抗原递送系统的制作方法

专利名称：抗原递送系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原递送系统。具体地，本发明涉及可用于对动物进行接种来对抗疾病以及区分接种的和天然感染的动物的系统。
理解和选择性操作动物中的天然内在和获得性免疫系统对于保护农场和家养动物对抗疾病以及使其对疾病控制用抗生素介入的依赖性减少是有利的，由于后者增加了抗生素抗性的风险，这一话题在所有物种中的重要性都增加。
抗生素通常不加选择地用来保护农场和家养动物种类免受多种病原体侵袭。不适当的抗生素使用的这种文化由于病原体抗原就保护免疫力而言的效果差而出现。
因此，需要发展并改善我们对于病原体保护中宿主获得性免疫力的作用的理解非常迫切，例如基于对动物健康的关注以及消费者对具有低抗生素残留的高质量肉的要求的增加。
现在对于分子抗原的研究增加，目的在于通过它们在疫苗产物中的用途诱导动物种类中的保护。然而由于所述产品很少考虑到激发细胞免疫系统来保护动物防治疾病，所述产品在许多情况中的有效性有限。
疫苗作为疾病控制装置的一个限制是区分天然感染的动物和接种的动物有困难。例如，与最近的英国的口蹄疫(FMD)暴发这一主要事件相关的时，其中没有采用接种，部分原因是一旦本国牛群被接种，一些国家不会允许进口来自该牛群的家畜。目前的接种方法还降低的肉类的市场价值，因为屠宰后的畜体一旦感染就必需被处理，终止较长时间以杀死可能存在的任何病毒。对于FMD，重点在于保持清洁畜群，但几乎不可能保持清洁的畜群，这是因为传染的问题(例如自大鼠，獾等)。标记物疫苗，其含有对于被免疫动物而言异源的免疫原，已经被推荐作为区分天然感染的和接种的动物。
本发明推荐靶向树突细胞，利用选择性结合树突细胞的组成部分(moiety)，联合抗原诸如与动物疾病相关的抗原，以及不天然存在动物种类中的所述选择性靶向的组成部分，不仅提供了抗原递送(接种)的新概念，而且允许区分经接种的和天然感染的动物。
本发明的第一个方面提供了用于接种动物的化合物，包括(i)选择性结合动物中的树突细胞的组成部分，但所述组成部分并非天然存在于动物中，和(ii)抗原。
“选择性结合树突细胞的组成部分”意指任何适宜的组成部分，其结合树突细胞但基本不结合其它类型的抗原呈递细胞。组成部分是否如所述选择性结合可通过测定所述组成部分与树突细胞的结合与其它抗原呈递细胞例如利用荧光标记的结合组成部分的结合并进行比较，和测定与树突细胞结合的荧光和其它抗原呈递细胞来测定。可选，抗-组成部分抗体可用于确定所述组成部分结合的细胞以确定其对树突细胞的选择性。
树突细胞是高度有效的抗原呈递细胞并显示作为生理佐剂可有效激发预防性和治疗性免疫力。它们捕获进入外周粘膜组织的微生物然后迁移到次级淋巴器官，其中它们呈递这些抗原形式的微生物以使得T细胞静息由此启动获得性免疫反应。
选择性结合树突细胞的组成部分也可是任何适宜组成部分。具体地，已知树突细胞呈递表面抗原，通常是受体，其被选择性表达并用作树突细胞的靶。由此，方便地，所述组成部分结合其本身在树突细胞上选择性表达的受体。通常，在树突细胞上选择性表达的受体是这样的受体，其以超过其它抗原呈递细胞10倍的水平，优选100倍，或更优选1000倍的水平存在。
优选所述组成部分结合树突细胞上的模式识别受体。模式识别受体是结合与分子模式相关的病原体的受体。通常，模式识别受体是结合外源凝集素(lectin)的受体。适宜模式识别受体包括DC-SIGN，DEC-205(见，例如，Steinman et al(1997)Immunol.Rev.156，25-37)和TOLL-样受体(见，例如，Werling & Jungi(2003)Vet.Immunol.Immunopathol.91，1-12)。更优选，所述组成部分结合细胞特异性细胞间粘附分子3-抓握型(grabbing)非整联蛋白C-型外源凝集素，DC-SIGN，其在树突细胞上高表达。DC-SIGN有时也称CD209。
DC-SIGN是II型跨膜蛋白，其形成N末端细胞质结构域，跨膜结构域，颈区，串联重复区域，和在其C末端的C型(钙依赖性)甘露糖结合型外源凝集素结构域。人和鼠DC-SIGN通过存在真皮、粘膜组织诸如直肠、子宫和宫颈的固有层以及扁桃腺、淋巴结和脾的T细胞区中的树突细胞表达。人DC-SIGN具有404个氨基酸。
DC-SIGN已经在人，黑猩猩(chimp)，大猩猩(gorilla)，猕猴中发现，其中编码所述多肽的cDNA已经被克隆。DC-SIGN的cDNA和氨基酸序列见于以下GenBank登录号AF391086(猕猴(Macaca mulattoa))，AY078913(大猩猩(Pan troglodytes))，NM_021155(人)和NM_133238(小鼠(Mus))。

图1显示牛DC-SIGN的一种变体的cDNA序列。变体1牛DC-SIGN的推定的氨基酸序列，与黑猩猩，猕猴和人的DC-SIGN比对，显示于图3。图6显示牛DC-SIGN的第二种变体的部分cDNA序列。变体2牛DC-SIGN的推定的氨基酸序列与小鼠，人和变体1牛DC-SIGN的比对显示于图7。(见实施例7中关于cDNA克隆的详述)。
人，小鼠和牛(变体2)DC-SIGN的SMART蛋白结构域分析显示，所述蛋白质共享结构同源性，每种含有C型外源凝集素受体基序。人DC-SIGN中，推定的C-外源凝集素结构域位于残基256和378之间；小鼠中，推定的C-外源凝集素结构域位于残基108和229之间；牛(变体2)DC-SIGN中，推定的C-外源凝集素结构域位于残基129和248之间。
据信DC-SIGN在树突细胞表面选择性表达并且由于其在免疫系统中的作用据信在物种之间保守。由此，当通过图示中的计算机程序评估时，例如编码人和小鼠DC-SIGN的氨基酸序列的cDNA共享44％的序列相似性。
由此，DC-SIGN I包括任何这样的蛋白质，其cDNA编码与图2所示的人或小鼠核苷酸序列具有至少40％相似性的多肽序列。
此外，DC-SIGN分子通常是能够结合ICAM-3或ICAM家族的其它成员的分子，所述结合可通过例如Geijtenbeek et al(2002)J.Biol.Chem.277，11314-11320所述确定。
以下文献描述了DC-SIGN与HIV-1或ICAM-3之间的相互作用，并且均包含在本文作为参考Geijtenbeek et al(2002)J.Leukoc.Biol.71，921-931；Geijtenbeek et al(2002)J.Biol.Chem.277，11314-11320；Geijtenbeeket al(2000)Cell 100，575-585；和Kooyk & Geijtenbeek(2002)Immunol.Rev.186，47-56。
此外，本发明包括任何这样的蛋白质，其多肽由在严谨条件下与GenBank登录号AF391086，AY078913，NM 021155或NM 133238的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。
“严谨条件”指在6xSSC、60℃杂交至少1小时，并随后在2xSSC中、60℃洗涤30分钟。1xSSC是0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠。
