专利名称：克隆原核生物耐盐相关基因方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程，尤其是一种可快捷克隆原核生物耐盐相关基因的方法。
背景技术：
目前从某种原核生物中克隆一个已知基因的常规做法是通过生物信息查寻，得知其它生物该基因的序列后，再循两条技术路线进行克隆基因1.合成该基因的寡聚核苷酸DNA探针，以放射性同位素或非放射性化学物质标记该分子探针，将该探针与事先构建的该生物基因组文库进行Southern杂交，钓出含有目的基因的DNA片段，对该片段测序；构建含该片段的表达重组质粒，转化受体细胞，检测该DNA片段转录后转化子获得的新蛋白及其生物学功能(参见文献1Sambrook J，Fritsch E F，Maniantis TMolecular CloningA Laboratory Mannual(2nd).Cold Spring HarborLaboratory Press，1989.(金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南(第二版).北京科学出版社，1996))。
2.根据已知基因的两端序列设计并人工合成3′端和5′端寡聚短核苷酸引物，以该生物的总DNA为模板进行PCR扩增，回收扩增产物并构建重组质粒，测序，转化受体细胞，检测该DNA片段转录后转化子获得的新蛋白及其生物学功能(参见文献2吴乃虎编著.基因工程原理.北京科学出版社，1998)。
方法1需要事先构建该生物的基因组文库，然后化学合成放射性或非放射性DNA探针，再进行大量的Southern杂交，费钱、费时，实验周期又长；方法2虽然比方法1简单，但由于不同生物的基因序列并不完全相同，因此往往需合成多对的引物，然后在PCR反应中设置多套循环参数，尤其是“退火”的温度。这样，方法2一般都要进行多次的反复摸索才可能克隆出目的基因，甚至可能以实验失败而告终。
此外，上述两种克隆基因的策略都只能克隆已知(即前人已克隆过)的基因，无法克隆序列未知的具有某种功能的基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种既快捷又经济的克隆原核生物耐盐相关基因的方法。
本发明的具体步骤如下1 将极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物，包括各种耐盐细菌和蓝藻接种在含NaCl0.1～0.9mol/L的培养基中，温度为15～32℃，以100～150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期；如果是耐盐蓝藻，应在光照下培养；2 常规碱变性法提取极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物的总DNA，经紫外光谱检测纯度，其OD260/OD280比值应≥1.8。用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的分子量是否≥21kb，若OD260/OD280比值≥1.8，说明所得DNA较纯，可以进入下一步骤；若OD260/OD280比值＜1.8，说明所得DNA纯度不够，应进一步纯化，直至OD260/OD280比值≥1.8；3、在无菌条件下用限制性核酸内切酶(E.coRI)或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶对上述总DNA在37℃进行60～100分钟的不完全酶切，酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量为1～3kb的酶切片段区域，切出含上述该酶切片段的凝胶，回收其中的DNA片段；4、在无菌条件下以E.coRI在人工构建的表达载体，如pUC18的多克隆位点将其完全酶切成线性，去磷酸化处理，将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接10～24小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌；5、将转化子溶液分别涂抹在高盐和含Amp-Xgal-IPTG的LB琼脂培养基上，培养48～60小时后，挑选既能在高盐琼脂培养基上生长又在含Amp-Xgal-IPTG培养基上菌落呈白色的转化子；6、提取上述至少10个中选耐盐转化子中的重组质粒，用E.coRI切出其中的插入片段，测序；7、将已测知的各个插入片段序列与生物数据库中的信息进行基因和蛋白质的同源性比较，初步判断插入基因的性质；8、检测转化子中外源基因表达的产物以及转化子获得的新功能，判定该基因的性质；9、将各转化子与对照分别接种在含NaCl为0.9～1.0mol/L的高盐液态LB培养基中，在恒温37℃、100～150rpm的摇床中连续培养，此时对照仅能缓慢进行细胞分裂，而各耐盐转化子则较快生长，取样检测其中的含菌数，分别绘出转化子与对照的生长曲线，比较两者生长状态的差异，借此再次验证该基因为耐盐相关基因。
在上述步骤3中可采用凝胶回收试剂盒回收含酶切片段的凝胶中的DNA片段；酶切后的总DNA经含溴乙啶(其含量已有相约俗成的规定，即约1‰)的1％琼脂糖凝胶电泳。
