专利名称：胶韧革菌10吨液体深层发酵培养方法
技术领域：
本发明属于食用菌发酵工业领域，特别是涉及胶韧革菌液体深层发酵培养方法。
背景技术：
胶韧革菌[Gloeostereum incarnatum]，别名榆耳、榆磨。属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、伏革菌科、胶韧革菌属。野生胶韧革菌主要分布于我国东北地区和日本北海道，辽宁省的铁岭、清原、新宾、本溪和抚顺，吉林省的通化、浑江、抚松、长白和安图等，黑龙江省的东部山区是榆耳的主产区，新疆也有少量分布。胶韧革菌是著名的药食兼用真菌。榆耳引入中药已有悠久的历史。明朝著名的医药学家李时珍所著《本草纲目》中载“榆耳八月采之”、“八月榆耳，以美酒渍曝，同青梁米、紫苋实蒸熟为末。每服三指撮，酒下，令人辟谷不饥。”胶韧革菌子实体营养成分极为丰富。据中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所分析，胶韧革菌主要含有蛋白质、糖类、维生素E、维生素B1、维生素B2、钙、磷、铁、锌等微量元素及谷氨酸、赖氨酸等人体所必需的各种氨基酸。发酵生产的菌丝体中各种功效成分的含量与子实体基本相同。
中国民间常把胶韧革菌水煎后，治疗肠炎。栾恒淳、太龙杰等在1994第2期东北师大学报发表了“胶韧革菌(GloeostereumincarnatumS.ItoetImal)研究(I)——发酵产物体外抑菌作用的研究”的文章。论文阐述了胶韧革菌发酵液对人体致病菌的明显抑制作用。
胶韧革菌野生资源极其稀少。人工栽培和液体深层发酵培养是获得胶韧革菌的两种有效方法，但人工栽培技术目前尚不成熟，不具备大规模种植的成熟技术。液体深层发酵培养是可以大量获得胶韧革菌的一种有效方法，但目前只有实验室规模的胶韧革菌液体深层发酵培养技术，液体深层培养技术仍处于试验室水平，太龙杰，栾恒淳，赵强等在1997第3期东北师大学报发表了“胶韧革菌(GloeostereumincarnatumS.ItoetImal)研究II——深层培养”的文章，文章报道了胶韧革菌实验室规模的发酵法生产方法。但大规模工业化液体深层培养胶韧革菌的方法尚未见披露。由于工业化规模液体深层培养方法受到发酵设备和工艺参数的影响，其培养方法需要深入研究和实验才能得到。大规模培养胶韧革菌方法的缺乏影响了胶韧革菌良好功效的进一步开发利用。
发明内容
本发明克服了目前胶韧革菌培养中缺乏大规模工业化培养方法的缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种大规模(10吨)胶韧革菌液体深层培养方法。
本发明的技术方案概述如下(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，22～28℃培养96～120小时左右，至菌丝长满斜面即可；最佳培养温度25℃。
(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床80～180转/分，22～28℃培养96～130小时左右；旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25℃为宜。
(3)二级种子培养将一级摇瓶种子以5～20％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床80～180转/分，22～28℃培养96～130小时左右；合适接种量为10％，旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25℃为宜。
(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以5～20％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床80～180转/分，22～28℃培养72～96小时；合适接种量为10％，旋转式摇床100转/分为宜，培养温度以25℃为宜。
(5)一级种子罐培养以5～20％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度22～28℃，搅拌速度80～180转/分，通风量(V/V)1∶0.3～0.8，罐压0.03～0.1Mpa，培养72～96小时；合适接种量为15％，最佳培养温度25℃，最佳搅拌速度120转/分，最佳通风量(V/V)1∶0.6，最佳罐压0.05Mpa。
(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以5～20％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度22～28℃，搅拌速度80～180转/分，通风量(V/V)1∶0.3～0.8，罐压0.03～0.1Mpa，培养72～96小时；合适接种量为15％，最佳培养温度25℃，最佳搅拌速度120转/分，最佳通风量(V/V)1∶0.6，最佳罐压0.05Mpa。
(7)发酵罐培养以5～20％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度22～28℃，搅拌速度80～180转/分，通风量(V/V)1∶0.3～0.8，罐压0.03～0.1Mpa，培养150～200小时；合适接种量为15％，最佳培养温度25℃，最佳搅拌速度120转/分，最佳通风量(V/V)1∶0.6，最佳罐压0.05Mpa。
本发明中胶韧革菌的干菌丝体得率在1.5％～3.0％之间。
本发明菌丝体干重测定方法用离心机3000rpm 10分钟离心分离发酵液，收集湿菌丝体，用无菌水离心洗涤2遍，将湿菌丝体于60-80℃恒温干燥至恒重称重即是菌丝体干重。
本发明菌丝体湿重测定方法用离心机3000rpm 10分钟离心分离发酵液，收集湿菌丝体称重即得。
本发明中胶韧革菌菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌号CICC14024。
本发明中斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基或其他合适培养基。
本发明中种子和发酵培养碳源可以选择葡萄糖、蔗糖、淀粉等常用原料，氮源可以选择蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、硫酸铵等；需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素添加维生素B1，培养基初始PH控制在6.0～7.0左右。
种子培养基和发酵培养基组成相同，其比例为淀粉2～3％，蔗糖3～5％，葡萄糖1～3％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2～3％，磷酸二氢钾0.13～0.2％，硫酸镁0.1～0.15％，维生素B12PPm，PH6～7。
本发明中放罐条件为湿菌丝体含量为20％以上，发酵液由稀变稠，由浑浊变透明，pH值3.5～4.5左右即可。发酵液经过滤操作即可获得发酵清液和菌丝体。
本发明通过培养基和培养条件的反复试验，确定了胶韧革菌10吨发酵液液体深层发酵培养方法，胶韧革菌的干菌丝体得率在1.5％～3.0％之间。发明取得了良好的效果。为开发加工胶韧革菌相关产品奠定了良好的基础。
本发明方法适用于胶韧革菌属其它菌种通过发酵法进行大规模培养。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1(10吨发酵液)(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，25℃培养120小时，菌丝长满斜面；(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床80转/分，25℃培养130小时。
(3)二级种子培养将一级摇瓶种子以5％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床80转/分，25℃培养120小时。
(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以5％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床80转/分，25℃培养96小时。
