专利名称：体外扩增特定环形或串联体核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种体外扩增环形或串联核酸即DNA的方法。特别地，本发明涉及无细胞体系中扩增环形或串联DNA的方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是一个强大的快速指数扩增目标核酸的方法，如美国专利U.S.Pat.No.4,683,195和4,683,202公开的技术方案。PCR已经成为分子生物学的核心技术，PCR使基因分离鉴定和分子克隆技术得到巨大发展，包括基因测序、等位基因的鉴定、以及传染病和遗传病的检测等等。PCR是通过热循环将DNA模板和引物进行加热变性、引物与互补DNA链复性、并用耐热DNA聚合酶延伸引物来实现扩增的。采用多个PCR循环可使位于两条引物之间的核酸序列得到指数扩增。
当今PCR是最常用、最有效的体外核酸扩增方法。但PCR扩增的主要局限性在于只能使扩增位于两条引物之间的核酸序列，而无法直接扩增位于两条引物之外的序列。尽管已经发展了各种技术来弥补这个缺陷，例如反向PCR，快速扩增cDNA末端(RACE)等。但是扩增在已知序列侧翼含有未知序列的全长序列仍然是一个具有挑战性的工作。
例如目前进行染色体步移或分离全长cDNA的方法主要包括构建和筛选文库、反向PCR和RACE等。构建全基因组文库或者全长cDNA文库并从中筛选目标序列是非常繁琐费时、费力而又费钱的工作，并且具有很高的假阳性。相比而言，RACE和反向PCR较为省力和省钱，但也同样具有很多问题不仅需要克服困难和花费时间来设计、合成和检测合适的RACE引物和反向引物，并且需要进行一系列的PCR扩增。这些方法不仅可能会产生很高的假阳性，而且即使最终获得成功，所获得的序列也还只是几个片段，还需要根据获得序列再在末端重新设计合成一对新的引物，再次进行PCR扩增以获得含有全长序列的DNA分子。如果不能设计合适的末端引物，或者因片段过长而无法进行PCR扩增，则必须用酶切、连接和亚克隆来将这些片段重新连接成全长DNA分子，二者又是一个非常繁琐和费时费力的工作。
在PCR反应体系中加入耐热DNA连接酶，极大地改进了PCR技术，而且有望解决这个问题。Michael在1994年在PCR反应中加入耐热DNA连接酶，并采用标准的PCR循环条件，获得了带有定点突变的寡核苷酸的普通线性小片段DNA。利用扩增-连接(ligation-during-amplification，LDA)方法，Chen在1998年成功地在体外扩增形成了封闭的环形质粒(U.S.Pat.Nos.6,620,597)。尽管LDA是一项非常奇妙的DNA扩增技术，但不幸的是却并没有像预期的那样被广泛使用。自1997年发明LDA技术至今，它唯一的实际应用是2000年对绿色荧光蛋白进行了定点和半随机突变的可控进化研究。
相反，另一项与LDA完全不同但却又十分相关的全新技术--滚环复制(RCA)技术，已广泛的应用于很多领域。最近发展起来的链置换等温扩增技术包括RCA，LAMP等已广泛的应用于基础和应用研究。在这些方法中，RCA成为最具吸引力的核酸扩增技术。用RCA技术扩增小环形寡核苷酸探针已在各种研究领域中被广泛用于的信号放大。同时，RCA也用于体外扩增大的环形DNA，比如用于测序模板制备以代替增殖大肠杆菌和分离质粒或噬菌体等传统步骤。
RCA技术具有诸多优点而领先于LDA技术，使得LDA技术相形见绌。RCA这种“简单的力量”使之易于得到广泛应用。一般情况下DNA扩增技术的关键仅是扩增目的DNA，而不必管产物的结构是环形的还是线性串联的。因为只要扩增成功，便很容易选择合适的限制性内切酶将扩增产物切开并用DNA连接酶再环化。
RCA技术的诸多优势使其广泛被应用。然而，其用途并非完美了。在我们和其他研究者的实验中都发现RCA技术虽然灵敏，但在扩增大的DNA环时扩增效率既不高又不稳定。RCA经常会产生错误结果，比如扩增出非目的序列或随机序列。值得指出的是，虽然phi 29 DNA聚合酶能够持续合成DNA，并可发生链置换反应，但它只能在较低的温度(大约30℃左右)下工作。在用phi 29DNA聚合酶扩增大的DNA环时，不能用序列特异引物，因为序列特异引物需要较高的温度才能与模板链的正确位置退火。另外，用序列特异引物扩增大的环形或线性DNA时耗时长、效率低，所以通常使用随机引物代替序列特异性引物进行多分枝扩增(hRCA)，这使得RCA反应更为灵敏，但是也使之失去了特异性和选择性。实际上，在一个典型的采用随机引物并由phi 29 DNA聚合酶催化的RCA反应中，如果模板DNA包括一种以上的DNA环，那么所有的环将被无选择性地扩增。如果模板DNA包括长的线性DNA，如细菌或真核生物的基因组DNA，那么线性DNA也将与环形DNA同时被扩增。更严重的是即使没有模板DNA，仅凭随机引物phi 29 DNA聚合酶也能产生很多的随机序列。