本发明还涉及任何与人或小鼠DC-SIGN免疫交叉反应的蛋白。通常这可利用多克隆人或小鼠DC-SIGN抗血清评估。
优选所述选择性结合树突细胞的部分是蛋白质。
所述化合物通常用于动物接种。通常，选择性结合的组成部分是全部或部分对于动物而言外源或外来的分子。其可来自另一种动物，诸如人，并可以是在所述动物中具有免疫原性，并导致抗体反应。因此，可见不仅选择性结合的组成部分将抗原靶向树突细胞，其自身也将导致免疫(抗体)反应，其作为接种标记物。此外，选择性结合的组成部分也可在免疫系统中起刺激作用，通常通过引发Th1反应，由此起佐剂的作用。
各种部分已知结合DC-SIGN包括结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的LAM蛋白(见例如，Tailleux et al(2003)J.Exp.Med.197，1-5)，埃博拉病毒(Ebola virus)的糖蛋白，HIV-1包膜糖蛋白gp120(见例如，Geijtenbeek et al(2002)J.Biol.Chem.277，11314-11320)。优选所述结合组成部分能以高亲合力结合DC-SIGN。应理解这些分子仅有一部分需要有效结合树突细胞。所述部分包含在“结合树突细胞的组成部分”这一术语中。但优选，如果所有或基本上所有分子用作结合组成部分。
优选所述选择性结合树突细胞的组成部分是HIV-1包膜糖蛋白gp120。在天然存在的感染的条件下，DC-SIGN介导树突细胞进行的HIV自粘膜表面(暴露于HIV的位点)到二级淋巴器官(HIV感染位点)的转移。所述转移可发生数天，其间HIV被保护不被降解并保持其感染力。一种可能的机制是通过结合DC-SIGN时的HIV胞吞作用(endocytosis)，仅仅为了回到细胞表面在到达淋巴结的树突细胞之后并与T细胞作用。该内化假设通过两种有效的胞吞基序LL和YXXL在DC-SIGN的细胞质结构域中的存在支持。这些基序介导胞吞并在各种背景中循环。结合于DC-SIGN并在293T细胞中短暂表达的HIVE保持其感染力数天，但对胰蛋白酶处理敏感。这是表达DC-SIGN的293T细胞不能胞吞HIV-1的原因。但HIV-1内化可能是树突细胞中HIV-1保护的重要机制。
LL和YXXL基序在物种间保守，这是由于已经在小鼠中发现人DC-SIGN分子同系物含有这些基序。
由于HIV-1与表达在树突细胞上的DC-SIGN初次结合由其gp129包膜蛋白介导，并且由于HIV摄取，转运和传染到T细胞中DC-SIGN的重要性，连接gp120的抗原可用于直接高效靶向树突细胞，由此提供本发明所述新的接种方法的实例。
因此，利用HIV gp120蛋白的靶向DC-SIGN将(a)刺激宿主内在免疫反应，通过靶向最有效的抗原呈递细胞，由此有效限制疫苗应用数目，每种疫苗需要的量，以及消除抗生素残余物或抗性细菌菌株过长的恐惧；和(b)通过利用例如可购得的检测系统分析对HIV gp120分子(在接种的动物中不天然存在的蛋白)的抗体反应，使得区分接种的和天然感染的动物。
本发明具体也包括，用于接种动物的化合物，其包含(i)HIV gp120，结核分支杆菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其部分中的任意一种，和(ii)抗原。
优选，其部分可结合树突细胞，具体是DC-SIGN。通常其部分长度超过10个氨基酸，更通常长度超过15，20，25，30，40，50，60或70个氨基酸残基。
尽管分支杆菌LAM蛋白结合DC-SIGN由此可用于实施本发明，将理解一些活动范围自由的动物诸如牛，绵羊，马，鹿，等与分支杆菌接触并可被它们感染。因此，当动物是活动范围自由的动物时(或其它可被分支杆菌感染的动物)，优选分支杆菌LAM蛋白不用作结合树突细胞的组成部分，。
优选，所述化合物是结合树突细胞后被树突细胞胞吞的化合物。
“抗原”包括任何这样的组成部分，起可激发免疫反应(无论是体液或细胞介导的)，例如通过产生抗体和CD8介导的和NK细胞介导的反应。所述抗原可指单个分子或抗原分子的同源或异源群体。各种大分子可作为抗原，包括所有蛋白(如果存在正确的背景中)，包括核蛋白，脂蛋白，大多数多糖(具体是大的多糖)，以及各种小分子(通常称为半抗原)，条件是它们附着于蛋白质或多肽或其它载体。术语“半抗原”也包括多价抗原分子，其具有多个表位，或单价抗原分子，其具有仅仅一个表位。
在疫苗制备的背景中，抗原是分子或其部分或其变体，与疾病相关。具体地，在动物疫苗的背景中，所述抗原是分子，或其部分，与待接种的动物的疾病相关。抗原与涉及病原体的疾病相关，具体是感染性疾病，并且其具体优选所述抗原是病原体的组成部分的抗原或免疫原部分，诸如感染性微生物。
病原体包括与以下疾病相关的那些口蹄疫(foot and mouth disease)，猪疱疹病(swine vesicular disease)，peste des petits ruminants，皱皮病(lumpy skindisease)，蓝舌病(bluetongue)，非洲马病(African horse sickness)，经典猪霍乱(classical swine fever)，新城疫(Newcastle disease)，疱疹性口炎(vesicularstomatitis)，牛瘟(rinderpest)，传染性牛胸膜肺炎(contagious bovinepleuropneumonia)，立夫特山谷热(Rift Valley fever)，绵羊痘(sheep pox)和山羊痘(goat pox)，非洲猪瘟(African swine fever)和高致病性禽流感(highlypathogenic avian influenza)。这些是传染性疾病，其播散可能非常严重且迅速，而不考虑国界，导致非常严重的社会经济或公共健康后果，由此在动物和动物产品的国际贸易中非常重要，是A列OIE疾病(Office Internationaldes Epizooties；www.oie.int)。
