专利名称：能可逆性增殖的表达胰岛素的人胰岛细胞株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及能可逆性增殖的表达胰岛素的人胰岛细胞株。本发明还涉及用于糖尿病的治疗剂和胰岛素的制造方法。
背景技术：
根据胰岛素活性降低的原因，可以将糖尿病分为1型糖尿病(青少年糖尿病)和2型糖尿病两大类。
1型糖尿病是由于自身免疫异常导致产生胰岛素的胰腺β细胞特异性受损而发生的(参照Atkinson MA，Maclaren NK.，N.Engl.J.Med.3311428-1436，1994)。胰腺β细胞的再生替代疗法之一的移植被认为是从根本上的治疗。作为这种方法有胰腺移植和胰岛移植。这两种移植的目的在于可以非常严格地调节血糖，避免发生低血糖，进而避免发生长期并发症。其目的不仅仅在于使患者从胰岛素疗法所产生的日常烦恼中解脱出来从而提高生活质量(QOL)。作为以治疗胰岛素依赖性糖尿病为最终目标的方法，移植疗法是一种在将来比胰岛素疗法更具潜力的治疗方法。但是，胰腺移植中存在着手术侵袭大，而且因伴随移植的外分泌腺产生的并发症而成为重症等问题。与之相反，可以说目的在于去除导致伴随移植操作的并发症的外分泌腺，仅仅分离、移植胰腺β细胞的胰岛移植是现在通过最接近生理的方法能够有望恢复到糖尿病发病以前的状态的治疗方法。而且，即使在胰岛素的分泌保持在一定程度的2型糖尿病中，也会随着疾病阶段的发展由于糖毒性和β细胞的衰竭引起胰岛素的不足，但是由于可用于移植的胰岛不足这一严峻的现实，2型糖尿病现在不适于胰岛移植。将来，在能够供给丰富的移植胰岛时，很有可能将胰岛移植用于呈胰岛素耐受性的胰岛素依赖型糖尿病。
据报道称，就2000年加拿大埃德蒙顿的Alberta大学提供的7个临床胰岛移植病例，通过后来称之为“埃德蒙顿方案”的免疫抑制剂的全新使用方法，所有接受胰岛移植的1型糖尿病病例可以摆脱胰岛素(参照Shapiro AM，Lakey JR，Ryan EA，等人，N.Engl.J.Med.343230-238，2000)。可以认为对于胰岛素依赖型糖尿病患者而言，胰岛移植是现在最理想的治疗方法。
胰岛是胰腺的内分泌腺组织，其体积不超过胰腺总体积的2％。胰岛是内分泌细胞的细胞群，其由α细胞、β细胞、PP细胞、δ细胞等构成。具有降低血糖作用的唯一的内源性激素胰岛素是由胰岛的β细胞分泌的。β细胞占构成胰岛的所有细胞的80-85％，不仅分泌胰岛素，而且可以感知血中的糖分。这种目的在于通过从胰腺中分离胰岛，移植到胰岛素依赖型糖尿病患者中以替代和再生业已衰竭的血糖降低系统的方法就是胰岛移植。
但是，现行的胰岛移植中，存在由于使用免疫抑制剂产生的安全性问题，而且存在所谓移植胰岛不足的大问题。所谓移植胰岛不足的问题是，无论怎样提高现在的胰岛分离技术，胰腺移植/胰岛分离所需要的从脑死亡的人体中摘出的胰腺都比需要这种胰腺的患者数少得多，而且未见到今后有解决该问题的可能。
因此，制备具有与胰岛或胰腺β细胞相同功能的细胞可对社会做出很大的贡献并且对医疗经济有着巨大的影响。而且，在近年来急速发展且倍受关注的干细胞研究中也显示出向胰腺内分泌细胞分化诱导的可能性(参照Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，等人，Science2921389-1394，2001；Assady S，Maor G，Amit M等人，Diabetes501691-1697，2001)，这也成为进一步促进对人为生产胰腺β细胞的关注的因素。
现在，正在对可作为代替人成熟胰岛β细胞的细胞的供给源的人ES细胞、组织干细胞等进行积极的研究。有报道称通过分化诱导在一部分细胞(小鼠ES细胞和肝干细胞)中确认有胰岛素的表达，但是尚不清楚在哪个阶段，导入了哪个基因才能有效地分泌胰岛素。而且，这样制备的干细胞的使用实质上包含着具有多分化能力和活跃的增殖能力的细胞难以由自身控制的困难，因此可认为实现应用今后尚需相当长的时间。
而且，一方面利用猪组织/细胞的研究获得进展，另一方面逐渐显现出人畜共感染性疾病、生物体组织适应性和伦理问题等问题。尤其是病毒的潜在的危险性逐渐成为很大的问题。例如，由于猪的脏器、细胞携带的来源于猪的病毒感染宿主而引起疾病的危险性(尤其是，由于内源性猪特异性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus；PERV)插入到染色体中，因此不可能排除)，这存在病毒扩散感染到家人和医务人员，进而将新病毒感染扩散到社会的危险性等。
