专利名称：具有t载体和表达载体功能的质粒以及采用其对靶基因的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时起着T载体和表达载体作用的质粒。此外，本发明涉及一种具有插入所述质粒的靶基因的表达载体，以及采用其对靶基因的表达。
背景技术：
一种表达靶基因的典型方法是采用将靶基因插入其中的载体，该方法包括通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增靶基因，然后将其插入表达载体中。通过这种PCR得到的基因扩增产物具有一种附加的核苷酸，其在3’末端处具有腺嘌呤碱基，这是由于PCR反应中使用的Taq DNA聚合酶具有末端转移酶活性的缘故(Clark，J.M.，Nucleic Acid Res.，169677，1988)。
由于基因扩增产物的这种特殊性质，因而在其被克隆到质粒载体中之前应当对该基因扩增产物进行加工，通过限制酶或末端转移酶使其末端钝化或具粘性。这样，就出现了基因的克隆过程需要多个步骤，效率降低以及难于实现的问题。
为了克服这些问题并使对PCR扩增基因产物的克隆变得容易，研制出了T载体，即一种含有一个附加核苷酸而且在其两个3’末端处都具有胸腺嘧啶碱基的线性载体。
一种制备T载体的方法是，人工加入在3’末端处具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸。也就是说，通过能够钝化其末端的限制酶的酶切方法，并且要么通过Taq DNA聚合酶的方式与三磷酸脱氧胸苷(dTTP)一起反应(Marchunk，D.et al.，Nucleic Acid Res.，191154，1991)，要么通过末端脱氧核苷转移酶的方式与三磷酸双脱氧胸苷(ddTTP)一起反应(Holton，T.A.et al.，Nucleic Acid Res.，191156，1991)以加入该具有钝化末端的线性载体，就可以构建出含有在3’末端处具胸腺嘧啶碱基的附加核苷酸的线性T载体。
然而，在该方法中，由于未达到最佳的反应条件或者酶的失活，会生成不具有附加胸腺嘧啶核苷酸的不完全T载体，因为T载体是以依赖于末端转移酶的活性效能的方式产生的。因此，该方法的问题在于，会增加克隆过程中不能克隆其自连产物的可能性。而且，其还存在转化该产物的宿主细胞使得扩增基因产物的克隆效率降低的问题。
另一种制备T载体的方法是，使用限制酶AspEI(Yoshikazu，I.et al.，Gene，130152，1993)、HphI(David，A.M.et al.，Bio/Technology，965，1991)，MboII或者XcmI，当用该限制酶切割基因时，其可以仅剩下一个3’末端具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸。
在该方法中，合成的寡核苷酸可以这样设计，当使用的两个限制酶识别位点平行设置并用限制酶切割基因时，仅有一个胸腺嘧啶保留在切割载体的3’末端处。将合成的寡核苷酸插入亲本载体中，并用限制酶切割从而产生T载体。然而，这种方法的问题在于，其不能够在亲本载体中存在限制酶识别位点的情况下使用。
根据对通常用作亲本载体的pUC19的分析表明，HphI和MboII识别位点各自存在于七个部位，AspEI识别位点存在于一个部位，只有XcmI识别位点不存在。因此，人们对采用XcmI的T载体的开发进行了许多研究(Kovalic，D.et al.，Nucleic Acid Res.194560，1991；Cha，J.et al.，Gene，136369，1993Testoris，A.et al.，Gene，143151，1994；Harrison，J.et al.，Anal.Biochem.，216235，1994；以及Boroskov，A.Y.et al.，Biotechniques，22812，1997)。
