用于检测和定量甲胎蛋白mRNA的基于等温扩增的试验的制作方法

专利名称：用于检测和定量甲胎蛋白mRNA的基于等温扩增的试验的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测和定量甲胎蛋白(AFP)mRNA的基于等温转录的试验。本发明也涉及用于扩增AFP mRNA的寡核苷酸。
背景技术：
尽管在医学研究领域已取得了很多成果，在美国，癌症仍是位于前列的死亡原因之一。在工业化国家，约五分之一的人将会死于癌症。肝细胞癌(HCC)是全球最常见的癌症之一。HCC病人长期存活的唯一希望是手术切除或肝移植。参见Wong等，″Circulating TumorCell mRNAs in Peripheral Blood From Hepatocellular Carcinoma PatientsUnder Radiotherapy，Surgical Resection or ChemotherapyA QuantitativeEvaluation(经放疗、手术切除术或化疗治疗的肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞mRNA定量评价)，″Cancer Letters，167183-191(2001)。然而，只有少数HCC病人用切除或移植来去除肿瘤而治愈，而对于多数病人来说，目前治疗仍令人不满意并且预后不良。而且，一半以上病人看起来经过成功的切除后又会复发。参见Wong等，参见上文，和Wong等，″Hematogenous Dissemination of Hepatocytes andTumor Cells After Surgical Resection of Hepatocellular CarcinomaAQuantitative Analysis(手术切除肝细胞癌后的肝细胞和肿瘤细胞的血源性扩散定量分析)，″Clinical Cancer Research，54021-4027(1999)。
甲胎蛋白是一种糖蛋白，通常在胚胎发生期间表达。主要表达于肝细胞，也表达于肠、胃、滋养层、肺和胰。随着肝发育和成熟，血清中AFP浓度降低。然而，AFP水平在一些疾病状态，特别是在HCC可升高。参见Jiang等，″Detection of Alphafetoprotein-expressingCells in the Blood of Patients with Hepatoma and Hepatitis(肝细胞癌和肝炎患者血中甲胎蛋白表达细胞的检测)，″British Journal of Cancer，75(6)928-933(1997)。因此，AFP血清水平升高已用作高特异性和高灵敏度的HCC诊断标记。参见Jiang等，参见上文。而且，近来发现循环血中AFP mRNA水平显著升高与HCC的复发或转移相关。参见Wong等，″Quantitative Comparison of Alpha-fetoprotein andAlbumin mRNA Levels in Hepatocellular Carcinoma/Adenoma，Non-tumor Liver and BloodImplications in Cancer Detection and Monitoring(定量比较肝细胞癌/腺瘤、非肿瘤肝和血中甲胎蛋白和白蛋白mRNA水平癌症检测和监测的意义)，″Cancer Letters，156141-149(2000)。
HCC症状开始后仅有几个月存活时间，因此建立HCC早期诊断技术至关重要。当HCC病人显示出AFP mRNA水平升高时，用于检测AFP mRNA存在和水平的示例性试验对诊断和治疗HCC确实很重要。
目前，市场上有很多检测甲胎蛋白的试验方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而，诸如ELISA之类的测定有一些问题。例如，使用ELISA，蛋白水平与HCC临床阶段不一定总是相关。分子生物学技术例如RT-PCR试验也得到了发展。但是，使用这些生物学技术必须使用热循环仪并要考虑DNA污染。
本发明提供远优于RT-PCR试验的基于等温核酸序列的扩增(NASBA)的应用。具体地说，NASBA是等温扩增过程，因此不需要热循环仪。而且，NASBA对RNA有特异性，因此不必考虑DNA污染。
