专利名称：紫色小麦二氢黄酮醇还原酶基因及其克隆与应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于紫色小麦中二氢黄酮醇还原酶TaDFR1基因的克隆、重组及其催化形成花葵素、花青素、花翠素的功能分析及应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
小麦是世界上三大粮食作物之一，也是我国主要的粮食作物。它含有丰富的食物纤维，维生素以及微量元素。目前，在小麦的抗性，高产方面的研究已取得了重大的成功，人们对小麦的农艺性状及品质又提出了更高的要求。
现在，在紫色小麦的种皮中也发现了花青素，它存在于小麦的果皮中；而且这些花青素不同于普通小麦的一些色素，它是具有生物活性的一些化合物，有很多重要的作用。小麦本身可以加工成面包，色素也可以被提出来作为色素添加剂。更重要的是这种色素具有一些医疗作用，它可以降低癌病发生的几率，防止一些慢性疾病的发生。
类黄酮作为次生代谢物在植物的生长发育过程中起着重要的作用，象抵抗病原体生成花色素等。花青素就是在植物次生代谢过程生成的一些类黄酮化合物，三种不同的花色素—花葵素、花青素与花翠素构成了种皮的基本颜色。
在花青素的合成途径中，PAL、C4H、CHS、F3’5’H、F3’H、DFR以及UFGT都对色素的生成有着重要的作用，尤其是F3’5’H与F3’H控制了由DFR起作用的底物的生成。F3’5’H能使香橙素(DHK)转变为二氢杨梅树皮素(DHM)，F3’H能把香橙素(DHK)转变为双氢槲皮素(DHQ)，F3’5’H也能使双氢槲皮素(DHQ)变为二氢杨梅树皮素(DHM)。这三种底物在DFR的作用下又被分别转变为原花葵素苷、原翠雀素苷、原花青素苷，它们并最终转变为花葵素、翠雀素与花青素，构成了植物种皮的基本色素。这三种色素在不同的PH值条件下，不同的比例配合而能显出不同的颜色。曾有报道指出，在紫色小麦种皮中，含有较高比例的翠雀素与花青素。研究表明，植物的DFR基因对花色素的生成起着关键的作用。
发明内容
本发明首次从紫色小麦中分离出编码二氢黄酮醇还原酶的基因的全长cDNA，分别命名为TaDFR1(AY707916)、TaDFR2(AY707917)、TaDFR3(AY707918)、TaDFR4(AY707919)、TaDFR5(AY707920)，并将TaDFR1构建到表达载体上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，获得的转基因植株叶片呈紫色，且萼片部分变紫。
小麦TaDFR1全长的cDNA为1230bp，包括起始密码子和多聚A尾。开放阅读框部分为1062bp，由此推得具有354个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现与已发表的水稻、玉米和拟南芥的DFR相比，氨基酸同源性分别为73％、75％和55％(见附图1)，表明经过上述克隆步骤得到了紫色小麦TaDFR1基因。该基因序列如下(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度1230碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源紫色小麦(f)序列描述SEQ ID NO.11ATGGACGGGA AGAAAGGGCC GGTGGTGGTG ACCGGAGCGT CGGGTTTCGT AGGGTCATGG 6061 CTCGTCATGA AGCTCCTCCA GGCCGGGTAC ACCGTCCGGG CCACCGTGCG CGACCCGGCC 120121 AACGTTGAGA AGAACAAGCC GTTGCTGGAG CTTCCCGGAG CCAAAGAGCG GCTGTCCATC 180181 TGGAAGGCCG ACCTGAGCGA CCAAGGCAGC TTCGACGACG CCATCGCCGG CTGCACCGGC 240241 GTCTTCCACG TCGCCACGCC CATGGACTTC GACTCCCAAG ACCCCGAGAA CGAGGTGATC 300301 AAGCCGACGG TGGAAGGGAT GCTGAGCATC ATGAGGGCCT GCAAAGAGGC TGGCACCGTG 360361 AAGCGCATCG TCTTCACCTC CTCCGCCGGC AGCGTCAACA TCGAGGAGCG GCAGCGGCCA 420421 GCCTACGACC AGGACAACTG GAGCGACATC GACTTCTGCC GCCGCGTCAA GATGACAGGA 480481 TGGATGTACT TCGTGTCCAA GGCCCTGGCA GAGAAGGCCG CCATGGAGTA CGCCAGCGAG 540541 AACGGCCTGG ACTTCATCAG CATCATCCCC ACGCTCGTCG CCGGCACCTT CCTCAGCGCC 600601 GGCATGCCGC CCAGCCTCGT CACCGCCCTC GCGCTCATCA CCGGGAACGA GGCCCACTAC 660661 TCGATCCTGA AGCAGGTGCA GCTGGTCCAC CTGGACGACC TCTGCGACGC CATGACCTTT 720721 CTCTTCGAGC ACCCGGAGGC CAACGGCCGC TACATCTGCT CCTCCCACGA CGCCACCATC 780781 CACGGCCTCG CCACGATGCT CCGGGACAGG TTCCCCGAGT ACCGCATCCC GCACAAGTTC 840841 CCGGGGGTCG ACGACGACCT CCAGCCCATC CACTTCTCCT CCAGGAAGCT CCTCGACCAC 900901 GGCTTCAGCT TCCGGTACAC CGCCGAGGAC ATGTTCGACG CCGCCATCCG CACCTGCAGG 960961 GAGAAGGGCC TCATTCCTCT CGGAGACGCC CCGCCGCCTG CAGCCGCCGG CAAGCTGGGA 10201021 GCTCTTGCTG CGGGGGAAGG CCAAGCCATT GGTGCCGAGA CATAATAAGC CAGCGCTGCT 10801081 GCATGAATAC TATTCTTGTG TTCGGAATTT GCATGGGCAG AGCCCTGTAA CTAGTGGGAT 1140