因此，现在希望建立容易处理的胰岛素分泌人胰岛细胞株作为代替人成熟胰岛β细胞的细胞供给源。但是，时至今日，许多研究人员积极地致力于使人胰岛细胞无限增殖，但是没有一个关于产生胰岛素的人胰岛细胞株的报道。可以认为这是因为1)由于产生胰岛素的β细胞存在于胰岛内部，因此导入基因存在困难、2)为了建立无限增殖细胞株，使用病毒来源的癌基因(猿猴病毒40肿瘤抗原等)可使细胞的寿命延长，但是无法实现完全的无限增殖。事实上，人细胞能够超越增殖衰减而持续无限增殖的频率低(参见Shay JW，WrightWE，Exp.Cell Res.184109-118，1989；Ray FA，K raemer PM，Carcinogenesis 141511-1516，1993)。进而，据报道使用SV40T的细胞在体外的自然无限增殖的可能性大约为3.3×10-7，据称这需要内源性端粒末端转移酶活性的自然表达(参见Bondar AG，Science279349-352，1998Zhu J等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA963723-3728，1999；Halvorsen TL等人，Mol.CellBoil.191864-1870，1999)。
本发明解决了以往的问题，以提供能够产生胰岛素并且能够容易地确保获得满足所需细胞数目的人胰岛细胞株为课题。
发明内容
为了解决上述课题我们反复进行了积极的研究，结果发现在从健康人分离的人胰岛细胞中导入表达人端粒末端转移酶逆转录酶(以下简称为“hTERT基因”)的重组逆转录病毒载体-SSR#197(参见WatanabeT等人，Transplantation 15；75(11)1873-1880，2003)和表达猿猴病毒40肿瘤抗原基因(以下简称为“SV40T基因”)的重组逆转录病毒载体SSR#69(参见Westerman KA，Leboulch P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996)时，可以建立一种能可逆性增殖的无限增殖细胞的细胞株，其特征为具有胰岛素产生能力，并且在除去hTERT和SV40T基因后可以增强胰岛素的表达的细胞株，从而完成本发明。
也就是说，本发明涉及一种可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株，该细胞株是含有分别夹在一对LoxP序列之间的hTERT基因和SV40T基因的可逆性无限增殖的人胰岛细胞株，其特征在于其具有产生胰岛素的能力，并且在除去所述hTERT基因和SV40T基因之后可以增强胰岛素的表达。
上述可逆性无限增殖人胰岛细胞株优选是NAKT-13(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)。
本发明还涉及通过从上述可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得的人胰岛细胞。
本发明进而还涉及含有通过从上述可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得的人胰岛细胞的用于糖尿病的治疗剂。
本发明还涉及胰岛素的制备方法，特征在于该方法使用上述可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株，或者使用通过从上述可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得的人胰岛细胞。
图1是表示本发明的可逆性无限增殖人胰岛细胞株的制备方法和通过从上述可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因可获得的人胰岛细胞的制备方法的示意图。其中，ATG表示起始密码子，Ψ表示包装信号，LoxP表示LoxP序列，hTERT表示hTERT基因，EGFP表示增强的绿色荧光蛋白质基因，MoMLVLTR表示Moloney小鼠白血病病毒长末端重复序列，ECMV IRES表示脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点，HygroR表示潮霉素抗性基因，HSV-TK表示单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，SV40T表示SV40T基因，NeoR表示新霉素抗性基因。
图2是表示NAKT-13细胞(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERMBP-08461)的相差显微镜照片。1表示核，2表示神经内分泌细胞样的突起。