另外，基于等温转录的扩增方法与RT-PCR或其它扩增方法相比，由于其基本上等温，所以几乎不需要实验人员操作。所述方法可用于纯化或半纯化的RNA提取物，或者用于原位扩增的细胞样品或组织样品。此外，如果样品含有DNA和RNA，使用RT-PCR则需要第一步用DNA酶处理，或者有必要用其它方法来区别扩增产物是源自mRNA还是源自DNA的PCR产物。RT-PCR前可用DNA酶处理(Bitsch等，J.Infect.Dis.167740-743(1993)；Meyer等，Mol.CellProbes，8261-271(1994))，但有时不能够完全去除污染的DNA(Bitsch等，参见上文)。
检测或定量AFP mRNA的等温扩增方法尚未见叙述。因此，本领域需要用等温扩增方法来检测AFP mRNA的存在并因此检测HCC及其转移和癌症复发。
发明概述本发明提供用于检测和定量AFP mRNA的基于等温转录的扩增试验。具体地说，本发明提供用于检测或定量样品中甲胎蛋白(AFP)mRNA的方法，所述方法包括下述步骤(a)取得可能含有AFP mRNA的样品；(b)用两种寡核苷酸引物对样品进行基于等温转录的扩增，第一引物包括选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列的至少10个连续核苷酸，第二引物包括选自SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列的至少10个连续核苷酸；和(c)对步骤(b)的扩增产物进行检测或定量，由此对所述扩增产物的检测或定量说明样品中AFP mRNA的存在或含量。
所用样品可以是各种机体组织或细胞，或是来自人体或其它动物的体外培养的细胞。许多情况下，样品是外周血或是从淋巴结获得的细胞。样品优选包括细胞而RNA优选是从步骤(b)之前的样品的细胞中提取的。
所述基于等温转录的扩增优选是基于核酸序列的扩增(NASBA)。而且，优选所述第一引物也包括与其5′端有效连接的RNA聚合酶启动子序列。所述RNA聚合酶启动子序列优选是SEQ ID NO1中所示的T7RNA聚合酶启动子。
本方法的步骤(c)优选是用包括SEQ ID NO8序列的标记的野生型探针来进行，由此野生型探针与扩增产物的杂交，说明样品中存在AFP mRNA。还优选在步骤(b)之前加入已知量的对照RNA Q，并用包括SEQ ID NO10序列的标记探针检测Q的扩增产物，由此通过比较Q探针信号和野生型探针信号来计算样品中AFP mRNA的含量。
或者，本方法的步骤(c)可用包括SEQ ID NO8序列的标记的野生型探针和SEQ ID NO9的捕捉探针来进行，由此野生型探针与扩增产物的杂交，说明样品中存在AFP mRNA。
本发明也提供以下序列标识号所示的寡核苷酸SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9和SEQ ID NO10。SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7是优选的寡核苷酸。
此外，本发明提供长约15-26个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括选自以下序列的至少10个连续核苷酸SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。所述寡核苷酸优选选自SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。所述寡核苷酸更优选选自SEQID NO2和SEQ ID NO3，并且所述寡核苷酸还包括与其5′端有效连接的RNA聚合酶启动子序列。所述RNA聚合酶启动子序列优选是SEQ ID NO1中所示的T7RNA聚合酶启动子。
此外，本发明提供一对用于检测或定量AFP mRNA的寡核苷酸。所述寡核苷酸对中第一寡核苷酸的长度约为15-26个核苷酸并包括选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列的至少10个连续核苷酸。所述第一寡核苷酸优选包括与其5’端有效连接的RNA聚合酶启动子序列，所述RNA聚合酶启动子序列优选是SEQ ID NO1中所示的T7RNA聚合酶启动子。所述寡核苷酸对中第二寡核苷酸的长度约为15-26个核苷酸并包括选自SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列的至少10个连续核苷酸。
本发明也提供用于检测或定量样品中mRNA的引物对。所述引物对包括选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的第一引物以及选自SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的第二引物。第一引物优选还包括与其5’端有效连接的RNA聚合酶启动子序列。所述RNA聚合酶启动子序列优选是SEQ ID NO1中所示的T7RNA聚合酶启动子。