病原体还包括与以下疾病相关的那些多物种疾病包括炭疽病(anthrax)，奥耶斯基氏病(Aujeszky’s disease)，棘球蚴病(echinococcosis)/包虫病(hydatidosis)，牛羊水心胸病(heartwater)，钩端螺旋性病(leptospirosis)，新世界螺旋虫(new world screwworm)(锥形蛆蝇(Cochliomyia hominivorax))，旧世界螺旋虫(old world screwworm)(Chrysomya bezziana)，类结核病(paratuberculosis)，Q热(Q fever)，狂犬病(rabies)，旋毛虫病(trichinellosis)；牛疾病包括牛边虫病(anaplasmosis)，牛巴贝虫病(bovine babesiosis)，牛布鲁氏杆菌病(bovine brucellosis)，牛包囊虫病(bovine cysticercosis)，牛生殖器弯曲菌病(bovine genital campylobacteriosis)，牛海绵样脑病(bovine spongiformencephalopathy)，牛结核(bovine tuberculosis)，潜蚤病(dermatophilosis)，地方性牛造白细胞组织增生(enzootic bovine leucosis)，出血性败血病(haemorrhagic septicaemia)，感染性牛鼻气管炎(infectious bovinerhinotracheitis)/感染性脓性外阴阴道炎(infectious pustular vulvovaginitis)，恶性卡它热(malignant catarrhal fever)，泰累尔梨浆虫病(theileriosis)，trichomonosis，锥虫病(trypanosomosis)(tsetse-borne)；绵羊和山羊疾病包括公羊和母羊布鲁氏杆菌病(caprine and ovine brucellosis)(排除(B.ovis))，羊关节炎/脑炎(caprine arthritis/encephalitis)，传染性无乳(contagious agalactia)，传染性羊胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia)，地方性母羊流产(enzootic abortion of ewes)(绵羊衣原体病(ovine chlamydiosis))，maedi-visna，Nairobi绵羊病，羊附睾炎(ovine epididymitis)(羊布(鲁)氏菌(Brucella ovis))，绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis)，沙门氏菌病(salmonellosis)(S.abortusovis)，羊瘙痒病(scrapie)；马疾病包括传染性马类性病(contagiousequine metritis)，马锥虫马类性病(dourine)，地方性淋巴血管炎(epizooticlymphangitis)，马脑脊膜炎(equine encephalomyelitis)(东方和西方)，马感染性贫血(equine infectious anaemia)，马流感(equine influenza)，马巴贝虫病(equine piroplasmosis)，马鼻肺炎(equine rhinopneumonitis)，马病毒性动脉炎(equine viral arteritis)，鼻疽病(glanders)，马疥疮(horse mange)，马痘(horsepox)，日本脑炎(Japanese encephalitis)，恶性贫血症(surra)(伊氏锥虫(Trypanosoma evansi))，委内瑞拉马脑脊髓炎(Venezuelan equineencephalomyelitis)；猪疾病包括猪萎缩性鼻炎(atrophic rhinitis of swine)，肠道病毒脑脊膜炎(enterovirus encephalomyelitis)，猪布鲁氏杆菌病(porcinebrucellosis)，猪包囊虫病(porcine cysticercosis)，猪生殖和呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome)，传染性胃肠炎(transmissiblegastroenteritis)；和兔类疾病包括粘液瘤变性(myxomatosis)，兔出血疾病(rabbit haemorrhagic disease)和土拉菌病(tularemia)。
这些是一些OIE的B列疾病；并且是被认为在国家内具有社会经济学和/或公共健康重要性有一些OIE的B列疾病；并且是传染性疾病，其被认为在国家中具有社会-经济学和/或公共健康重要性，并且在国际动物和动物产品贸易中有意义。
具体的病原体包括口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus)，FeLV(猫白血病病毒(feline leukaemia virus))，FIV(猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiency virus))，CDV(犬瘟热病毒(canine distemper virus))，细小病毒(Parvovirus)，冠状病毒(coronavirus)，牛呼吸道合胞病毒(bovinerespiratory syncytial virus)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus)。
但是，此外，与疾病相关但不一定与病原体相关的疾病包括例如癌症，其中肿瘤抗原与所述疾病相关。通常，肿瘤抗原是蛋白质，其在癌症中异常过表达，或其以异常的例如突变的形式在癌症中表达。
朊病毒或其部分是可用于实施本发明的抗原，并据信与病原体生物体相关。软病毒与海绵状脑病诸如牛海绵状脑病(BSE)和羊瘙痒病相关。
用于本发明背景中的疫苗抗原包括生物体的抗原或免疫原性成分，诸如病毒，细菌，真菌和寄生虫包括蠕虫(helminth)或所述成分的一部分，意图防止动物中的疾病或提供针对动物中疾病的保护。
适宜抗原包括，例如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白，牛白血病病毒gp51蛋白，和呼吸道合胞病毒(RSV)F或G蛋白。这些蛋白的氨基酸序列在病毒基因组中编码。病毒基因组的GenBank保藏号是NC_001781(人RSV)，NC_001989(牛RSV)，AF033818(牛白血病病毒)，AF091605(I型BVDV)和AF145967(II型BVDV)。
其它适宜的疾病相关抗原可通过本领域技术人员选择，且通常对于许多这种抗原而言，它们的氨基酸和cDNA序列可得自GenBank。
所述抗原通常是与疾病相关的多肽的全部或一部分，诸如病原体或肿瘤抗原的多肽部分。多肽的一部分可以是多肽的任何部分，其能激发免疫反应诸如抗体反应。已知具有至少5个氨基酸的肽可激发抗体反应，但是通常使用较大的抗原。因此，当抗原是多肽时，其可具有至少5个氨基酸，通常5-1000个氨基酸，诸如5-500，5-200，5-100，5-50，5-40，5-30，5-20，例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个氨基酸。
将理解本发明的化合物的抗原可以是与疾病相关的分子的变体，条件是其可激发针对疾病起保护作用的免疫反应。所述变体包括与所述疾病相关的天然抗原相比具有一或多个氨基酸取代，多至5％的取代的多肽。通常，所述取代是保守取代，其中例如“变体”指其中一或多个位置具有氨基酸插入，缺失或取代(保守或非保守的)的蛋白，条件是所述改变导致基本性质例如酶活性(活性种类和比活性)，热稳定性，具体pH范围内的活性(pH稳定性)没有明显改变。“明显”在本文意指本领域技术人员认为所述变体的性质可不同但对于原始蛋白而言并非不明显。
“保守取代”意指组合诸如Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。
