生长激素1基因与原发性高血压的相关性的制作方法

专利名称：生长激素1基因与原发性高血压的相关性的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及生长激素1基因(growthhormone 1，GH1)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其与原发性高血压的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。
背景技术：
高血压是指收缩压或舒张压升高的一组临床症侯群。血压的升高与冠心病、肾功能障碍、高血压心脏病及高血压并发脑卒中的发生存在明显的因果关系。高血压最新的诊断标准是收缩压≥19kpa(140mmHg)或舒张压≥12kpa(90mmHg)，符合其中一项者可确诊为高血压。
大多数的高血压患者在血压升高早期仅有轻微的自觉症状，如头痛、头晕、失眠、耳鸣、烦燥、工作和学习精力不易集中并容易出现疲劳等。随着病情的发展，特别是出现并发症时，症状逐渐增多并明显，如手指麻木和僵硬、多走路时出现下肢疼痛，或出现颈背部肌肉酸痛紧张感。当出现心慌、气促、胸闷、心前区疼痛时表明心脏已受累，出现夜间尿频、多尿、尿液清淡时表明肾脏受累、肾小动脉发生硬化。如果高血压患者突然出现神志不清、呼吸深沉不规则、大小便失禁等提示可能发生脑出血，如果是逐渐出现一侧肢体活动不便、麻木甚至麻痹，应当怀疑是否有脑血栓的形成。
高血压早期无明显异常体征出现。当脑、心、肾等重要器官出现轻度损害时可有异常的体征出现。常见的心脏异常表现有心尖搏动左移、心前区有抬举样搏动感，听诊心尖区第一心音增强、主动脉瓣区第二心音增强且有收缩期杂音和舒张期杂音，表明已发生动脉硬化和左心室肥厚，如果在心尖区听及奔马样心律可能表明有心力衰竭的出现。另外还常见耳垂出现折痕、毛细血管搏动、桡动脉出现硬脉或无脉及下肢间歇性跛行等。
此外，由于某些诱发因素或高血压本身的发展，可导致一些高血压患者血压显著或急骤升高，同时伴有脑、心、肾、视网膜等重要器官功能损害，严重危及生命，出现一系列临床特殊征象，称为高血压急症。高血压急症的发病率占高血压人群的5％，常见有高血压脑病、脑出血、急性左心衰竭、可乐宁急性停药综合征、急性心肌梗塞、急进型恶性高血压等。
高血压患者中约5％左右无自觉症状，也不知道血压何时升高，更不知道什么时候已产生了血管和器官损害的并发症，有些患者甚至在发生了心血管意外之后才知道自己患有高血压。所以，找出高血压发病的遗传原因，及早的进行预防以及检测，可以有效控制高血压的发病，将疾病对人体的伤害减到最小。
原发性高血压(essential hypertension，EH)也叫高血压病，是一种独立的疾病，有着自己的病因、发生发展转归的规律和临床表现。临床上主要表现为动脉血压的升高。占人群高血压患者的90％以上，目前发病机理尚未完全明了，主要依据排除了其他疾病导致的高血压后才能诊断为原发性高血压(高血压病)。动脉血压的升高主要是因外周小动脉阻力增高所致，同时有不同程度的血容量和心输出量的增加。晚期常导致心、脑、肾等脏器受累发生高血压心脏病、心力衰竭、肾功能障碍、脑出血等严重并发症。原发性高血压的治疗主要是降低血压同时防止并发症的发生。原发性高血压患者致死原因为脑血管意外、心血管意外和肾功能不全，我国以脑血管意外为多见，心力衰竭和尿毒症次之，而欧美国家以心力衰竭多见，脑血管意外和尿毒症次之。
原发性高血压作为最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。
虽然已有许多关于各种基因多态性与原发性高血压的研究，但没有证实GH1基因与原发性高血压相关性的报道，更没有证实GH1基因的SNP与原发性高血压相关性的报道。
综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻找原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容
本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)高血压的方法及检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种新的治疗高血压的方法。
本发明的再一目的是提供一种治疗高血压的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤检测该个体的GH1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GH1基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。
在另一优选例中，所述的方法中检测的是GH1的基因或转录本，并与正常GH1核苷酸序列比较差异。
在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性6341位A→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在生长激素1基因GH1的单核苷酸多态性的方法，包括步骤(a)用GH1基因特异性引物扩增样品的GH1基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性6341位A→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ IDNO1中第6341位。
在本发明的第三方面，提供了一种检测高血压的试剂盒，它包括特异性扩增GH1基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第6341位的扩增产物。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂(a)与SEQ ID NO1中第6341位的突变结合的探针；(b)识别SEQ ID NO1中第6341位的突变限制性内切酶。
在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性6341位A→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的GH1蛋白以及药学上可接受的载体。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了GH1基因的部分SNP与高血压密切相关，而且发现了它的新功能GH1的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在GH1第6341位的SNP(6341位A→T)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，因此可作为检测高血压的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