然而，即使在这种情况下，也存在一个问题，即在琼脂糖电泳凝胶上，不完全切割载体与完全切割载体之间的迁移距离差异太小，这是由于用限制酶切割寡核苷酸来制备T载体时释放的基因片段太小的缘故。因此，通过凝胶纯化方法即使只分离出完全切割的T载体时，也会存在不完全的切割载体。结果，由于事实上在克隆扩增基因时采用了限制酶不完全切割的一部分载体，因而在转化的E.coli中存在高比例的自连载体，使得基因扩增产物的克隆效率降低。
为了克服这个问题，人们继续努力从而研发出了又一种制备T载体的技术，通过它可以清楚地区分出被切割并在琼脂糖凝胶电泳上分离的基因片段，可以解决因不完全载体的产生，只转化那些由于自连现象而没有进行克隆的扩增基因产物的载体的问题。这样可降低建立在转化基础上的自连载体的比例，从而提高了扩增基因产物的克隆效率。
同时，在对大量靶蛋白表达的一般性研究中，首先要进行建立适合表达系统的表达质粒的步骤。在建立表达质粒的过程中，对用在插入载体的靶蛋白质基因扩增中的寡核苷酸的制备包括，分析编码靶蛋白质基因的碱基序列，以及插入限制酶识别位点，该位点在靶基因的碱基序列中不存在。这有助于将扩增产物复制到表达载体中。
结果，除了用作模板的靶基因的碱基序列之外，产生的寡核苷酸还含有用于加入限制酶识别位点的额外寡核苷酸。因此，在利用该寡核苷酸通过PCR来扩增靶基因的过程中，存在一个问题，即寡核苷酸特别针对靶基因的退火效率降低了，使得难以选择性地只扩增靶基因。而且，由于要插入用于基因扩增的寡核苷酸以帮助克隆的限制酶识别位点位于扩增的靶基因产物的两个末端，因此存在酶切效率低的问题。
因此，为了提高用于表达靶蛋白质的质粒的功效，人们设计了一种方法，包括步骤克隆扩增的靶基因产物到T载体中，选择含有靶基因的T载体克隆，用限制酶切割该T载体，以及利用切割的T载体形成最终的质粒。然而，该方法需要两个步骤，因而不太方便。
在大量表达靶蛋白质的情况下，最大的目的在于，以更加简单、有效和经济的方式来进行工业制备靶蛋白质，因此，人们对开发具有良好工业实用性，例如基因表达更稳定和节省成本的基因表达系统的需求不断提高，并且为满足这种需求人们在不断地进行着努力。
因此，本发明者们进行了深入的研究，试图建立一种最终表达载体，可以仅仅通过简单的T载体克隆来表达靶蛋白质从而使靶蛋白质被高水平地表达出来，并且由此发现，即使通过一步克隆过程将PCR扩增的靶蛋白质基因克隆到载体中用以高水平表达时，也可以高水平地表达靶蛋白质基因，并且该载体也可以十分有效地用于对大量靶基因的表达过程中，例如建立微生物基因组的全表达系统，从而使本发明更加完美。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种同时起着T载体和表达载体作用的质粒，并且其可用于简单而快速地构建靶蛋白质的基因表达载体，同时也提供了其制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种具有插入所述质粒的靶基因的表达载体，还有由该表达载体转化的微生物。
本发明还有一个目的是提供一种表达靶基因的方法，包括培养所述转化的微生物。
本发明还有另一个目的是提供一种载体文库系统，其可同时以高效而经济的方式表达大量的靶基因。
为达到上述目的，本发明提供了一种质粒，其中引入了两个能克隆T载体的限制酶识别位点，位于载体的启动子的下游，该载体无论宿主细胞的种类如何都能够稳定地高水平表达，由此该质粒同时起着T载体和表达载体作用，并且其特征在于能够仅通过一步T载体克隆过程来表达被测的靶基因。
优选地，能克隆T载体的所述限制酶识别位点选自以下物质构成的组HphI、MboII、AspEI和XcmI，并且多核苷酸插入该质粒的两个限制酶识别位点之间。
当用限制酶切割本发明涉及的质粒时，在被插入的多核苷酸的去除部位，暴露出两个3’末端都具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸，从而起到了T载体的作用。