所述变体利用蛋白工程和定点诱变的标准方法制备。
优选选择性结合树突细胞部分与抗原共价相连。当所述部分和抗原分别为多肽的情况下，所述两个部分可通过常规多肽交联方法之一连接在一起。例如，本发明的化合物的两个部分可通过常规多肽交联方法之一连接在一起，诸如O’Sullivan et al Anal.Biochem.(1979)100，100-108中所述。例如，第一部分可富含硫醇基团，第二部分与能与这些硫醇基团反应的双功能试剂反应，例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(hydroxysuccinimide ester)(NHIA)和N-琥珀酰亚胺基(succinimidyl)-3-(2-吡啶基二硫代(pyridyldithio))丙酸酯(SPDP)，异源双功能交联剂，其在偶联的物质之间掺入二硫桥。利用m-马来酰亚氨苯甲酰基(maleimidobenzoyl)-N-羟基琥珀酰亚胺酯获得的酰胺和硫醚键，通常在体内比二硫键更为稳定。
其它有用的交联剂包括S-乙酰基硫代乙醇酸(acetylthioglycolic acid)N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)，其为伯胺的硫醇化试剂，允许在温和条件下的巯基去保护(Julian et al(1983)Anal.Biochem.132，68)，二甲基suberimidate二氢氯化物(dimethylsuberimidate dihydrochloride)和N，N′-o-亚苯基马来酰亚胺(phenylenedimaleimide)。
可选，所述化合物可作为融合化合物(或融合多肽)通过重组DNA技术制备，由此一定长度的DNA包含编码所述结合树突细胞组成部分的多肽部分的各个区域，以及相互邻近或通过编码连接肽的区域分离的抗原，所述连接肽不破坏该化合物的所需性质。
本文所用融合多肽是含有结合融合于作为本发明化合物抗原的多肽的N末端或C末端的树突细胞的组成部分的多肽部分。获得所述融合多肽的简单方法是翻译多核苷酸序列即杂合基因的框内融合物。编码融合多肽的杂合基因被插入用于转化或转染宿主细胞的表达载体。转录和翻译控制区域通常存在于表达载体中。DNA随后在适宜宿主中表达以产生包含本发明第一方面的化合物。
将理解所述抗原包括两种或多种与动物的疾病相关的分子或所述分子的一部分或变体。
由此，本发明的化合物可用于针对一种以上的疾病进行接种。因此，例如所述化合物可包含来自一种疾病药剂(例如BVDV的E2多肽或其免疫原性部分)以及来自第二种疾病药剂的抗原(例如RSV的F蛋白或其免疫原性部分)在相同的多肽链中，作为结合树突细胞的部分。其它变异对于本领域技术人员而言是明显的。
本发明的第二方面包括编码本发明第一方面的融合化合物的核酸分子。
适宜的核酸分子可通过本领域技术人员利用本领域已知的方法轻易合成或构建，诸如克隆手册例如Sambrook，J.and Russell，D.(2001)“MolecularCloninga laboratory manual”3rded.Vol 1-3，Cold Spring Harbor LaboratoryPress所述。通常所述核酸是DNA，但其也可为RNA。下文中，如果使用DNA，除非上下文表明相反的意思，也包括RNA。
编码本发明第一方面化合物的抗原的DNA序列可通过搜索DNA序列数据库鉴定，诸如GenBank等。编码适宜抗原的DNA的实例在上文给出。一旦知道编码所选抗原的DNA序列，其可用于设计引物和/或特异性分离编码所述抗原的DNA或cDNA的引物，所述抗原例如来自与待抗击疾病相关的病原体。如果已知DNA序列，引物和探针可利用可购得的软件设计并通过自动化的合成来合成。通常，编码所述抗原的DNA序列可分离自由适宜来源产生的cDNA或DNA序列的文库，诸如所选病原体。筛选所述文库中的目的DNA序列，利用优选在高度严谨条件下与编码所选抗原的已知DNA序列互补的探针。与所述探针杂交的DNA序列可被亚克隆，并且该DNA序列编码的多肽可通过DNA序列分析和/或通过体外翻译、表达、和多肽检测等测定法证实。但通常编码抗原的适宜DNA序列可利用PCR和针对克隆区的5’和3’末端的适宜引物合成，如本领域已知的那样。
一旦编码所选抗原的DNA序列被分离，其可操作地连接于编码结合树突细胞的部分的DNA序列，例如选择性结合树突细胞的DC-SIGN的HIVgp120。编码所述抗原的DNA序列和结合树突细胞的组成部分的DNA序列均在同一读框内，可操作连接于转录和翻译控制区。转录和翻译控制区包括启动子，增强子，顺式调节元件，多聚腺苷酸序列，转录和翻译起始区域和转录终止序列。
所述DNA随后在适宜宿主中表达以产生作为本发明第一方面的化合物的多肽。因此，编码组成本发明的化合物的多肽的DNA可根据已知技术使用，根据本发明中的教导进行适宜的修饰，以构建表达载体，其用于转化适宜宿主细胞用于表达和制备本发明的多肽。
因此，编码构成本发明化合物的多肽的DNA可连接于多种其它DNA序列用于导入适宜的宿主。伴随DNA将有赖于宿主的性质，将DNA导入宿主的方式，以及是否需要附加体保持或整合。
通常，所述DNA以适当的方向和正确的表达读框被插入表达载体，诸如质粒。如果必要，DNA可连接于适宜的转录和翻译调节控制核苷酸序列，其由适宜的宿主识别，尽管所述控制序列通常在表达载体中可得。所述载体随后通过标准技术被导入宿主。通常并非所有宿主将被所述载体转化。因此，必需针对转化的宿主细胞进行选择。一种选择技术涉及将DNA序列以及任何必需的控制元件掺入表达载体，其编码宿主细胞中可选择的性质。可选，编码所述可选择性质的基因可在另一载体上，其可用于共转化所需宿主细胞。
已经被本发明的重组DNA转化的宿主细胞随后根据本发明的教导在本领域技术人员已知的适宜条件下培养足够的时间，以允许所述多肽的表达，其随后被回收。
许多表达系统是已知的，包括细菌(例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))，酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，丝状真菌(filamentous fungi)(例如曲霉(Aspergillus))，植物细胞，动物细胞和昆虫细胞。
载体包括原核复制子，诸如ColE1 ori，用于在原核细胞中增殖，甚至所述载体用于在其它非原核细胞类型中表达。所述载体还可包括适宜启动子，诸如能够指导基因在用其转化的细菌宿主细胞诸如大肠杆菌中的表达(转录和翻译)的原核启动子。通常所述载体是可稳定整合在宿主细胞中和/或高表达所述化合物的载体。适宜载体包括可得自Invitrogen的pcDNA 3.1(+/-His标记)。
“启动子”指DNA序列形成的表达控制元件，其允许与RNA聚合酶的结合以及转录的发生。与示例性宿主相容的启动子序列通常在质粒载体中提供，其含有方便的限制性位点用于插入本发明的DNA片段。
本发明的另一方面提供了用编码本发明第一方面的化合物的核酸转化的宿主细胞。