(5)一级种子罐培养以5％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度25℃，搅拌速度80转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.03Mpa，培养96小时。
(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以5％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度25℃，搅拌速度80转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.03Mpa，培养96小时。
(7)发酵罐培养以5％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度25℃，搅拌速度80转/分，通风量(V/V)1∶0.3，罐压0.03Mpa，培养200小时。
本例中斜面培养基组成为PDA斜面培养基。
本例中种子培养基和发酵培养基组成为淀粉2％，蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，维生素B12PPm，PH6.0。
本例中胶韧革菌干菌丝体得率为2.5％。
实施例2(10吨发酵液)(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，22℃培养120小时，菌丝长满斜面。
(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床150转/分，25℃培养130小时。
(3)二级种子培养将二级摇瓶种子以10％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床100转/分，25℃培养100小时。
(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以10％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床100转/分，25℃培养72小时。
(5)一级种子罐培养以10％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度25℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养80小时。
(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以10％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度25℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.3，罐压0.05Mpa，培养80小时。
(7)发酵罐培养以10％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度25℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养180小时。
本例中斜面培养基组成为PDA斜面培养基。
本例中种子培养基和发酵培养基组成为淀粉2％，蔗糖3％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.1％，维生素B12PPm，PH6.0。
本例中胶韧革菌干菌丝体得率为1.5％。
实施例3(发酵液10吨)(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，25℃培养100小时，菌丝长满斜面；(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床120转/分，25℃培养100小时。
(3)二级种子培养将一级摇瓶种子以15％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床150转/分，25℃培养96小时。
(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以15％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床100转/分，25℃培养96小时。
(5)一级种子罐培养以15％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度24℃，搅拌速度120转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.03Mpa，培养96小时。
(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以15％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度25℃，搅拌速度120转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.03Mpa，培养96小时。
(7)发酵罐培养以15％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度25℃，搅拌速度120转/分，通风量(V/V)1∶0.3，罐压0.03Mpa，培养160小时。
本例中斜面培养基组成为PDA斜面培养基。
本例中种子培养基和发酵培养基组成为淀粉3％，蔗糖3％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.1％，维生素B12PPm，PH6.0。
本例中胶韧革菌干菌丝体得率为2.0％。
实施例4(发酵液10吨)(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，28℃培养96小时左右，至菌丝长满斜面即可；最佳培养温度28℃。
(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床180转/分，28℃培养96小时左右。
(3)二级种子培养将一级摇瓶种子以20％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床80转/分，28℃培养96小时左右。
(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以20％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床180转/分，28℃培养72小时。
(5)一级种子罐培养以20％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度28℃，搅拌速度180转/分，通风量(V/V)1∶0.8，罐压0.1Mpa，培养72小时。
(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以20％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度28℃，搅拌速度180转/分，通风量(V/V)1∶0.8，罐压0.1Mpa，培养72小时。
(7)发酵罐培养以20％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度28℃，搅拌速度180转/分，通风量(V/V)1∶0.8，罐压0.1Mpa，培养150小时。
本例中斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基。
本例中种子培养基和发酵培养基组成为淀粉2％，蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.1％，维生素B12PPm，PH6.0。
本例中胶韧革菌干菌丝体得率为2.4％。