在优选的实施例中，组成性高水平表达的载体为pHCE，本发明提供了一种同时起到T载体和表达载体作用的质粒(pHCE-FOREX)，其中在pHCE载体的HCE启动子下游处引入了两个AspEI限制酶识别位点，并且将在其两个末端都具有AspEI限制酶识别位点的多核苷酸插入这两个AspEI限制酶识别位点之间。
此外，本发明提供了一种组成性高水平表达的载体(pHCE-FOREX-T)，其获得如下，用AspEI限制酶酶切质粒pHCE-FOREX，以便去除在其两个末端都具有AspEI限制酶识别位点的多核苷酸，其中在该多核苷酸去除部位，暴露出两个3’末端都具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸。
另外，本发明提供了一种制备同时起着T载体和表达载体作用的质粒(pHCE-FOREX)的方法，该方法包括步骤(a)构建pHCE-M1，其AspEI限制酶识别位点的去除是通过在pHCE载体中的AspEI限制酶识别位点引入位点突变而实现的；(b)构建pHCE-M2，使用含有AspEI限制酶识别位点的引物，通过PCR将两个AspEI限制酶识别位点引入pHCE-M1载体的HCE启动子下游；以及(c)将两个末端都具有AspEI限制酶识别位点的多核苷酸插入pHCE-M2载体的两个AspEI限制酶识别位点之间。
同时，本发明还提供了一种表达载体，其通过用限制酶酶切质粒去除被插入的多核苷酸，然后将编码靶蛋白质的基因插入去除该多核苷酸的位点处而获得。
同样，本发明还提供了一种表达载体，其中编码靶蛋白质的基因被插入到组成性高水平表达的T载体(pHCE-FOREX-T)。
编码靶蛋白质的基因优选为通过PCR扩增的基因。同时，该基因优选还是这样一种PCR扩增的产物其中采用了具有ATG氨基末端的引物，以及对该基因的碱基序列具有特异性的引物，而NdeI限制酶的识别位点优选形成于该基因的插入部位。
此外，本发明提供了一种由所述表达载体转化的微生物，还有一种用于表达靶蛋白质的方法，其中包括培养所述转化的微生物。
而且，本发明提供了一种表达载体文库，其中可将该各种基因的文库插入质粒中，还提供了一种表达质粒文库，其中可将该各种基因的文库插入高水平表达的T载体中(pHCE-FOREX-T)。
此外，本发明提供了一种用于测定靶基因克隆的方法，该方法包括步骤(a)用表达载体文库转化微生物；以及(b)培养所述转化的微生物。
本发明用于测定靶基因克隆的方法优选还包括步骤在步骤(b)之后分离质粒，以及用NdeI限制酶酶切所述质粒。
在下文中，将分步骤详细地说明根据本发明的高水平表达T载体(pHCE-FOREX-T)的制备方法，以及采用该T载体的表达方法。
步骤1制备含有两个AspEI限制酶识别位点的pHCE-M1
为了利用作为基本构架的组成性高水平表达载体(pHCE DNA载体；FERM P-17814)来制备T载体，其中所述组成性高水平表达载体具有高水平的组成性启动子和用于亚克隆的多克隆位点，要在pHCE载体中存在的AspEI限制酶识别位点中引入突变位点，从而形成去掉了限制酶识别位点的pHCE-M1。
通过PCR利用含有两个AspEI限制酶识别位点的引物，可制备出在pHCE-M1的HCE启动子下游处引入了两个AspEI限制酶识别位点的pHCE-M2。
步骤2制备用于组成性高水平表达T载体的质粒(pHCE-FOREX)通过PCR利用含有AspEI限制酶识别位点的引物，获得了在其两个末端都具有AspEI限制酶识别位点的大约800-bp的多核苷酸。将其插入pHCE-M2的AspEI限制酶识别位点，从而产生用于组成性高水平的质粒(pHCE-FOREX)。这有助于在后来转化到T载体中时对DNA片段的分离。
步骤3将用于组成性高水平表达载体的质粒(pHCE-FOREX)转化到组成性高水平表达的T载体中(pHCE-FOREX-T)从用作组成性高水平表达T载体的质粒(pHCE-FOREX)转化的E.coli中分离出质粒，并用AspEI限制酶切割。将酶切质粒通过琼脂糖凝胶电泳，分离了大约800-bp的多核苷酸之后，在剩余的基因中获得大约3000-bp在两个3’末端都具有胸腺嘧啶的核苷酸的组成性高水平表达的T载体(pHCE-FOREX-T)。