具体优选用于表达本发明化合物的宿主细胞包括COS和CHO细胞，其可使得蛋白质糖基化。可使用大肠杆菌细胞，在此情况下，存在所述化合物的终产物中的脂多糖组成部分本身可以是免疫刺激物。这在一些情况中可有益，但在其它情况中不是所需的，其可损害对免疫反应的测定。
在允许所述DNA聚合物表达的条件下培养宿主细胞可常规进行。所述产物可通过常规方法根据宿主细胞和表达产物的定位(细胞内或分泌入培养基或进入细胞周质)来回收。因此，如果所述宿主细胞是细菌，诸如大肠杆菌，其可例如通过物理、化学或酶促方法裂解，且蛋白产物可分离自产生的裂解物。如果所述宿主细胞是哺乳动物细胞，所述产物通常可分离自培养基或分离自细胞游离提取物。如果所述宿主细胞是酵母，诸如酿酒酵母或巴氏毕赤酵母，所述产物通常可分离自裂解的细胞或培养基，然后利用常规方法进一步纯化。表达系统的特异性可通过western印迹利用针对目的多肽的抗体来评估。
常规蛋白分离技术包括选择性沉淀吸收层析，和亲合层析，包括单克隆抗体亲和柱。
将理解本发明可轻易提供“盒式表达(cassette expression)”载体，其中产生含有编码结合树突细胞的部分的序列，诸如HIV-1 gp120，其可轻易融合于所选抗原的编码区，所述编码区被插入盒式表达载体的适宜位置。
因此，本发明的另一方面提供核酸分子，其包含(i)编码选择性结合树突细胞的组成部分的部分和(ii)用于插入编码抗原的多核苷酸的插入点，其中当所述多核苷酸被插入所述插入点时，所述核酸分子编码本发明第一方面的化合物的核酸分子。
通常，核酸分子采取表达载体的形式，其含有适宜转录和翻译控制信号以允许一旦抗原编码区被插入插入点就表达融合多肽。如本领域众所周知，“盒式表达”载体中的插入点允许插入适宜编码序列(在本发明中为编码抗原的序列)使得产生框内融合。通常，所述插入位点是核酸内的独特限制位点。
通常，所述载体可稳定整合入宿主细胞和/或产生所述化合物的高水平表达。其可方便地基于得自Invitrogen的pcDNA3.1(+/-His tag)载体。
由于所述抗原在其N末端或C末端融合于结合部分，插入位点可以在编码所述结合组成部分的5’或3’末端，转录和翻译信号的位置适宜，如本领域技术人员已知那样。
本发明第一方面的化合物可用于针对动物中疾病的免疫或治疗。由此，所述化合物可用于疫苗中。
本发明另一方面提供本发明第一方面的化合物在药物中的用途。通常所述化合物被包装并作为药物用于动物中。
本发明另一方面提供包含本发明第一方面的化合物的疫苗，其优选在本发明的疫苗配制剂中包含佐剂。所述佐剂是适宜的可得的诸如明矾和QuilA。
优选所述佐剂组合物诱导主要是Th1型的免疫反应。高水平Th1型细胞因子(例如，IFN-γ，TNFα，IL-2和IL-12)倾向于有利于诱导针对给药的抗原的细胞介导的免疫反应。优选，所述化合物可激发Th1和Th2反应。
本发明另一方面提供包含本发明第一方面的化合物以及可药用载体的药物组合物。
所述载体就与本发明的化合物相容而言必须是“可接受的”，并且随其受体无害。通常，所述载体可以是水和盐水，其无菌或无病原体。然而，可以使用其它可接受的载体。
通常，本发明的药物组合物或配制剂可用于胃肠外给药，更具体用于静脉内给药。所述组合物或配制剂可通过以下途径给药经肌内，皮下，皮内，鼻内，静脉内，口服和腹腔内。经肌内是最为优选的，因为其为兽医的最常用途径。
适于经胃肠外给药的配制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和使得配制剂与目的受体血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂。
本发明也提供针对疾病免疫动物的方法，包括给药动物本发明第一方面的化合物的步骤。
将理解给药的化合物基于以下因素选择(i)待免疫动物(使得适宜结合组成部分可被选择，其对于动物而言是异源的)和(ii)待针对其进行免疫的疾病(使得适宜抗原可被选择)。
因此，本发明具体优选的实施方案是针对疾病免疫动物的方法，包括给药动物包含以下物质的化合物(i)选择性结合所述动物中的树突细胞但不天然存在所述动物中的组成部分，和(ii)与所述疾病相关的抗原。
所述方法盒组合物可针对免疫和保护动物，优选有经济学重要性的动物，包括农场动物诸如母牛，绵羊，山羊，猪，马和兔，和家养动物，诸如猫和狗。根据使用的抗原的类型，利用这些抗原免疫动物可导致预防感染，缓解症状，死亡率降低和/或中和抗体的诱导。
因此，本发明也可提供对抗动物中的疾病的方法，包括给药动物本发明第一方面的化合物。
具体优选的实施方案是对抗动物中的方法，包括给药动物包含以下物质的化合物的步骤(i)选择性结合所述动物中的树突细胞但不天然存在所述动物中的组成部分和(ii)与所述疾病相关的抗原。
通常所述化合物作为免疫原性组合物给药。
可利用本发明的方法对其进行免疫或对抗的疾病包括BVDV，RSV和牛白血病病毒，适宜抗原可选自例如BVDV E2蛋白，RSV F和G蛋白和牛白血病病毒gp51。因此，本发明的化合物可用于预防或治疗。
通常待治疗的疾病是病原体引起的疾病。然而，肿瘤也可被治疗。
可利用本发明的方法治疗的肿瘤包括黑素瘤(见例如，Nestle，F.O.(2002)Clinical & Experimental Dermatology 27(7)，597-601)。通常，可能需要一种以上抗原以起效。这些可在同一化合物中组合用于免疫或在所述化合物中分离存在。通常，所述抗原可为突变的抗原(例如MAGE-1，MAGE-3和NY-ESO-1)，分化抗原(例如酪氨酸酶，gp100和MelanA/MART-1)或细胞表面神经节苷脂(例如GM2，GD2和GD3)，如上文Nestle(2002)所述。
术语“肿瘤”理解为指所有肿瘤细胞生长形式，包括肺、肝、血细胞、皮肤、胰腺、胃、结肠、前列腺、子宫、乳腺、淋巴腺和膀胱的肿瘤。实体肿瘤尤其适合。
本发明的其它方面提供本发明第一方面的化合物在制备用于对抗动物中的疾病的药物中的用途；和在制备用于免疫动物的疫苗中的用途。
具体优选的实施方案包括化合物在制备用于对抗动物中的疾病的药物中的用途，所述化合物包括(i)选择性结合动物中的树突细胞但不天然存在所述动物中的组成部分和(ii)与所述动物中的疾病相关的抗原；以及所述化合物在制备免疫动物的疫苗中的用途，所述疫苗包括(i)选择性结合动物中的树突细胞但不天然存在所述动物中的组成部分，和(ii)与所述动物中的疾病相关的抗原。
本发明具体包括化合物用于接种动物的用途，其中包括(i)选自HIVgp120，结核分支杆菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其部分之一的组成部分，和(ii)抗原在制备用于对抗与所述抗原相关疾病和用于制备针对与所述抗原相关的疾病免疫动物的疫苗中的用途。
利用本发明方面接种的动物可与由与本发明的化合物的抗原相关的疾病因素天然感染的动物区分，这是由于被接种的动物将具有针对结合树突细胞的组成部分的免疫反应，所述组成部分结合树突细胞而天然感染的动物不会。
因此，本发明的另一方面提供测定动物是否接受本发明第一方面的化合物的方法，所述方法包括测定所述动物是否对选择性结合树突细胞的组成部分有免疫反应。测定动物中是否存在对所述化合物中的抗原的免疫反应也是有用的。