GH1基因生长激素1基因(growth hormone 1，GH1)的详细序列可参见登录号为J03071的核苷酸序列(可参见网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO1所示。
GH1基因编码产生生长激素蛋白，是垂体前叶分泌的一种含有191个氨基酸的多肽。种群不同，其结构及组成也不尽相同。人生长激素的分子量是21 500D(≈2.15×104u)，含有两个二硫键(Niall HD et al.Proc Natl Acad Sci USA.1971 Apr；68(4)866-70.)。其大部分作用是通过IGF-1(一种含有70个氨基酸的碱性多肽)介导的。它调节胰岛素样生长因子(IGF1)的表达。
胰岛素样生长因子能够促进血管平滑肌细胞的增殖。有报道在高血压病人中，IGF1的血浆水平与血压高低相关。(Andromico G et al.J Hypertens1993 Oct；11(10)1097-101).IGF-1并非为GH的唯一介质，比如GH还可刺激血小板源性生长因子(PDGF)在心肌组织和原癌基因c-myc等在许多组织中的表达。
GH可通过刺激肾脏再吸收、减少心房利钠多肽分泌、活化肾素血管紧张素醛固酮(RAA)系统、增加红细胞产生等机制引起血容量扩张，使左室前负荷增加。
尽管GH可引起水钠潴留和血容量扩张，但其并不能使动脉血压增高，相反在巨人症患者外周血管阻力明显下降，表现为一种高动力状态。GH/IGF-1的此种血管扩张效应是内皮细胞依赖性的，可能与其促进内皮细胞合成一氧化氮(NO)有关。这与一些研究标明GH水平在高血压个体中较低的结果是一致的(季乃军等，高血压杂志2000 Jun，8(2)137-138)。
本发明人对GH1基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与高血压易感性并不相关，然而关联研究表明6341位A→T却是与高血压易感性关联性非常高的SNP。该SNP位于GH1的第4号内含子，提示对GH1的转录后的mRNA剪接过程有影响，进而影响其表达以及其与胰岛素样生长因子(IGF1)的相互作用，并最终导致携带者的高血压易感性明显高于正常人群。
基于本发明的新发现，GH1蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗GH1蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如高血压)，和用于筛选促进GH1蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人GH1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人GH1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人GH1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人GH1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人GH1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人GH1蛋白的分子，也包括那些并不影响人GH1蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人GH1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人GH1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人GH1蛋白功能的抗体以及不影响人GH1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人GH1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人GH1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人GH1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人GH1蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗GH1抗体是不识别正常GH1但识别突变GH1的抗体，或者识别正常GH1但不识别突变GH1的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。
利用本发明GH1蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与GH1蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明GH1蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
正常的GH1多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于高血压治疗。在使用本发明GH1蛋白时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明GH1蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的GH1蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
人GH1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于GH1蛋白的无表达或异常/无活性的GH1蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带GH1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人GH1基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还涉及定量和定位检测人GH1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。
一种检测检测样品中是否存在GH1蛋白的方法是利用GH1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与GH1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在GH1蛋白。
GH1蛋白的多聚核苷酸可用于GH1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，GH1蛋白的多聚核苷酸可用于检测GH1蛋白的表达与否或在疾病状态下GH1蛋白的异常表达。如GH1 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断GH1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用GH1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测GH1蛋白的转录产物。
