(reproductive hormone)相关的、神经性和其它一些疾病。所述神经性疾病包括但不限于以下疾病中的一或多种阿尔茨海默氏症，感觉神经元病(sensory neuropathy)和癫痫(epilepsy)。
这种生殖激素相关的疾病包括一或多种选自下组的疾病生育力(fertility)、节育(contracteption)、性欲和青春期开始(libido and the onset ofpuberty)的调节，泌乳(lactation)，骨质疏松(osteoporosis)/骨硬化病(osteopetrosisi)或停经(menopause)。此外，GPR54激动剂或拮抗剂可用于激素替代治疗(HRT)。
其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛(pain)，激素依赖性癌症(hormonedependent cancer)和肥胖(obesity)。
因此，本发明另一方面提供了鉴定一或多激动GPR54多肽的功能活性的一或多种分子的方法，包括以下步骤选择一或多种哺乳动物，其包含功能失活的GPR54多肽；(b)用一或多种可能的GPR54类似物(mimic)治疗所述一或多种哺乳动物，所述类似物可能激动至少一方面的GPR54活性；(c)检测根据步骤(b)治疗的一或多种哺乳动物，以确定这些经过治疗的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种恢复的性质知(d)选出一或多种GPR54-配体类似物，所述类似物使得根据步骤(a)选出的哺乳动物恢复野生型哺乳动物的一或多种性质。
本发明还提供鉴定拮抗GPR54多肽的有功能活性的一或多种分子的方法，包括以下步骤(a)选择一或多种哺乳动物，其包含功能活性GPR54多肽；
(b)用一或多种可能的GPR54拮抗剂治疗所述一或多种哺乳动物，所述拮抗剂可能拮抗至少一方面的GPR54活性；(c)检测根据步骤(b)治疗的一或多种哺乳动物，以确定这些经过治疗的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种经过调节的性质。
此外，本发明提供转基因GPR54敲除哺乳动物在用于测定一或多种化合物的生物效应的实验中的用途。
根据本发明上述方面，术语“拮抗剂“指与适当的对照相比，显著抑制(如本发明定义)GPR54的一或多种功能的分子。
本发明利用GPR54本身，其激动剂和拮抗剂，以及GPR54活性的调节物。本领域技术人员应理解多种试剂可增加或降低GPR54的效应，且实现上述效应改变的途径有多种；因此所述激动剂可模拟活化的GPR54，或与GPR54结合并增加其活性；GPR54活性的激动型调节物也如此，或增加GPR54的内源激动剂或内源GPR54本身的产生。拮抗剂和拮抗型调节物的作用可相同(likewise)，但都降低GPR54的生物效应。
本文术语“哺乳动物“指任何哺乳动物。优选所述哺乳动物是非人哺乳动物。优选所述哺乳动物选自小鼠，大鼠，豚鼠，兔，仓鼠，沙鼠，猫，狗和猴。本领域技术人员应理解所列动物并非穷尽性的。
根据本发明这方面，术语“治疗”(用可能的GPR54拮抗剂治疗哺乳动物)指使得所述哺乳动物的一或多种细胞与一或多种可能的GPR54拮抗剂接触。
根据本发明上述方面，异常神经性质的指征包括接触性翻正反射减少和Barnes maze表现降低。
根据本发明上述方面，术语“异常生殖系统和/或形态”包括′生殖激素水平和/或模式(包括周期)与适宜对照相比的任何改变，生殖器官和相关器官形态与适宜对照相比的任何改变，以及性/生殖行为与适宜对照相比的改变。
优选，根据本发明上述方面，生殖器官形态与适宜对照相比的改变包括选自下组的一或多种改变生殖器及相关器官萎缩，胃及上颌下唾液腺萎缩，肌肉及褐色脂肪萎缩。
异常神经功能，异常生殖系统和异常生殖形态的检测利用标准实验室技术并是本领域技术人员熟悉的。
优选，本发明上述方面的步骤(c)涉及检测一或多种哺乳动物，以确定所述哺乳动物是否显示一或多种由GPR54敲除小鼠显示的性质，所述性质是异常生殖系统和/或形态。
根据本发明上述方面，根据步骤(a)选出的一或多种哺乳动物优选为GPR54敲除小鼠。优选，它们根据本文所述方法产生。
本文术语“功能失活的”(GPR54)意思是与其中的GPR54没有被功能失活的对照相比，通常由GPR54多肽在其天然环境(即在体内环境中)显示的一或多种功能被明显抑制。优选，术语“功能失活的”指与其中的GPR54没有被功能失活的对照相比，GPR54在其天然环境(体内环境中)通常显示的一种以上的功能被明显抑制。更优选，本文术语“功能失活的”指与其中的GPR54没有被功能失活的对照相比，GPR54在其天然环境(体内环境中)通常显示的所有功能被明显抑制。
同样，本文“功能失活的”GPR54核酸编码本文功能失活的GPR54。
如上所述，术语“明显抑制的”(GPR54功能)指所述抑制(如上述通过同源重组对哺乳动物细胞中的至少一种GPR54功能而言)与适宜的对照相比被抑制至少20％。适宜对照的实例是相同或相似体内环境中的相同或相似细胞，其中GPR54没有如本文所述由于同源重组而被功能失活。优选，术语“明显抑制的”(如上述通过同源重组对哺乳动物细胞中的GPR54功能而言)指至少一种GPR54功能与适宜的对照相比被抑制至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。最优选，术语“明显抑制的”(如上述通过同源重组对哺乳动物细胞中的GPR54功能而言)指至少一种GPR54功能与适宜的对照相比被抑制100％。
根据本发明这方面，术语“治疗”(用可能的GPR54拮抗剂治疗哺乳动物)指使得所述哺乳动物的一或多种细胞与一或多种可能的GPR54拮抗剂接触。
根据本发明上述方面，术语“野生型哺乳动物的一或多种经过调节的活性”指调节野生型哺乳动物与包含本文所述功能失活的GPR54多肽的哺乳动物相比的一或多种活性。优选所述调节是恢复丢失的功能。
本文的GPR54类似物复制野生型GPR54的至少一种活性或功能。所述类似物可模拟活化的GPR54，或模拟失活的GPR54，使得其进一步抑制功能，所述功能本身在缺乏天然失活的GPR54时被抑制。
本发明人认为GPR54核酸或编码GPR54的一或多种激动剂或拮抗剂的核酸可插入哺乳动物以产生一或多种治疗效果。
另一方面，本发明提供转基因动物，其中至少部分细胞包含编码一或多种选自下组物质的外源性核酸GPR54多肽，GPR54多肽的一或多种激动剂以及GPR54多肽的一或多种拮抗剂。
优选，所述转基因动物选自小鼠，人，猪，山羊，鹿，猴和母牛。本领域技术人员理解所列动物并非穷尽性的。
根据本发明上述方面，术语“外源性核酸”指不源自所述具体动物的核酸。然而，其可来自相同动物种类或品系。例如，转基因小鼠可包含细菌来源的GPR激动剂核酸。
优选，转基因动物的部分细胞包含外源性DNA，所述外源性DNA编码GPR54的一或多种激动剂或一或多种拮抗剂。
本文的非人转基因动物可为选自下组的一或多种动物小鼠，大鼠，猴，狗，猫和猪。本领域技术人员应理解所列动物并非穷尽性的。
利用根据本发明制备的GPR54敲除小鼠进行研究表明，GPR54多肽与神经元功能和生殖功能(包括生殖周期)以及其它疾病有关。这种神经疾病包括，但不限于以下疾病的一或多种阿尔茨海默氏症，感觉神经元病或癫痫。所述生殖激素相关疾病包含下组疾病的一或多种生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病或停经。此外，GPR54激动剂或拮抗剂可用于激素替代治疗(HRT)。其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症和肥胖。
因此，本发明另一方面提供诊断选自下组的疾病的方法阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症或肥胖，所述方法包括以下步骤从待诊断的患者中选出细胞样品，比较所述细胞样品与来自健康个体的一或多个对照样品的GPR54多肽表达水平和/或功能活性。
另一实施方案中，Harry Potter或其天然配体的多态性可用于诊断疾病。因此，本发明提供了诊断选自以下疾病的方法阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症或肥胖，包括以下步骤从待诊断的患者中选出细胞样品，分析所述细胞中的内源核酸，以检测内源性GPR54基因一或多种天然GPR54配体的一或多种多态性。
根据本发明上述方面，其中GPR54的表达水平和/或功能活性增加、降低或改变，或其中GPR54核酸或编码GPR54配体的核酸包含一或多种多态性的样品，与来自健康个体的一或多种对照样品相比可表明前一种样品所来源的个体具有上述一或多种疾病。
根据本发明上述方面，利用标准实验室技术选择来自患者的样品细胞，所述技术是本领域技术人员熟悉的。
上文术语GPR54多肽的“功能活性”指GPR54在其天然环境即在其细胞内中通常执行的功能。
因此，另一方面，本发明提供治疗患者中选自下组的疾病肌肉消耗性疾病，疼痛，炎症，激素依赖性癌症，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，与停经相关的激素失衡或肥胖，所述治疗包括用治疗有效量的GPR54的一或多种拮抗剂或激动剂治疗所述患者。
另一方面，本发明提供GPR54的一或多种拮抗剂或激动剂在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病选自下组肌肉消耗性疾病，疼痛，炎症，激素依赖性癌症，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，与停经相关的激素失衡或肥胖。
另一方面，本发明提供操纵患者性激素轴的方法，包括用治疗有效量的GPR54的一或多种拮抗剂或激动剂治疗患者。
另一方面，本发明提供GPR54的拮抗剂或激动剂在制备用于操作动物性激素轴的药物中的用途。
根据本发明上述两方面，优选对性激素轴操纵的导致对选自下组的任何一或多种影响(effect)或疾病的操纵生育力，性欲，节育和青春期早熟(precocious puberty)。
附图简述
图1显示GPR54敲除前，小鼠GPR54基因组基因座的结构。
图2显示GPR54敲除后，小鼠GPR54的基因组基因座的结构。
图3显示用于GPR54同源重组的靶向型载体(targeting vector)的结构，包括相关限制位点。
图4a显示敲除小鼠脑切片以及图4b显示对杂合子和野生型的检测。
图5a显示对野生型和突变体小鼠的检测。图5b显示野生型小鼠的包皮腺(preputial gland)，且图5c显示突变体小鼠的包皮腺。
图6显示野生型(上图)和敲除小鼠(下图)的卵巢。
图7图示用Barnes maze实验比较野生型和敲除小鼠的行为的结果。
图8显示敲除小鼠阴道涂片的照片。
图9图示野生型和敲除小鼠的平均睾丸重量。
图10显示野生型和敲除小鼠的平均肌肉重量。
图11显示野生型和敲除小鼠的平均肾上腺重量(图11a)和唾液腺重量(图11b)。
图12显示雄性和雌性GPR54敲除小鼠与野生型小鼠相比的睾酮水平。
图13图示雌性敲除小鼠的雌二醇水平。
图14图示雌性(图14a)和雄性(图14b)敲除小鼠的FSH水平。
图15图示血清(图15a)和垂体(图15b)的LH水平。
图1 6显示电Northern(electronic Northern)。
发明内容
除非特别说明，本发明的实践采用传统的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术，其是本领域技术人员能力范围内的。所述技术在文献中有描述。见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Books 1-3，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995 and periodic supplements；CurrentProtocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA IsolationandSequencingEssential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak andJames O′D.McGee，1990，In Situ HybridizationPrinciples and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide SynthesisAPractical Approach，Irl Press；and，D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods ofEnzymologyDNA StructurePart ASynthesis and Physical分析of.DNA Methods in Enzymology，Academic Press。所述文献的内容包含在本文作为参考。