图3是表示通过胰岛素免疫染色法染色的NAKT-13细胞(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)的照片。无论深浅显出红色的部分1都表示细胞核，无论深浅显出绿色的部分3都表示胰岛素。
图4是为了更明确地表示胰岛素和细胞核而绘制的图3的示意图。1对应于图3的1，表示细胞核。并且，3对应于图3的3，表示胰岛素。
图5是表示通过胰岛素免疫染色法染色的经AxCANCre处理的NAKT-13细胞的照片。无论深浅显出红色的部分1都表示细胞核，无论深浅显出绿色的部分3都表示胰岛素。
图6是为了更明确地表示胰岛素和细胞核而绘制的图5的示意图。1对应于图5的1，表示细胞核。并且，3对应于图5的3，表示胰岛素。
具体实施例方式
本发明中，所谓“可逆性无限增殖”或“能够可逆性增殖的”是指将无限增殖基因转导到细胞中，使该细胞处于可以无限增殖的状态，在增殖到目的细胞数后，通过去除该无限增殖基因，可以停止细胞增殖，使细胞恢复到原来的高安全性状态的状态。
本发明的可逆性无限增殖的人胰岛细胞株是含有分别夹在一对LoxP序列之间的hTERT基因和SV40T基因的人胰岛细胞株。更为详细的是，通过将含有夹在一对LoxP序列之间的hTERT基因的逆转录病毒载体-SSR#197和含有夹在一对LoxP序列之间的SV40T的逆转录病毒载体-SSR#6 9导入到从健康人分离的胰岛细胞中获得的具有胰岛素产生能力，并且在除去hTERT基因和SV40T基因后可以增强胰岛素的表达的细胞。不过这其中优选NAKT-13细胞株(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)。并且，如图2(NAKT-13细胞株(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461))所示，本发明的可逆性无限增殖胰岛细胞具有小型、伸出突起(部分2)的神经内分泌细胞的特征。
本发明中使用的从健康人分离的胰岛细胞，可以按照公知的方法从人胰腺中分离(参照Staudacher C，Ricordi C，Stella M，Socci C，Cammelli L，Ferrari G，Dicarlo V.Minerva Chir.311665-1668，1985或Ricordi C，Finke EH，Lacy PE.，Diabetes 35649-653，1986)。
所谓“胰岛素表达增强”是指与除去前相比，通过除去无限增殖基因胰岛素的表达量增加，例如，优选增加2～100倍。
胰岛素的表达，可以通过公知的方法例如采用胰岛素抗体的胰岛素免疫染色法进行评价，可以通过测定经胰岛素染色的试样的荧光强度比较其表达量。这种荧光强度的比较，可以使用图像处理分析软件NIH image(Vol.62)(由美国NIH(National Institute of Health)无偿分发)。
逆转录病毒载体-SSR#197中，除hTERT基因之外，还编码增强的绿色荧光蛋白质基因(EGFP)，逆转录病毒载体-SSR#69中除SV40T基因之外，还编码潮霉素抗性基因(HygroR)与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的融合基因以及新霉素抗性基因(NeoR)。可以按照各种公知的方法，例如上述Watanabe T等人，Transplantation15；75(11)1873-1880，2003和Westerman KA，Leboulch P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996中记载的方法对它们进行制备。
上述LoxP序列是可被Cre重组酶识别的公知的位点特异性重组序列，其是可在这种序列之间进行所谓DNA链的切断，链的交换和结合的同源重组的特异序列。相同的DNA分子上存在相同方向的一对LoxP序列时，切除它们之间夹着的DNA序列从而形成环状分子(切除反应)。
上述hTERT基因是源于正常细胞的TERT基因。hTERT基因是在血液、皮肤、肠道粘膜、子宫内膜等历时一生进行重复再生的器官的干细胞/前体细胞中以及在每当暴露于特定的抗原时可克隆增殖的淋巴细胞中自然表达增强的基因。
上述SV40T基因是公知的DNA型肿瘤病毒的肿瘤抗原(T抗原)基因。
逆转录病毒载体SSR#197和逆转录病毒载体SSR#69的导入可以通过向培养细胞直接接种这两种逆转录病毒载体的方法进行。