发明内容
本发明的目的之一为提供一种能快速有序的在体外产生和扩增环形或串联DNA的方法。
本发明另一个发明目的为提供在体外产生和扩增环形或串联DNA并改变其核苷酸组成和序列的方法。
本发明还有一个发明目的为提供在体外快速有序地选择性地扩增环形或串联DNA的方法。
在阐述体外无细胞体系中扩增并产生环形或串联DNA的方法之前，首先应该说明的是本发明并不仅限于这里所陈述的特定的配置，过程步骤以及材料，因为这些配置，过程步骤以及材料都可能在某种程度有所改变。另外还需说明，这里所用的名词术语仅用于阐述特定的具体实施方式
，而不是要使本发明仅限于所用的名词术语所限定的范围，因为本发明的范围仅由所附加的权利要求及其他与之相当的条款来限定。
在本说明书以及权利要求中，除文中清楚地说明了以外，反应体系中加入“一种耐热DNA连接酶”时，也可包括加入2种或2种以上耐热DNA连接酶混合物；在反应体系中加入“一种耐热DNA聚合酶”时，也可包括加入2种或2种以上耐热DNA聚合酶混合物；说“一种模板”包括2种或2种以上的混合模板。等等。
在阐述本发明时，需要用到下列名词术语，在这里给出其定义在这里所用“连环扩增”，“连串扩增”，“ligation circle amplification”，“ligation concatemeric amplification”，“LCA”，等名词的含义是指在PCR反应体系中加入耐热DNA连接酶，并用合适的反应条件扩增产生环形或串联DNA。亦即反应条件使引物能够延伸，新生DNA链能够变性、并以串联的形式复性和连接，使相邻的5’-磷酸基和3’-羟基形成磷酸二酯键，从而形成环形或串联DNA。这些5’-磷酸基通常是由5’-磷酸化的引物提供的，而这些5’-磷酸基既可以在引物合成之后用T4多核苷酸激酶催化产生，也可以在合成引物时直接进行5’-磷酸化。
这里所说的“聚合酶链式反应”或“PCR”指的是用至少两条引物和一种DNA聚合酶扩增一段线性DNA的过程。PCR技术在美国专利文献U.S.Pat.No.4,683,195 and U.S.Pat.No.4,683,202中已有描述。PCR一般是通过热循环处理PCR反应混合物，使DNA模板和引物进行加热变性(通常约为95℃左右)、引物与互补DNA链复性(通常约为50℃左右)、并用耐热DNA聚合酶延伸引物来实现扩增的(通常约为72℃左右)。采用多个PCR循环可使位于两条引物之间的核酸序列得到指数扩增。
这里所说的“PCR反应混合物”或者“PCR反应体系”指的是包含进行PCR扩增所需的各种成分的混合物。PCR反应混合物包含适量的耐热DNA聚合酶、模板DNA、一对引物(其中一条与模板DNA的正链结合，另一条与负链结合)、ATP、四种三磷酸核苷酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)以及适当的缓冲液，盐类，防腐剂、去污剂和水等。
这里所说的“耐热DNA聚合酶”指的是能够在与非耐热DNA聚合酶相比较高温度下合成DNA，并且经过多次高温热循环后仍然能够保持其DNA合成活性的DNA聚合酶。例如Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus DNA polymerase)能够在74℃复制DNA，并且在95℃保温30分钟后仍然保持活性。(A.Chienet al.，127 J.Bacteriol.1550，1976；A.S.Kaledin et al.，45 Biokhimiya 494，1980)。耐热DNA聚合酶可以通过商业途径购买。例如美国专利U.S.Pat.No.4,889,818中陈述了从Thermos aquaticus中分离纯化了这种耐热DNA聚合酶。本发明采用了TaKaRa公司供应的LA-Taq DNA聚合酶，该酶具有校正功能，因而与普通Taq酶相比较，在DNA复制时具有较高的保真度，适合于长距离、大片段DNA的扩增。另外New England Biolabs公司提供Vent DNA聚合酶，具有比Taq DNA聚合酶更高的保真度，也适合本发明使用。
这里所说的“耐热DNA连接酶”指的是能够在与非耐热DNA连接酶相比较高温度下连接DNA，并且经过多次高温热循环后仍然能够保持其DNA连接活性的DNA连接酶。耐热DNA连接酶可以通过商业途径购买。例如Pfu DNA连接酶是从Pyrococcus furiosus中分离出来的一种耐热DNA聚合酶；(U.S.Pat.Nos.5,506,137和5,700,672)，可从Stratagene公司购买到。此酶在45℃至80℃催化双链DNA上相邻的5’-磷酸基和3’-羟基。此酶具有很高的热稳定性，在95℃下半衰期可以保持60分钟以上。此酶封闭缺口的最佳温度为70℃。