检测GH1基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。GH1蛋白突变的形式包括与正常野生型GH1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用GH1基因特异性引物扩增样品的GH1基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性6341位A→T，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
应理解，在本发明首次揭示了GH1基因的SNP与高血压的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在6341位A→T。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO2和3的序列。
虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO1中第6341位。
由于本发明的SNP与高血压具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期较准确地诊断原发性高血压，而且可以未雨绸缪地使携带者在未发病前就采取合理的预防措施(如在饮食上采取相应控制)，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例11.1研究对象由于血压是多基因参与的受多种环境因素影响的数量性状，必然在分析相关基因时要考虑遗传异质性的问题。选择遗传背景相对比较单一的隔离人群作为研究多基因疾病的材料将有助于降低遗传异质性的影响，同时由于这些群体具有比较固定的生活环境和较为一致的生活习惯使得环境因素的影响大大降低。选择这样的群体，不论是用于连锁不平衡分析，还是从中选取家系进行家系分析，都有助于提高高血压易感基因位点的检测灵敏度。因此在本实施例中选定隔离群体作为研究对象(隔离群体具有遗传背景的相对一致性，奠基者数目比较少的优点)。
在知情同意的基础上随机收集了324个年龄在50岁以上的汉族个体，均来自于安徽省岳西县大别山响肠镇。80％的个体只有6个姓，奠基者数目应该比较少，并且同一性别的个体来自于同一个奠基者。选用的高血压样本要求收缩压不低于140mmHg，舒张压不低于90mmHg，测量血压两次取平均值。
挑选其中的11％位于血压分布的最顶端(37例个体；SBP＞178mmHg)和有7％位于血压分布的最底端的(22个个体；SBP＜104mmHg)共59个个体，通过直接测序的方法进行SNP的检测。
1.2实验方法和结果1.2.1 DNA提取用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。
1.2.2 PCR及测序引物的设计根据GenBank中GH1的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。
表1引物序列表

1.2.3 GH1基因的PCR扩增以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。
结果，获得394bp的扩增产物。
1.2.4 SNP的发现和检测PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISMTM377 DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。
结果，发现存在以下SNP6341位A→T。
1.2.5 SNP基因分型和关联分析用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在高血压病人和正常血压对照组中进行分型和关联分析。
等位基因的频率统计出来以后进行卡方检验，通过对血压最高的11％和最低的7％个体数据进行比较，初步确定是否等位基因的频率和血压水平连锁。
结果发现SEQ ID NO1中6341位的A型SNP在高血压个体中的频率为29％，而在低血压人群中的频率为44.3％。两者之间的频率差为15.3％，证实了SEQ ID NO1中6341位的A/T型SNP与高血压的发生存在着相关性。
实施例2原发性高血压易感性检测试剂盒如实施例1所述，SEQ ID NO1中6341位A→T的突变与高血压疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计GH1基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有

抽取待检测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISMTM377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。
或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出6341位A→T。
检测结果，含6341位A→T的检测对象的高血压易感性高于正常人群。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>复旦大学上海人类基因组研究中心<120>生长激素1基因与原发性高血压的相关性<130>040177<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7140<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gaattcctgg gcctggggct gtggcagctg cctcgtccct tcacctcctg gcttattctc 60tccctccata tcttagcaat ttcttcatgg gaatgtcccc aattagaaat ttctattata 120ccattatatt accaacatat atatatatac ctggccgggc gcggtggctc atgcctgtaa 180tcccagcatt ttggtaggcc aaggcgggtc ggatcacctg aggtcaggag ttcgagggcc 240agcctgatga ccatggtgaa accccatctc tactaaaaat acaaaattaa tcgggcatgg 300tggcacatgc ctgtaatccc agctactcgg gaggctgagg caggagaatc gcttaaaccc 360aggaagtgga ggtttcagtg agctgagatt gtgccattgc