此外，本发明提供用于检测或定量样品中AFP mRNA的试剂盒。所述试剂盒包括以上定义的引物对和至少一种选自SEQ ID NO8和SEQ ID NO10的探针。所述试剂盒优选也包括SEQ ID NO9捕捉探针。
本发明也提供用于检测或定量样品中AFP mRNA的另一试剂盒。所述试剂盒包括一对寡核苷酸。所述寡核苷酸对中第一寡核苷酸的长度约为15-26个核苷酸并包括选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列的至少10个连续核苷酸。所述寡核苷酸对中第二寡核苷酸的长度约为15-26个核苷酸并包括选自SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列的至少10个连续核苷酸。
样品中AFP mRNA的存在和水平可以通过本发明方法进行检测或定量。AFP mRNA的存在和水平与疾病进程相关，因而在HCC诊断和/或治疗上是有用的信息。
附图简述

图1显示野生型RNA和Q RNA，其中野生型探针与其相互专有的标靶杂交，Q探针与其相互专有的标靶杂交。
发明详述基于等温转录的试验是用来检测和定量AFP mRNA。基于等温转录的扩增系统中的扩增是通过三种酶(反转录酶、RNA酶H和RNA聚合酶)的协同活性和两种对靶序列有特异性的DNA寡核苷酸(在本文称为引物)而实现的。所述等温扩增法由RNA模板开始并且交替合成DNA和RNA。使用RNA模板、引物和反转录酶，产生了RNA/DNA杂交体。所述RNA被RNA酶H活性从杂交体降解。然后用另一引物通过反转录酶产生双链DNA，接着双链DNA用作模板，通过RNA聚合酶大量合成RNA。所述引物之一除具有与模板互补的序列外，还具有附加序列，所述附加序列是产生RNA聚合酶启动子和产生可被RNA聚合酶利用的转录起始位点所必需的。与或不与固定扩增产物的附加探针一道，通过与适当标记的寡核苷酸DNA探针杂交，可以容易地检测出单链RNA产物。检测到扩增产物说明样品中存在靶分子(RNA)，而检测到扩增产物的具体含量则说明样品中存在具体含量的靶分子。
任何基于等温转录的试验可以同本发明的引物和探针一起使用。本发明的基于等温转录的试验是在本领域普通技术人员可容易测定的条件下进行的。
本发明优选的扩增法是基于等温转录的扩增系统，称为NASBA。NASBA方法在美国专利第5,409,818号和第5,554,527号中公开，每个所述专利通过引用结合到本文中。NASBA包括用T7RNA聚合酶从包含T7启动子的模板转录多拷贝RNA。另外的NASBA试验也在美国专利第6,093,542号和第6,121,023号中公开，每个所述专利通过引用结合到本文中。
另一核酸扩增技术是所谓基于转录的扩增系统(TAS)。所述TAS方法已叙述于国际专利申请PCT公布号WO 88/10315，其通过引用结合到本文中。基于转录的扩增技术通常包括用两种寡核苷酸处理靶核酸，其中一种包含产生包括功能启动子的模板的启动子序列。多拷贝RNA转录于模板并可作为进一步扩增的基础。
另外的基于转录的扩增技术已叙述于欧洲专利申请第408295号(″EP 408295″)，其通过引用结合到本文中。EP 408295主要是关于基于双酶转录的扩增法。基于转录的扩增法，例如NASBA法已叙述于欧洲专利申请第329822号，其通过引用结合到本文中，通常与一系列寡核苷酸同时使用，其中之一具有被具DNA依赖性RNA聚合酶活性的酶例如T7聚合酶识别的启动子序列。基于转录的技术的一些修改技术是本领域已知的。这些修改包括例如阻断寡核苷酸(可具有启动子序列)的应用。这些寡核苷酸被阻断，以便从那里开始抑制延伸反应的进行(参见美国专利第5,554,516号，其通过引用结合到本文中)。一个或多个“启动子-引物”(具有启动子序列的寡核苷酸)可用于基于转录的扩增技术，任选结合一个或多个没有启动子序列的寡核苷酸使用。
本文所用的术语“寡核苷酸”是指包含两个或两个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。这样的寡核苷酸可用作引物和探针。
当然，根据本发明的寡核苷酸序列，也可制备寡核苷酸类似物。这样的类似物可构成可供选择的其它结构例如“PNA”(具肽样骨架而不是正常核酸的磷酸糖骨架的分子)等。很明显，代表本发明序列的这些可供选择的其它结构，同样是本发明的一部分。