1141 ATCATGGACT ATGGAGTGCA TCAAATTTTT TTCACCTCGG CAGTAGTATG AAATAAAATT 12001201 GAAAATAACG CATAAAAAAA AAAAAAAAAA 1230(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度354氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述1 MDGKKGPVVV TGASGFVGSW LVMKLLQAGY TVRATVRDPA NVEKNKPLLE LPGAKERLSI 6061 WKADLSDQGS FDDAIAGCTG VFHVATPMDF DSQDPENEVI KPTVEGMLSI MRACKEAGTV 120121 KRIVFTSSAG SVNIEERQRP AYDQDNWSDI DFCRRVKMTG WMYFVSKALA EKAAMEYASE 180181 NGLDFISIIP TLVAGTFLSA GMPPSLVTAL ALITGNEAHY SILKQVQLVH LDDLCDAMTF 240241 LFEHPEANGR YICSSHDATI HGLATMLRDR FPEYRIPHKF PGVDDDLQPI HFSSRKLLDH 300301 GFSFRYTAED MFDAAIRTCR EKGLIPLGDA PPPAAAGKLG ALAAGEGQAI GAET354从不同颜色四个品种的小麦幼叶中提取基因组DNA，然后用HindIII限制性内切酶进行酶切，以TaDFR1的一段序列为模板合成探针进行Southern杂交分析(见附图2)。结果显示，在小麦基因组中存在五个DFR基因的同源基因，这五个基因也就是TaDFR1、TaDFR2、TaDFR3、TaDFR4、TaDFR5。另外，通过对不同的小麦组织器官进行的Northen杂交分析以及不同颜色的种皮中mRNA分离后的杂交分析表明，TaDFR1基因在胚芽鞘以及种皮中均有表达(附图3)。
构建TaDFR1正义表达载体，利用渗透法转化拟南芥，收获的种子在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在GM培养基上与野生型共同培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株的叶片及其萼片的颜色不同程度的变紫(附图4)。根据叶片颜色的深浅，我们应用RT-PCR验证可以得出，叶片颜色越深，TaDFR1基因的表达量越高。
根据上述技术，从小麦中分离到了TaDFR1、TaDFR2、TaDFR3、TaDFR4、TaDFR5基因，并构建TaDFR1的正义表达载体，转化拟南芥。结果显示，TaDFR1基因的过量表达能导致转基因拟南芥叶片颜色变紫，且萼片部分变紫。天然的色素具有食用、医疗以及观赏功能，因此，该基因转化各种作物及蔬菜，将会使这些作物的食用部分变紫，具有非常重要的经济价值和社会价值。
图1小麦中TaDFR1、TaDFR2、TaDFR3、TaDFR4、TaDFR5与水稻、玉米、拟南芥中DFR氨基酸的同源性比较。
图2TaDFR1基因Southern杂交A白农66；B扬麦158；C漯珍一号；D黑麦76图3TaDFR1基因Northern杂交R根；S茎；L叶C13天的胚芽鞘；C26天的胚芽鞘G1黑麦76的25天种皮；G2漯珍一号的25天种皮；G3扬麦158的25天种皮；G4白农66的25天种皮图4转基因拟南芥与野生型的对比W野生型拟南芥；T转基因拟南芥；A野生型拟南芥的叶片；B转基因拟南芥的叶片；C转基因拟南芥的早期萼片；D转基因拟南芥的后期萼片；E野生型拟南芥的萼片(五)具体发明实施方式实施方式1紫色小麦TaDFR1基因的克隆方法(1)RNA的提取利用RNA kit提取总RNA。
(2)DNA第一条链的合成取2μg总RNA，加入5×反应缓冲液4μl，10mM脱氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反转录酶(10u/μl)2μl，42℃反应60分钟，85℃放置10分钟终止反应，稀释至200μl。
(3)CR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为首先将下列试剂混在一起10×反应缓冲液 5μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM) 4μl反向引物(5μM) 4μl模板cDNA 4μlTaq DNA聚合酶0.5μl总体积 50μlPCR反应条件为94℃ 3分钟；然后进入下列循环94℃ 1分钟，56℃1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
