专利名称：草酸氧化酶法检测河豚毒素的制作方法
技术领域：
河豚毒素的检测方法(快速检测方法)背景技术 据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，河豚毒素现有的快速简便的检测技术主要为小鼠生物法(MU法)及荧光检测法。
小鼠生物法简便快速，为日本的官方检测河豚毒素的方法。但该类方法存在一些问题。首先，与河豚毒素共存的无机盐(如氯化钠，羧酸的单钠盐或双钠盐)和疏水(或大分子)氨基酸可明显地降低河豚毒素的相对毒力。其次，小鼠生物法检测的结果为提取液的总毒性，而非其中河豚毒素的准确含量。再次，由于小鼠个体之间的生物差异，造成该种检测方法重复性差。最后，用该种方法进行检测，需要进行小鼠储备，及标准化的饲养管理，一般的养殖业主及消费部门难以实现。由于诸种原因，使得该种方法难于大范围推广普及。
荧光检测法通过将河豚毒素用碱处理得到2-氨基-6-羟甲基-8-羟基喹啉，用荧光检测器以激发波长370nm，发射波长495nm检测。该方法快速，但需要昂贵的荧光检测器，难于普及推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种河豚毒素的简便快速的检测方法。
本发明用强碱处理河豚毒素，得到与河豚毒素等摩尔量的2-氨基-6-羟甲基-8-羟基喹啉与草酸盐。利用草酸氧化酶催化草酸盐，得到与草酸盐，也即与河豚毒素等摩尔量的过氧化氢。之后将显色剂加入过氧化氢中，得到紫红色物质醌亚胺，通过在520nm比色即可定量河豚毒素的含量。显色剂为自行配制制得。
本发明通过利用草酸氧化酶的高度特异性来检测河豚毒素，许多干扰传统检测方法的因素均不会对检测产生干扰。本发明对河豚毒素的提取纯化要求简单，只需脱脂浓缩即可，避免了传统检测方法中繁琐的前处理如柱层析、固相萃取甚至亲和层析等纯化处理。本发明对检测仪器的要求低，检测过程易控制，不需要高级昂贵的检测设备及复杂的操作技术。本发明检测用时短，从河豚毒素的提取到检测完成仅需4-5小时。
无下面通过实施例说明本发明具体实施方式
取三种虫纹东方豚肝脏各5g，用0.1％乙酸溶液进行匀浆提取。将提取液用与提取液等体积的石油醚重复脱脂二次，减压浓缩，然后用0.1％乙酸将提取液稀释定容到5mL，此提取液1mL相当于1.0g样品。
取1mL的提取液，加入3mol/L氢氧化钠溶液1mL，80-100℃加热衍生化反应45-60min，之后用酸调节pH值至3.80左右。取草酸氧化酶加入处理液中催化反应7min。加入显色剂，室温成色15min。用可见分光光度计比色定量河豚毒素的含量，也可目测定量河豚毒素的大体含量。
三种河豚鱼肝脏中河豚毒素的含量分别为1.60μg·g-1，1.82μg·g-1，4.16μg·g-1。
注河豚毒素分子式C11H17N3O8显色剂的配制取1.0mg的辣根过氧化物酶，50mg4-氨基安替比林及0.1g的苯酚，溶于磷酸缓冲液(4mol/L，pH7.00)并定容到100mL备用。该显色剂应现用现配，一周之后会产生红色干扰物质。
草酸氧化酶、辣根过氧化物酶的介绍本方法中使用的草酸氧化酶提取自大麦苗，其最适作用温度为38℃，最适pH值为3.80，分子量为130，000道，Km值为3.5×10-3M。
本方法中使用的辣根过氧化物酶提取自辣根，R.Z值≥3.0即可。
权利要求
1.保护将河豚毒素衍生化，然后通过检测其衍生物草酸进行河豚毒素检测的方法。
2.保护利用草酸氧化酶与辣根过氧化物酶进行河豚毒素检测。
全文摘要
本发明的目的是提供一种河豚毒素的简便快速的检测方法。本发明用强碱处理河豚毒素，得到与河豚毒素等摩尔量的2－氨基－6－羟甲基－8－羟基喹啉与草酸盐。利用草酸氧化酶将草酸盐催化氧化成过氧化氢。之后通过显色剂与过氧化氢反应显色，通过在520nm比色即可定量河豚毒素的含量。显色剂为自行配制制得。本发明通过利用草酸氧化酶的高度特异性来检测河豚毒素，抗干扰能力强；该方法对河豚毒素的提取纯化要求简单，只需脱脂浓缩即可；本发明对检测仪器的要求低，不需要高级昂贵的检测设备及复杂的操作技术，检测过程易控制；本发明检测用时短，仅需4－5小时即可完成检测。
文档编号C12Q1/28GK1778940SQ200410036380
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月22日 优先权日2004年11月22日
发明者林洪, 李德昆 申请人:中国海洋大学