步骤4克隆和高水平地表达编码靶蛋白质的基因通过PCR扩增编码靶蛋白质的基因，然后将其克隆到组成性高水平表的的T载体中(pHCE-FOREX-T)。靶基因插入其中的该高水平表达的T载体这样设计，使得如果用于扩增编码靶蛋白质的基因的氨基末端引物的起始密码子由ATG构成，则当进行T载体克隆和之后的向前插入时，将产生NdeI限制酶的识别位点使其能够容易地检测出克隆过程是否成功。
如果如上所述地插入向前方向的被表达基因，则在培养由质粒转化的E.coli之后，在给定时间内，无需使用表达诱导剂就能确定靶蛋白质的过表达程度。
将质粒从由T载体的质粒转化而来的E.coli中分离出来，用AspEI限制酶切割该分离的质粒，然后分离并纯化大约800-bp的多核苷酸除外的剩余的质粒部分，可以很容易地将本发明的高水平表达T载体的质粒转化成高水平表达的T载体。同时，该质粒还具有优良的储存特性，使其能够以转化到E.coli中的形式而储存。此外，其允许对表达进行检测，即使在仅通过一个步骤来克隆编码要表达的靶蛋白质的基因时也一样。这表明该质粒还具有无论宿主细胞种类如何都能作为表达靶蛋白质的系统的优点。
此外，在建立同时表达大量靶基因的系统时，根据本发明的质粒系统显示出远优越于其它现有系统的效率。这种优点只有本发明的质粒系统才拥有，因为其中由T载体克隆产生的表达质粒利用了组成性高水平表达的启动子，并且无论宿主细胞的种类如何都能够表达，因此可以立即检测出在通过一步克隆过程获得的转化子中的表达。由于这个优点，可以显著地提高建立微生物基因组表达系统的效率。
图1是用AspEI酶切高水平表达T载体的质粒(pHCE-FOREX)所获得的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图2表示了根据本发明的新型高水平表达T载体(pHCE-FOREX-T)的示意图。
图3是通过PCR扩增的hTNF-α的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4是用NdeI限制酶酶切12种菌群所获得的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中随机地选择所述菌群用以对采用高水平表达T载体的克隆的检测。
图5是从所选的用于克隆检测的12种转化子中获得的蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱。
发明的详细说明在下文中将通过实施例对本发明进行更详细的描述。然而对于本领域技术人员来说显然这些实施例只起到说明的目的，本发明的范围并不限于这些实施例或受其限制。
在以下的实施例中，尽管特别使用了pHCE作为组成性表达的载体，但只要该载体的表达与宿主种类无关，可以无限制地采用任何载体。
同样，在以下的实施例中，尽管在pHCE的HCE启动子下游引入了两个AspEI限制酶识别位点，但对于本领域技术人员来说，显然在采用诸如HphI、MboII、XcmI的限制性酶来切割载体的情况下，引入诸如HphI、MboII、XcmI的限制性酶的识别位点并在两个3’末端都暴露出具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸，也可以产生同样的结果。然而，如果限制酶识别位点存在于组成性高水平表达的载体中时，则这种位点应当通过突变去掉。
实施例1制备用于组成性高水平表达T载体的质粒为了去掉现有pHCE载体中存在的AspEI限制酶识别位点，要通过PCR利用下面SEQ ID NO1的引物在该AspEI限制酶识别位点中引入位点突变，从而制备出去掉了该限制酶识别位点的pHCE-M1。