(4)基因克隆取2μl PCR与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T and pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
(5)质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。
(6)序列测定本工作在大连宝生物工程公司进行。
(7)3′序列的分离按Clontech公司的SMART RACE cDNAAmplification Kit说明书进行。
(8)同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。
实施方式2紫色小麦中二氢黄酮醇还原酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列见“发明内容”部分。
实施方式3表达载体的构建(1)根据分离出的TaDFR1的核苷酸序列，设计引物正向引物5′-GTTCTAGAATGGACGGGAANAAAGGG-3′反向引物5′-AGGTCGACTTATGTCTCGGCACCAAT-3′以种皮总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。
(2)取2μl PCR产物与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T and pGEM-T easy Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
(3)用XabI和SacI两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T载体上切下，与相同酶酶切的pBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
(4)将构建好的表达载体转化农杆菌GV3101。
实施方式4基因功能分析(1)种植拟南芥。
(2)挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
(3)离心收集菌体，沉淀用渗透培养基(5％蔗糖，0.1M MgCl2，0.5％Silwet L-77)悬浮，菌液OD600在0.8左右。
(4)将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。
(5)收获的种子在筛选培养基(1×MS盐，1％蔗糖，pH5.7，0.8％琼脂，卡那霉素30μg/ml)筛选，得到抗性植株。
(6)转基因植株表型分析(见附图4)。
序列表<110>山东农业大学<120>紫色小麦二氢黄酮醇还原酶基因及其克隆与应用<160>1<170>patent In 3.1<210>1<211>1230<212>cDNA<213>小麦(Triticum aestivum)<221>1-1230<400>11ATGGACGGGA AGAAAGGGCC GGTGGTGGTG ACCGGAGCGT CGGGTTTCGT AGGGTCATGG 6061 CTCGTCATGA AGCTCCTCCA GGCCGGGTAC ACCGTCCGGG CCACCGTGCG CGACCCGGCC 120121 AACGTTGAGA AGAACAAGCC GTTGCTGGAG CTTCCCGGAG CCAAAGAGCG GCTGTCCATC 180181 TGGAAGGCCG ACCTGAGCGA CCAAGGCAGC TTCGACGACG CCATCGCCGG CTGCACCGGC 240241 GTCTTCCACG TCGCCACGCC CATGGACTTC GACTCCCAAG ACCCCGAGAA CGAGGTGATC 300301 AAGCCGACGG TGGAAGGGAT GCTGAGCATC ATGAGGGCCT GCAAAGAGGC TGGCACCGTG 360361 AAGCGCATCG TCTTCACCTC CTCCGCCGGC AGCGTCAACA TCGAGGAGCG GCAGCGGCCA 420421 GCCTACGACC AGGACAACTG GAGCGACATC GACTTCTGCC GCCGCGTCAA GATGACAGGA 480481 TGGATGTACT TCGTGTCCAA GGCCCTGGCA GAGAAGGCCG CCATGGAGTA CGCCAGCGAG 540541 AACGGCCTGG ACTTCATCAG CATCATCCCC ACGCTCGTCG CCGGCACCTT CCTCAGCGCC 600601 GGCATGCCGC CCAGCCTCGT CACCGCCCTC GCGCTCATCA CCGGGAACGA GGCCCACTAC 660661 TCGATCCTGA AGCAGGTGCA GCTGGTCCAC CTGGACGACC TCTGCGACGC CATGACCTTT 720721 CTCTTCGAGC ACCCGGAGGC CAACGGCCGC TACATCTGCT CCTCCCACGA CGCCACCATC 780781 CACGGCCTCG CCACGATGCT CCGGGACAGG TTCCCCGAGT ACCGCATCCC GCACAAGTTC 840841 CCGGGGGTCG ACGACGACCT CCAGCCCATC CACTTCTCCT CCAGGAAGCT CCTCGACCAC 900901 GGCTTCAGCT TCCGGTACAC CGCCGAGGAC ATGTTCGACG CCGCCATCCG CACCTGCAGG 960961 GAGAAGGGCC TCATTCCTCT CGGAGACGCC CCGCCGCCTG CAGCCGCCGG CAAGCTGGGA 10201021 GCTCTTGCTG CGGGGGAAGG CCAAGCCATT GGTGCCGAGA CATAATAAGC CAGCGCTGCT 10801081 GCATGAATAC TATTCTTGTG TTCGGAATTT GCATGGGCAG AGCCCTGTAA CTAGTGGGAT 11401141 ATCATGGACT ATGGAGTGCA TCAAATTTTT TTCACCTCGG CAGTAGTATG AAATAAAATT 12001201 GAAAATAACG CATAAAAAAA AAAAAAAAAA 1230