实施例5(发酵液10吨)(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，22℃培养120小时左右，至菌丝长满斜面即可；(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床150转/分，22℃培养130小时左右；(3)二级种子培养将一级摇瓶种子以20％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床100转/分，22℃培养96小时左右；(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以20％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床130转/分，22℃培养80小时；(5)一级种子罐培养以20％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度22℃，搅拌速度80转/分，通风量(V/V)1∶0.8，罐压0.1Mpa，培养80小时；(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以20％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度22℃，搅拌速度80转/分，通风量(V/V)1∶0.8，罐压0.06Mpa，培养96小时；(7)发酵罐培养以15％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度22℃，搅拌速度120转/分，通风量(V/V)1∶0.4，罐压0.05Mpa，培养180小时；本例中斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基或其他合适培养基。
本例中种子培养基和发酵培养基组成为淀粉2％，蔗糖5％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉3.0％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.15％，维生素B12PPm，PH7.0。
本例中胶韧革菌干菌丝体得率为1.7％。
实施例6(发酵液10吨)(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，26℃培养96小时左右，至菌丝长满斜面即可。
(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床130转/分，26℃培养90小时左右；(3)二级种子培养将一级摇瓶种子以10％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床140转/分，26℃培养96小时左右；(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以10％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床100转/分，26℃培养72小时；(5)一级种子罐培养以10％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度26℃，搅拌速度150转/分，通风量(V/V)1∶0.4，罐压0.06Mpa，培养86小时；(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以10％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度26℃，搅拌速度130转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.06Mpa，培养96小时；(7)发酵罐培养以10％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度26℃，搅拌速度120转/分，通风量(V/V)1∶0.6，罐压0.08Mpa，培养150小时。
本例中斜面培养基组成为PDA斜面培养基。
本例中种子培养基和发酵培养基组成为淀粉3％，蔗糖3％，葡萄糖3％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉3.0％，磷酸二氢钾0.13％，硫酸镁0.10％，维生素B12PPm，PH7.0。
本例中胶韧革菌干菌丝体得率为3.0％。
权利要求
1.一种胶韧革菌10吨液体深层发酵培养方法，其特征在于包括如下步骤(1)斜面菌种活化培养将保藏的胶韧革菌斜面菌种转接到斜面培养基上，22～28℃培养96～120小时左右，至菌丝长满斜面即可；(2)一级种子培养将上述胶韧革菌斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床80～180转/分，22～28℃培养96～130小时左右；(3)二级种子培养将一级摇瓶种子以5～20％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床80～180转/分，22～28℃培养96～130小时；(4)三级种子培养将二级摇瓶种子以5～20％接种量接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件旋转式摇床80～180转/分，22～28℃培养72～96小时；(5)一级种子罐培养以5～20％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为培养温度22～28℃，搅拌速度80～180转/分，通风量(V/V)1∶0.3～0.8，罐压0.03～0.1Mpa，培养72～96小时；(6)二级种子罐培养将一级种子罐的菌液以5～20％的接种量转接入装有1.0吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，培养条件为培养温度22～28℃，搅拌速度80～180转/分，通风量(V/V)1∶0.3～0.8，罐压0.03～0.1Mpa，培养72～96小时；(7)发酵罐培养以5～20％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。培养条件为培养温度22～28℃，搅拌速度80～180转/分，通风量(V/V)1∶0.3～0.8，罐压0.03～0.1Mpa，培养150～200小时。
2.根据权利要求1所述一种胶韧革菌10吨液体深层发酵培养方法，其中种子和发酵培养基碳源为葡萄糖、蔗糖和淀粉，氮源为蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉和硫酸铵；无机盐为磷酸二氢钾，硫酸镁。
3.根据权利要求2所述一种胶韧革菌10吨液体深层发酵培养方法，其中种子和发酵培养基组成相同，其比例为淀粉2～3％，蔗糖3～5％，葡萄糖1～3％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2～3％，磷酸二氢钾0.13～0.2％，硫酸镁0.1～0.15％，维生素B12PPm，PH6～7。
4.根据权利要求1所述一种胶韧革菌10吨液体深层发酵培养方法，其中培养温度为25℃。
全文摘要
本发明公开了胶韧革菌10吨液体深层发酵培养方法，本发明属于食用菌发酵工业领域，特别是涉及胶韧革菌液体深层发酵培养方法。本发明的技术方案包括(1)斜面菌种活化培养，(2)一级种子培养，(3)二级种子培养，(4)三级种子培养，(5)一级种子罐培养，(6)二级种子罐培养，(7)发酵罐培养；本发明中种子和发酵培养碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉等常用原料，氮源为蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、硫酸铵等；需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素需添加维生素B1。本发明确定了胶韧革菌10吨发酵液液体深层发酵培养方法，为开发加工胶韧革菌相关产品奠定了良好的基础。
文档编号C12M1/00GK1724634SQ20041006906
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月19日 优先权日2004年7月19日
发明者蔡永峰, 岳国海, 李绩, 程池, 黄宇彤 申请人:中国食品发酵工业研究院