本文所用的术语“引物”是指既不是天然存在的(例如作为限制性片段)也不是合成的寡核苷酸，在核苷酸和核酸聚合试剂例如DNA依赖性或RNA依赖性聚合酶存在下，置于合适的条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)下时，它可作为与核酸链(模板或靶序列)互补的引物延伸产物的合成起始位点。引物必须足够长以致在聚合试剂存在下可引发延伸产物的合成。典型的引物含有至少10个核苷酸长度、与靶序列基本互补或同源的序列，但优选稍长的引物。通常引物约含有15-26个核苷酸，但也可使用更长的引物，当所述引物含有附加序列例如特定聚合酶的启动子序列时尤其如此。
通常，一组引物由至少两个引物构成，一个“上游”引物(P2)和一个“下游”引物(P1)一起决定扩增物(用引物扩增的序列)。一种引物可理解为除含有可与靶序列杂交的序列外，还含有可提供启动子活性的序列。所述启动子序列与所述引物序列5’端有效连接。绝大多数时候，P1引物包括启动子序列。
术语“启动子序列”定义了一个可被RNA聚合酶特异性识别的核酸序列区，所述酶可与识别序列结合并可通过产生RNA转录物而启动转录过程。原则上，任何启动子序列都可使用，因为存在能够识别起始序列的已知和可利用的聚合酶。已知的和有用的启动子是那些可被某些噬菌体RNA聚合酶例如噬菌体T3、T7或SP6识别的启动子。如上所述，它们作为引物的功能例如延长反应的起始位点可被阻断，或者在一些基于转录的扩增反应实施方案中不存在。一个特别优选的启动子序列是T7RNA聚合酶启动子序列，其序列如下AATTCTAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO1)下述SEQ ID NO 4和5包含与T7启动子序列(见上述SEQ ID NO1)有效连接的特异性靶引物的序列。这使得所述序列在基于转录的扩增技术例如NASBA中尤其适合用作下游引物。
本发明一个优选的实施方案是根据本发明用作核酸扩增引物组的两个寡核苷酸的组合。在扩增反应中，其中一个寡核苷酸可用作“上游寡核苷酸”即上游引物，而第二个寡核苷酸可用作“下游寡核苷酸”即下游引物。
优选反转录酶活性由禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶提供，RNA聚合酶活性由T7RNA聚合酶提供。
与PCR等其它扩增法相比，基于等温转录的扩增方法的优点是其基本等温，几乎不需要实验人员操作。但是没有高温步骤的确给寻找合适的引物造成一定的困难(参见下文)。
本发明的扩增法可适用于包含核酸的样品提取物，或者适用于原位扩增的全细胞或组织。所述样品可以是各种体液，特别是来自人的血液、血浆和血清。所述样品也可以是人体组织样品，例如淋巴组织。
如果所述方法用于包含核酸的样品提取物，所述样品可以是总RNA提取物(例如Chomczynslci和Sacchi，Anal.Biochem.，162156(1987)中叙述的提取物，其通过引用结合到本文中)或″Boom″提取物(参见Boom等，J.Clin.Micro.，28495-503(1990)，其通过引用结合到本文中)。所述方法优选适用于“Boom提取物”。
扩增物可用与适当标记的寡核苷酸探针杂交来检测。所述标记可含有放射性部分、可检测酶部分或任何可产生可检测信号例如显色信号、荧光信号、化学发光信号或电化学发光(ECL)信号的其他部分。优选使用基于印迹的杂交分析和基于液相杂交的ECL分析，虽然也可以使用其它分析系统例如ELGA(酶联凝胶试验)和原位杂交。
在本发明的一个实施方案中，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后转移到尼龙膜上并与用标准方法在5’端以32P标记的探针杂交。产物接着用放射自显影显现。在本发明的第二个实施方案中，可以用ELGA检测扩增产物。本方法中，对扩增反应产物具有特异性的并且在其5’端与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的探针与扩增产物杂交。杂交产物接着进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。显色酶反应使得凝胶中的反应产物显现。本发明的第三个实施方案使用电化学发光法(或ECL)。此实施方案使用通过生物素-抗生物素蛋白相互作用而固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠表面的生物素化捕捉探针。所述系统也需要可与扩增产物独立区杂交的寡核苷酸检测探针。所述检测探针用钌标记，钌负责产生ECL信号。