在步骤4中，所说的去磷酸化处理可按上述文献1的方法进行。将回收的DNA片段与线性载体共育，一般载体的量至少1倍于DNA片段；转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌通常都用大肠杆菌。
在步骤5中，最好在无菌条件下各取100μL转化子溶液分别用三角形无菌玻棒均匀涂抹在高盐(所含NaCl≤1.1mol/L)和含Amp-Xgal-IPTG的LB琼脂培养基上，培养48～60小时后，按常规挑选既能在高盐琼脂培养基上生长又在含Amp-Xgal-IPTG培养基上菌落呈白色的转化子。
在步骤7中，所说的生物数据库为GenBank或其他数据库。
在步骤9中，所说的对照为未经遗传学处理的大肠杆菌，分别接种在含NaCl为0.9～1.0mol/L的高盐液态LB培养基中，在恒温37℃、100～150rpm的摇床中连续培养48～72小时。每隔4～8小时取样检测其中的含菌数。
与已有的常规基因克隆方法比较，本发明的突出优点在于1.简捷。由于不需要建立基因组文库等烦琐的实验程序，因此本发明步骤较少，比较简便；2.经济。由于实验方法比较简便，且无需各种昂贵的药品，因此本发明的费用较低；3.可以克隆未知基因。由于本发明不以克隆哪一个基因为目标，而是设计经筛选获得耐盐相关基因，因此将可能获得未知的与该生物耐盐有关的基因；4.可以同时克隆多个基因。由于本发明随机构建了众多包含各种基因的重组质粒，经高盐条件筛选，将可以同时克隆得到多个与该生物耐盐有关的基因；5.略加改进可用于克隆其它种类的基因。只要在基因筛选条件方面有针对性地加以改变，同时结合后续基因鉴定，将可克隆其它种类的基因。
具体实施例方式
以下实施例将结合克隆各种耐盐原核生物，其中包括各种耐盐细菌和蓝藻的耐盐相关基因对本发明作进一步说明。
实施例1从极端耐盐的假单胞菌中克隆其耐盐相关基因，其步骤为1.将假单胞菌接种在含NaCl 0.5mol/L的培养基中，恒温25℃，以120rpm的速度震荡培养至指数生长中后期，约为22小时；2.常规碱变性法提取其总DNA。分别检测总DNA溶液的OD260和OD280值以确认它的纯度，两者的比值为1.82。用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的分子量是为21.5kb；3.用限制性核酸内切酶E.coRI(或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶)对上述高纯度的总DNA在37℃进行80分钟的不完全酶切。酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量为2kb的酶切片段区域，用锋利的刀片切出含上述片段的凝胶，用凝胶回收试剂盒回收其中的DNA片段；4.以E.coRI在表达载体，如pUC18，的多克隆位点将其完全酶切成线性，去磷酸化处理以减少其自身连接的几率。将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接20小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌(大肠杆菌)；5.在无菌条件下，各取100μl转化子分别涂抹在高盐(含NaCl 1.1mol/L)和含Amp-Xgal-IPTG的LB琼脂培养基上，培养48小时后，挑选既能在高盐琼脂培养基上生长又在含Amp-Xgal-IPTG培养基上菌落呈白色的转化子；6.在含NaCl 0.5mol/L的LB培养基中，恒温25℃，以120rpm的速度震荡培养各个耐盐转化子。分别提取10个耐盐转化子中的重组质粒，用原内切酶(E.coRI)切出其中的插入片段，测序；7.将已测知的各个插入片段序列与生物数据库(GenBank或其他数据库)中的信息进行基因和蛋白质的同源性比较，初步判断插入基因的性质8.根据上述提示，进一步检测转化子中外源基因表达的产物以及转化子获得的新功能，判定该基因的性质。
9.将各转化子与对照(未经遗传学处理的大肠杆菌)分别接种在高盐液态LB培养基(含NaCl 0.9mol/L)中，在恒温37℃、120rpm的摇床中连续培养48小时。此时对照仅能缓慢进行细胞分裂，而各耐盐转化子则较快生长。每隔6小时取样检测其中的含菌数，分别绘出转化子与对照的生长曲线，比较两者生长状态的差异，借此再次验证该基因为耐盐相关基因。
实施例2与实施例1类似，其区别在于将假单胞菌接种在含NaCl0.7mol/L的培养基中，恒温20℃，以150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期，约为20小时。用限制性核酸内切酶E.coRI(或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶)对上述高纯度的总DNA在37℃进行70分钟的不完全酶切。酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量约为3kb的酶切片段区域，用锋利的刀片切出含上述片段的凝胶，用凝胶回收试剂盒回收其中的DNA片段。将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接18小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌(大肠杆菌)。在含NaCl0.7mol/L的LB培养基中，恒温20℃，以150rpm的速度震荡培养各个耐盐转化子。将各转化子与对照(未经遗传学处理的大肠杆菌)分别接种在高盐液态LB培养基(含NaCl0.95mol/L)中，在恒温37℃、130rpm的摇床中连续培养48小时。