5’-GCCTGGCTCCCCGTTGTGTAGATAAC-3’(SEQ ID NO1)在PCR中，将作为模板的50ng组成性高水平表达载体(pHCE DNA载体)，10pmol SEQ ID NO1的引物，以及2单位的ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa，Japan)，加入到50μl含有10mM Tris HCl(pH 9.0)、1.5mM氯化镁、50mM氯化钾、0.1％的Triton X-100和150μM四种三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)的试剂组合物中，然后在PCR反应仪(iCycler，BIO-RAD，USA)中进行30个循环的PCR扩增，每个循环包括温度变化，94℃30秒，50℃30秒和72℃3分钟。
之后，为了在pHCE-M1启动子的下游引入AspEI限制酶识别位点，要进行PCR过程，其中采用含有AspEI限制酶识别位点(5’-GACNNN↓NNGTC-3’)的SEQ ID NO2和3的引物，从而制备出在pHCE-M1的启动子HCE下游引入了两个AspEI限制酶识别位点的pHCE-M2。在下面的引物碱基序列SEQ ID NO2和3中，所述限制酶识别位点为下划线的部分。
5’-TCCGACATATGGTCATCTCCTTCGGTATATCTCCTTTTTCCAG-3’(SEQ ID NO2)5’-GGACTTAAGGTCGGATCATTAGTTCCGCGTGGC-3’(SEQ IDNO3)在PCR中，将作为模板的pHCE-M1，10pmol SEQ ID NO2和3的引物，以及2单位的ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa，Japan)，加入到与上述PCR中使用相同的试剂组合物中，然后进行30个循环的PCR扩增，每个循环包括温度变化，94℃30秒，50℃30秒和72℃3分钟。
为了在上述获得的质粒pHCE-M2转化到T载体的过程中简化DNA的分离过程，可将两端都具有AspEI限制酶识别位点的800-bp DNA扩增产物插入这两个AspEI限制酶识别位点之间，从而制备出质粒(pHCE-FOREX)。通过利用含有AspEI限制酶识别位点的引物SEQ IDNO4和5的PCR，可获得该800-bp的DNA扩增产物。在该PCR中，采用的试剂组合物与上述PCR中所使用的相同，然后在PCR反应仪(iCycler，BIO-RAD，USA)中进行30个循环的PCR扩增，每个循环包括温度变化，94℃30秒，50℃30秒和72℃1分钟。
5’-GACCATATGTCGAAAGTTTATATTAGTGCAG-3’(SEQ IDNO4)5’-GACCTTAAGTCCAGTTAAAAACTGCAATATTCG-3’(SEQ IDNO5)所制备的用于组成性高水平表达T载体的质粒pHCE-FOREX同时起着T载体和表达载体的作用。
实施例2将T载体的质粒转化成T载体为了将实施例1中获得的用于组成性高水平T载体的质粒(pHCE-FOREX)转化成T载体，其中已克隆了两端都含有AspEI限制酶识别位点的800-bp DNA片段，可将经过分离并纯化的高纯T载体质粒用AspEI限制酶(每3μg DNA 10个单位)在37℃下处理6小时，然后在1％的琼脂糖凝胶上电泳(图1)。
在图1中，第一泳道表示1-kb+的DNA条带(Promega Co.USA)，第二泳道表示用AspEI处理(两步酶切)用于组成性高水平表达T载体的质粒(pHCE-FOREX)得到的T载体和基因的位置。如图1所示，可发现当用AspEI切割T载体的质粒pHCE-FOREX两次时，切割出的多核苷酸在琼脂糖凝胶上的迁移距离有显著的差异。这表明T载体的DNA片段容易被分离。用AspEI处理后切割得到大约3000bp的T载体DNA片段可用凝胶纯化试剂盒(Bioneer，Korea)来纯化，然后用作T载体(pHCE-FOREX-T)。图2是表示作为新型、组成性高水平表达T载体的pHCE-FOREX-T的结构示意图。
实施例3利用由pHCE-FOREX转化的T载体(pHCE-FOREX-T)的克隆为了证实T载体(pHCE-FOREX-T)的克隆效率，所述载体是由用限制酶AspEI来处理组成性高水平表达的质粒(pHCE-FOREX)所转化而成，可通过PCR来扩增人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)的基因，然后将其克隆到T载体中。