本发明所采用的Taq DNA连接酶，是从Thermus aquaticus中提取的。此酶催化双链DNA上相邻的5’-磷酸基和3’-羟基形成磷酸二酯键。Taq DNA连接酶在45℃ to 65℃下具有活性。(F.Barany，88 Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 189(1991)；M.Takahashi et al.，259 J.Biol.Chem.10041-10047，1984)再例如AMPLIGASETM耐热DNA连接酶(Epicentre Technologies)催化NAD-依赖性的连接双链DNA上相邻的5’-磷酸基和3’-羟基形成磷酸二酯键。此酶在65℃下半衰期达48小时，95℃下半衰期可达1小时。此酶在经历500个或16个小时的热循环(94℃/80℃)后依然保持活性(M.Schalling et al.，4 NatureGenetics 135，1993)。
需要注意的是，很多酶类包括DNA聚合酶和DNA连接酶需要辅助因子才能表现活性。例如Taq DNA连接酶需要NAD+作为辅助因子。因此在Taq DNA连接酶催化的反应混合物中必须加入适量的NAD+。
这里所说的“适合于模板变性的温度”，指的是能够使模板DNA融解变性的温度，这个温度与很多因素有关，如溶液中单价阳离子的浓度，模板DNA的GC含量、长度、有无错配碱基，以及其他影响溶解的溶质。众所周知根据这些因素来确定一定条件下DNA的溶解温度(Tm)依靠的是经验公式。一般选择高于Tm值的温度作为变性温度。
这里所说的“适合于引物与变性的模板退火并适台连接酶连接新链的温度”，指的是使单链的引物能够与变性的单链模板DNA杂交结合的温度。影响变性温度的因素同样也影响退火。由于引物的长度一般为10-40核苷酸，而短核酸的退火温度比长核酸的要低，因而退火温度比变性温度要低得多。
退火温度一般为45-65℃。在45-65℃这个温度下进行退火，Taq DNA连接酶也被激活了，因为这刚好是Taq DNA连接酶最适的工作温度范围。因而新生成的正链和负链会互相退火和连接。一种可能的退火和连接形式是形成了新的环形DNA；另外一种形式是许多新合成的链串联产生高分子量的线性或环形DNA。不论哪种方式为主都会导致环形或串联目的DNA得到指数扩增。
这里所说的“适合于聚合酶催化引物延伸的温度”，指的是耐热DNA聚合酶具有活性，能够催化引物延伸，即利用四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP，dTTP，dGTP和dCTP)合成与模板DNA互补的新链的温度。这个温度应该接近耐热DNA聚合酶的最佳温度但高于用来连接新链的耐热DNA连接酶的最佳温度。例如Taq DNA聚合酶的最大活性温度范围约为72-80℃，Taq DNA连接酶的最大活性温度范围约为45-65℃，因而延伸温度选择为72-75℃。以防止新链在引物延伸完毕后，未经变性便立即被封闭，形成拓扑上互相缠绕的闭合环形DNA。
为实现上述发明目的，本发明采用了下述技术方案。
一种体外扩增特定环形或串联体核酸(DNA)的方法，它包括LCA反应体系的构成含有目标序列的环形DNA或线性串联DNA作模板，一对5’磷酸化的寡核苷酸引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，耐热DNA连接酶和带有3’→5’校正活性的耐热DNA聚合酶，以及适当的缓冲体系，包括耐热DNA连接酶需要的辅助因子(如Taq DNA连接酶所需要的NAD)等。将LCA反应体系在94℃至99℃预变性5至10分钟后，再进行一定数目的热循环处理。耐热DNA连接酶和耐热DNA聚合酶可在预变性之前加入，也可再预变性之后再加入。循环数目为1至40个循环，每个循环包括三个步骤(1)变性保温于一个适宜于模板DNA变性的温度下，通常为90～99℃，持续时间1秒至5分钟；优选温度为94～95℃，持续时间10秒至2分钟；(2)复性和连接保温于一个适宜于引物和模板之间，以及模板和模板之间相互退火，并且适宜于耐热DNA连接酶催化连接新链的温度，以形成环形或串联体DNA。此温度通常30～85℃，持续时间10秒到15分钟；优选45～65℃，持续时间1分钟到5分钟。
(3)延伸保温于一个适合于耐热DNA聚合酶催化引物延伸，但不适合耐热DNA连接酶催化连接封闭新生DNA链的温度，以防止引物延伸完成后未经变性和复性，随即封闭生成拓扑上互相缠绕的封闭环形DNA。此温度通常为65～85℃，持续时间1分钟到30分钟，优选72～75℃，持续时间1分钟到20分钟。
如果所有引物与模板DNA完全匹配，即可扩增出无突变的环形或串联体DNA。
如果在引物中引入至少一个与模板DNA在特定位置错配的碱基，即可扩增出带有定点突变的环形或串联体DNA。
如果者四种dNTPs之一带有同位素、生物素、地高辛或者荧光标记，即可扩增出带有同位素、生物素、地高辛或者荧光标记的环形或串联体DNA。