通常，含有抗体的样品取自动物，并测定是否存在针对所述组成部分的抗体。针对所述抗原的抗体是否存在也可被确定。通常，所述样品是血液样品。通常所述血液样品获自动物的颈静脉或尾静脉。
本发明还提供包含多个部分的试剂盒，其可用于区分天然感染的动物以及给予了本发明第一方面的化合物的动物。
一种包含多个部分的试剂盒，包括(i)本发明第一方面的化合物和(ii)检测对存在选择性结合树突细胞的化合物中的组成部分的免疫反应的装置，和/或(iii)检测对所述化合物中的抗原的免疫反应的装置。
另一种包含多个部分的试剂盒，包括(i)用于检测对动物疾病抗原的免疫反应的装置和(ii)用于检测对选择性结合树突细胞的组成部分的免疫反应的装置。
优选实施方案中，所述结合组成部分是HIV-1 gp120，或其一部分。
通常免疫反应通过测定来自动物的样品是否含有适宜抗体(即所述抗原和/或结合部分的抗体)来检测。
因此，检测免疫反应的适宜装置包括利用ELISA检测抗体反应。用于检测gp120的抗体反应的ELISA装置可购得，例如购自AdvancedBioSciences Laboratories Ltd or ImmunoDiagnostics Inc。
本发明所有引用的文献的全文内容包含在此作为参考。说明书中的讨论部分或已经公开的文献的不应被认为是认同本发明是现有技术的一部分或是已知技术。
本发明还将参考以下图和实施例更详细描述。
图1显示编码牛DC-SIGN变体1的部分cDNA序列(SEQ ID No.1)。字母“n”表示四种天然存在核苷酸A，G，C或T之一。
图2显示利用自Scientific and Educational Software购得的SE中心序列分析包(Central sequence analysis package)(Align Plus and Clone Manager)，对编码黑猩猩、大猩猩(Pan)、人、猕猴和小鼠的DC-SIGN的cDNA序列的比对(分别为SEQ ID No.2-5)。
给出所述比对、参数和背景。短线表示没有核苷酸。
图3显示牛DC-SIGN变体1(SEQ ID No.6)的推定的部分氨基酸序列与黑猩猩，人和猕猴DC-SIGN的氨基酸序列(SEQ ID Nos.7-9)的比对。短线表示没有核苷酸。牛DC-SIGN氨基酸序列中的星号是没有分配的(unallocated)氨基酸。所述比对利用SE中心序列分析包进行。比对参数为相对于参比分子的整体蛋白比对；参数评分矩阵(scoring matrix)BLOSUM 62；参比分子推定的boDC-SIGN，区1-577；与比对4的序列数。推定的boDC-SIGN 192氨基酸；黑猩猩_DC-SIGN 404氨基酸；huDC_SIGN_CDS405氨基酸；猕猴(mulatto)_CDS 405氨基酸。
图4图示HIV gp120-FITC与牛DC的结合。细胞或者未经处理或在4℃或37℃用gp120-FITC保温60分钟并通过流式细胞术分析。
图5显示利用针对人DC-SIGN分子的多克隆抗体，人单核细胞衍生的巨噬细胞，人单核细胞衍生的树突细胞和牛单核细胞衍生的树突细胞的染色模式。
图6显示编码牛DC-SIGN，变体2的部分cDNA序列(SEQ ID No.10)。
图7显示人DC-SIGN，鼠DC-SIGN，和牛DC-SIGN的两种变体(分别为SEQ ID No.11-14)的氨基酸序列的CLUSTAL W(1.7)比对。短线指示没有匹配残基。
实施例实施例1gp120蛋白结合牛细胞DC-SIGN的能力已经通过流式细胞术显示HIV gp120-FITC蛋白(Cat No 1021-F和1001-F，Immuno Diagnostic Inc.，Woburn，USA)结合牛DC。在4℃保温HIVgp120-FITC 1小时诱导低水平的结合，但所述结合在37℃保温时增加(图4)。
此外，利用针对人DC-SIGN激发的兔抗人多克隆抗体(Dr.T.Geiitenbeck(Department of Molecular Cell Biology，Medical Faculty，Vrije UniversiteitAmsterdam馈赠)，通过激光扫描共聚焦显微术显示，对牛DC的染色(图5)程度低于人DC(图5)。
为评估HIV-1gp120蛋白结合牛细胞上的DC-SIGN能力，将编码所述蛋白的cDNA克隆入含有His-tag(即寡聚组氨酸标记)的表达载体。作为对照，使用已知不结合DC-SIGN的无关的His-标记的蛋白诸如FITC-标记的卵清蛋白(OVA)。DC摄取gp120-His后，制备DC培养物并将其分成4组细胞。第一(试验性)和第二(对照)组用gp120-His或无关的His-标记的蛋白脉冲2小时并洗涤。第三(阴性对照)组仅仅用生长培养基处理，第四组(摄取对照)用于证实DC吸收FITC-标记的抗原(本发明为OVA)的能力，作为DC摄取所述抗原的能力的功能对照。随后，所有细胞的组均用于通过共聚焦荧光显微术，利用FITC标记的抗His抗体，观察蛋白的细胞定位模式。最后，针对牛DC-SIGN分子激发的多克隆抗体显示g120-His摄取特异性，其经由DC-SIGN通过将DC与这些抗体预保温以阻断DC-SIGN实现。阻断DC-SIGN应减少gp120-His的摄取，但是任何其他分子或对照均不能。
此外或可选，为评估gp120蛋白结合牛细胞上的DC-SIGN的能力，编码所述蛋白的cDNA被克隆入含有His标记的表达载体利用RT-PCR以及直接克隆方法利用获自NIH AIDS试剂程序(reagent program)的构建体。产生的质粒用于转染COS-7细胞，表达的蛋白利用分子量截留旋转柱或His标记纯化柱从细胞上清和/或细胞裂解物浓缩。gp120-His的存在通过Western印迹利用抗His抗体评估。为评估牛DC对gp120-His的吸收，制备DC培养物并分成3组细胞。第一(试验)和第二(对照)组用gp120-His或源自用空质粒转染2小时并洗涤的COS-7细胞的上清脉冲。第三组(摄取对照，本发明为FITC-OVA)将用作功能对照以证实DC摄取抗原的能力(Werling，D et al(1999)J Leukoc Biol 6650-58)。随后，所述细胞组用于通过流式细胞术和共聚焦荧光显微术观察摄取的蛋白的量或鉴定蛋白的细胞定位。FITC-标记的抗-His抗体用于检测gp120-His。此外，用人DC-SIGN分子稳定转染的COS-7细胞用作阳性对照。
结果基于目前对于公开的DC-SIGN序列的相似性，预期gp120-His将结合并随后被牛DC-SIGN分子内化，这种结合/摄取将被多克隆抗体阻断，而对于所用对照没有影响。
讨论为区分结合的和内化的gp120-His，可测定细胞的gp120-His摄取量，细胞用EDTA-胰蛋白酶溶液处理以降解表面gp120-His，但不被内化。由此，细胞和细胞质提取物可用于通过western印迹分析gp120-His的存在，所述分析利用单克隆抗His-标记抗体或直接结合gp120蛋白。一旦成功摄取gp120-His，gp120与模型抗原(model-antigen)一起表达(即牛呼吸道合胞病毒包膜蛋白或牛病毒性腹泻病毒E2蛋白)，其可用于进一步的研究(为了简便，所述产物称为gp120-Ag)。