GPR54为避免疑问，本文术语″GPR54″指任何通过相关GenBank登录号鉴定的以下序列NT011255人(Homo sapiens)染色体19基因组片段组(contig)；NM～053244小家鼠(Mus musculus)G蛋白-偶联的受体54(Gpr54)，mRNA；BC016531小家鼠G蛋白-偶联的受体54，mRNA(cDNA克隆MGC27839IMAGE3488082)，完全cds；M 032551人G蛋白-偶联的受体54(GPR54)，mRNA；NM023992大家鼠(Rattus norvegicus)G蛋白-偶联的受体54(Gpr54)，mRNA；NW047773大家鼠染色体7WGS超片段组(supercontig)；AK039628成年雄性小家鼠脊髓cDNA，RIKEN全长富集的(enriched)文库，克隆A330075J02产物G-蛋白-偶联的受体GPR54(G蛋白COUPLED受体54)，整个(full)插入序列；NT039496小家鼠染色体10基因组片段组，品系(strain)C57BL/6J；AY029541人推定的G蛋白-偶联的受体mRNA，完整(complete)cds；AF343726小家鼠G-蛋白偶联的受体GPR54(Gpr54)mRNA，完整cds；AF343725人G蛋白-偶联的受体GPR54(GPR54)mRNA，完整cds；BE506644db65fO8.yl Wellcome CRC pSK卵光滑爪蟾(Xenopus laevis)cDNA克隆IMAGE3377895 5′类似于TRQ9ZOT7 Q9ZOT7 ORPHAN G蛋白-偶联的受体GPR54.；，MRNA序列；BB261471 BB261471 RIKEN全长富集的，7日龄新生鼠小脑小家鼠cDNA克隆A730098N23 3′类似于AF115516大家鼠孤儿(orphan)G蛋白-偶联的受体GPR54(GPR54)mRNA，MRNA序列；AF115516大家鼠孤儿G蛋白-偶联的受体GPR54(GPR54)mRNA，完整cdsGPR54多肽本文术语″多肽″指任何包含相互通过肽键或修饰的肽键即肽同配体(isostere)相连的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白。″多肽″指短链(通常称为肽，寡肽或寡聚物)和长链(通常称为蛋白)。多肽可包含20种基因所编码的氨基酸以外的氨基酸。
“多肽″包括通过天然过程(诸如翻译后加工等)和本领域已知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这种修饰在教科书中描述并在专论以及大量研究文献中更具体地描述。修饰可出现在多肽任何部位，包括肽主链，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可理解给定多肽的数个位点的同类型修饰可相同或有不同程度变化。同样，给定多肽可包含许多类型的修饰。
由于泛化(ubiqitination)多肽可为分支的或有或无分支的环状。环状、分支的、和分支的环状多肽可以是转录后天然加工的结果或可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，与黄素共价结合(convalent attachement of flavin)，与血红素部分共价结合，与核苷酸或核苷酸衍生物共价结合，与脂质或脂质衍生物共价结合，与磷脂酰肌醇共价结合，交联化(cross-inkings)，环化(clyclization)，二硫键形成，去甲基化，共价交联形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸盐/酯(pyroglutamate)形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚(anchor)形成，羟化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊烯化(prenylation)，外消旋化(racemization)，硒酰化(selenoylation)，硫化，转运-RNA介导的氨基酸添加到蛋白，诸如精氨酸化(arginylation)和泛化(ubiquitination)。见例如，Proteins-Structure andMolecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993 and Wold，F.，Posttranslational Protein ModificationsPerspectives and Prospects，pgs.1-12 inPosttranslational Covalent Modificationof Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter等，″Analysis for Protein modifications and nonProtein cofactors″，Meth Enzymol(1990)182626-646 and Rattan等，″Protein SynthesisPosttranslationalModifications and Aging″，AnnNYAcad Sci(1992)66348-62本发明术语“变体”，“同源物”，“衍生物”或“片段”包括从或对序列的任何替换，变异，修饰，取代，缺失或添加一(或多个)氨基酸。除非具体说明，“GPR54”包括GPR54的所述变体，同源物，衍生物和片段。
诸如GPR54的受体的“受体活性”或“生物活性”指GPR54受体的代谢或生理功能，包括类似活性或改进的活性或与降低不良副作用有关的那些活性。还包括GPR54受体的抗原性和免疫原活性。GPCR活性的实例，测定并定量所述活性的方法是本领域已知的，并描述的本文其它部分。
本文的“缺失”指核苷酸或氨基酸序列改变，其中一或多个核苷酸氨基酸分别缺失。本文术语“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列改变，其分别导致与天然物质相比一或多个核苷酸或氨基酸残基的添加。本文的“替换”是不同核苷酸或氨基酸分别取代一或多种核苷酸或氨基酸的结果。
本发明的GPR54多肽可具有氨基酸缺失，插入或取代，其导致沉默型(silent)改变并产生功能对等的氨基酸序列。基于所述残基的极性、电荷、溶解性、疏水性.亲水性和/或两亲性的相似性可进行有目的的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；疏水性值相似的、具有不带电极性头基团的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
GPR54核苷酸和多核苷酸“多核苷酸”通常指任何聚多核糖核苷酸或聚多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰或修饰的RNA和/或DNA。“多核苷酸”包括，但不限于单-和双链DNA、单-和双链区的混合物DNA，单-和双链的RNA，单-和双链区的混合物RNA，杂合分子包括单链或双链DNA和RNA，或更常见为双链的或单-和双链区混合物。此外，“多核苷酸”指三链区，包括RNA和/或DNA。术语多核苷酸还包括含有一或多个修饰的基团的DNA或RNA，以及具有为稳定性或其它原因而进行修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”基团包括，例如三苯甲基化的基团和不常见的基团诸如肌苷。已对DNA和RNA进行多种修饰，因此“多核苷酸”包括通常见于天然环境的多核苷酸的化学、酶或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞的DNA和RNA的化学修饰形式。“多核苷酸”还包括相对较短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。
本领域技术人员应理解由于遗传密码的简并性多种核苷酸序列可编码相同的多肽。
本文所述“核苷酸序列”指核苷酸序列，寡核苷酸序列，多核苷酸序列及其变体，同源物，片段和衍生物(诸如其一部分)。所述核苷酸序列可为基因组或合成或重组来源的双链或单链DNA或RNA，代表有义链或反义链或其组合。术语核苷酸序列可通过利用重组DNA技术(例如重组DNA)制备。
优选，术语“核苷酸序列”指DNA。
本发明术语“变体”，“同源物”，“衍生物”或“片段”包括从或对GPR54核苷酸序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失或添加一(或多个)氨基酸。除非具体说明，“GPR54”包括GPR54的所述变体，同源物，衍生物和片段。
GPR54的表达分析为设计用于治疗GPR54相关疾病的治疗剂，可测定GPR54(野生型或具体突变体)的表达图谱。因此本领域已知的方法可用于测定器官，组织和细胞类型(以及发育阶段)，其中有GPR54表达。可进行例如传统或“电”Northern。反转录酶PCR(RT-PCR)也可用于测定GPR54基因或突变体的表达。测定GPR54表达图谱的更敏感的方法包括RNAse保护实验(protectionassay)，这是本领域已知的。
Northern分析是实验室技术，可用于检测基因转录物的存在，并涉及标记的核苷酸序列与膜的杂交，其中来自具体细胞类型或组织的RNA固定在所述膜上。(Sambrook，supra，ch.7 and Ausubel，F.M.等supra，ch.4 and 16.)类似的计算机技术(″电Northern″)利用BLAST，用于搜索核苷酸数据库如GenBank或LIFESEQ数据库(Incyte Pharmaceuticals)中的相同或相关分子。这种分析类型的优势在于它们比多重膜杂交(multiple memebrane-basedhybridization)更快。此外，无论任何具体配对被分类为精确的(exact)或同源的(homologous)，所述计算机搜索的敏感性可修饰。
本发明的多核苷酸和多肽，包括上述探针，可用作研究试剂和材料以发现治疗和诊断动物和人类的疾病，本文以下部分将详述。
GPR54多肽的表达GPR54多肽的表达是产生GPR54抗体所需的，所述抗体的功能为本文所述GPR54的激动剂或拮抗剂。
为表达生物活性GPR54多肽，编码GPR54或其同源物、变体或衍生物的核苷酸序列被插入适宜的表达载体，即含有用于转录和翻译插入的编码序列所需元件的载体。
用本领域技术人员已知的方法构建表达载体，所述载体含有编码GPR54的序列和适宜转录及翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术以及体内基因重组。所述技术描述于Sambrook，J.等(1989；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ch.4，8，and 16-17，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)and Ausubel，F.M.等(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)。
多种表达载体/宿主系统可用于包含并表达编码GPR54的序列。这些包括，但不限于诸如用重组噬菌体，质粒，粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(诸如杆状病毒)转化的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜嵌合病毒(cauliflower mosaicvirus)(CaMV)或烟草嵌合病毒(TMV))或病毒表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。本发明不限于所用宿主细胞。