本发明的定量方法可用一个或多个内标物来监测提取过程和扩增实验本身的效率。所述检测系统详述于Romano等，DNA Technology，1689-103(1996)和Van Gemen等，J.of Virol.Methods，49157-168(1994)，其中每个所述文献通过引用结合到本文中。内标物法描述于Van Gemen等，Reviews in Medical Virology，5205-211(1995)，其通过引用结合到本文中。
在本发明定量试验的一个优选实施方案中，将已知量的体外转录的Q RNA在RNA提取之前加入样品中，之后再进行与样品本身同样流程的提取和扩增。Q探针用来检测样品中的Q扩增产物，野生型探针用来检测样品中AFP mRNA的扩增产物。通过比较来自Q扩增产物与来自野生型扩增产物二者的信号量可测定样品中存在的AFP mRNA含量。
也可采用适合于原位形式的试验，其可用于组织病理学研究，特别是淋巴组织病理学研究。如果所述方法是在固定制剂上进行原位分析，所述方法如下进行。样品可以包括各种体液样品或组织样品。淋巴组织在原位分析中是优选组织。细胞进行固定并进行透化处理以优化细胞膜渗透性。固定液是本领域用于细胞或组织制备的标准固定液，例如丙酮和甲醇、乙醇、福尔马林、甲醛、多聚甲醛或Permafix.RTM，而透化处理是通过蛋白酶K或胃蛋白酶原等蛋白酶来完成。然后洗涤细胞，以除去所有可能抑制基于转录的反应的试剂。透化处理进行到所有必需扩增反应成分可进入细胞而靶和扩增产物仍留在细胞中为止。此外，也可加入甘油或DMSO等助溶剂来优化NASBA反应。
检测扩增产物可通过直接标记(用例如生物素或毛地黄毒苷-UTP)或者通过与标记探针原位杂交。直接标记法要求优化条件以在保持扩增产物的同时，除去未结合的标记。
在本发明一个特别优选的实施方案中，基于等温转录的扩增法与特定RNA提取技术(“Boom提取物”，Boom等，参见上文)和ECL检测(电化学发光)协同使用。所述系统的优点与能够提供序列水平数据的基于扩增的试验有关。尽管RT-PCR也有一些同样的优点(即高于ELISA的灵敏度，基因序列特异性)，但是对于RNA，NASBA的优点多过RT-PCR。这些包括等温扩增、反转录结合到扩增中、适用于更广泛的样本类型(通过Boom提取物)以及ECL检测的灵敏度和动态范围。
Boom提取物是DNA和RNA的纯化制剂。Boom法基于离液剂硫氰酸胍(GuSCN)的裂解和使核酸酶失活的性质以及核酸与硅胶颗粒或硅藻的结合性质。通过使用按大小分级的硅胶颗粒，包括共价闭合环状DNA、松弛环状DNA、线状双链DNA、单链DNA、tRNA、mRNA和rRNA在内的核酸，可在1小时内从样品中纯化并在原始反应容器中回收。
将少量样品移入含有固相核酸载体和含硫氰酸胍的裂解缓冲液的反应容器。细胞裂解发生，释出的核酸结合载体。载体-核酸复合物可用离心分离。几步洗涤后将复合物干燥。所述核酸在含水低盐缓冲液中洗脱到原始反应容器中并用于扩增反应。
在本发明的一个优选实施方案中，20μl扩增反应物包含40mMTris pH 8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM DTT、各1mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、各2mM的ATP、CTP和UTP、1.5mMGTP、0.5mM ITP、15％DMSO、各0.2μM的寡核苷酸P1和P2、1.5M山梨醇、2.1μg BSA、0.08单位RNA酶H、32单位T7RNA聚合酶和6.4单位AMV-RT。20μl扩增反应物包含5μl核酸提取物、10μl预混合液和5μl酶混合液。(酶混合物一定不要漩涡混合)。如果核酸样品减少(5μl)，则水体积相应增加，以保证核酸加入时总体积仍为15μl。
所述方法可如下操作1.混合预混合液。
2.将10μl预混合液加入到微量离心管(EPPENDORF管)中的5μl核酸中。
3.在65℃保温5分钟。
4.转移到41℃加热器，保温5分钟。
5.加入5μl酶混合液。
6.混合而不是漩涡混合。
7.在41℃保温5分钟。
8.如果管上端经冷却而冷凝，可离心。
9.在41℃保温90分钟。
10.将样品离心并保存于-20℃。