实施例3与实施例1类似，其区别在于将假单胞菌接种在含NaCl0.3mol/L的培养基中，恒温28℃，以110rpm的速度震荡培养至指数生长中后期，约为18小时。用限制性核酸内切酶E.coRI(或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶)对上述高纯度的总DNA在37℃进行90分钟的不完全酶切。酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量约为1kb的酶切片段区域，用锋利的刀片切出含上述片段的凝胶，用凝胶回收试剂盒回收其中的DNA片段。将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接15小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌(大肠杆菌)。在含NaCl0.3mol/L的LB培养基中，恒温28℃，以110rpm的速度震荡培养各个耐盐转化子。将各转化子与对照(未经遗传学处理的大肠杆菌)分别接种在高盐液态LB培养基(含NaCl1.0mol/L)中，在恒温37℃、110rpm的摇床中连续培养48小时。
实施例4与实施例1类似，其区别在于将假单胞菌接种在含NaCl 0.1mol/L的培养基中，恒温32℃，以100rpm的速度震荡培养至指数生长中后期，约为16小时。用限制性核酸内切酶E.coRI(或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶)对上述高纯度的总DNA在37℃进行60分钟的不完全酶切。酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量约为2kb的酶切片段区域，用锋利的刀片切出含上述片段的凝胶，用凝胶回收试剂盒回收其中的DNA片段。将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接10小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌(大肠杆菌)。在含NaCl0.1mol/L的LB培养基中，恒温32℃，以100rpm的速度震荡培养各个耐盐转化子。将各转化子与对照(未经遗传学处理的大肠杆菌)分别接种在高盐液态LB培养基(含NaCl 0.95mol/L)中，在恒温37℃、100rpm的摇床中连续培养48小时。
实施例5与实施例1类似，其区别在于将假单胞菌接种在含NaCl 0.9mol/L的培养基中，恒温15℃，以150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期，约为24小时。用限制性核酸内切酶E.coRI(或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶)对上述高纯度的总DNA在37℃进行100分钟的不完全酶切。酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量约为3kb的酶切片段区域，用锋利的刀片切出含上述片段的凝胶，用凝胶回收试剂盒回收其中的DNA片段。将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接24小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌(大肠杆菌)。在含NaCl 0.9mol/L的LB培养基中，恒温15℃，以150rpm的速度震荡培养各个耐盐转化子。将各转化子与对照(未经遗传学处理的大肠杆菌)分别接种在高盐液态LB培养基(含NaCl0.9mol/L)中，在恒温37℃、150rpm的摇床中连续培养48小时。
实施例6采用在含NaCl0.1mol/L以上的环境生长的耐盐细菌，其步骤与实施例1类似，培养至指数生长中后期的时间为12～24小时。
实施例7采用耐盐蓝藻接种在含NaCl0.1～0.9mol/L的培养基中，温度为15～32℃，在2000～4000lux的光照下以100～150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期，其余步骤与实施例1类似。
该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏编号为CCTCC NOM204052，保藏的培养物名称及注明的鉴别特征为假单胞杆菌Pseudomonas sp.cn 4902，保藏日为2004年7月13日。
权利要求