“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区(例如增强子，启动子以及5′和3′未翻译区)，其与宿主细胞蛋白相互作用以便进行转录和翻译。所述元件的强度(strength)和特异性不同。根据所用载体系统和宿主，可使用任何数目的适宜转录和翻译元件，包括连续和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子诸如BLUESCRIPT噬菌粒(phagemid)(Stratagene，La Jolla，Calif.)，或者PSP或T1质粒(GIBCO/BRL)的杂合lacZ启动子等。杆状病毒多角体蛋白(polyhedrin)启动子可用于昆虫细胞。来自植物细胞基因组(例如，热休克(heat shock)，RUBISCO和储存蛋白基因(storage protein gene))或来自植物病毒(例如，病毒启动子或前导序列)的启动子或增强子可克隆入所述载体。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子是优选的。如果需要产生含有多个拷贝GPR54多肽编码序列的细胞系，基于SV40或EBV的载体可与适宜的选择标记一起使用。
在细菌系统中，许多表达载体可根据GPR54多肽的使用意图选择。例如，当需要大量GPR54多肽诱导抗体时，可使用指导易纯化融合蛋白高水平表达的载体。所述载体包括，但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，诸如BLUESCRIPT(Stratagene)(其中编码GPR54多肽的序列可与所述载体中编码氨基末端Met以及随后的β-半乳糖苷酶7个残基的序列在框内相连，从而产生杂合蛋白)，pIN载体(Van Heeke，G.and S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等诸如此类。pGEX载体(Prω，Madison，Wis.)也可用谷胱甘肽S-转移酶(GST)将外来蛋白表达为融合蛋白。通常，所述融合蛋白是可溶的，并可容易地通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠、然后在游离谷胱甘肽存在下进行洗脱而自溶解的细胞纯化。在所述系统中制备的蛋白可设计为包括肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶切割位点，使得感兴趣的克隆的多肽可任意从GST部分释放出来。
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用许多含有连续或诱导型启动子的载体诸如α因子，醇氧化酶和PGH。综述参见Ausubel(supra)andGrant等(1987；Methods Enzymol.153516-544)。
如果使用植物表达载体，编码GPR54多肽的序列的表达可通过多种启动子之一驱动。例如，病毒启动子诸如CaMV的35S和19S启动子可单独或与TMV的ω前导序列联合使用。(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6307-311.)可选，可使用植物启动子诸如RUBISCO小亚基或热休克启动子。(Coruzzi，G.等(1984)EMBO J.31671-1680；Broglie，R.等(1984)Science 224838-843；Winter，J.等(1991)Results Probl.Cell Differ. 1785-105.)这些构建体可通过直接DNA转化或病原体介导的转染导入植物细胞。所述技术在许多通常可得的综述中描述。(见，例如，Hobbs，S.or Murry，L.E.in McGraw HillYearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill，New York，N.Y.；pp.191-196.)昆虫系统可用于表达GPR54多肽。例如，在一种这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa caiifornica nuclear polyhedrosisvirus)(AcNPV)用作在Spodopterafrugiperda细胞或夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因的载体。编码GPR54的序列可克隆入该病毒的非必要区诸如多角体蛋白基因等，并且处于多角体蛋白启动子的控制下。将GPR54多肽成功插入将使得多角体蛋白基因失活并产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。所述重组病毒可用于感染例如，S.fiugEperda细胞或夜蛾幼虫(GPR54多肽可z在其中表达)。(Engelhard，E.K.等(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.913224-3227.)哺乳动物宿主细胞中，许多基于病毒的表达系统可利用。如果用腺病毒作为表达载体，编码GPR54多肽的序列可连入腺病毒转录/翻译复合物，所述复合物由晚期启动子和三分(tripartite)前导序列组成。插入病毒基因组的非必要E1或E3区可用于获得有活力的病毒，所述病毒能够在感染的宿主细胞中表达GPR54多肽。(Logan，J.and T.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659.)此外，转录增强子诸如劳斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)增强子可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
人的人工染色体(HAC)也可用于递送大于可在质粒中包含并表达的DNA片段的DNA片段。构建并通过常规递送方法递送(脂质体，多阳离子氨基聚合物或囊泡)约6kb-10Mb的HAC用于治疗。
具体的起始信号也可更有效翻译编码GPR54多肽的序列。这种信号包括ATG起始密码子以及邻近的序列。如果编码GPR54多肽的序列及其起始密码子和上游序列被插入适宜的表达载体，无需其它转录或翻译控制信号。然而，如果仅插入编码序列或其一部分，应提供包含ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应在正确的阅读框中以保证整个插入序列得以翻译。外源翻译元件和起始密码子可为各种来源的，天然和合成的。表达的效率可通过将适合所用具体细胞系统的增强子来得以提高，所述增强子如文献所述。(Scharf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20125-162.)。
此外，宿主细胞菌株可根据其调节插入序列的表达以及按照所需方式加工所表达蛋白的能力来选择。多肽的这种修饰包括，但不限于，乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化和酰化。切割蛋白的“前原(prepro)”形式的翻译后加工可用于促进正确的插入，折叠和/或功能。为翻译后活性具有特定细胞结构(machinery)和特征机制(mechanism)的不同宿主细胞(例如CHO，HeLa，MDCK，HEK293和WI38)可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Bethesda，Md.)，并可被选择以保证所述外来蛋白的正确修饰及加工。
为长期高产重组蛋白，优选稳定表达。例如，能稳定表达GPR54 GPCR的细胞系可利用表达载体转化，所述表达载体可包含位于相同或分离载体上的病毒复制起点和/或外源表达元件以及选择标记。导入所述载体后，细胞可在富集的培养基中生长约1-2天，然后转移到选择培养基中。选择标记的目的是赋予选择抗性，且其存在允许表达被导入序列的细胞的生长和回收。稳定转化的细胞的抗性克隆可利用适合所述细胞类型的组织培养技术进行增殖。
可利用任何数量的选择系统来回收转化的细胞系。所述系统包括但不限于，单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸苷激酶基因(Wigler，M.等(1977)Cell 11223-32)以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Lowy，I.等(1980)Cell22817-23)，所述系统分别可用于tk-或apr-细胞。此外，抗代谢物，抗生素或除莠剂抗性可用作选择基础。例如，dhfr赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler，M.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt赋予对氨基糖苷新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F.等(1981)J.Mol.Biol.1501-14)；als或pat分别赋予对氯磺隆(chlorsulfuron)和草丁膦(phosphinotricin)乙酰转移酶的抗性(Murry，见上文)。其它适宜基因也有描述，例如trpB(其允许细胞利用吲哚取代色氨酸)或hisD(其允许细胞利用组氨醇(histinol)取代组氨酸)(Hartman，S.C.and R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51.)最近，可利用诸如花青素(anthocyanin)，p-葡糖醛酸酶及其底物GUS，以及萤光素酶及其底物荧光素作为可见标记(visible marker)。这些标记不仅可用于鉴定转化体，也可用于定量具体载体系统的瞬时或稳定蛋白表达量。(Rhodes，C.A.等(1995)Methods Mol.Biol.55121-131.)尽管标记基因表达的存在/缺失提示目的基因也存在，所述基因的存在和表达需要证实。例如，如果编码GPR54多肽的序列被被插入标记基因序列，含GPR54多肽编码序列的转化细胞可通过标记基因功能的缺失鉴定。可选，标记基因可与GPR54多肽编码序列串联地位于单个启动子控制下。标记基因对诱导或选择反应而表达通常表明所述串联的基因也表达。
可选，可通过本领域已知的多种方法鉴定含有GPR54多肽编码核酸序列并表达GPR54的宿主细胞。这些方法包括，但不限于DNA--DNA或DNA-RNA杂交以及蛋白生物分析(protein bioassay)和免疫分析(immunoassay)技术，包括基于膜，溶液或芯片的技术来检测和/或定量核酸或蛋白序列。
编码GPR54多肽的多核苷酸序列的存在可利用探针或片段或编码GPR54 GPCR的多核苷酸片段通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。基于核酸扩增的实验包括利用基于GPR54多肽编码序列的寡核苷酸或寡聚物来检测含有编码GPR54的DNA或RNA的转化体。
多种利用对所述蛋白特异多克隆或单克隆抗体来检测和测定GPR54表达的方案是本领域已知的。所述技术的实例包括酶联免疫吸附实验(ELISA)，放射免疫实验(RIA)和荧光激活的细胞分选(FACS)。优选两位点、基于单克隆的免疫实验，所述实验利用对GPR54上的两种非干扰性(non-interfering)表位有反应的单克隆抗体，但可采用竞争结合实验。这些和其它实验是本领域已知的，例如见Hampton，R.等(1990；Serological Methods，a Laboratory Manual，Section IV，APS Press，StPaul，Minn.)and in Maddox，D.E.等(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)。