实施例2抗原脉冲的DC对Th1型免疫反应的增加的激发最近的数据强调通过模式识别受体诸如Toll样受体(TLR)或DC-SIGN的抗原摄取，极强地增强了Th1-型免疫反应，IFNα和IL-12通过抗原脉冲的DC释放。这些细胞因子的释放有利于发展细胞介导的免疫力。
一种已知结合TLR的抗原是呼吸道合胞病毒F蛋白(RSV)，其导致诱导IL-12(Haeberle，HA et al(2002)J Infect Dis 1861199-1206；Haynes，LM et al(2001)J Virol 7510730-10737；和Kurt-Jones，EA et al(2000)Nat Immunol 1398-401)。由于RSV是多种物种包括牛和人的新生儿下呼吸道感染的主要原因，RSV F蛋白将用于这些实验中作为模型抗原。
含有HIV gp120(在实施例1中产生)，RSV F蛋白(Dr Geraldine Taylor，Institute for Animal Health，Compton馈赠)，gp120/F蛋白的融合蛋白(实施例1中生成)的His标记的表达载体用于感染COS-7细胞。72小时后，His-标记的蛋白利用镍-琼脂糖收获自细胞上清以及裂解的细胞，它们的存在通过western印迹利用抗His抗体分析。
为证实gp120-His，F-蛋白-His或gp120-Ag对牛DC的影响细胞与不同剂量的纯化的蛋白保温2小时。此后，利用ELISA-系统，收集上清并分析IFNα，IL-10和IL-12的存在(Werling，D et al(2004)Immunology 11141-52)。
结果预期暴露于gp120-His或gp120-Ag的DC释放的IFNα和IL-12的量应超过暴露相同时间和相同量的gp120-His的外周血淋巴细胞或巨噬细胞产生的量。此外预期单独的gp120-His将导致产生IL-10，F-蛋白-His将导致主要产生IL-12，gp120-Ag将导致IL-12的非常强的释放。
实施例3通过DC刺激初始T细胞与抗原呈递细胞诸如巨噬细胞和B细胞相反(APC)，DC具有独特的刺激初始T细胞和刺激强得多的记忆T细胞反应的能力(Werling et al(1999)；Werling，D et al(2002)J Leukoc Biol 72297-304)。为评估Tgp120-Ag脉冲的DC的刺激能力，以及它们是否能刺激初始以及记忆T细胞，产生不同的APC亚组(Werling et al(2002)并与gp120-Ag保温不同时间(0-6h)。该时间以后，DC通过暴露于丝裂霉素D灭活，并以各种量比加入来自相同供体的经分选的CD4+T细胞。培养5天后，通过液闪技术，利用beta计数仪，gp120-Ag脉冲的DC，巨噬细胞和B细胞的刺激能力通过测定[3H]-标记的胸腺嘧啶在增殖T细胞的DNA中的掺入来测定。
类似的试验利用APC和T细胞进行，产生自BRSV免疫的牛，由此评估APC亚组刺激记忆T细胞反应的性质(经免疫的动物由Dr Geraldine Taylor，Institute for Animal Health，Compton提供)。
结果预期强T细胞增殖仅仅在存在DC是观察到，而不见于巨噬细胞或B细胞(其显示低10倍的反应)。
也预期当与来自BRSV免疫的动物的T细胞共培养时，仅仅用gp120-Ag脉冲的DC将刺激初始T细胞的增殖并且其诱导的增殖反应强于其它APC诱导的10倍。
实施例4DC-SIGN胞吞作为HIV-1结合的结果在人系统中，DC-SIGN的胞吞作为HIV-1结合的结果降低DC表面上的DC-SIGN分子数。特异性单克隆抗DC-SIGN抗体在小鼠中通过标准方法激发或克隆抗DC-SIGN抗体在兔中通过标准方法激发，并检测它们是否影响gp120-Ag或gp120-His与DC-SIGN的结合。非干扰型抗体和荧光标记的第二抗小鼠抗体用于定量DC表面的DC-SIGN表达(用gp120-Ag培养基或空质粒转染的COS-7细胞上清脉冲，作为阴性对照)，其利用荧光活化的细胞分选(FACS)进行。所述测定在类似的DC组上在用gp120-Ag或gp120-His脉冲2小时以后重复(实验组)。足量的gp120-Ag应用于增加DC-SIGN结合以及内化的可能性。
结果如果试验组中表面DC-SIGN的量类似于对照组的，预期很可能不出现明显的DC-SIGN胞吞，由此支持DC-SIGN结合抗原被保护而不被降解并且不被加工的理论。如果表面DC-SIGN表达在gp120-Ag结合时降低，DC-SIGN很可能被DC胞吞，由此将被随后递送到细胞内的胞吞隔室，其允许加工蛋白用于随后经由MHC II类(和MHC I类)分子呈递给T细胞。这将导致T细胞的随后的增殖反应。
需要胞吞出现以使得免疫反应出现。
阻断DC-SIGN应减少gp120-His而非其它分子的摄取。
可能有用的对照组包括无表面DC-SIGN的DC，例如作为简单胰蛋白酶处理的结果，以及可导致DC-SIGN胞吞的试剂(阳性对照)。
实施例5gp120-Ag免疫在动物中的影响为证实gp120-Ag免疫在动物中的影响，用不同剂量的gp120-Ag免疫牛，并且对抗原诸如F蛋白或gp120的免疫反应的出现利用可用于具体Ag的ELISA系统分析。适宜用于gp120和RSV-F蛋白的ELISA系统可购得。四个组的动物用单独的载体溶液，纯化的gp120-His，纯化的F-蛋白-His，或gp120-Ag。免疫前后每周取血样，测定血清样品中的抗体滴度。
结果预期用gp120-Ag免疫的动物将出现对gp120以及目的Ag诸如F蛋白的抗体。为了估计Ag特异性抗体和gp120特异性抗体之间的关系，用gp120-His免疫的动物的抗体滴度将作为对照，由此确定数据以证实gp120-Ag被摄取和呈递的效率。
通常，gp120-Ag免疫的动物中抗gp120抗体的滴度可用作成功免疫单个动物的直接指示物，并也将允许区分免疫的相对于天然感染的动物。
实施例6用抗原攻击成功免疫的动物对动物成功进行免疫之后，相同的动物组利用抗原攻击，诸如RSV F蛋白(或完整RSV)，并监测临床症状的进展。
结果由于F蛋白是RSV的一种主要抗原，预期经免疫的动物应具有对抗随后攻击的保护并且不应出现任何临床症状，而给予gp120-His或载体溶液的动物应如此。
实施例7获得牛DC-SIGN cDNA序列牛树突细胞根据Werling et al(2002)J.Leukoc.Biol.72，297-304所述方法分离，并分离mRNA。来自Becton Dickinson(Cat.No.K1811-1)的SMARTTMRACE cDNA扩增试剂盒用于扩增，所用引物为TAGCTGACTCCTTGTCCDC-SIGNGTG。对扩增的cDNA(称为变体1)进行测定，核苷酸序列显示于图1。
利用简并引物，基于鼠和人DC-SIGN分子(GenBank登录号分别为AF373408和NM_021155)之间的同源性获得另一部分牛DC-SIGN cDNA序列，称为变体2。牛DC-SIGN变体2的部分cDNA序列显示于图6。
变体牛DC-SIGN cDNA序列均编码C型外源凝集素受体，并且与相应的鼠和人序列在碱基配对和/或氨基酸序列方面共享达89％的同源性(图7)。