actccagcct gggtaacaag 420agcaaaactc catcaaaaaa aataatatat gtatatatat attacaattt tatatatata 480tacacattat gtaatttttt ttaccatttt atatatatac attacgtaat ggtaaatgtt 540ttctctgccc cccagtagat tgttagctcc agaagagaag gatcatgtct ttggtttatc 600tagatatgtc catcggcctg gtacagtctc tggcccatgt tataggcaac aactacttgt 660agaatcggtg aatgcatgaa tagaagaatg agtgaatgaa tgaatagacg aaaggcagaa 720atccagcctc aggccgggcg tgggtggctc acacctgtaa tcccagcact ttgggaggcc 780gaggcgggtg gatcacaaga tcaagagatg gagaccaacc tggctaacac agtgaaaccc 840cgtctctact aaaaatacaa aacattagcc gggcatggcg gtaggctcct gtagtccgag 900ctactaggga gcctgaggca ggagaatggc atgaacccag gggggcggac gttgcagtga 960gccaagatcg cgccactgca ctccagcctg ggcgacagag caagactcgg tctcaaaaaa1020aaaaaaaaaa gaaatccagc ctcaaagagc ttacagtctg gtaagaggaa taaaatgtct1080gcaaatagcc acaggacagg tcaaaggaag gagaggctat ttccagctga gggcacccca1140tcaggaaagc accccagact tcctacaatt actagacaca tctcgatgct tttcacttct1200ctatcaatgg atcgtctccc tggagaataa tccccaatgt gaaattactt agcacgtcaa1260gttaggtaga tccttgtgta cttcttggtt gttcagagat catcaccagt gcaacatccc1320ccatcataca cagcagtgtc ttgcccctct cctccccaag ccttccgagg cccttcctcc1380gtgcctgaac cccctggaca tatcatgtgg caaactgaag ggtccaacga gatacaggaa1440gtgaaacacg atgtacactg aaacgtgcaa tacaaatatg cagcatgaag tgcctcggtt1500cactaacccg agctatgctg ggtgcttctt ttctaccact ttccttaatg cctatggaca1560cctcattctg tggctgaagt tccttgtgtt caattccccc catcttcatt gaacatcctc1620tgtgcaggga cttgacccct gtcctgctag ctttgcactg aggcaagttt tgtccatgcc1680tagtagtgcc acatctttac tagatgaggt ttctaaagag cttggcatgg aaggaaagcc1740tggggggcct tagaagccat cacttaggaa ctgggagagc tccaggcaag ccaccttatc1800
tctttgggcc tcagtatcct cactcacatc cccatggtca gtagagtgcc aagcacatgg1860tggacacgca gaagtattga tcatcttcct cacctcccct aggagagccc ttggaatccc1920catataatat tctctgaaga cctcaatcca atgagccgag taattgactc ggtagcaaac1980tcatggaaag gacattagaa gccaaaagga ggtagagtat gtcccagtac aataaccagc2040ctctgatctc aaggaagaaa gaacagagct gcaggtgaga agtgtgcgcc tcaaatcacc2100aaagtgagag tggaaggagc acccaccagt cccttggagg cgatccctaa gaccggtgag2160aatggcttcg aaaaatgtga tcgtcctcaa ccccacagtc ttgaacctaa caggagatct2220tgaagcctga aagacaccac tttaggatca acagcagatc tgtgactttc cacagcaggc2280acacagaacc ctagagttag tcgaggttgg acataggaag ggcttccaaa cacacagaga2340aattcatgga tcctaaatta taaagggagg ttctttaaaa gaaccaagat gattctgaga2400tttatcctga gctttttttt tttttttttt tttggatgca gagtctcgct ctgtcgccca2460ggctggagtg cagtggcgtg atctcggcta actgcaacct ccacctcgcg ggttcaagca2520attccctgcc tcggcctcct gaatagctgg gattacaggc gcctgccacc acacctggct2580aatttttgta tttttagcag agacgggatt tcaccatctt ggccaggctg gtcttgaact2640cctgatctca tgatccaccc accttggcct ccctaagtgg tgggattaca ggcgtgtgcc2700caacttttcc tgagcctttt gaggctgaca ccagaggtag aagcccagcc tctccccact2760ggccatgtgg ggagaggctc cagcctgcag caaccaggga tctggcctca agtgatgccc2820caacagtggg cgacttccca gtactgttag gagaatccca agtctaattc aaagttgatt2880ttttactagc aattaatgat agacatggtc tccattgctc aaggctctgg gaagatctag2940actagagaaa acgatcaccg acttctacca cacctgtggg cctcagttct tccctctggt3000ccatggttac cacagtaacc ccttgtaaag gtgtttcccc aggggtccct