多种标记和结合技术是本领域已知的，并用于多种核酸和氨基酸实验。制备标记的杂交或PCR探针用于检测与GPR54的编码多核苷酸相关序列的方法包括利用标记的多核苷酸进行oligolabeling，缺口翻译(nicktranslation)，末端标记(end-labeling)，或PCR扩增。可选，编码GPR54的序列或其片段可克隆入载体以制备mRNA探针。所述载体是本领域已知、可购得并可用于通过加入适当的RNA聚合酶诸如T7，T3或SP6等以及标记的核苷酸在体外合成RNA探针。这些方法可利用多种可购得的试剂盒进行，例如Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo，Mich.)，Promega(Madison，Wis.)，和U.S.Biochemical Corp(Cleveland，Ohio)提供的那些。适宜的报道分子或标记可用于简化检测，其包括放射性核素(radionuclide)，酶，荧光，化学发光或生色制剂，以及底物，辅因子，抑制物，磁性颗粒等诸如此类。
由编码GPR54的核苷酸序列转化的宿主细胞可在适宜表达和从细胞培养物回收所述蛋白的条件下培养。转化的细胞产生的蛋白可位于细胞膜，根据所用序列和/或载体分泌或包含在细胞内。本领域技术人员应理解，含有编码GPR54的多核苷酸的表达载体可设计为包含信号序列，所述信号序列指导GPR54分泌通过原核或真核细胞膜。其它构建体可用于连接GPR54编码序列与编码促进可溶蛋白回收的多肽区的核苷酸序列。所述纯化促进区(purification facilitating domain)包括，但不限于，金属螯合肽诸如允许在固定的金属上进行纯化的组氨酸-色氨酸组件(module)，以及允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A区，以及FLAGS延伸/亲合纯化系统(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)中所用的区。在纯化区和GPR54 GPCR编码序列之间包含可切割的接头序列，诸如对因子XA或肠激酶特异性的接头(Invitrogen，San Diego，Calif.)，可用于促进纯化。一种这样的载体使得融合蛋白得以表达，所述融合蛋白含有GPR54和编码6组氨酸残基然后是硫氧还蛋白或肠激酶切割位点。所述组氨酸残基可促进在固定的金属离子亲和层析上的纯化(IMIAC；described in Porath，J.等(1992)Prot.Exp.Purif.3263-281)，而肠激酶切割位点提供从所述融合蛋白纯化GPR54的方法。含有融合蛋白的载体的描述见Kroll，D.J.等(1993；DNA Cell Biol.12441-453)。
GPR54的片段不仅可通过重组制备产生，也可通过利用固相技术的直接肽合成产生(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154.)蛋白合成可通过人工或自动化技术进行。自动化的合成可通过例如使用AppliedBio系统431A肽合成仪(Perkin Elmer)进行。GPR54的各种片段可单独合成然后组合在一起产生全长分子。
转基因动物敲除本发明另一方面提供GPR54敲除哺乳动物，其包含一或多种细胞，其中的GPR54多肽是功能失活的。
本发明的GPR54敲除可为GPR54基因或该基因任何一部分的功能破坏的结果，包括使GPR54基因丧失一或多种功能的突变，包括缺失或取代。所述突变体包括单点突变，并靶向GPR54的编码或非编码区。
优选，所述敲除动物是非人哺乳动物，诸如猪，绵羊或啮齿动物。最优选所述敲除动物是小鼠或大鼠。所述敲除动物可用于筛选方法中以鉴定GPR54的激动剂和/或拮抗剂，以及检测其在体内治疗疾病的效力。
例如，经改造GPR54生成缺陷的敲除动物可用于实验以鉴定GPR54的激动剂和/或拮抗剂。一种实验设计为评估可能的药物(候选配体或化合物)以测定其在缺乏GPR54受体时是否产生生理反应。这可通过将药物给予上述敲除动物，并检测所述动物的特定反应来进行。任何生理参数可在该实验中测定。
来自GPR54敲除动物的组织可用于受体结合实验以测定所述可能的药物(候选配体或化合物)是否与GPR54受体结合。所述实验可通过从经改造GPR54生成缺陷的敲除动物获得第一受体制备物，并从已知与任何鉴定的GPR54配体或化合物结合的来源获得第二受体来进行。通常，所述第一和第二受体制备物在除获得它们的来源以外的所有方面都相似。例如，如果敲除动物(如上文和下文所述)的脑组织用于实验中，来自正常(野生型)动物的可比(comparable)脑组织可用作第二受体制备物的来源。每种受体制备物都与已知与GPR54受体结合的配体一起、在存在或不存在候选配体或化合物的条件下进行保温。优选所述候选配体或化合物可在不同浓度检测。
测定第一和第二受体制备物与已知配体的结合被检验化合物取代的程度。来自敲除动物的组织可直接用于实验，或所述组织可经过加工成为分离的膜或膜蛋白(其本身可用于实验)。优选的敲除动物是小鼠。配体可用任何与结合实验相容的方法标记。这可包括，但不限于，放射活性，酶，荧光或化学发光标记(以及下文所述其它标记技术)。
此外，GPR54受体的拮抗剂可通过将候选化合物等给药表达功能性GPR54的野生型动物，以及鉴定为显示任何与GPR54受体功能表达的降低或消除相关的表型特征的动物来鉴定。
产生非人敲除动物的详细方法在下文描述。转基因构建体可导入动物的种系以产生敲除哺乳动物。例如，一或数个拷贝的构建体可通过标准转基因技术掺入哺乳动物胚胎基因组中。
一个示例性实施方案中，本发明敲除非人动物通过将转基因导入非人动物的种系制备。各个发育阶段的胚胎靶细胞可用于导入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段利用不同方法。用于实践本发明的任何动物的具体的系(line)可根据总体健康良好，胚胎产量良好，胚胎中原核可见性良好以及生殖健康状况良好来选择。此外，单倍体是明显的因素。
将转基因导入胚胎可通过本领域已知的任何方法进行，诸如微量注射(microinjection)，电穿孔，或脂质转染。例如，GPR54受体转基因可通过将所述构建体微量注入受精的哺乳动物卵的原核中，从而使一或多个拷贝的构建体保持在发育动物的细胞中。将所述转基因构建体导入受精卵中以后，所述卵可在体外保温不同时间，和/或再植入代理宿主(surrogate host)。体外保温到成熟是本领域已知的。一种常用方法是将胚胎在体外保温约1-7天(根据种类而不同)，然后将所述胚胎再植入代理宿主。
可通过对组织部分进行Southern印迹分析，来检测经转基因操作的胚胎的后代中的所述构建体的存在。如果一或多个拷贝的外源克隆的构建体保持稳定整合在所述敲除胚胎的基因组中，可建立携带以转基因方式加入的构建体的永久性敲除哺乳动物系。
敲除改变哺乳动物的同窝幼仔出生后，可测定所述构建体掺入所述后代基因组中的情况。优选，该实验通过将对应编码所需重组蛋白产物或其片段的DNA序列的探针与所述后代的染色体物质进行杂交来进行。使基因组中含有至少一个拷贝的构建体的哺乳动物后代成长到成熟。
为本发明的目的，合子(zygote)基本上是形成的二倍体细胞，其能发育成完整生物体。通常，所述合子包含有核的卵，所述核可通过将来自相同或不同配子的两个单倍体核融合而天然或人工形成。因此，所述配子的核一定是天然相容的，即其产生能经过分化并发育成有功能的生物体的可存活合子。通常，优选整倍体合子。如果获得非整倍体合子，根据配子所来源生物体的整倍体数目，染色体数目变化不能超过一个。
此外，类似的生物考虑，物理因素也影响(govern)外源遗传物质的量(体积)，所述外源遗传物质可加入该合子的核或形成该合子核的一部分的遗传物质。如果没有遗传物质被去除，可加入的外源遗传物质量受到可被吸收而不会被物理因素破坏的量的限制。通常外源遗传物质日不超过约10皮升(picoliter)。加入的物理影响不能大到物理破坏所述合子的存活力。DNA序列的数目核多样性的生物限制可根据具体的合子以及外源遗传物质的功能而变化，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的，这是由于所得合子的遗传物质(包括所述外源性遗传物质)必须在生物学上能够起始并保持所述合子分化并发育成有功能的生物体。
加入合子的转基因构建体拷贝数目有赖于加入的外源遗传物质总量，并且将是能够使遗传转化成为可能的量。理论上，仅需一个拷贝；然而通常利用多个拷贝，例如，1,000-20,000拷贝的转基因构建体，以保证一个拷贝有功能。对于本发明，每个插入的外源DNA序列有一个以上功能型拷贝以改善外源DNA序列的表型表达通常是有利的。
任何允许将外源遗传物质加入到细胞核遗传物质中的技术均可用，只要其不破坏细胞、核膜或已有的细胞或遗传结构。外源遗传物质优选通过微量注射进入核酸遗传物质。细胞和细胞结构的显微注射是本领域已知的。
再植入通过标准方法实现。通常，对代理宿主进行麻醉，并将胚胎插入其输卵管。植入具体宿主的胚胎数目根据种类而不同，但通常与该宿主自然产生的后代数相似。
可通过任何适宜方法筛选代理宿主的敲除后代中转基因的存在和/或表达。筛选通常利用与至少部分转基因互补的探针、通过Southern印迹或Northern印迹分析来进行。利用转基因所编码蛋白的抗体进行的Western印迹分析可用作筛选转基因产物存在的可选或其它方法。通常DNA自尾组织制备，并通过Southern分析或PCR分析所述转基因。可选，利用Southern分析或PCR检测据信表达高水平转基因的组织或细胞中转基因的存在和表达，但任何组织或细胞类型均可用于该分析。
评估转基因存在的可选或其它方法包括，但不限于适宜的生化实验，如酶和/或免疫实验，具体标记物或酶活性的组织染色，流式细胞分析等。血液分析也可用于检测转基因产物在血液中的存在，以及评价所述转基因对各种类型血细胞和其它血液成分的水平的影响。
逆转录病毒感染也可用于将转基因导入非人动物。正在发育的非人胚胎也可在体外培养到胚泡(blastocyst)阶段。该过程中，分裂球是逆转录病毒感染的靶(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。分裂球的有效感染通过酶处理去除透明带(zona pellucida)实现(Manipulating the mice Embryo，Hoganeds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用于导入转基因的逆转录载体系统通常为携带该转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner等(1985)PNAS 826927-6931；Van der Putten等(1985)PNAS 826148-6152)。转染通过在单层产病毒细胞(virus-producing cell)上培养分裂球容易且有效地实现(Van der Putten，supra；Stewart等(1987)EMBO J.6383-388)。可选，感染可在以后的阶段进行。病毒或产病毒细胞可注入囊胚腔(blastocoele)(Jahner等(1982)Nature 298623-628)。大多数建立者(founder)对转基因而言是嵌合的，这是由于掺入(incorporation)仅在部分形成转基因非人动物的细胞中出现。此外，建立者基因组中的不同位置可含有转基因的各种逆转录病毒插入物，其通常在后代分离。此外，还可对孕期中的胚胎(midgestation embryo)进行子宫内逆转录病毒感染，来将转基因导入种系(Jahner等(1982)，见上文)。
转基因导入的第三种类型的靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞自植入前体外培养的胚胎获得，并与胚胎融合(Evans等(1981)Nature 292154-156；Bradley等(1984)Nature 309255-258；Gossler等(1986)PNAS 839065-9069；Robertson等(1986)Nature 322445-448)。转基因可有效通过DNA转染或逆转录病毒介导的转导导入ES细胞。所述转化的ES细胞随后可与来自非人动物的胚泡结合(combine)。所述ES细胞随后在胚胎建群并有成为产生嵌合动物的种系。参见Jaenisch，R.(1988)Science 2401468-1474.