权利要求
1.一种克隆的紫色小麦二氢黄酮醇还原酶基因TaDFR1，其特征在于它具有下述所示的序列1 ATGGACGGGA AGAAAGGGCC GGTGGTGGTG ACCGGAGCGT CGGGTTTCGT AGGGTCATGG 6061CTCGTCATGA AGCTCCTCCA GGCCGGGTAC ACCGTCCGGG CCACCGTGCG CGACCCGGCC 120121 AACGTTGAGA AGAACAAGCC GTTGCTGGAG CTTCCCGGAG CCAAAGAGCG GCTGTCCATC 180181 TGGAAGGCCG ACCTGAGCGA CCAAGGCAGC TTCGACGACG CCATCGCCGG CTGCACCGGC 240241 GTCTTCCACG TCGCCACGCC CATGGACTTC GACTCCCAAG ACCCCGAGAA CGAGGTGATC 300301 AAGCCGACGG TGGAAGGGAT GCTGAGCATC ATGAGGGCCT GCAAAGAGGC TGGCACCGTG 360361 AAGCGCATCG TCTTCACCTC CTCCGCCGGC AGCGTCAACA TCGAGGAGCG GCAGCGGCCA 420421 GCCTACGACC AGGACAACTG GAGCGACATC GACTTCTGCC GCCGCGTCAA GATGACAGGA 480481 TGGATGTACT TCGTGTCCAA GGCCCTGGCA GAGAAGGCCG CCATGGAGTA CGCCAGCGAG 540541 AACGGCCTGG ACTTCATCAG CATCATCCCC ACGCTCGTCG CCGGCACCTT CCTCAGCGCC 600601 GGCATGCCGC CCAGCCTCGT CACCGCCCTC GCGCTCATCA CCGGGAACGA GGCCCACTAC 660661 TCGATCCTGA AGCAGGTGCA GCTGGTCCAC CTGGACGACC TCTGCGACGC CATGACCTTT 720721 CTCTTCGAGC ACCCGGAGGC CAACGGCCGC TACATCTGCT CCTCCCACGA CGCCACCATC 780781 CACGGCCTCG CCACGATGCT CCGGGACAGG TTCCCCGAGT ACCGCATCCC GCACAAGTTC 840841 CCGGGGGTCG ACGACGACCT CCAGCCCATC CACTTCTCCT CCAGGAAGCT CCTCGACCAC 900901 GGCTTCAGCT TCCGGTACAC CGCCGAGGAC ATGTTCGACG CCGCCATCCG CACCTGCAGG 960961 GAGAAGGGCC TCATTCCTCT CGGAGACGCC CCGCCGCCTG CAGCCGCCGG CAAGCTGGGA 10201021 GCTCTTGCTG CGGGGGAAGG CCAAGCCATT GGTGCCGAGA CATAATAAGC CAGCGCTGCT 10801081 GCATGAATAC TATTCTTGTG TTCGGAATTT GCATGGGCAG AGCCCTGTAA CTAGTGGGAT 11401141 ATCATGGACT ATGGAGTGCA TCAAATTTTT TTCACCTCGG CAGTAGTATG AAATAAAATT 12001201 GAAAATAACG CATAAAAAAA AAAAAAAAAA 1230
2.根据权利要求1所述的一种克隆的紫色小麦二氢黄酮醇还原酶基因TaDFR1的功能，其特征在于该基因在拟南芥中过量表达，显著促进花色素的生成。
全文摘要
本发明涉及紫色小麦二氢黄酮醇还原酶TaDFR1基因的克隆、重组及促进花色苷生成的功能分析与应用，属于分子生物学和生物技术领域。从紫色小麦种皮中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的二氢黄酮醇还原酶保守的氨基酸序列，设计一对正向特异引物应用于3’RACE，进行常规聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到pGEM－T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后用3’特异引物和5’兼并引物快速扩增获得全长的cDNA。进一步构建正义表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥的叶片呈现紫色且萼片部分变紫。天然的色素具有许多医疗、保健功能以及重要的观赏价值。因此，该基因转化各种作物及蔬菜，具有非常重要的经济价值和社会价值。
文档编号C12N15/53GK1632125SQ20041003591
公开日2005年6月29日 申请日期2004年10月13日 优先权日2004年10月13日
发明者张宪省, 刘茂森, 李祥 申请人:山东农业大学