如果四种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)之一被以任何形式修饰，则这种修饰核苷酸即可随机掺入扩增产物，扩增出带有这种修饰的环形或串联体DNA。
如果引物含有修饰或标记的核苷酸，则该修饰或标记的核苷酸可被定点引入到扩增出的环形或串联DNA中。
LCA是一项具有全新的复制模式的DNA扩增技术。LCA的假设复制机理如图1，理论上在模板DNA变性和引物结合之后，当耐热DNA聚合酶在72℃温度下完成了新链的合成时，此时因为温度高于耐热DNA连接酶的最适工作温度45-65℃，因而耐热DNA连接酶没有活性或者活性很低，这就防止了新链立即被封闭环化。在下一个循环中95℃变性时，新合成的链与旧模板环分离成为自由链；下一步45-65℃再复性和连接时，Taq DNA连接酶被激活，因为此时温度恰好是其最适温度，新合成的正链与负链相互退火并连接。一种可能的退火和连接形式形成新的单拷贝环形DNA；另外一种复性和连接形式是许多新合成的链互相串连产生高分子量的线性或环形串联DNA。不论哪种复性和连接方式为主都会导致环形目的DNA得到指数扩增。不论哪种复性和连接方式为主都会导致环形目的DNA得到指数扩增。
本发明中，在PCR反应中加入耐热DNA连接酶，并延长退火和延伸时间，就可以在一个热循环反应中得到环形和线性串联DNA，我们把此项技术命名为连环扩增(ligation circle amplification，LCA)，或者叫连串扩增(ligationconcatemeric amplification，LCA)。利用连环扩增技术，快速而高效的得到已知和未知的基因序列就变得非常简单了。不需要任何接头、连接物、RACE引物、反向引物和末端引物，只需从已知序列或同源基因的保守序列中选择一对特异性引物，就可以从环化或串联化的模板DNA中扩增出目的基因。LCA技术在许多领域里都有广泛潜在的应用，比如染色体步移，基因寻找，全长cDNA分离，信号扩增和无细胞体系DNA生产包括测序模板制备，定点突变，DNA修饰和DNA重组等。
本发明中，上述的连环扩增方法是利用耐热DNA聚合酶和耐热DNA连接酶来对目的基因进行体外扩增。用共价连接闭合的环形DNA或共价串联线性DNA作为模板进行连环扩增，产生高分子量的线形或环形串联DNA，在3-8小时内目的DNA便可被扩增10,000倍。避免了传统的转化大肠杆菌、培养扩增和分离质粒等步骤。高纯度的连环扩增产物可直接用于酶切、测序、杂交、克隆和文库构建等分子生物学操作。连环扩增过程也可在连环扩增产物中掺入修饰或标记的核苷酸或寡核苷酸，以满足更为特殊的用途。
LCA与LDA技术有根本性的区别。虽然在反应混合物中应用相似的原料，但是LCA的反应温度循环控制程序与LDA完全不同，并且要比LDA简单得多。LCA技术的主要目的和特征不是产生闭合环形DNA，而是产生高分子量环形或串联DNA。Chen认为在普通PCR循环的三个步骤之后再增加95℃变性和72℃退火步骤，对形成闭合环形DNA是至关重要的。这些增加的步骤抑制了引物与模板结合，并允许标准的短PCR产物与模板退火，作为超长引物(megaprimer)，启动LDA反应，扩增出整个环形分子。实质上，LDA要求在延伸完成后直接连接并环化新生链，而LCA要求新生链在经过热变性之后，相互退火并连接成为单拷贝的闭合环形或多拷贝互相连接的串联DNA。LCA的温控程序比LDA简单得多，与普通PCR几乎相同，仅仅延长了退火时间，以保证连接过程的完成。LCA反应比LDA反应易于发生，因而稳定且容易控制。
虽然LCA与RCA的产物相似，都含有串联DNA，但LCA与RCA反应也有根本的不同。在RCA反应中，长的线性串联分子是通过phi29 DNA聚合酶单独催化的连续滚动合成和替换模板链而生成的。在LCA反应中，环形或串联DNA是由两种热稳定的酶并行协作来完成的Taq DNA聚合酶进行复制，TaqDNA连接酶进行连接。形象而言，如果把RCA比喻成长跑，那么LCA就像是接力赛。这就是LCA比RCA效率高的原因。另外，RCA反应必须采用无校正活性的DNA聚合酶，如phi 29DNA聚合酶、Vent R(exo-)、Bst DNA聚合酶等；LCA反应采用的LA-Taq DNA聚合酶具有校正活性，应该能够比RCA更精确地复制目标。
除了扩增环形或串联DNA外，本发明的另一个重要用途是对环形或串联DNA进行定点突变。在LCA反应中加入一条活多条突变引物，环形或串联DNA即可被稳定地突变和扩增。与其他方法相比，用LCA方法进行突变具有很多优点。