NASBA试验的发展面临的一个技术性难题是引物的选择。情况通常是选自序列数据并满足引物所有已知要求的引物实际上往往不起作用。此外，运用模型系统例如体外转录的RNA、有非常高的靶基因表达的病毒株或细胞系开发的引物，在一些情况下，当靶分子在临床样品背景中时这些引物却不起作用。这个问题的内在确切机理还不清楚，但认为是由NASBA反应的低温引起的，其使得靶分子的二级结构没有被完全熔解和/或致使引物与样品中背景核酸非特异性结合。将NASBA系统用于临床样品时非常重要的是，引物不被背景核酸吸附，而更适用于与靶分子特异性结合。这一问题由NASBA的低温无法解开模板RNA中二级结构而产生，使合适的引物退火甚至更为困难。因此，实际的引物只可借助于经验性研究和NASBA过程的基本性质(即低温)来开发而避免使用功能性引物组的精确预测。
在本发明方法中，引物和探针为AFP mRNA转录物而设计。引物和探针序列源自该基因的Genbank条目。(登记号NM_001134)。最初设计和合成了全部四种引物；有四种用于靶序列的引物组合(P1A和P2A(″AA″)；P1A和P2B(″AB″)；P1B和P2A(″BA″)以及P1B和P2B(″BB″))。引物和探针列于下表1。
表1甲胎蛋白寡核苷酸
*图位相当于起始密码子中碱基1如A。
**所有序列按5’→3’列出。
Pm表示T7RNA聚合酶启动子序列(SEQ ID NO1)，T7RNA聚合酶启动子序列在SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5中用斜体表示。Q探针中的斜体核苷酸表示与野生型探针有关的取代。
本发明在下面的实施例中有进一步详细描述，所述实施例是说明性的，而不是用来以任何方式限制本发明。本领域众所周知的标准技术或以下具体描述的技术可供利用。
实施例1NASBA-初步评价为AFP模板设计的两个P1引物和两个P2引物列于上表1。用Chomczynski和Sacchi的方法从肝细胞癌细胞系Hep 3B中提取RNA。所述引物的四种可能组合AA、AB、BA和BB与5ng总RNA一起用于标准NASBA反应。
扩增在含有以下组分的20μl反应物中实现5μl核酸提取物、10μl预混合液和5μl酶混合液。20μl扩增反应物包含40mM Tris pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM DTT、各1mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、各2mM的ATP、CTP和UTP、1.5mM GTP、0.5mMITP、15％DMSO、各0.2μM的寡核苷酸P1和P2、1.5M山梨醇、2.1μg BSA、0.08单位RNA酶H、32单位T7RNA聚合酶和6.4单位AMV-RT。
NASBA产物用ECL检测法以及捕捉探针和野生型(WT)检测探针进行检测。结果见下表2。
表2
初步分析说明所有这四种引物组合在NASBA扩增中都有功能，尽管引物对AA和AB比引物对BA和BB给出略高的ECL信号。
实施例2评价现有引物组合的下一步骤是评价灵敏度。可通过连续稀释从500pg到5fg的Hep 3B总RNA完成这一步。RNA用引物组AA、AB、BA或BB进行扩增，通过用ECL检测法以及捕捉探针和WT检测探针进行检测。结果见下表3。
表3
表3中的结果说明用在基于NASBA方法的各种AFP引物组合对检测AFP RNA是灵敏的。
实施例3接着测定AFP NASBA试验的灵敏度。稀释Hep 3B细胞并用Boom法进行提取(参见Boom等，参见上文)。提取物接着用引物组AA、AB或BB扩增，之后扩增产物通过ECL检测法用捕捉探针和WT检测探针检测。结果见下表4。
表4
表4中的结果说明引物组都对Hep 3B细胞的稀释显出相似的灵敏度。
实施例4接着测定AFP NASBA试验的特异性。体外转录的AFP WT RNA用作阳性对照，全血、正常人血浆和PBMC以及各种细胞系用作阴性对照。
分析两个结肠直肠腺癌细胞系HT-29和COLO 205以及乳腺癌细胞系MCF-7和前列腺癌细胞系LNCaP。所述细胞用Boom法提取，接着提取物用引物组AB扩增。扩增产物通过ECL检测法用捕捉探针和WT检测探针检测。结果见下表5。
表5
结果显示AFP NASBA试验对其目标靶具有特异性。具体地说，所得结果显示肠相关细胞系中为弱阳性。通常，从每个样品中减去两倍阴性试验(仅捕捉探针和WT探针)来建立阳性。HT-29和COLO205细胞系刚超过此阳性界点。
实施例5用于AFP RNA的定量试验如下进行。克隆AFP的cDNA，用来产生体外RNA，然后用紫外分光光度法对RNA拷贝数定量。克隆的AFP RNA接着通过体外诱变产生用于内标物和定量的Q型。WT或Q体外RNA接着进行稀释并用引物组AB或BB对其扩增。结果见下表6。
AFP的Q型可用与扩增AFP WT相同的引物组扩增，但是与AFPWT的差别在于其检测探针区中12个核苷酸的取代。因此，Q RNA不与WT 探针杂交，WT RNA不与Q探针杂交(数据未显示)。