为了扩增hTNF-α基因而设计了具有插入基因片段中的ATG的引物SEQ ID NO6，以及碱基序列特异性引物SEQ ID NO7。
5’-ATGGTCAGATCATCTTCTC-3’(SEQ ID NO6)5’-CAGGGCAATGATCCAAAG-3’(SEQ ID NO7)接着，将10pmol SEQ ID NO6和7的引物，以及2单位的ExTaqDNA聚合酶(TaKaRa，Japan)，加入50μl含有10mM Tris HCl(pH9.0)、1.5mM氯化镁、50mM氯化钾、0.1％的Triton X-100和150μM四种三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)的试剂组合物中，然后在PCR反应仪(iCycler，BIO-RAD，USA)中进行30个循环的PCR扩增，每个循环包括温度变化，94℃30秒，50℃30秒和72℃40秒。
在1％的琼脂糖凝胶上电泳分析该基因扩增产物，然后用凝胶纯化试剂盒(Bioneer，Korea)进行纯化(图3)。在图3中，第一泳道表示1-kb+的DNA条带(Promega Co.USA)，第二泳道表示大小为472bp的纯化hTNF-α基因扩增产物。将50ng实施例2中制备的T载体，以及扩增和纯化的hTNF-α基因扩增产物通过5个单位的T4DNA连接酶(TaKaRa，Japan)相互连接，并引入E.coli JM109中。将转化的E.coli在5ml LB介质中培养，然后分离质粒并检测hTNF-α是否克隆到了质粒中。
分析从获得的转化子中随机选取的12个菌群，结果表明hTNF-α插入了所有的菌群中。这表明该质粒具有高克隆效率。当用具有ATG起始密码子的引物来克隆基因扩增产物时，如果基因以向前的方向插入HCE启动子中的话，就产生了NdeI限制酶识别位点。利用这种情况，可通过NdeI限制酶的酶切来检测克隆方向，结果表明12个菌群中有6个是以向前的方向克隆到HCE启动子中的(图4)。
在图4中，第一和第九泳道表示1-kb+的DNA条带(Promega Co.USA)，第二泳道表示DNA大小之间比较的对照组，其是用只具有一个识别位点EcoRI切割的pHCE-FOREX，第三至八泳道和第十至十四泳道表示从12个菌群中用NdeI限制酶切割并显影获得的DNA。在第五、七、八、十二、十三和十四上显影的六个菌群中，观察到由NdeI切割的大约3.5kb的单条DNA片段。这表明在这六个菌群中，hTNF-α以向前的方向克隆到了T载体中。
实施例4证实由克隆基因扩增产物表达的蛋白质在通过NdeI限制酶处理而检测的六个菌群中，编码hTNF-α的基因以向前的方向插入了HCE启动子中。因此，利用该创造性T载体的表达载体特征，无需进行再克隆过程或转化到其它的宿主细胞中就能够直接检测出hTNF-α的表达。
将发现的进行了克隆的这12个菌群在LB介质中培养20小时，然后用12％的SDS-PAGE分离从每份培养细胞中获得的各10μg蛋白质，用染料(亮蓝R250)染色并检测hTNF-α是否表达(图5)。
结果表明，在第四、六、七、十二和十三泳道中都发现了高度表达的hTNF-α，而以向前的方向将基因插入HCE启动子中的六个菌群中有五个成功地高水平表达了该基因。在图5中，第一和第八泳道表示低分子量的标记(Amersham，USA)，第二至七泳道和第九至十四泳道表示通过培养上述获得的12个转化子而得到的10μg显影蛋白。测试组的显影顺序与图4中相同。
尽管本发明是参考特定的特征来进行详细描述的，但对于本领域技术人员来说显然这些描述仅仅是针对优选的实施例，而并没有限制本发明的范围。因此，本发明的实质性范围将由附加权利要求及其等价物限定。