在以PCR方法为基础的突变中，先用突变引物对要突变的序列进行扩增，然后对突变的DNA片段进行纯化和亚克隆，再替换原来的片段。用LCA方法突变后产生的突变质粒中有一部分是环形的，不需要进行亚克隆，可以直接用于转化宿主细菌，或者采用适当的限制性内切酶切割，使串联的突变质粒变为单拷贝突变质粒，再自身连接环化后转化宿主细菌。如果原来质粒中含有一个Cre/lox识别位点，或者用LCA方法在突变的质粒中引入一个Cre/lox识别位点，则可以用Cre重组酶将串联质粒DNA环化为单拷贝质粒。由于无论是直接转化、切割后自身连接环化，还是用Cre/lox系统进行环化，转化效率和突变效率都很高，因而用LCA方法进行基因定点突变具有非常简便、快捷而又高效的优点。
在PCR反应中加入耐热DNA连接酶进行定点突变已有报道。该方法在PCR反应中加入了一种耐热DNA连接酶和一条与PCR产物内部互补的突变引物。在PCR反应过程中，耐热DNA连接酶将突变引物连接到PCR产物中。然后与其他PCR方法一样，将产生的突变PCR产物纯化并亚克隆到原来的质粒中去。显然该方法的作者没有想到能够用耐热DNA连接酶和PCR反应直接产生环形或串联质粒DNA，而不需要进行纯化和亚克隆PCR产物。
本发明可用序列特异性的引物扩增环形或串联DNA，除可用于DNA扩增和突变外，还可能有(但不限于)以下应用(1)从连接产物中直接选择扩增插入片段具有一定插入方向的质粒或其他环形载体DNA。插入片段的插入方向错误的质粒或其他载体不会被扩增。
(2)从转化的琼脂培养皿上的单克隆中直接扩增目的质粒，因而用LCA方法进行克隆筛选或者制备测序模板，不需要费时费力的液体培养和质粒提取等传统步骤。
(3)检测点突变或者单核苷酸多态性。用5’-末端带有一个错配碱基的寡核苷酸，可以把具有相应突变的环形DNA连接并扩增出来，而没有该突变的环形DNA不能被扩增，以鉴别点突变或者单核苷酸多态性。或者将5’-末端带有一个错配碱基的寡核苷酸探针与目标DNA杂交，用连接酶连接环化，并用LCA方法扩增，只有具有相应突变的DNA才能够使探针被连接环化并被扩增出来，而没有该突变的DNA不能使探针被连接环化并被扩增，从而鉴别点突变或者单核苷酸多态性。
(4)在LCA反应中加入修饰核苷酸，制备带有随机掺入修饰核苷酸的环形或串联DNA，或者在LCA反应中适用与特定位点互补的带有修饰核苷酸的引物，制备定点掺入修饰核苷酸的环形或串联DNA。这些修饰DNA分子可用于DNA-DNA，DNA-PNA以及DNA-蛋白质相互作用等研究。
(5)从基因组或者cDNA文库中分离扩增带有特定基因或序列DNA片段的载体。用LCA方法筛选文库大大简化了基因发现的过程，目标克隆可很快就得到分离和分析。
(6)从感染细胞或组织中分离和扩增环形或串联病毒或细菌DNA并进行诊断和鉴定。无需进行复杂的细胞培养，用LCA方法可在无细胞体系中安全地生产可复制的DNA，包括危险的病毒DNA。
(7)直接从真核生物细胞或组织中选择性扩增整个线粒体基因组或其他环形DNA用于诊断和鉴定从而省却了提取线粒体的过程。
(8)把线性DNA转化成环形或串联DNA。选择与两个末端都互补的引物进行LCA扩增反应，就可以把线性DNA转化成环形或串联DNA。
(9)把RNA转化成互补DNA并进行扩增。在LCA扩增反应之前或者在LCA扩增过程中，用反转录酶把RNA转录成互补DNA，再进行环化或串联扩增。
比较现有的DNA扩增技术，PCR通过热循环将线性或环形DNA扩增为线性小片段；RCA将环形DNA等温扩增为线性串联分子，LAMP将线形DNA等温扩增为线性串联分子；LDA通过热循环将环形DNA扩增为闭合环形分子，LCA则通过热循环将环形或串联DNA扩增为环形或串联分子。所以LCA兼具PCR，LDA和RCA等技术的特点。
LCA技术不仅具有选择性和特异性，而且简单、快捷和高效等优点。首先，在扩增大环DNA时，LCA反应仅需3-8小时，相对于RCA反应耗时12-18小时来说非常省时。其次，利用LCA技术扩增DNA大环效率高，我们已成功的扩增出了各种大小的环形DNA。目前我们利用LCA技术扩增出的最大的DNA环包括从基因组文库中分离的一个含有8kb插入片段的pUC19质粒和一个长16.5kb鲍鱼(Haliotis discus hannai)线粒体基因组。LCA扩增DNA长度的最大限度至少为20kb以上。利用LCA技术扩增大的环形DNA时，如果使用多条序列特异性引物还可进一步增加扩增效率。
LCA是一项既简单又有效的DNA扩增技术。通过LCA方法，我们可以用序列特异引物选择性地扩增任何具有一段已知序列的环形或串联DNA分子。LCA技术显然很容易实现完全自动化和实时监测，适用于大规模、高通量的DNA制备和检测。相信这项技术能广泛应用于分子克隆的多种领域，如染色体步移，基因寻找，全长cDNA分离，信号放大和无细胞体系生产DNA，包括测序模板制备，定点突变，DNA修饰和重组等均可完全在体外进行。总之，LCA是PCR技术的重大改进，也是RCA技术的有力替代品。
本发明体外扩增特定环形或串联体核酸的方法能广泛应用于分子生物学的各个领域，例如染色体步移，全长cDNA分离，基因寻找，信号扩增，分子克隆、基因治疗以及各种无细胞DNA制备，包括测序模板制备，定点突变，DNA修饰、DNA标记、DNA检测和重组等可完全在体外进行。