本发明还涉及用于功能破坏宿主细胞的GPR54基因的核酸构建体。该核酸构建体包括(a)非-同源置换部分(non-homologous replacement portion)；(b)位于所述非-同源置换部分上游的第一同源区；所述第一同源区具有与第一GPR54基因序列基本相同的核苷酸序列；和(c)位于所述非-同源置部分下游的第二同源区，所述第二同源区具有与第二GPR54基因序列基本相同的核苷酸序列，所述第二GPR54基因位于天然存在的内源GPR54基因中所述第一GPR54基因序列的下游。此外，当所述核酸分子被导入宿主细胞时，第一和第二同源区应足够长，以进行核酸构建体与宿主细胞中的内源GPR54基因进行同源重组。优选实施方案中，所述非-同源置换部分包含表达报道物，优选包括lacZ和阳性选择表达盒，优选包含可操作连接于调节元件的新霉素磷酸转移酶基因。
GPR54 GPCR缺陷的转基因动物可如下产生(a)构建体GPR54基因靶向型载体(targeting vector)鼠GPR54基因组克隆分离自利用探针序列获自HGMP(Hinxton，UK)的小鼠大插入子(mouse large insert)PAC文库，所述文库为利用标准技术自部分预测的鼠可读框cDNA序列(SEQ ID NO4)扩增的。分离的鼠GPR54基因组克隆随后利用小寡核苷酸探针和标准技术通过限制酶切作图(restriction mapped)在GPR54基因的区域中。
对鼠基因组基因座进行部分测序，以使得可设计用于克隆入靶向型载体中的同源臂。通常为1-5kb的DNA的两个区(从将被缺失的可读框区域的任何一侧起)称为5′和3′同源臂，其通过PCR扩增且所述片段被克隆入靶向型载体。这些臂的位置选择使得同源重组事件将通过缺失至少7个跨膜区而功能性破坏GPR54基因。靶向型载体被制备成其中缺失的GPR54序列被非-同源序列取代，所述非-同源序列包含选择盒(selection cassette)上游的内源基因表达报道物(不依赖框(frame independent)的lacZ基因)，其由启动的(promoted)新霉素磷酸转移酶(neo)基因组成，所述基因的方向与GPR54基因一样。
(b)胚胎干细胞的转染和分析胚胎干细胞(Evans and Kaufman，1981)在新霉素抗性胚胎成纤维细胞培养基支持层(feeder layer)上培养、在Dulbecco′s改良的Eagles培养基中生长，所述培养基补充了20％胎牛血清，10％新生牛血清，2mM谷氨酰胺，非必需氨基酸，100μM 2-巯基乙醇和500u/ml白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor)。每天更换培养基，并每3天对ES细胞进行传代。5×106ES细胞用5μg线性化的质粒通过电穿孔(25μF电容和400伏特)进行转染。电穿孔24小时后，转染的细胞在含200μg/ml新霉素的培养基中培养9天。将克隆转移至96孔板，复制并扩增，然后通过PCR鉴定其中内源GPR54基因与靶向型构建体发生同源重组的克隆。阳性克隆比例通常为1-5％。扩增这些克隆，以便允许复制体被冷冻并且制备足够高质量的DNA用于通过Southern印迹利用外部5′和3′探针确定靶向事件(targeting event)，所述过程均使用标准技术(Russ等，2000，Nature 2000Mar 2；404(6773)95-9)。
(c)GPR54缺陷小鼠的产生C57BL/6雌性和雄性小鼠进行交配，并在怀孕3.5天时分离胚泡。每个胚泡中注入来自选定克隆的10-12个细胞，并将7-8胚泡植入假孕F1雌性小鼠子宫。
同窝嵌合幼鼠出生时含较高水平(达100％)的有花纹雄鼠(agoutimales)(花纹外皮颜色表明被靶向的克隆的后代细胞的作用)。雄性嵌合体与雌性和MF1以及129小鼠交配，分别通过花纹外皮颜色和PCR基因型分析确定种系传递(germline transmission)。
其它非人转基因动物本发明还涉及非人转基因动物，其导致GPR54受体过表达或所述受体低表达(与适宜对照相比)。
所述动物可用于鉴定受体功能的激动剂和拮抗剂(也可用于治疗)。
抗体本文的抗体可用作GPR54多肽的激动剂或拮抗剂。
为本发明目的，除非特别说明，术语″抗体″包括但不限于，多克隆，单克隆，嵌合，单链，Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。所述片段包括完整抗体的片段(其保持与靶物质结合的活性)，Fv，F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)，融合蛋白以及包含抗体的抗原结合位点的其它合成蛋白。抗体及其片段可为人源化抗体，例如EP-A-239400所述。此外，可使用具有完整人可变区的抗体(或其片段)，例如美国专利5,545,807和6,075,181所述。中和抗体，即抑制所述物质氨基酸序列的生物活性的抗体，具体优选用于诊断和治疗。
抗体可通过标准技术制备，诸如通过免疫(immunization)或利用噬菌体展示文库。
本发明的多肽或肽可用于通过已知技术制备抗体。所述抗体可与GPR54蛋白或其同源物、片段等特异性结合。
如需要多克隆抗体，选定的哺乳动物(例如，小鼠，兔，山羊，马等)可用免疫原性组合物免疫，所述组合物包括本发明的多肽或肽。根据宿主种类可利用多种佐剂来增强免疫反应。所述佐剂包括，但不限于，Freund′s，矿物盐凝胶诸如氢氧化铝，以及表面活性物质诸如溶血卵磷脂，聚醚多羟基化合物(pluronic polyol)，聚阴离子，肽，油乳液，匙孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin)和二硝基酚。BCG(BacilliCalmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是可能有用的人佐剂，如果所述物质氨基酸序列给药免疫受损(compromised)的个体以刺激系统防御时可使用所述佐剂。
根据已知方法收集来自免疫的动物的血清并进行处理。如可获自本发明多肽的、含有抗表位多克隆抗体的血清含有其它抗原的抗体，所述多克隆抗体可通过免疫亲和层析纯化。用于制备并加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为制备所述抗体，本发明还提供本发明的氨基酸序列或其片段，其对用作动物或人的免疫原的其它氨基酸序列是半抗原化的(haptenised)。
抗表位的单克隆抗体可由本领域技术人员轻易制备，所述表位可获自本发明的多肽或肽。通过杂交瘤制备单克隆抗体的常用方法已知。不朽的(immortal)产抗体细胞系可通过细胞融合以及其它技术制备，所述其它技术诸如用致癌(oncogenic)DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒进行转染。可筛选针对眼眶(orbit)表位制备的所有单克隆抗体的各种性质，诸如对于同种型和表位的亲和力。
单克隆抗体可通过任何可通过连续细胞系培养制备抗体分子的方法制备。这些技术包括，但不限于Koehler and Milstein(1975 Nature 256495-497)的杂交瘤技术，trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)ImmunolToday 472；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 802026-2030)以及EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
此外，可使用为制备嵌合抗体发展的技术，如将小鼠抗体基因与人抗体基因进行拼接以获得具有适宜抗原特异性和生物活性的分子的技术(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 816851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312604-608；Takeda等(1985)Nature 314452-454)。可选，用于制备单链抗体(美国专利4,946,779)的技术可用于制备物质特异性单链抗体。
针对获自本发明多肽或肽的表位的单克隆和多克隆抗体尤其可用于诊断，且其中的中和型抗体可用在被动免疫治疗中。具体地单克隆抗体可用于激发抗-独特型抗体。抗-独特型抗体是携带物质“内部图像(internalimage)”和/或需要防止其攻击的试剂的免疫球蛋白。用于激发抗独特型抗体的技术在本领域已知。这些抗独特型抗体也可用于治疗。
抗体也可通过在淋巴细胞群诱导体内产生或通过筛选重组免疫球蛋白文库或全部高特异性结合试剂来制备，如Orlandi等(1989，Proc Natl Acad Sci863833-3837)，and Winter G and Milstein C(1991；Nature 349293-299)所述。
也可产生含有多肽或肽的特异性结合位点的抗体片段。例如，所述片段包括，但不限于F(ab′)2片段(其可通过用胃蛋白酶消化抗体分子制备)，和Fab片段(其可通过还原F(ab′)2片段的二硫桥制备)。可选，可构建Fab表达文库以允许快速容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(HuseWD等(1989)Science 2561275-1281)。
用于制备单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可用于制备本发明多肽的单链抗体。同样，转基因小鼠或其它生物体包括其它哺乳动物可用于表达人源化抗体。
因此，本发明人认为GPR54抗体或包含它们的组合物尤其可用于治疗神经性，生殖激素相关的和一些其它疾病。所述神经疾病包括但不限于以下一或多种疾病阿尔茨海默氏症，感觉神经元病或癫痫.
所述生殖激素相关的疾病包括下组的一或多种生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病或停经。此外，GPR54激动剂或拮抗剂可用于激素替代治疗(HRT)。
其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症和肥胖。
诊断实验本发明另一方面提供诊断选自下组的疾病的方法阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症和肥胖，所述方法包括以下步骤(a)从待诊断的患者中选出细胞样品，(b)比较所述细胞样品与来自健康个体的一或多个对照样品的GPR54多肽表达水平和/或功能活性。
本发明还涉及GPR54多核苷酸，编码GPR54肽配体的多核苷酸和多肽(以及其同源物，变体和衍生物)在诊断试剂和基因分析中的用途。与能够和GPR54核酸(包括同源物，变体及衍生物)互补或能与其杂交的核酸，以及抗GPR54多肽以及GPR54配体多肽的抗体也可用于所述实验。
GPR54基因突变形式、metastin基因或与功能不良相关的其它天然配体基因的检测可提供诊断工具，其可添加或限定疾病或疾病易感性的诊断，所述疾病是GPR54或其天然配体的表达过低，超量表达或表达改变的结果。可通过各种技术在DNA水平检测携带GPR54基因(包括对照序列)中突变的个体。
例如，DNA可分离自患者并测定GPR54或metastin DNA多态性模式。所述鉴定的模式可与对照患者比较，已知所述对照患者患有与GPR54或metastin表达过低，超量表达或表达异常相关的疾病。表达与GPR54或metastin相关疾病的遗传多态性的患者可由此鉴定。GPR54或metastin的基因分析可通过本领域任何已知技术进行。例如，个体可通过RFLP或SNP分析等测定GPR54或metastin等位基因的DNA序列来筛选。通过检测GPR54或metastin的基因序列或控制其表达的任何序列中的DNA多态性存在，可将患者鉴定为具有患与GPR54或metastin表达过低，超量表达或表达异常相关的疾病的遗传倾向。
可治疗或预防如此鉴定的患者的GPR54或metastin相关疾病，或更进一步在GPR54或metastin相关疾病的早期治疗，以防止所述疾病的进一步发展。GPR54或metastin相关疾病包括阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症。
优选实施方案中，GPR54或metastin相关疾病包括阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症和肥胖。优选，所述疾病涉及性类固醇激素轴(sex steroid hormonal axis)调节。
本发明还涉及试剂盒，其用于鉴定患者GPR54或metastin相关疾病的遗传多态性模式。所述试剂盒包含DNA样品收集装置，以及测定遗传多态性模式的装置，其可与对照样品比较来确定患者对GPR54或metastin相关疾病的易感性。诊断GPR54或metastin相关疾病的试剂盒包含GPR54或metastin多肽和/或所述多肽(或其片段)的抗体。
诊断用核酸可获自受试者细胞，诸如来自血，尿，唾液组织活检或尸检的物质。在优选实施方案中，所述DNA可获自收集在吸收纸上的患者指血的血细胞。另一优选实施方案中，所述血液收集在AmpliCard.TM.(University of Sheffield，Department of Medicine and Pharmacology，RoyalHallamshire Hospital，Sheffield，EnglandS10 2JF)。
所述DNA可直接用于检测或用PCR或其它扩增技术进行酶促扩增，然后进行分析。可制备目的基因中靶向特异性多态性DNA区的寡核苷酸DNA引物，使得在PCR反应中实现靶序列的扩增。RNA或cDNA也可以相似方式用作模板。从模板DNA扩增的DNA序列可利用限制酶分析，以确定扩增的序列的遗传多态性，并由此提供患者的遗传多态性图谱。限制片段长度可通过凝胶分析确定。可可选或联合地使用诸如SNP(单核苷酸多态性)分析等技术。