作为通过将逆转录病毒载体直接接种于培养细胞将逆转录病毒载体导入培养细胞的方法，可以使用任意方法只要可以实现本发明目的即可。例如，也可以通过培养逆转录病毒载体产生细胞，将其培养上清接种于另外培养的胰岛细胞中，从而完成导入。可以通过本领域中公知的方法确定各细胞的培养条件和接种浓度等各种条件。
并且，如果考虑到对细胞的影响，例如染色体的稳定性，向培养细胞的接种次数优选仅1次。但是，如果考虑到这种载体的导入效率，优选向细胞接种多次。因此，本发明中最优选1天感染两次，每次感染4小时，总共进行3天。
本申请说明书中，Cre重组酶是特异识别LoxP序列的公知的重组酶，只要可以切除夹在LoxP序列中的核苷酸序列即可，没有特别的限定。本发明中，为了切除存在于可逆性无限增殖人胰岛细胞株的染色体上的夹在LoxP序列间的hTERT基因和SV40T基因，使用Cre重组酶。通过从可逆性无限增殖人胰岛细胞株的染色体上切除夹在LoxP序列间的hTERT基因和SV40T基因获得的细胞没有癌变的危险性，因此是安全的，适于细胞移植。
作为通过使用Cre重组酶，在体外大量培养的可逆性无限增殖胰岛细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因的方法，可例举(1)通过基因转导效率良好的腺病毒载体转导Cre重组酶的方法，(2)用磷酸钙法在细胞培养液中添加Cre重组酶DNA的方法，(3)在培养上清中加入源自人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白质与Cre重组酶的融合蛋白质的方法，(4)在细胞培养液中加入阳离子化的Cre重组酶蛋白质的方法，还有(5)通过导入药物诱导性Cre重组酶表达载体，附以可通过添加药物而使该基因自由地去除的系统的方法等。在不使用腺病毒载体的方法中，优选没有病毒载体引起的进一步的重复感染。
通过从本发明的可逆性无限增殖胰岛细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得的人胰岛细胞(以下简称“恢复的人胰岛细胞”)，例如如图5(恢复的NAKT-13细胞)所示，胰岛素表达增强，细胞相互间自然地凝集，形成与正常胰岛结构类似的形态。
本发明的用于糖尿病的治疗剂可以使用含有上述恢复的人胰岛细胞的细胞制剂。本发明的用于糖尿病的治疗剂，除上述恢复的人胰岛细胞之外还可以含有在糖尿病的治疗中可以使用的成分作为其它的活性成分。作为这种活性成分，可例举曲格列酮(troglitazone)等。此外，由于目的在于促进胰岛素的分泌，优选添加烟酰胺。本说明书中的所谓的细胞制剂，可举例有在培养基、等渗液或缓冲液中悬浮了的上述人胰岛细胞的悬浮液，或者通过离心等浓缩了的团状颗粒(pellet)等细胞块。适当选择培养基、等渗液或缓冲液以适应上述人胰岛细胞。进而，上述细胞制剂也可以加入DMSO等保护剂，冷冻保存。并且，考虑到上述细胞制剂要接种于人体内，如果预先消除细胞增殖性会更安全。作为细胞制剂，为了更为安全地利用，可在保留作为细胞制剂的功能，使病原细胞的蛋白质变性程度的条件下进行加热处理、放射线处理或丝裂霉素C处理等处理。
移植恢复的人胰岛细胞时，细胞优选经门静脉移植到肝脏。作为这种方法，例如通过在右下腹部开一小切口，露出肠系膜的细血管，直视下插入导管移植细胞的方法，或者根据回声确定肝脏的门静脉，通过导管穿刺移植细胞的方法。尤其是，由于侵袭小因而优选以回声进行细胞移植的方法。
并且，该治疗剂的给药量(移植量)，优选例如1亿～100亿个细胞/个体，更优选10亿～100亿个细胞/个体，最优选的是10亿～20亿个细胞/个体。
可以使用本发明的可逆性无限增殖人胰岛细胞株和恢复的人胰岛细胞作为例如以糖尿病为靶的移植治疗或生物人工胰腺的来源。作为移植治疗或生物人工胰腺，可以列举有例如在以高分子原料制成的装置中封入了胰岛素分泌细胞的扩散腔型(diffusion-chamber type)、微囊型、中空纤维型模件(元件)与分离/培养细胞组合在一起的杂合型人工胰腺等。生物人工胰腺有以下三种形态安置在体外与血管连接的，留在体内与血管连接的，或者不与血管连接留在腹腔内的。本发明的可逆性无限增殖人胰岛细胞株和恢复的人胰岛细胞，无论哪一种都可以在任意形态的生物人工胰腺中使用。
并且，本发明的可逆性无限增殖人胰岛细胞株和恢复的人胰岛细胞，无论哪一种都可以在胰岛素的制造中使用。为了增强胰岛素的表达，优选在大量培养可逆性无限增殖人胰岛细胞后，除去hTERT基因和SV40T基因的恢复的人胰岛细胞作为有效制备胰岛素的恢复的人胰岛细胞。
可以通过以亲合层析柱等通常在蛋白质的纯化中使用的方法纯化从细胞培养物中除去细胞后得到的培养液，进行胰岛素的制备。