agagtcctct3060gagtcaccat aattctgggt caacagaaat ggagaggtaa gaggagacac tcccctgccc3120tggctggtcc cacgtgttca tggcagtaac ctgtctgggg agcctcgcca cccctgtgtc3180cacctgcaga gttatgcagt ggtccccaac tagggcccct gccaccctca ttcctaaggg3240aggctggaga cttcttccat ggccgaaaat ccacatctaa gtccccggca ctagcaaaaa3300ggccctgtca tgggggctcc ctgccccagt tgagattgga ggaacatgga agaagctaaa3360ataactaaat aactcagtag catcacacta cctgctctgg agaaaaaaaa atttaatatt3420attatttttt gttttttgag atggagttct gctctgctgc acaggctgga gtgcagtggc3480gcaatcttgg ctcacggcaa cctctgcctc ctgagggttc aagtgattct cccgcctcag3540cctcccgagt agttgggatt acagctcatg ccaccacgcc cagctaattt ttgtactttt3600agtagagatg gagttttgcc atgttggcta gtctggcctt gaactcctga cctcaagtga3660tccacccacc tcaaagccac ccaaagtttg gggattacaa gcgtgagcca ctgtgtccgg3720cctggagaaa ggactttaaa tgacgcaatg taggaagagc aaggttgtgg agatctgctg3780ccctggctga ggtagctcat gcaatcagtc tctctgagcc acagtctctt gatctgtgaa3840atcggaagaa aataatacct ccttcacaag acaagtggca ggtcagatgt gagaatgcac3900aggcaggccc tcggcaactg gaaaagctct atacagatct gaaaaggagg aggagaaaaa3960agaggagggg cttccatggc tggacagggc atctttcttt ttctttttct tttttttttt4020tttttttttt ttgaggtgga gtcttgctct gttgccaagg ttggagtgca gcagcacgat4080ctccgctcac tgcaagctct gcctcccgga ttcacgccat tctcctgcct cagcctcccg4140agtagctggg aatacacggt ccgccactac gcccagctaa cttttttgca tttttagtac4200agagtggatt tcacctggtt agccaagatg gtcttgatct actgacctcg tgatccgccc4260gcctcggcct cccaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc accgcgccca gcctgataga4320gcatctttcg gcgtgatgtg ttctgagttc caaagctgag gaagagactc aaatcttcaa4380gagctcttct aactttgaga ttctctgatg gtttcagggc tatgggagga agagcttgtg4440gtccgtgtct gctcccggga tttctgtttc ttggtttgtg tctctgctgc aagtccaagg4500agctggggca ataccttgag tctgggttct tcgtccccag ggacctgggg gagccccagc4560aatgctcagg gaaaggggag agcaaagtgt ggggttggtt ctctctagtg gtcagtgttg4620gaactgcatc cagctgactc aggctgaccc aggagtcctc agcagaagtg gaattcagga4680ctgaatcgtg ctcacaaccc ccacaatcta ttggctgtgc ttggcccctt ttcccaacac4740
acacattctg tctggtgggt ggaggttaaa catgcgggga ggaggaaagg gataggatag4800agaatgggat gtggtcggta gggggtctca aggactggct atcctgacat ccttctccgc4860gttcaggttg gccaccatgg cctgcggcca gagggcaccc acgtgaccct taaagagagg4920acaagttggg tggtatctct ggctgacact ctgtgcacaa ccctcacaac actggtgacg4980gtgggaaggg aaagatgaca agccaggggg catgatccca gcatgtgtgg gaggagcttc5040taaattatcc attagcacaa gcccgtcagt ggccccatgc ataaatgtac acagaaacag5100gtgggggcaa cagtgggaga gaaggggcca ggtataaaaa gggcccacaa gagaccagct5160caaggatccc aaggcccaac tccccgaacc actcagggtc ctgtggacag ctcacctagc5220ggcaatggct acaggtaagc gcccctaaaa tccctttggg cacaatgtgt cctgagggga5280gaggcagcga cctgtagatg ggacgggggc actaaccctc aggtttgggg cttctgaatg5340tgagtatcgc catgtaagcc cagtatttgg ccaatctcag aaagctcctg gtccctggag5400ggatggagag agaaaaacaa acagctcctg gagcagggag agtgctggcc tcttgctctc5460cggctccctc tgttgccctc tggtttctcc ccaggctccc ggacgtccct gctcctggct5520tttggcctgc tctgcctgcc ctggcttcaa gagggcagtg ccttcccaac cattccctta5580tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac5640acctaccagg agtttgtaag ctcttgggga atgggtgcgc atcaggggtg