缺失和插入可通过扩增产物与正常基因型相比而言的大小改变来检测。点突变可通过使扩增的DNA与标记的GPR54或metasin核苷酸序列的杂交来鉴定。优选匹配的序列可通过RNase消化或解链温度差异来与未配对的双链体区分。DNA序列差异也可通过DNA片段在凝胶(可包含或不包含变性剂)中电泳迁移率的改变，或通过直接DNA测序来检测。见例如，Myers等，Science(1985)2301242。具体位置的序列改变也可通过核酸酶保护实验(nuclease protection assay)诸如RNase和S1保护或化学切割法显示。见Cotton等，Proc Natl Acad Sci USA(1985)854397-4401。另一实施方案中，可构建包含GPR54或metastin核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针的阵列，以有效筛选例如基因突变。阵列技术法是已知并常用的，可用于说明分子遗传学中的多种问题，包括基因表达，基因连接以及基因多样性(见例如M.Chee etal.，Science，Vol 274，pp 610-613(1996))。
单链构型多态性(SSCP)可用于检测突变体和野生型核酸之间的电泳迁移率差异(Orita等(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA862766，see also Cotton(1993)Mutat Res 285125-144；and Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 973-79)。样品和对照GPR54或metastin核酸的单链DNA片段可变性并允许其复性。单链核酸的二级结构根据序列而不同，产生的电泳迁移率改变可用于检测单个碱基改变。DNA片段可被标记或用标记的探针检测。所述实验的敏感性可通过利用RNA(而不是DNA)来增强，其中的二级结构对序列改变更敏感。在优选实施方案中，目的(subject)方法利用异源双链分析基于电泳迁移率分离双链异源复合体分子(Keen等(1991)TrendsGenet 75)。
诊断实验提供诊断或确定对以下疾病的敏感性的方法感染诸如病毒，真菌，原核生物和病毒感染、尤其是HIV-1或HIV-2的感染；疼痛；癌症；糖尿病；肥胖；厌食；贪食(bulimia)；哮喘；帕金森氏症；血栓形成(thrombosis)；急性心衰，低血压；高血压；阳痿(erectile dysfunction)；尿潴留(urinary retention)；代谢性骨病诸如骨质疏松和骨硬化病；心绞痛；心肌梗塞；溃疡；哮喘；过敏；类风湿性关节炎；炎性肠病；肠易激综合征；良性前列腺肥大以及精神和神经性疾病，包括焦虑(anxiety)，精神分裂(schizophrenia)，狂燥型抑郁(manic depression)，谵妄(delirium)，痴呆(dementia)，严重精神迟缓和运动功能障碍(severe mental retardation anddyskinesia)，诸如亨廷顿(Huntington)氏病或Gilles dela Tourett′s综合征，可通过所述方法检测GPR54或metastin基因中的突变。
在具体优选的实施方案中，所述诊断试验用于诊断或治疗对阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症和肥胖的易感性。优选，所述疾病涉及调节性类固醇激素轴。
可检测样品中GPR54或metastin多肽和核酸的存在。因此，上述感染和疾病可通过以下方法诊断，所述方法包括测定来自个体的样品中异常降低或增加的GPR54或metastin多肽或者GPR54或metastin mRNA水平。所述样品可包含来自患有或易患与增加，降低或异常GPR54或metastin表达相关疾病的生物体的细胞或组织，包括表达水平或模式的空间性或暂时性改变。患有或易患所述疾病的生物体中的GPR54或metastin的表达水平或模式可通过与正常生物体中的所述表达水平或模式比较作为疾病诊断方法。
因此，通常本发明包括检测样品中核酸存在的方法，所述核酸包含GPR54或metastin核酸，所述方法通过将所述样品与至少一种对所述核酸特异的核酸探针接触，并监测该样品中所述核酸的存在来进行。例如，所述核酸探针可特异性结合于GPR54或metastin核酸或其一部分，并检测两者的结合；所述复合物本身的存在也可被检测。此外，本发明包括检测GPR54或metastin多肽的方法，所述方法通过将细胞样品与能结合所述多肽的抗体接触，并检测该样品中所述多肽的存在来进行。这可通过监测所述抗体和多肽之间的复合物形成，或监测所述多肽与抗体的结合方便地实现。检测两种实体之间的结合的方法在本领域已知，并包括FRET(荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer))，表面胞质团共振(surfaceplasmon resonance)等。
降低或增加的表达可利用本领域已知任何用于定量多核苷酸的方法在RNA水平测定，所述方法诸如PCR，RT-PCR，RNase保护，Northern印迹和其它杂交法。可用于测定宿主样品中蛋白如GPR54或metastin水平的实验技术是本领域技术人员已知的。所述实验方法包括放射免疫实验，竞争结合实验，Western印迹分析和ELIA实验。
本发明涉及用于诊断以下任意疾病或对以下任意疾病的易感性的诊断试剂盒阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症或肥胖。优选，所述疾病涉及性类固醇激素轴的调节。
用具体优选的诊断试剂盒来诊断以下疾病或对以下任意疾病的易感性阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症或肥胖。优选，所述疾病涉及性类固醇激素轴的调节。
所述诊断试剂盒包含GPR54或metastin多核苷酸或其片段；互补核苷酸序列；GPR54或metastin多肽或其片段，或抗GPR54或metastin多肽的抗体。
预防和治疗方法本发明提供治疗与GPR54多肽活性过高或不足相关的异常疾病的方法，且GPR54多肽，其结合蛋白和/或编码它们的核酸具体可用于治疗神经性，生殖激素相关的和一些其它疾病。所述神经疾病包括但不限于一或多种选自下组的疾病阿尔茨海默氏症，感觉神经元病或癫痫。
所述生殖激素相关的疾病包括选自下组疾病的一或多种疾病生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病或停经。此外，GPR54激动剂或拮抗剂可用于激素替代治疗(HRT)。
其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症和肥胖。
如果GPR54活性过高，可采用多种方法。一种方法包括给药受试者有效抑制活化的量的本文上述的抑制性化合物(拮抗剂)以及可药用载体，其通过阻断配体与GPR54的结合，或通过抑制第二信号从而缓解所述异常疾病。
另一方法中，可给药仍能与内源GPR54竞争结合配体的可溶形式的GPR54多肽。这种竞争物的常见实施方案包括GPR54多肽的片段。
另一方法中，内源GPR54多肽编码基因的表达可利用表达阻断技术抑制。已知的这种技术涉及利用反义序列，所述反义序列可内部产生或分别给药。见例如O′Connor，JNeurochem(1991)56560 in Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors of基因Expression，CRC Press，Bocaraton，Fla.(1988).可选可提供与所述基因形成三螺旋的寡核苷酸。见，例如，Lee等，NucleicAcids Res(1979)63073；Cooney等，Science(1988)241456；Dervan等，Science(1991)2511360。这些组合物可按原样给药或相关寡聚物可在体内表达。
为治疗GPR54或其活性低表达相关的异常疾病，可采用多种方法。一种方法包括给药受体治疗有效量的化合物与可药用载体，所述化合物类似配体结合的GPR54(即上述激动剂)，从而缓解所述异常疾病。可选，可用基因治疗以通过受试者中的相关细胞内源性产生GPR54。例如，本发明的多核苷酸可经改造以表达如上所述的复制缺陷的逆转录病毒载体。所述逆转录病毒表达构建体可随后被分离并导入包装细胞(packaging cell)，所述包装细胞用含有编码本发明多肽的RNAd的逆转录病毒质粒载体转导，使得所述包装细胞可产生含有目的基因的感染性病毒颗粒。可将这些制备型细胞(producer cell)给药受试者，以在体内改造细胞并在体内表达所述多肽。基因治疗的综述参见Chapter 20，Gene Therapy and other Molecular Genetic-basedTherapeutic Approaches，(and references cited therein)in Human Molecular基Genetics，T Strachan and A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。
配制和给药肽诸如GPR54多肽的可溶形式，以及激动剂和拮抗剂肽或小分子可与适宜的药用载体配制在一起。所述配制剂包含治疗有效量的所述多肽或化合物以及可药用的载体或赋形剂。所述载体包括但不限于盐水，缓冲的盐水，右旋糖，水，甘油，乙醇及其组合物。配制剂应适合给药，并且是本领域技术人员已知的。本发明还涉及药物包和试剂盒，其包含一或多种容器，所述容器中充满本发明前述组合物的一或多种成分。
本发明的多肽和其它化合物可单独使用或与其它化合物诸如治疗性化合物联用。
所述药物组合物系统给药的优选形式包括注射，通常经静脉内注射。可使用其它注射途径，诸如经皮下，肌肉内或腹腔内。系统给药的其它方式包括经粘膜(transmucosal)和经皮(transdermal)给药，利用穿透剂(penetrant)诸如胆盐或梭链孢酸(Fusidic Acid)或其它清洁剂。此外，如果适当地配制成肠溶或包囊化的制剂，也可口服给药。这些化合物也可经局部(topical)和/或局部化(localize)，以药膏(salve)，膏剂(paste)，凝胶等形式给药。
所需剂量范围有赖于所选肽，给药途径，配制剂性质，以及受试者疾病的性质，以及主治医师判断。适宜的剂量为0.1-100ug/kg受体。预期所需剂量范围可变化较大，这是由于可获得各种化合物并且各种给药途径的效率不同。例如预期口服给药需要的剂量高于静脉内注射。这些剂量水平的差异可利用优化的标准经验途径调节，这也是本领域已知的。
用于治疗的多肽也可在受体内源中，在如上所述通常称为“基因治疗”的药征(modality)中产生。因此，例如来自受体的细胞可用在离体条件下编码多肽的多核苷酸诸如DNA或RNA以及例如通过利用逆转录病毒质粒载体进行改造。所述细胞随后被导入受试者。
药物组合物本发明还提供药物组合物，包括给药治疗有效量的本发明GPR54多肽，其结合分子或编码它们的核酸分子，以及可选的可药用载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
所述药物组合物在人和兽医医学中可用于人和动物，并将通常包括任何一或多种可药用稀释剂、载体或赋形剂。可用于治疗的载体和稀释剂在药学领域已知，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)所述。药用载体、赋形剂或稀释剂可根据给药途径以及标准药物实践选择。所述药物组合物可包含载体、赋形剂或稀释剂，任何适宜的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂(coating agent)、增溶剂等。
防腐剂，稳定剂，染料甚至调味剂可用于本发明药物组合物。防腐剂实例包括苯甲酸钠(sodium benzoate)，山梨酸(sorbic acid)以及对羟苯甲酸的酯。还可使用抗氧化剂和悬浮剂。
不同递送系统需要不同组合物/配制剂。例如，本发明的药物组合物可配制成利用微型泵(mini-pump)或通过粘膜途径递送(例如作为喷鼻剂或气溶胶以便吸入)或可摄取的溶液，或经胃肠外(其中所述组合物配制称可注射形式用于通过例如经静脉内，肌肉内或皮下递送)。可选，所述配制剂可设计成通过所述两种途径递送。
当所述制剂通过胃肠道粘膜而经粘膜递送时，其在通过胃肠道时应保持稳定；例如，其应抵抗蛋白水解，在酸性pH稳定并抵抗胆汁的清洁作用。
适宜的药物组合物可通过如下方式给药经吸入，以栓剂或阴道栓剂(pessary)的形式，以洗液、溶液、乳膏、油膏或细粉(dusting powder)的形式，通过利用贴皮剂(skin patch)，以含有赋形剂诸如淀粉或乳糖的片剂形式口服，或在胶囊或卵形囊(ovule)中单独或与赋形剂一起，或以含有调味或着色剂的的酏剂、溶液或混悬液的形式，或经胃肠外诸如，例如经静脉内，肌肉内或皮下注射。对于胃肠外给药，所述组合物最好为无菌含水溶液的形式，所述溶液可含有其它物质，诸如足够的盐或单糖，使得所述溶液与血液等张。对于经口含(buccal)或舌下给药，所述组合物可以以常用方式配制的片剂或锭剂形式给药。
给药通常，医师决定适合个体受试者的实际剂量，且所述剂量随年龄、体重或具体患者的反应变化。所述剂量低于示例性平均情况。当然可有优选高于或低于所述范围的剂量个别情况。
本发明药物组合物可通过直接注射给药。所述组合物可配制成经胃肠外，经粘膜，经肌肉内，经静脉内，经皮下，经耳内(intraocular)或经皮给药。通常，每种蛋白的给药剂量为0.01-30mg/kg体重，优选0.1-10mg/kg，更优选0.1-1mg/kg体重.