表6
表6中的结果显示所述试验的灵敏度对WT RNA和Q RNA而言都是约50个拷贝。对WT和Q体外RNA in uniplex而言扩增效率相同是很重要的，在用于定量试验前两种RNA将置于同一个试管。
对于定量试验，将已知量的Q RNA加入样品中，然后与样品RNA一起进行提取和扩增。扩增后，产物用WT探针和Q探针独立地探测。根据所获得的Q信号与WT信号比值来计算WT RNA的含量。该信号比值通过用引物组AB扩增已知量的体外转录的WT RNA得到验证。结果见下表7。
表7
表7中的结果显示AFP RNA可用NASBA法定量。AFP定量NASBA试验也已适用于定量细胞内AFP RNA。Hep 3B细胞和猕猴肝细胞用作模板。将所述细胞稀释10倍，用Boom法提取并用引物组AB扩增(数据未显示)。
本申请实施例的结果表明，本发明的引物和探针可特异性检测低水平靶分子，甚至在临床样品背景中也是如此。此外，所述引物在Q探针和WT探针与其相互专有的标靶杂交时可扩增Q RNA(参见图1)。因此，本发明所用的引物为检测和定量AFP RNA提供了意想不到的好结果。
本文所用的出版物和其他资料用来说明本发明背景并提供关于本发明实践的补充细节，所述出版物和其他资料通过引用结合到本文中，其程度与每个独立出版物和其它资料单独通过引用结合到本文中一样。
因此，尽管已经描述了目前认为的本发明优选实施方案，但是本领域技术人员将会认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以实施其它和进一步实施方案，本发明的真正范围内将包括所有这样的进一步修改和变化。
序列表<110>Shurtliff，RoxanneLee，Eun Mi<120>用于检测和定量甲胎蛋白mRNA的基于等温扩增的试验<130>01036<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物P1A<400>2ggaagcattc aactgcattt tcagc25
<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P1B<400>3gcacatgcat gttgatttaa caagc25<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P1A+T7RNA聚合酶启动子<400>4aattctaata cgactcacta tagggggaag cattcaactg cattttcagc 50<210>5<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P1B+T7RNA聚合酶启动子<400>5aattctaata cgactcacta taggggcaca tgcatgttga tttaacaagc 50
<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P2A<400>6gatcccactt ttccaagttc cagaa25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物P2B<400>7tgtcacaagc tgtgaagcat atgaa25<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型探针<400>8tctttgggct gctcgctatg ac 22<210>9
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>捕捉探针<400>9agcaagaagg catcccttcc tg 22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Q探针<400>10tcttttctgg cgcgtgcatg ac 2权利要求
1.一种用于检测或定量样品中甲胎蛋白(AFP)mRNA的方法，所述方法包括(a)取得可能含有AFP mRNA的样品；(b)用两种寡核苷酸引物对样品进行基于等温转录的扩增，第一引物包括选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列的至少10个连续核苷酸，第二引物包括选自SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列的至少10个连续核苷酸；和(c)对步骤(b)的扩增产物进行检测或定量，由此对所述扩增产物的检测或定量说明样品中AFP mRNA的存在或含量。