图1用本发明扩增环形或串联DNA的复制原理图。
附图中图例说明 引物 DNA聚合酶 DNA连接酶图2为电泳分离用本发明(LCA)扩增的pUC19质粒DNA，与从细菌培养物中分离提取的质粒以及分子量标准(Ladder)对比。
具体实施例方式
LCA是一项具有全新的复制模式的DNA扩增技术。LCA的假设复制机理如图1，在图1a中原始模板DNA变性，在图1b中复性和引物结合，耐热DNA聚合酶开始延伸引物合成新链，当耐热DNA聚合酶完成了新链的合成时，如图1c所示，此时反应体系温度高于Taq DNA连接酶的最适工作温度45-65℃，因而耐热DNA连接酶没有活性或者活性很低，这就防止了新链立即被封闭环化。在下一个循环中变性时，新合成的链与旧模板环分离成为自由链。再经复性和连接时，Taq DNA连接酶被激活，此时温度恰好是其最适温度，新合成的正链与负链相互退火并连接。一种可能是如图1h所示，经复制后的模板DNA经退火和连接形式形成新的单拷贝环形DNA；另外一种复性和连接形式是如图1e所示形成多拷贝串联DNA。多拷贝串联DNA又可作为原始模板，再经过变性和复性后，在图1f中和引物结合，由于在串联模板DNA中引物有多个结合位点，耐热DNA聚合酶可在多处延伸引物合成新链，当耐热DNA聚合酶完成了新链的合成时，如图1g所示，此时反应体系温度高于耐热DNA连接酶的最适工作温度45-65℃，因而耐热DNA连接酶没有活性或者活性很低，新链上的缺口不会立即被封闭，而在下一个循环中变性时，新合成的链与旧模板DNA分离成为自由链。再经复性和连接时，Taq DNA连接酶被激活，此时温度恰好是其最适温度，新合成的正链与负链再相互退火并连接，如此循环扩增形成高分子量线性或环形串联DNA。不论哪种复性和连接方式为主都会导致环形目的DNA得到指数扩增。
具体实施例方式
1为了证明用LCA方法扩增并产生环形和线性串联DNA的可行性，用不带插入片段或带有300bp至2kb插入片段的闭合环形天然质粒pUC19为模板，用本发明所述的方法进行扩增。
连环扩增闭合环形质粒DNA将10纳克天然闭合环形质粒pUC19(无插入片段或有300bp-2kb插入片段)和1.0μM M13正向、反向引物混合，加入到50μl反应体系，其中含有0.5xLA-Taq DNA聚合酶缓冲液(TaKaRa)、0.5x Taq DNA连接酶缓冲液(20mM Tris-HCl，25mM醋酸钾，10mM醋酸镁，1mM NAD+，10mM二硫苏糖醇，0.1％Triton X-100)以及400μM四种单核苷酸。95℃预变性5分钟后，向反应混合物中加入5单位LA耐热DNA聚合酶(TaKaRa)和40单位耐热DNA连接酶(New England Biolabs)。随后按照以下程序扩增30个循环95℃变性30秒，60℃复性和连接5分钟，72℃延伸3-5分钟。反应最后再在65℃延伸和连接15分钟。阴性对照反应条件与之相同但反映体系中不加耐热DNA连接酶。
连环扩增产物的序列测定、结构和功能分析连环扩增产物直接用双脱氧方法测序，并用以下方法分析它们的结构用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化。连环扩增产物和酶处理后的产物分别进行1％琼脂糖电泳和溴化乙锭染色。并将500ng pUC19连环扩增产物用EcoRI消化后，用T4 DNA连接酶(MBI)自身环化后转化大肠杆菌JM109以检测其功能。
连环扩增闭合环形DNA如图2所示，添加了耐热DNA连接酶的反应产物，电泳后在进样口附近有高分子量DNA，并沿泳道形成拖带(smear)，另外还有几条带的迁移率分别稍高、稍低或相似于天然线形pUC19电泳条带的迁移率。这些低分子量DNA条带是由一个，两个或几个新合成的线形质粒DNA链连接形成的环形或线性分子，高分子量DNA条带则是由几十个或几百个新链串联形成的线形或环形多联体分子。阴性对照PCR仅能扩增出两条引物之间的短片段。
图2中，1、分子量标准1kb ladder DNA marker(MBI)；2、线性天然质粒pUC19 EcoRI酶切(未用RNase A消化处理RNA)；3、pUC19的LCA扩增产物；4、含300bp插入片段的pUC19的LCA扩增产物；5、含500bp插入片段的pUC19的LCA扩增产物
6、pUC19的LCA扩增产物EcoRI酶切；7、含300bp插入片段的pUC19的LCA扩增产物EcoRI+HindIII酶切；8、含500bp插入片段的pUC19的LCA扩增产物EcoRI+HindIII酶切。
连环扩增产物结构的分析如图2所示，所有的连环扩增限制性酶切产物都产生了清晰的pUC19载体条带，并且它们的迁移率与从用pUC19转化的JM109大肠杆菌中分离的质粒限制性酶切产物的电泳条带相同。插入片段DNA的条带也非常清晰，表明高分子量连环扩增产物的基本构成单元与原来质粒是等同的。