术语″给药的″包括通过病毒或非病毒技术递送。病毒递送机制包括但不限于腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体，疱疹病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体和杆状病毒载体。非病毒递送基质包括，脂质介导的转染，脂质体，免疫脂质体(immunoliposome)，脂质转染，阳离子表面两亲物(cationicfacial amphiphil)及其组合。这种递送机制的途径包括但不限于经粘膜，经鼻，口服，经胃肠外，经胃肠道，经局部或经舌下途径。
术语“给药的“包括但不限于通过粘膜途径递送，例如作为喷鼻剂或气溶胶用于吸入或作为可摄取的溶液；胃肠外途径，其通过可注射的形式诸如经静脉内、肌肉内或皮下途径递送。
术语″共同给药的(co-administered)″指每种例如本发明的多肽和其它实体诸如佐剂的给药位点和时间使得可实现对免疫系统的必要调节。因此，虽然可将所述多肽和佐剂同时给药同一位点时，但优选在不同时间和位点给药所述多肽和佐剂。所述多肽和佐剂甚至可在同一递送载体内给药，且所述多肽和抗原可为偶联和/或非偶联和/或基因偶联/或非偶联的。
所述多肽、多核苷酸、肽、核苷酸以及可选佐剂可作为单一剂量或多个剂量分开或共同给药宿主受体。
本发明的药物组合物可通过多种不同途径给药，诸如注射(包括经胃肠外，经皮下和经肌肉内注射)，经鼻内、粘膜内、经口服、经阴道内、经尿道内或经耳给药。
本发明的药物组合物可常规通过注射例如通过皮下或肌肉内而经胃肠外给药。适合其它给药方式的其它配制剂包括栓剂，以及一些情况下的口服制剂。对于栓剂，常用粘合剂和载体可包括，例如，聚乙二醇或三甘油酯；所述栓剂可以由有0.5％-10％或1％-2％的性组分的混合物形成。口服制剂包括诸如通常采用的赋形剂，例如药用级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。所述组合物可为溶液，混悬液，片剂，丸，胶囊，持续释放的配制剂或粉末，并含有10％-95％，优选25％-70％的活性成分。当疫苗组合物为冻干的时，冻干的物质可在给药前溶解，例如溶解为混悬液。溶解优选在缓冲液中进行。
本发明将根据实施例进行具体说明，所述实施例不应理解为对本发明的限制。
实施例实施例1.转基因GPR54敲除小鼠构建靶向GPR54基因的载体鼠GPR54基因通过生物信息学方法(bioinformatically)鉴定，并发现其位于来自PAC文库的10.3kb基因组片段组中。进一步生物信息学研究将该片段组扩大到28kb。该片段组提供足够的侧翼序列信息，使得可设计同源臂以便克隆入靶向型载体(所用靶向载体的结构，包括相关限制位点显示在图3)。
鼠GPR54基因有五个编码型外显子。靶向策略设计为去除7tm编码区前的部分第一外显子和第二含7tm的外显子(second 7tm-containing exon)的大部分。侧接待缺失的含7tm的外显子的4.7kb 5′同源臂和1.0kb 3′同源臂可通过PCR扩增，并将其片段克隆入靶向型载体。合成用于扩增所述臂的每种寡核苷酸引物的5’末端，其含有稀少切割型限制酶(rare cuttingrestriction enzyme)的不同识别位点，并与所述载体的多聚接头(polylinker)的克隆位点相容且从臂本身缺失。对于GPR54，所述引物设计为以下序列所示那样，具有AgeI/SpeI的5′臂克隆酶(cloning enzyme)和AscI/FseI的3′臂克隆酶。
此外，对于臂引物对(5′臂5′1(AgeI)/5′臂3′(SpeI)以及3′臂5′末端AscI/3′臂3′2 Fse)，其它对GPR54基因座特异的引物被设计为用于以下目的5′和3′探针引物对(5′探针FII/5′探针RII和3′探针F1/3′探针R1)，用于扩增在分离的推定靶向克隆中的非重复性基因组DNA的两个150-300bp短片段(所述片段位于每个臂外侧并延伸超过所述臂)，从而允许对靶基因座进行Southern分析；小鼠基因型引物对(hetF和hetR)，当其与载体特异性引物(本文中为Asc403)用于多元PCR时，允许野生型、杂合和纯合小鼠之间的区分；最后，靶筛选引物(target screening primer)(3P3A)，其在3’臂区末端上游退火，且当与载体3’末端特异性引物(neo36)配对时产生靶事件特异性1.2kb扩增引物(amplimer)。该扩增引物可仅来自出现所需基因组改变的细胞的模板DNA，并允许区分正确靶向的细胞与背景，所述背景为含有该载体随机整合的拷贝的克隆。靶向策略(targeting strategy)中的这些引物的位置和GPR54的基因座结构显示在SEQ ID NO10中。
musHarryP5′探针eFIIGTGTACCAGGTGAGGAGGCCATCAGAGGTGmusHarryP5′探针eRIITGTCATCCTGAGGCCCAATGGTTCTTCAGGmusHarry5′臂5’1 Age AAAACCGGTAAATGCTGTTAATCCTGCCAAGAGmusHarry5′臂3’Spe ATAACTAGTGTAGCGAAAAACAGGGGAACmusHarry3′臂5’末端AscIAAATTCGTCAACTACATCCAGCmusHarry3′臂3’2FseGGGAAGTGGGATAGACACGmusHarry 3P3A GGAAAAGCTAAGAACTAAGTGTGGmusHarry3′探针eF1 ATGAGTGTGGACCGCTGGTATGTGACmusHarry3′探针eR1 TCTGAGACTGAGTATGTGCCCTTGmusHarryP heft TCACTCGGACCCGGATGTACAGGTCAGmusHarryP hetR AGCCCGCGTACCTGCTGGATGTAGTTGAsc403 CAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGNeo36 CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGAC表1.GPR54引物序列同源臂的位置选择为通过缺失7个跨膜区的大部分5’来功能性破坏GPR54基因。制备靶向型载体，所述载体中缺失的GPR54序列用非同源序列取代，所述非同源序列由选择盒上游的内源基因表达报道物(不依赖框的lacZ基因)组成，所述选择盒由与GPR54基因方向一致的、启动的(promoted)新霉素磷酸转移酶(neo)基因组成。
一旦将5′和3′同源臂克隆入靶向型载体pTK4IBLMNL(见图5)，大的高纯度DNA制备物利用标准分子生物技术制备。20μg新鲜制备的无内毒素DNA用另一中稀有切割限制酶PmeI限制(restricted)，其存在于载体支架(backbone)中氨苄青霉素抗性基因和细菌复制起点之间的独特位点。线性化DNA被沉淀并重悬于100μl磷酸缓冲的盐水，为电穿孔做好准备。
电穿孔24小时后，转染的细胞在含200g/ml新霉素的培养基中培养9天。克隆被转移到96孔板、复制并扩增，然后通过PCR筛选(利用引物3P3A和neo36，如上所述)以鉴定克隆，所述克隆中在内源GPR54基因与靶向型构建体之间发生了同源重组。阳性克隆较少，为1-5％。扩展这些克隆到允许复制物(replica)被冷冻，并且可制备足够高质量的DNA用于利用如上述制备的外部5′和3′探针通过Southern印迹确定所述靶向事件，所有过程都利用标准技术(Russ等，Nature 2000 Mar 2；404(6773)95-92000)。当用诊断性限制酶消化的DNA的Southern印迹与外部探针杂交时，被同源靶向的(homologously targeted)ES细胞克隆通过突变带以及改变的野生型带的存在来证实。例如，利用5′探针，BglII消化的DNA产生9kb野生型带以及14.5kb靶向的带；HindIII消化的DNA产生15kb野生型带以及9.5kb靶向的带；XbaI消化的DNA产生15kb野生型带以及19.5kb靶向的带。类似，利用3′探针，BamHI的DNA产生7.5kb野生型带和4kb靶向的带；EcoRI的DNA产生7kb野生型带以及4.5kb靶向的带。
敲除前小鼠GPR54的基因组基因座的结构显示于图1。敲除后小鼠GPR54的基因组基因座的结构显示于图2。与Southern证实(verification)相关酶的位点已经表示出。
GPR54 GPCR缺陷小鼠的产生C57BL/6雌性和雄性小鼠进行交配，并在孕期(gestation)第3.5天分离胚泡。每个胚泡中注入来自所选克隆的10-12个细胞，并将7-8个胚泡植入假孕F1雌性小鼠的子宫。嵌合同窝幼鼠出生时含有数只高水平(达l00％)有花纹的雄性(agouti male)小鼠(花纹外皮颜色(agouti coat colour)提示靶向的克隆的细胞的作用)。这些雄性嵌合小鼠与雌性MF1和129小鼠交配，并通过有花纹外皮颜色与PCR基因分型(PCR genotyping)分别测定种系传递(germline transmission)。
PCR基因分型在溶解的尾碎片(clip)上，利用引物hetF和hetR，以及第三种载体特异性引物(Asc403)来进行。该多元PCR允许从野生型基因座(如存在)从引物hetF和hetR进行扩增产生217bp带。hetF的位点在敲除小鼠中缺失，使得所述扩增不能从靶向的等位基因开始(fail from a targetedallele)。然而，Asc403引物将与与3’臂区内的区退火的hetR引物一起从靶向的基因座扩增439bp的带。因此，该多元PCR显示同窝鼠的基因型如下野生型样品显示单217bp带；杂合DNA样品显示两条带217bp和439bp；纯合子样品仅显示靶特异性439bp带。
实施例2B)结果I)基因表达模式1)电Northern电Northern见图16。
PCR结果。给定组织的表达表示为(-)未检测到，(+)检测到低水平丰度，(++)检测到中等水平丰度，(+++)检测到高水平丰度。睾丸+，肌肉-，卵巢+，前列腺-，小肠+，肺++，肾+，白细胞+，肝-，脑+++，心+，脾+Est数据库搜索结果
2)被LacZ染色的结构lacZ实验中，以下结构含有LacZ表达的证据脑(以下区)，脊髓(感觉区)，睾丸。
LacZ表达见于脑的不同区域，诸如海马(最强的区)，视交叉上核(suprachiasmatic nucleus)，乳头体，脑桥和小脑，以及脊髓背侧(感觉)区。
观察和显微镜切片固定6只野生型和6只突变体GPR54敲除小鼠的脑经并在冷冻切片机(freezing microtome)切出40张显微镜切片。
在显微镜下观察切片显示LacZ染色在以下区域的定位海马嗅球(Olfactory bulbs)视交叉前(Preoptic)下丘脑脑室周(Periventricular)下丘脑缰核(Habenular nucleus)下丘脑束(Hypothalamic tract)蜗神经核(Cochlear nucleus)上乳头体(Supramamillary body)3)Lac Z表达图突变体脑切片见图4a；杂合子和野生型的睾丸见b。
II)解剖学观察Harry Potter敲除小鼠显示一些大体解剖异常突变体的生殖道总体明显畏萎缩(雄性包皮腺(preputial gland)萎缩，小阴茎(micropenis)，睾丸和储精囊/coagulatory腺非常小)，肌肉重量减少，棕色脂肪减少且胃和上颌下唾液腺较小。
雌性突变体乳腺发育不良，卵巢(图6)、子宫和输卵管萎缩。
雄性突变体的肛门生殖器距离(anogenital distance)短于野生型(以cm为单位突变体0.97±0.03野生型1.4±0.3，p＜0.001)，这导致饲养人员错误判断动物的性别。但在雌性中没有观察到差异。
子宫和卵巢(上图，野生型；下图，突变体)III)行为所有动物被圈养，其可自由获得食物和水，昼-夜循环为12小时昼/12小时夜，7am开始给光。
在小鼠8-10周龄时进行检测，除Barnes maze和性行为检测在下午15-17点进行以外，所有实验都在早上10-12点进行。
检测显示突变体和野生型之间有差异a)Barnes mazeBarnes maze为空间记忆(spatial memory)实验，其在白色圆形平台上进行，需要区分特定空间。其包含圆形平台，所述平台上有18个孔沿周长平均分布。一个孔下方有黑色逃跑盒子。Barnes maze实验利用啮齿类动物避免有光照的非封闭表面(brightly lit unenclosed surface)并寻找暗的封闭场所(darkened enclosed shelter)的天然倾向。
训练所述动物动物10天以上，记录进入所述逃跑盒子的等待期以及错误次数和搜索策略。
有趋势表明，雄性突变体的该实验表现较差(图7)。
b)交配行为5只雄性突变体和5只野生型同窝小鼠与野生型雌性动情期小鼠(通过阴道涂片评估)一同置于新笼中，并观察30分钟。所述小鼠都显示对雌性有兴趣(嗅(sniffing))并在观察期间进行交配。
突变体对雌性没有显示有兴趣，且在观察期间不进行交配。此外，数只雄性和雌性突变体小鼠同处一笼但没有怀孕，表明GPR54敲除小鼠是不育的。
c)动情期周期6只突变体雌性和6只野生型同窝小鼠在连续5天中接受涂片实验。还检验了3周大+/+雌性。利用甲基蓝染色所述载片。所有野生型显示明显的动情周期阶段，但突变体不显示。-/-雌性的阴道图片与3周大野生型小鼠相似(图8)。
d)生理建立15个交配对，其包含任意性别的GPR54突变与异性野生型小鼠，但从不产生同窝小鼠。因此，雄性和雌性GPR54突变体都不育。
1)重量a)器官重量测定睾丸(图9)，肌肉(图10)，肾上腺(图11a)和唾液腺(图11b)的重量。
2)实验a)睾酮，雌激素和GnRH测定测定6雄性突变体和6只野生型小鼠的睾酮。突变体的睾酮水平明显低于(P＜0.05)野生型小鼠(图12)。
雌性突变体的雌激素水平明显低于动情期正常雌性小鼠。这于前者缺乏动情期周期一致。在动情前期，动情期，动情后期，以及动情间期的野生型雌二醇水平显示正常的循环水平(图13)。
下丘脑中GnRH水平与野生型动物是可比的。这表明突变对于敲除小鼠的GnRH合成没有影响(未显示)。
b)LH/FSH实验突变体中FSH低得多(图14a为雌性的；图14b为雄性的)。LH水平没有差异(未显示)。
c)外源性促性腺激素.