工业实用性正如上面详细描述和证明的那样，同时起着T载体和表达载体作用的本发明质粒很容易转化到T载体中，并且可以通过一步克隆过程来表达被测的靶蛋白质。特别是，在本发明质粒中的AspEI限制酶识别位点位于800bp的间隔处，从而使得在限制酶酶切的基础上很容易在切割载体之间进行区分，并且本发明的T载体以质粒的形式存在因而具有优良的储存性能。
此外，本发明的表达载体具有一种非常有效的特性，即无需进行再次亚克隆过程就能够表达被测的靶蛋白质，使得其能够广泛地用于编码要表达的靶蛋白质的基因克隆中。尤其是，根据本发明，用于大量靶蛋白质的表达质粒可以同时制备，本发明可以应用于短期建立用于特定微生物基因组和基因种类的表达系统。而且，由于本发明的载体是组成性高水平表达系统的表达载体，其不需要用表达诱导剂来处理，因此作为连接到表达系统的载体来说其具有很高的实用性，且不需要特定的宿主细胞。
序列表FP05KR068SEQUENCE LISTING<110>生物领先公司(BIOLEADERS CORPORATION)韩国生命工学研究院(KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCEAND BIOTECHNOLOGY)<120>具有T载体和表达载体功能的质粒，以及采用其对靶基因的表达<130>FP05KR068<140>PCT/KR03/02927<141>2003-12-31<150>KR10-2003-0048625<151>2003-07-16<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>1gcctggctcc ccgttgtgta gataac 26<210>2<211>43<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>2tccgacatat ggtcatctcc ttcggtatat ctcctttttc cag43<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>3ggacttaagg tcggatcatt agttccgcgt ggc 33<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>4gaccatatgt cgaaagttta tattagtgca g 31<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>5gaccttaagt ccagttaaaa actgcaatat tcg 33<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>6atggtcagat catcttctc 19<210>7
FP05KR068<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<400>7cagggcaatg atccaaag18
权利要求
1.一种质粒，其特征在于其中引入了两个能克隆T载体的限制酶识别位点，位于载体的启动子下游，该载体无论宿主细胞的种类如何都能够稳定地高水平表达，由此该质粒同时起着T载体和表达载体的作用，能够仅通过一步T载体克隆过程来表达被测的靶基因。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于其中能克隆T载体的所述限制酶识别位点选自以下物质构成的组HphI、MboII、AspEI和XcmI，并且多核苷酸插入该质粒的两个限制酶识别位点之间。
3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于当用限制酶切割所述质粒时，在被插入的多核苷酸的去除部位，暴露出两个3’末端都具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸。
4.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于所述组成性高水平表达的载体为pHCE。