gcaggaaggg5700gtgactttcc cccgctggga aataagagga ggagactaag gagctcaggg tttttcccga5760agcgaaaatg caggcagatg agcacacgct gagtgaggtt cccagaaaag taacaatggg5820agctggtctc cagcgtagac cttggtgggc ggtccttctc ctaggaagaa gcctatatcc5880caaaggaaca gaagtattca ttcctgcaga acccccagac ctccctctgt ttctcagagt5940ctattccgac accctccaac agggaggaaa cacaacagaa atccgtgagt ggatgccttc6000tccccaggcg gggatggggg agacctgtag tcagagcccc cgggcagcac agccaatgcc6060cgtccttccc ctgcagaacc tagagctgct ccgcatctcc ctgctgctca tccagtcgtg6120gctggagccc gtgcagttcc tcaggagtgt cttcgccaac agcctggtgt acggcgcctc6180tgacagcaac gtctatgacc tcctaaagga cctagaggaa ggcatccaaa cgctgatggg6240ggtgagggtg gcgccagggg tccccaatcc tggagcccca ctgactttga gagctgtgtt6300agagaaacac tgctgccctc tttttagcag tcaggccctg acccaagaga actcacctta6360ttcttcattt cccctcgtga atcctccagg cctttctcta caccctgaag gggagggagg6420aaaatgaatg aatgagaaag ggagggaaca gtacccaagc gcttggcctc tccttctctt6480ccttcacttt gcagaggctg gaagatggca gcccccggac tgggcagatc ttcaagcaga6540cctacagcaa gttcgacaca aactcacaca acgatgacgc actactcaag aactacgggc6600tgctctactg cttcaggaag gacatggaca aggtcgagac attcctgcgc atcgtgcagt6660gccgctctgt ggagggcagc tgtggcttct agctgcccgg gtggcatccc tgtgacccct6720ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa6780taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga6840ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct6900attcgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc6960tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg7020accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg7080ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga7140<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>2aggagtgtct tcgccaacag 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cttgaagatc tgcccagtcc 20
权利要求
1.一种体外检测样品是否存在生长激素1基因GH1的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用GH1基因特异性引物扩增样品的GH1基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性6341位A→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQID NO2和3的序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第6341位。
4.一种检测高血压的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增GH1基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第6341位的扩增产物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂(a)与SEQ ID NO1中第6341位的突变结合的探针；(b)识别SEQ ID NO1中第6341位的突变限制性内切酶。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是以下的单核苷酸多态性6341位A→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
8.一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤检测该个体的GH1基因、转录本和/或蛋白，并与正常的GH1基因、转录本和/或蛋白相比较，存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，检测的是GH1的基因或转录本，并与正常GH1核苷酸序列比较差异。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异是以下的单核苷酸多态性6341位A→T；其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO1。
全文摘要
本发明公开了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的生长激素1基因GH1、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患原发性高血压的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1661053SQ20041001652
公开日2005年8月31日 申请日期2004年2月25日 优先权日2004年2月25日
发明者金力, 黄薇, 姜正文, 王颖, 张晨辉, 李艳平, 王志敏, 肖君华, 卢大儒 申请人:复旦大学, 上海人类基因组研究中心