给药1000iu PMS(怀孕母马血清-FSH-样促性腺激素)后两天给予1000iu bHCG(β人绒毛膜促性腺激素)，导致50％雌性突变体(n＝6)排出成熟卵，表明所述末端器官(end organ)保持对天然促性腺激素产生反应的能力。这与GPR54受体和配体在垂体下丘脑轴而非末端器官水平起作用的推定一致。
3)给药外源性GnRH以及对垂体FSH和LH分泌的影响方法将25ng GnRH肽分四次间隔30分注入，并在末次注射后30分钟处死动物以收集血液和垂体。所有小鼠在11am到1pm之间处死。
动物分组6WT仅注入PBS(对照)，6WT注入在PBS中制备的GnRH，6HP注入GnRH/PBS。所有WT动物被分期并在动情间期(LH和FSH峰末期)使用。所有小鼠均为2-4月龄。重复所述过程测定LH和FSH。
血清FSH实验注入GnRH的WT的血清FSH比仅注入PBS的那些增加1.9-倍。HP水平比仅注入PBS的WT增加1.7倍，这表明所述突变体动物保持至少对GnRH有部分反应。这表明GPR54的作用可由下丘脑中的GnRH释放控制。
血清LH实验注入GnRH的WT的血清LH比仅注入PBS的那些增加5-倍。HP水平比仅注入PBS的WT增加5倍。这表明LH的释放由外源性GnRH(图15a)刺激。
外源性刺激后测定垂体中LH水平的消耗。结果显示垂体LH水平相应消耗，表明突变体仍对自垂体释放的GnRH和LH有反应(图15b)。从突变体敲除基因没有任何有害影响。
上文所述所有公开出版物包含在本文作为参考。所述方法和系统的的各种修饰和改变对本领域技术人员而言显而易见，且不偏离本发明范围和精神。尽管本发明根据具体优选实施方案进行描述，应理解本发明权利要求不限于所述具体实施方案。实际上，实践本发明的所述模式的各种变化是化学、分子生物学以及生物技术或相关领域技术人员显而易见的，并意图包含在权利要求中。
权利要求
1.GPR54敲除哺乳动物，其含有一或多种细胞，所述细胞中的GPR54多肽是功能失活的。
2.权利要求1的GPR54敲除小鼠，其与野生型对照相比具有一或多个选自下组的特征接触翻正反射减少且Barnes maze表现降低，生殖激素水平和/或模式(包括周期)改变，生殖器官以及相关器官的形态改变，或性行为/生殖行为改变。
3.权利要求2的GPR54敲除小鼠，其具有选自下组的特征生殖激素水平和/或模式(包括周期)改变，生殖器官以及相关器官的形态改变，或性行为/生殖行为改变。
4.产生一或多种哺乳动物细胞的方法，所述细胞包含一或多种功能失活的GPR54基因，该方法包括以下步骤(a)选择一或多种细胞，所述细胞包含一或多种有功能活性的内源GPR54基因，(b)利用功能失活的GPR54核酸转染步骤(a)的一或多种细胞，所述功能失活的GPR54核酸可通过同源重组与一或多种内源GPR54基因进行重组，(c)选择一或多种细胞，所述细胞中的一或多种内源GPR54基因已经与功能失活的GPR54核酸发生了同源重组。
5.核酸构建体，其适宜使宿主细胞中的一或多种内源GPR54基因发生功能性失活，所述构建体包含(a)非-同源置换区(b)位于所述非-同源置换区上游的第一同源区(c)突变的GPR54基因，其在表达时不编码有功能活性的GPR54，(d)位于所述非-同源置换部分下游的第二同源区，所述第二同源区位于该非-同源置换区的下游，并具有与第二GPR54基因至少90％同一性的核苷酸序列。
6.组合物，所述组合物包含GPR54多肽、或GPR54多肽的一或多种结合蛋白、或编码它们的核酸，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
7.鉴定GPR54多肽的功能活性的一或多种拮抗剂的方法，其包括以下步骤(a)选择一或多种哺乳动物，所述哺乳动物包含有功能活性的GPR54多肽(b)用GPR54多肽的一或多种可能的拮抗剂治疗所述一或多种哺乳动物，(c)检测所述一或多种哺乳动物，以确定所述哺乳动物是否显示GPR54敲除小鼠的一或多种选自下组的性质异常的神经性质，或异常的生殖系统和/或形态，(d)选出显示步骤(c)的一或多种特征的一或多种拮抗剂。
8.权利要求7的方法，其中步骤(c)包括检测一或多种哺乳动物以确定所述哺乳动物是否显示异常的生殖系统和/或形态。
9.鉴定一或多种分子的方法，所述分子激动GPR54多肽的功能活性，所述方法包括以下步骤(a)选择一或多种哺乳动物，所述哺乳动物包含功能失活的GPR54多肽；(b)用一或多种可能的GPR54类似物治疗所述一或多种哺乳动物，所述类似物可激动GPR5活性的至少一个方面；(c)检测根据步骤(b)治疗的一或多种哺乳动物，以确定经过治疗的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种恢复的性质，和(d)选择所述一或多种GPR54-配体类似物，其使得根据步骤(a)选出的哺乳动物恢复野生型哺乳动物的一或多种性质。
10.鉴定一或多种分子的方法，所述分子拮抗GPR54多肽的功能活性，所述方法包括以下步骤(a)选择一或多种哺乳动物，所述哺乳动物包含有功能活性的GPR54多肽；(b)用一或多种可能的GPR54拮抗剂治疗所述一或多种哺乳动物，所述拮抗剂可拮抗GPR54活性的至少一个方面；(c)检测根据步骤(b)治疗的一或多种哺乳动物，以确定经过治疗的哺乳动物与根据步骤(a)选出的哺乳动物相比是否具有一或多种经过调节的性质。
11.转基因GPR54敲除哺乳动物在用于测定一或多种化合物的生物效应的实验中的用途。
12.诊断选自下组的疾病的方法阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症或肥胖，所述方法包括以下步骤(a)从待诊断的患者中选出细胞样品，(b)比较所述细胞样品与来自健康个体的一或多个对照样品中的GPR54多肽的表达水平和/或功能活性。
13.诊断选自下组的疾病的方法阿尔茨海默氏症，感觉神经元病和癫痫，生育力、性欲和青春期开始的调节，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，停经，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依赖性癌症或肥胖，所述方法包括以下步骤(a)从待诊断的患者中选出细胞样品，(b)检测来自所述细胞的核酸，并检测GPR54基因的一或多种多态性。
14.转基因动物，其至少部分细胞包含外源性核酸，所述外源性核酸编码一或多种选自下组的多肽GPR54多肽，GPR54多肽的一或多种激动剂、GPR54多肽的一或多种拮抗剂或者GPR54活性的一或多种调节物。
15.治疗患者的疾病的方法，所述疾病选自肌肉消耗性疾病、疼痛、炎症、激素依赖性癌症、泌乳、骨质疏松/骨硬化病、与停经相关的激素失衡或肥胖，所述方法包括用治疗有效量的一或多种选自下组的物质治疗所述患者GPR54多肽，GPR54多肽的一或多种激动剂、GPR54多肽的一或多种拮抗剂或者GPR54活性的一或多种调节物。
16.一或多种物质在制备用于预防或治疗患者疾病的药物中的用途，所述一或多种物质选自GPR54多肽，GPR54多肽的一或多种激动剂，GPR54多肽的一或多种拮抗剂或GPR54活性的一或多种调节物，所述疾病选自肌肉消耗性疾病，疼痛，炎症，激素依赖性癌症，泌乳，骨质疏松/骨硬化病，与停经相关的激素失衡或肥胖。
17.操纵患者的性激素轴的方法，包括用治疗有效量的一或多种选自下组的物质治疗所述患者GPR54多肽，GPR54多肽的一或多种激动剂、GPR54多肽的一或多种拮抗剂或者GPR54活性的一或多种调节物。
18.GPR54多肽、GPR54多肽的一或多种激动剂、GPR54多肽的一或多种拮抗剂或者GPR54活性的一或多种调节物在制备用于操纵哺乳动物的性激素轴的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及甘丙素样受体和/或其配体在操纵垂体激素轴和生殖系统中的用途。
文档编号C12N15/12GK1708585SQ200380101998
公开日2005年12月14日 申请日期2003年10月17日 优先权日2002年10月25日
发明者塞缪尔·阿帕里西奥, 威廉·科利奇, 约翰·狄克逊, 艾伦·亨德里克, 索菲·梅萨格, 罗斯玛丽·思雷舍, 德克·赞 申请人:帕拉迪姆医疗有限公司