2.权利要求1的方法，其中对所述扩增产物的检测利用包含SEQID NO8序列的标记的野生型探针，由此野生型探针与所述扩增产物的杂交，说明样品中存在AFP mRNA。
3.权利要求2的方法，所述方法还包括在步骤(b)之前加入已知量的对照RNA Q，然后用包含SEQ ID NO10序列的标记探针检测Q的扩增产物，由此通过比较Q探针信号和野生型探针信号来计算样品中AFP mRNA的含量。
4.权利要求2的方法，其中对所述扩增产物的检测还使用SEQ IDNO9的捕捉探针。
5.权利要求1的方法，其中所述样品包含细胞，并且在步骤(b)之前从所述样品的细胞中提取RNA。
6.权利要求1的方法，其中所述第一引物还包含与其5’端有效连接的RNA聚合酶启动子序列。
7.权利要求6的方法，其中所述RNA聚合酶启动子序列是SEQID NO1中所示的T7 RNA聚合酶启动子。
8.权利要求1的方法，其中所述基于等温转录的扩增是基于核酸序列的扩增(NASBA)。
9.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。
10.权利要求9的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
11.一种约15-26个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含选自以下序列的至少10个连续核苷酸SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。
12.权利要求11的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
13.权利要求11的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3，所述寡核苷酸还包含与其5’端有效连接的RNA聚合酶启动子序列。
14.权利要求13的寡核苷酸，其中所述RNA聚合酶启动子序列是SEQ ID NO1中所示的T7RNA聚合酶启动子。
15.一对用于检测或定量AFP mRNA的寡核苷酸，所述寡核苷酸对中第一寡核苷酸的长度约为15-26个核苷酸并包含选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列的至少10个连续核苷酸，所述寡核苷酸对中第二寡核苷酸的长度约为15-26个核苷酸并包含选自SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列的至少10个连续核苷酸。
16.权利要求15的寡核苷酸对，其中所述第一寡核苷酸还包含与其5’端有效连接的RNA聚合酶启动子序列。
17.权利要求16的寡核苷酸对，其中所述RNA聚合酶启动子序列是SEQ ID NO1中所示的T7 RNA聚合酶启动子。
18.用于检测或定量样品中AFP mRNA的引物对，所述引物对包含选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的第一引物以及选自SEQ IDNO6和SEQ ID NO7的第二引物。
19.权利要求18的引物对，其中所述第一引物还包含与其5’端有效连接的RNA聚合酶启动子序列。
20.一种用于检测或定量样品中AFP mRNA的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求18的引物对和至少一种选自SEQ ID NO8和SEQ IDNO10的探针。
21.权利要求20的试剂盒，所述试剂盒还包括SEQ ID NO9的捕捉探针。
22.一种用于检测或定量样品中AFP mRNA的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求15的一对寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及用于检测和定量甲胎蛋白(AFP)mRNA的基于等温转录的试验。本发明也涉及用于扩增AFP mRNA的寡核苷酸以及用于检测和定量扩增产物的探针。本发明也涉及通过分析外周血中AFPmRNA的存在检测肝细胞癌及其转移和肿瘤复发。
文档编号C12Q1/68GK1832955SQ200380101726
公开日2006年9月13日 申请日期2003年10月7日 优先权日2002年10月22日
发明者R·舒尔特利夫, E·M·李 申请人:拜奥梅留克斯公司