下面，给出具体的实施例说明本发明，但是本发明并不限于此。
实施例1可逆性无限增殖人胰岛细胞株NAKT-13(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)的建立在立体显微镜(STEMI，Carl Zeiss公司，德国)下用手动挑选法(hand pickup)法从加拿大Alberta大学提供的从健康人分离的胰岛细胞(加拿大Alberta大学，人胰岛移植方案，由Jonathan RT.Lakey博士提供，公众可以获得)中挑选出10个呈现球形的清晰形态的胰岛细胞，将它们接种于T25培养瓶中。使用由WILLIAM’S培养液E(SIGMA公司，圣路易斯，美国)中加入10％胎牛血清(FCS，SIGMA公司)，10-7mol/l胰岛素(S IGMA公司)，10-6mol/l地塞米松(SIGMA公司)，25μg/ml表皮生长因子(EGF，SIGMA公司)，10mM烟酰胺(SIGMA公司)，抗生素青霉素G/链霉素(SIGMA公司)组成的培养液作为基础培养液。自接种起第3天，以4ml作为基础培养基，不进行培养液的更换。从第4天起，更换培养液时，2ml基础培养液中分别加入分别经0.45微米的过滤器筛滤的逆转录病毒载体SSR#197产生细胞的培养上清和逆转录病毒载体SSR#69产生细胞的培养上清各1ml，以总共4ml培养4小时，1天进行两次基因导入。在第4，6，8天(总共6次)时，同样重复上述操作。
并且，逆转录病毒载体SSR#197产生细胞的培养上清和逆转录病毒载体SSR#69产生细胞的培养上清的制备按以下方式进行。
使用美国马萨诸塞州剑桥的哈佛马萨诸塞工科大学的PhilippeLeboulch博士提供的可产生逆转录病毒载体SSR#197的Crip细胞(SSR#197)(Watanabe T等人，Transplantation 15；75(11)1873-1880，2003)(效价4×106cfu/ml)和可产生逆转录病毒载体SSR#6 9的Crip细胞(SSR#69)(Westerman KA，Leboulch P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938971-8976，1996)(效价4×106cfu/ml)，以10万个细胞/cm2将各Crip细胞接种于T75培养瓶中，于10ml的DMEM+10％NCS(新生小牛血清)培养液中培养。在细胞密度达到90％的时间点，用10ml的DMEM+10％NCS培养液替换培养液。更换培养液后培养24小时，分别获得含有逆转录病毒载体SSR#197和逆转录病毒载体SSR#69的培养上清。
自上述人胰岛细胞的接种第10天(自最终感染第2天)起，将基础培养液改变为由低葡萄糖DMEM(Giboco公司，奥克兰，新泽西州)中加入10％FCS、10mM烟酰胺、320μl/l潮霉素、青霉素G/链霉素组成的培养液，用100μg/ml潮霉素(SIGMA公司)进行筛选。在出现潮霉素抗性株时，采用克隆环使细胞克隆化。各个克隆细胞增殖时，通过用流式细胞仪MoFlo(Dako Cytomation株式会社，京都，日本)回收GFP阳性细胞，建立可逆性无限增殖人胰岛细胞株NAKT-13(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)。将该NAKT-13保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)。如图2所示，所获得的细胞株NAKT-13(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)具有小型、伸出突起(部分2)的神经内分泌细胞的特征。
实施例2从可逆性无限增殖人胰岛细胞株中去除hTERT基因和SV40T基因将实施例1中获得的可逆性无限增殖人胰岛细胞株以10万个细胞/ml培养于以由低葡萄糖DMEM(Giboco公司，奥克兰，新泽西州)中加入10％FCS、10mM烟酰胺、青霉素G/链霉素组成的培养基中。自培养开始24小时时，在培养基中添加1 MOI(MOI感染复数)表达Cre重组酶的腺病毒载体AxCANCre，这之后持续感染48小时。用PBS洗涤细胞2次，进行培养基的更换。如图5所示，得到的恢复的NAKT-13细胞具有细胞相互间自然地凝集，形成与正常胰岛结构类似的形态的特征。