图7显示人DC-SIGN(NM_021155_DC-SIGN)，鼠DC-SIGN(muDC-SIGN_DC-SIGN)，和牛DC-SIGN(boDC-SIGN变体1/2_DC-SIGN)的两种变体的氨基酸序列的Clustal W比对。短线表示没有配对残基。
权利要求
1.动物接种用化合物，包含(i)选择性结合动物中的树突细胞但不天然存在于该动物中的组成部分，和(ii)抗原。
2.权利要求1的化合物，其中所述组成部分选择性结合树突细胞上的模式识别受体。
3.权利要求的化合物2，其中所述模式识别受体是DC-SIGN。
4.权利要求1或2的化合物，其中所述选择性结合的组成部分是蛋白质。
5.权利要求4的化合物，其中所述选择性结合的组成部分是以下物质之一HIV gp120，结核分支杆菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其部分。
6.动物接种用化合物，包含(i)选自HIV gp120，结核分支杆菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白，或其一部分的组成部分，和(ii)抗原。
7.前述权利要求之一的化合物，其中所述抗原是多肽。
8.前述权利要求之一的化合物，其中所述抗原是与动物疾病相关的分子或所述分子的一部分或变体。
9.前述权利要求之一的化合物，其中所述抗原包括与动物疾病相关的两种或多种分子或所述分子的一部分或变体。
10.权利要求8或9的化合物，其中所述抗原是病原体或肿瘤的抗原成分或所述成分的抗原部分或变体。
11.权利要求10的化合物，其中所述病原体是细菌、病毒、真菌、原生动物或寄生虫之一。
12.权利要求的化合物11，其中所述抗原是选自与OIE列表A疾病相关的病原体的病原的抗原成分，或所述成分的一部分或变体。
13.前述权利要求之一的化合物，其中所述组成部分和抗原共价连接。
14.前述权利要求之一的化合物，其中所述选择性结合的组成部分以及抗原各自包含多肽并且均存在于相同的多肽链中。
15.核酸分子，其编码权利要求14的化合物。
16.表达载体，其包含权利要求15的核酸分子。
17.宿主细胞，其包含权利要求15的核酸分子或权利要求16的表达载体。
18.疫苗，其包含权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸分子。
19.权利要求18的疫苗，还包含佐剂。
20.权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸分子作为药物的用途。
21.药物组合物，其包含权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸分子以及可药用的载体。
22.针对疾病免疫动物的方法，包括给药动物权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸分子的步骤。
23.对抗动物中的疾病的方法，包括给药动物权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸分子的步骤。
24.权利要求22或23的方法，其中所述疾病是病原体引起的疾病。
25.权利要求24的方法，其中所述病原体是细菌、病毒、真菌、原生动物或蠕虫之一。
26.权利要求25的方法，其中所述病原体是与OIE列表A疾病相关的病原体。
27.权利要求22或23的方法，其中所述动物是哺乳动物。
28.权利要求22-27之一的方法，其中所述动物是家养动物或农场动物。
29.权利要求27或28的方法，其中所述动物是母牛，绵羊，马，猪，山羊，狗，猫或兔。
30.权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸在制备用于对抗动物中的疾病的药物中的用途。
31.权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸在制备用于免疫动物中的疫苗中的用途。
32.权利要求30或31的用途，其中所述疾病是病原体引起的疾病。
33.权利要求32的用途，其中所述病原体是细菌、病毒、真菌、原生动物或蠕虫之一。
34.权利要求33的用途，其中所述病原体是与OIE列表A疾病相关的病原体。
35.权利要求30或31的用途，其中所述动物是哺乳动物。
36.权利要求30或31的用途，其中所述动物是家养动物或农场动物。
37.权利要求35或36的用途，其中所述动物是母牛，绵羊，马，猪，山羊，狗，猫或兔。
38.制备权利要求1或6的化合物的方法，包括连接所述组成部分和所述抗原。
39.制备权利要求14的化合物的方法，所述化合物中包含多肽，所述方法包括(i)培养表达所述多肽的权利要求17的宿主细胞，和(ii)分离所述多肽。
40.制备权利要求15的核酸分子的方法，包括将编码选择性结合树突细胞的组成部分的核酸分子与编码抗原的核酸分子相连。
41.核酸分子，包括(i)编码选择性结合树突细胞的组成部分的部分和(ii)用于插入编码抗原的多核苷酸的插入点，其中所述多核苷酸被插入所述插入点，所述核酸分子编码权利要求14的化合物。
42.权利要求41的核酸分子，其中所述核酸编码选择性结合树突细胞上的模式识别受体的组成部分。
43.权利要求42的核酸分子，其中所述识别受体是DC-SIGN。
44.权利要求41或42的核酸分子，其中所述选择性结合的组成部分是HIV gp120，结核分支杆菌的LAM蛋白或埃博拉病毒的糖蛋白之一。
45.检测是否已经给药动物权利要求1的化合物的方法，所述方法包括测定动物对于所述选择性结合树突细胞的组成部分是否有免疫反应。
46.权利要求45的方法，包括测定所述动物是否具有对存在于所述化合物中的抗原的免疫反应的其它步骤。
47.包含多个部分的试剂盒，包括(i)权利要求1-14之一的化合物或权利要求15的核酸分子，和(ii)检测对存在于所述选择性结合树突细胞的化合物中的组成部分的免疫反应的装置，和/或(iii)检测对所述化合物中存在的抗原的免疫反应的装置。
48.权利要求47的试剂盒，其中如果存在，部分(ii)包括所有或部分结合针对该组成部分激发的抗体的所述组成部分，且部分(iii)包括所有或部分结合针对该抗原激发的抗体的所述抗原。
49.包含多个部分的试剂盒，包括(i)用于检测对动物疾病抗原的免疫反应的装置和(ii)用于检测对选择性结合树突细胞的组成部分的免疫反应的装置。
50.权利要求47-49之一的试剂盒，其中用于检测免疫反应的装置是ELISA装置。
51.免疫动物的新方法，其中利用该方法免疫的动物可与本文所述天然感染的动物区分。
全文摘要
动物接种用化合物，包含(i)选择性结合动物中的树突细胞但不天然存在该动物中的组成部分和(ii)抗原。通常，所述选择性结合的组成部分与DC－SIGN结合。该组成部分可为HIV－1 gp120。本发明的化合物可用于接种动物，接种后，它们可与天然感染的动物区分开。
文档编号C12N15/62GK1867356SQ200480029135
公开日2006年11月22日 申请日期2004年8月5日 优先权日2003年8月5日
发明者德克·韦林 申请人:皇家兽医学院