序列测定和功能检测用M13F和M13R引物对10个连环扩增产物进行部分序列测定。获得的序列数据表明质粒和插入片段的序列基本上完全正确，只有不到0.001％的碱基置换，没有超出测序的精确度阈值。这表明LA-Taq DNA聚合酶在连环扩增的反应体系中具有较高的保真度。pUC19的连环扩增产物用EcoRI消化，T4 DNA连接酶自身环化后转化JM109大肠杆菌，转化率非常高(＞105cfu)，表明连环扩增产物依然保持其生物学功能。
具体实施例方式
2在这个具体实施方式
中，用具体实施方式
1相同的方法扩增了质粒pCMV2-EGFP，所用的5’磷酸化引物为CMV-F和BGH-R。扩增出来的环形或串联DNA，用EcoRI酶切后再用T4 DNA连接酶环化，转化大肠杆菌JM109，细菌表达了绿色荧光蛋白，可以直接在紫外线下直接观察。
所用引物序列如下
CMV-FCGCAAATGGGCGGTAGGCGTGBGH-RTAGAAGGCACAGTCGAGG具体实施方式
3在这个具体实施方式
中，用具体实施方式
1相同的方法扩增了质粒pCMV2-EGFP，所用的5’磷酸化引物为CMV-F和GFP-R。GFP-R含有三个随机核苷酸，可在绿色荧光蛋白基因内部定点导入突变。扩增出来的环形或串联DNA，用EcoR I酶切后再用T4 DNA连接酶环化，转化大肠杆菌JM109，细菌表达了突变的绿色荧光蛋白，可以直接在紫外线下直接观察。
所用引物序列如下CMV-FCGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGFP-RGCGGACTGNNNGCTCAGGTAG具体实施方式
4此例表明LCA能用于扩增大的环形或串联DNA。这利用LCA方法扩增了一个11kb的pUC19质粒，其中带有一个8kb的插入片段。扩增方法与具体实施方式
1基本相同，但是循环条件改为94℃变性30sec，50℃复性和连接5min，72℃延伸10min，以保证完整地扩增大质粒。结果表明大质粒和小质粒同样都可用LCA方法扩增，表明LCA方法可用于扩增分子克隆中常用的各种质粒载体。
具体实施例方式
5在这一具体实施方式
中，扩增条件参照具体实施方式
1，但在反应体系中加入了生物素标记的dUTP以代替部分dTTP。这样扩增出来的环形或串联DNA含有随机掺入的生物素-dUTP，可用于荧光原位杂交的探针DNA。这表明LCA方法可用于扩增含有随机掺入了修饰核苷酸的质粒DNA。
具体实施例方式
6在这一具体实施方式
中，扩增条件参照具体实施方式
1，但在引物合成中加入了生物素标记的dUTP以代替dTTP。这样扩增出来的环形或串联DNA含有定点掺入的生物素-dUTP，可用于荧光原位杂交的探针DNA。这表明LCA方法可用于扩增含有定点掺入了修饰核苷酸的质粒DNA。
具体实施例方式
7在这个具体实施方式
中，扩增条件参照具体实施方式
1，但是用小鼠基因组文库提取的混合DNA为模板，才用beta-肌动蛋白基因特异性引物，扩增出了小鼠beta-肌动蛋白基因。表明LCA方法可用于直接从基因组文库中扩增出目的基因，而不必按一般方法用探针杂交来筛选菌落获菌班。
具体实施例方式
8在这个具体实施方式
中，采用与具体实施方式
1相同的方法，设计SV40基因特异性引物，扩增出了SV40基因组DNA。结果表明LCA方法可用来在无细胞体系中安全地扩增病毒DNA。
具体实施例方式
9在这个具体实施方式
中，采用与具体实施方式
1相同的方法，用从小鼠基因组文库中跳去的单克隆菌落，直接扩增出了含有基因组DNA片段的质粒DNA。结果表明LCA方法可用于取代传统的费时费力的细菌培养和质粒提取，在体外无细胞体系中生产DNA，包括测序模板的制备。
具体实施例方式
10利用LCA方法扩增了一个长16.5kb鲍鱼(Haliotis discus hannai)线粒体基因组。扩增方法与具体实施方式
1基本相同，但是采用鲍鱼基因组DNA或其线粒体DNA为模板，采用4条引物(一对16SrDNA通用引物和一对细胞色素B基因通用引物)，循环条件为94℃变性30sec，50℃复性和连接5min，72℃延伸15min，以保证完整地扩增线粒体基因组。结果表明LCA能用于扩增线粒体DNA，同时说明在LCA反应中采用2条以上的引物可以增加扩增效率和长度。
具体实施例方式