实施例3胰岛素表达和形态将实施例1和2获得的细胞(各5万个细胞)接种于6孔板中铺了盖玻片的位置上，使用由低葡萄糖DMEM(Giboco公司，奥克兰，新泽西州)中加入10％FCS、10mM烟酰胺、青霉素G/链霉素组成的培养基作为培养基，培养24小时直至细胞密度达到60％。接着，将培养基换成由高葡萄糖DMEM(Giboco公司，奥克兰，新泽西州)中加入10％FCS，10mM烟酰胺、青霉素G/链霉素组成的培养基，培养6小时。
培养结束后，以兔抗人胰岛素抗体(Dako Cytomation株式会社制，京都，日本)使用的免疫染色法，研究细胞中胰岛素的表达。染色结果示于图3和5中。并且，图4和6分别是图3和5的示意图。图3和5分别表示的是实施例1获得的NAKT-13细胞(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)和实施例2获得的恢复的NAKT-13细胞。图3和图5中，无论深浅显出红色的部分1都表示细胞核，无论深浅显出绿色的部分3都表示胰岛素。
根据图3，可确认在实施例1获得的NAKT-13细胞(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)的胰岛素的表达。并且，根据图3和5，在实施例2获得的恢复的NAKT-13细胞中，通过使用图像处理分析软件NIH image(Vol.62)(由美国NIH无偿分发)比较荧光强度，确认出其胰岛素的表达比恢复前的无限增殖胰岛细胞显著增加30倍。
产业上的可利用性根据本发明的可逆性无限增殖人胰岛细胞株，可以容易地确保获得足够数量的具有胰岛素产生能力的细胞以满足需要。并且，从该细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得的恢复的人胰岛细胞显示出增强的胰岛素表达，并且安全，在糖尿病治疗中非常有用。
进而，基于本发明的细胞，可以使胰岛素的制备或者将扩散腔型、微囊型、中空纤维型模件(元件)与分离/培养细胞组合在一起的杂合型生物人工胰腺的开发成为可能。
权利要求
1.可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株，其为含有分别夹在一对LoxP序列之间的hTERT基因和SV40T基因的可逆性无限增殖的人胰岛细胞株，其特征在于该细胞株具有产生胰岛素的能力，并且在除去所述hTERT基因和SV40T基因之后能增强胰岛素的表达。
2.权利要求1的可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株，所述可逆性无限增殖人胰岛细胞株是NAKT-13(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编号305-8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP-08461)。
3.人胰岛细胞，其通过从权利要求1的可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得。
4.用于糖尿病的治疗剂，其中含有通过权利要求1的可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得的人胰岛细胞。
5.制备胰岛素的方法，其特征在于该方法使用权利要求1记载的可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株，或者使用权利要求3记载的人胰腺等细胞。
全文摘要
本发明涉及一种可逆性无限增殖人胰岛细胞株，其是含有分别夹在一对LoxP序列之间的hTERT基因和SV40T基因的可逆性无限增殖的人胰岛细胞株，其特征在于其具有产生胰岛素的能力，并且在除去所述hTERT基因和SV40T基因之后可以增强胰岛素的表达，尤其是涉及NAKT－13(保藏于独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心，地址是日本茨城筑波市东1－1－1中央第6号(邮政编号305－8566)，保藏日是2003年9月4日，保藏号为FERM BP－08461)或其传代细胞株，通过从该可逆性无限增殖人胰岛细胞株或其传代细胞株中除去hTERT基因和SV40T基因获得的人胰岛细胞，以及这些细胞的用途。通过使用本发明的可逆性无限增殖人胰腺细胞株，可以容易地确保获得满足所需数量的胰岛产生细胞。
文档编号C12N5/10GK1878864SQ200380110670
公开日2006年12月13日 申请日期2003年11月10日 优先权日2003年11月10日
发明者田中纪章, 小林直哉, 成岛道树, 田中斋仁 申请人:日本可乐丽医疗器材株式会社, 田中纪章, 小林直哉