5.一种同时起着T载体和表达载体作用的质粒(pHCE-FOREX)，其特征在于在pHCE载体的HCE启动子下游处引入了两个AspEI限制酶识别位点，并且将在其两个末端都具有AspEI限制酶识别位点的多核苷酸插入这两个AspEI限制酶识别位点之间。
6.一种组成性高水平表达的载体(pHCE-FOREX-T)，其特征在于以下述方式获得，即用AspEI限制酶酶切权利要求5所述的质粒pHCE-FOREX，以便去除在其两个末端都具有AspEI限制酶识别位点的多核苷酸，其中在该多核苷酸去除部位，暴露出两个3’末端都具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸。
7.一种用于制备同时起着T载体和表达载体作用的质粒(pHCE-FOREX)的方法，其特征在于包括下述步骤(a)构建pHCE-M1，通过在pHCE载体中的AspEI限制酶识别位点引入位点突变而去除其限制酶识别位点；(b)构建pHCE-M2，通过PCR将两个AspEI限制酶识别位点引入pHCE-M1载体的HCE启动子下游，使用的引物含有AspEI限制酶识别位点；以及(c)将两个末端都具有AspEI限制酶识别位点的多核苷酸插入pHCE-M2载体的两个AspEI限制酶识别位点之间。
8.一种表达载体，其特征在于通过用限制酶酶切权利要求2所述的质粒以去除被插入的多核苷酸，然后将编码靶蛋白质的基因插入去除该多核苷酸的位点处而获得。
9.一种表达载体，其特征在于其中编码靶蛋白质的基因被插入权利要求6所述的组成性高水平表达的T载体(pHCE-FOREX-T)中。
10.权利要求8或9所述的表达载体，其特征在于所述靶蛋白质的编码基因是通过PCR扩增的基因。
11.权利要求8或9所述的表达载体，其特征在于所述靶蛋白质的编码基因是这样一种PCR扩增的产物其中采用了具有ATG氨基末端的引物，以及对该基因的碱基序列具有特异性的引物。
12.权利要求8或9的表达载体，其特征在于NdeI限制酶的识别位点形成于编码靶蛋白质的基因的插入部位。
13.一种微生物，其特征在于其是由权利要求8～12中任意一个所述的表达载体转化的。
14.一种用于表达编码靶蛋白质的基因的方法，其特征在于其包括培养权利要求13所述的转化的微生物。
15.一种表达载体文库，其特征在于其制备方法包括下述步骤(a)用选自HphI、MboII、AspEI和XcmI的限制酶酶切权利要求2所述的质粒以去除插入的多核苷酸；以及(b)将各种基因的文库插入去除多核苷酸的位点中。
16.一种表达载体文库，其特征在于其中各种基因的文库被插入权利要求6所述的高水平表达T载体(pHCE-FOREX-T)中。
17.一种用于测定靶基因克隆的方法，其特征在于包括步骤(a)用权利要求15或16所述的表达载体文库转化的微生物；以及(b)培养所述转化的微生物。
18.根据权利要求17的用于测定靶基因克隆的方法，其特征在于其还包括步骤在步骤(b)之后分离质粒，以及用NdeI限制酶酶切所述质粒。
全文摘要
本发明涉及一种同时起着T载体和表达载体作用的质粒(pHCE－FOREX)，其制备是使来自组成性高水平表达载体的T载体具有HCE启动子的作用，并且其能够以简单而快速的方式表达靶蛋白质。同时，本发明还涉及一种具有插入质粒的靶基因的表达载体，以及采用其对靶基因的表达。本发明的质粒可以以简单而快速的方式通过一步T载体克隆过程转化到表达靶蛋白质的载体中。转化到表达载体中的质粒不需要再转化步骤，并且允许在不添加额外诱导剂的情况下仅通过培养转化的E.coli就能够高水平表达靶蛋白质。因此，根据本发明，可同时制备用于大量靶基因的表达质粒，这样在建立一定基因组和基因种类的表达系统时本发明将非常高效。
文档编号C12N15/64GK1802436SQ200380110389
公开日2006年7月12日 申请日期2003年12月31日 优先权日2003年7月16日
发明者宋永信, 夫夏玲, 成文喜, 洪承杓, 崔允豪, 金光, 李日汉, 朴帝炫 申请人:生物领先公司, 韩国生命工学研究院