11将10纳克天然闭合环形质粒pUC19(无插入片段或有300bp-2kb插入片段)和1.0μM M13正向、反向引物混合，加入到50μl反应体系，其中含有0.5xVent DNA聚合酶缓冲液(New England Biolabs)、0.5x Taq DNA连接酶缓冲液(20mM Tris-HCl，25mM醋酸钾，10mM醋酸镁，1mM NAD+，10mM二硫苏糖醇，0.1％Triton X-100)以及400μM四种单核苷酸。99℃预变性1分钟后，向反应混合物中加入5单位Vent耐热DNA聚合酶(TaKaRa)和40单位Taq耐热DNA连接酶(New England Biolabs)。随后按照以下程序扩增25个循环92℃变性30秒，45℃复性和连接10分钟，75℃延伸3-5分钟。反应最后再在65℃延伸和连接15分钟。结果表明LCA方法可用其他类型的耐热DNA聚合酶(如Vent DNA聚合酶)进行，并且反应条件、温度程序和循环数目等可以根据所采用的耐热DNA聚合酶的性质灵活改变。
具体实施例方式
12将10纳克天然闭合环形质粒pUC19(无插入片段或有300bp-2kb插入片段)和1.0μM M13正向、反向引物混合，加入到50μl反应体系，其中含有0.5xVent DNA聚合酶缓冲液(New England Biolabs)、0.5x pfu DNA连接酶缓冲液(MBI)以及400μM四种单核苷酸。99℃预变性1分钟后，向反应混合物中加入5单位Vent耐热DNA聚合酶(TaKaRa)和40单位pfu耐热DNA连接酶(MBI)。随后按照以下程序扩增35个循环99℃变性5秒，70℃复性和连接3分钟，80℃延伸3-5分钟。反应最后再在75℃延伸和连接15分钟。结果表明LCA方法可用其他类型的耐热DNA连接酶(如pfu DNA连接酶)进行，并且反应条件、温度程序和循环数目等可以根据所采用的耐热DNA连接酶的性质灵活改变。
权利要求
1.一种体外扩增特定环形或串联核酸的方法，将含有目标序列的环形核酸或线性串联核酸作模板、一对5’磷酸化的寡核苷酸引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸、耐热核酸连接酶和耐热核酸聚合酶，以及适当的缓冲体系，在90℃～99℃预变性1至30分钟后，再进行1至40个热循环处理，所述耐热核酸连接酶和耐热核酸聚合酶在所述预变性步骤前或者预变性步骤后加入均可，所述热循环包括如下三个步骤(1)变性保温于90～99℃，持续时间1秒至5分钟；(2)复性和连接保温于30～85℃，持续时间10秒到15分钟；(3)延伸保温于65～85℃，持续时间1分钟到30分钟。
2.根据权利要求1所述的体外扩增特定环形或串联核酸的方法，其特征在于所述引物与模板核酸完全匹配，扩增产物是无突变的环形或串联核酸。
3.根据权利要求1所述的体外扩增特定环形或串联核酸的方法，其特征在于所述引物中引入至少一个与模板核酸在特定位置错配的碱基，扩增产物是带有定点突变的环形或串联核酸。
4.根据权利要求1所述的体外扩增特定环形或串联核酸的方法，其特征在于所述四种三磷酸脱氧核糖核苷酸之一带有同位素、生物素、地高辛或者荧光标记，扩增产物是带有同位素、生物素、地高辛或者荧光标记的环形或串联核酸。
5.根据权利要求1所述的体外扩增特定环形或串联核酸的方法，其特征在于所述四种三磷酸脱氧核糖核苷酸之一被以任何形式修饰，则这种修饰核苷酸即可随机掺入扩增产物，扩增产物是带有这种修饰的环形或串联核酸。
6.根据权利要求1所述的体外扩增特定环形或串联核酸的方法，其特征在于所述引物含有修饰或标记的核苷酸，则该修饰或标记的核苷酸可被定点引入到扩增出的环形或串联核酸中，扩增产物是带有定点修饰的环形或串联核酸。
7.根据权利要求1所述的体外扩增特定环形或串联核酸的方法，其特征在于所述预变性步骤温度在94℃～99℃，持续时间1至10分钟；所述步骤(1)的变性温度为94～95℃，持续时间10秒至2分钟；所述步骤(2)的复性和连接温度为45～65℃，持续时间1分钟到5分钟；所述步骤(3)的延伸温度为72～75℃，持续时间1分钟到20分钟。
8.根据权利要求1所述的体外扩增特定环形或串联核酸的方法，其特征在于所述引物为2条或者2条以上。
全文摘要
本发明提供了一种体外扩增特定环形或串联核酸的方法，将含有目标序列的环形核酸或线性串联核酸作模板、一对5’磷酸化的寡核苷酸引物、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸、耐热核酸连接酶和耐热核酸聚合酶，以及适当的缓冲体系，在90℃～99℃预变性1至30分钟后，再进行1至40个热循环处理。所述热循环包括如下三个步骤(1)变性保温于90～99℃，持续时间1秒至5分钟；(2)复性和连接保温于30～85℃，持续时间10秒到15分钟；(3)延伸保温于65～85℃，持续时间1分钟到30分钟。本发明能快速有序的在体外产生和扩增环形或串联DNA，并可选择性地扩增环形或串联DNA。
文档编号C12P19/34GK1616669SQ20041003581
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月17日 优先权日2004年9月17日
发明者汪小龙, 包振民, 胡景杰, 张全启, 吕翠仙 申请人:包振民, 汪小龙