1.克隆原核生物耐盐相关基因方法，其特征在于其步骤为1)将极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物，包括各种耐盐细菌和蓝藻接种在含NaCl0.1～0.9mol/L的培养基中，温度为15～32℃，以100～150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期；如果是耐盐蓝藻，应在光照下培养；2)常规碱变性法提取极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物的总DNA，经紫外光谱检测纯度，其OD260/OD280比值应≥1.8。用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的分子量是否≥21kb，若OD260/OD280比值≥1.8，说明所得DNA较纯，可以进入下一步骤；若OD260/OD280比值＜1.8，说明所得DNA纯度不够，应进一步纯化，直至OD260/OD280比值≥1.8；3)在无菌条件下用限制性核酸内切酶(E.co RI)或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶对上述总DNA在37℃进行60～100分钟的不完全酶切，酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量为1～3kb的酶切片段区域，切出含上述该酶切片段的凝胶，回收其中的DNA片段；4)在无菌条件下以E.co RI在人工构建的表达载体，如pUC18的多克隆位点将其完全酶切成线性，去磷酸化处理，将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接10～24小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌；5)将转化子溶液分别涂抹在高盐和含Amp-Xgal-IPTG的LB琼脂培养基上，培养48～60小时后，挑选既能在高盐琼脂培养基上生长又在含Amp-Xgal-IPTG培养基上菌落呈白色的转化子；6)提取上述至少10个中选耐盐转化子中的重组质粒，用E.co RI切出其中的插入片段，测序；7)将已测知的各个插入片段序列与生物数据库中的信息进行基因和蛋白质的同源性比较，初步判断插入基因的性质；8)检测转化子中外源基因表达的产物以及转化子获得的新功能，判定该基因的性质；9)将各转化子与对照分别接种在含NaCl为0.9～1.0mol/L的高盐液态LB培养基中，在恒温37℃、100～150rpm的摇床中连续培养，此时对照仅能缓慢进行细胞分裂，而各耐盐转化子则较快生长，取样检测其中的含菌数，分别绘出转化子与对照的生长曲线，比较两者生长状态的差异，借此再次验证该基因为耐盐相关基因。
2.如权利要求1所述的克隆原核生物耐盐相关基因方法，其特征在于在步骤3)中采用凝胶回收试剂盒回收含酶切片段的凝胶中的DNA片段；酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶的含量为1‰。
3.如权利要求1所述的克隆原核生物耐盐相关基因方法，其特征在于在步骤4)中，将回收的DNA片段与线性载体共育，载体的量至少1倍于DNA片段；转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌通常都用大肠杆菌。
4.如权利要求1所述的克隆原核生物耐盐相关基因方法，其特征在于在步骤5)中，在无菌条件下各取100μL转化子溶液分别用三角形无菌玻棒均匀涂抹在高盐和含Amp-Xgal-IPTG的LB琼脂培养基上，培养48～60小时后，按常规挑选既能在高盐琼脂培养基上生长又在含Amp-Xgal-IPTG培养基上菌落呈白色的转化子。
5.如权利要求1所述的克隆原核生物耐盐相关基因方法，其特征在于在步骤7)中，所说的生物数据库为GenBank或其他数据库。
6.如权利要求1所述的克隆原核生物耐盐相关基因方法，其特征在于在步骤9)中，所说的对照为未经遗传学处理的大肠杆菌，分别接种在含NaCl为0.9～1.0mol/L的高盐液态LB培养基中，在恒温37℃、100～150rpm的摇床中连续培养48～72小时，每隔4～8小时取样检测其中的含菌数。
全文摘要
克隆原核生物耐盐相关基因方法，涉及基因工程。提供一种克隆原核生物耐盐相关基因的方法。将极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物，提取极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物的总DNA；对总DNA不完全酶切，酶切后的总DNA经凝胶电泳，找酶切片段区域，切出凝胶，回收DNA片段；完全酶切成线性，将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶形成重组质粒，转化用CaCl
文档编号C12P19/00GK1644706SQ20041008481
公开日2005年7月27日 申请日期2004年10月1日 优先权日2004年10月1日
发明者刘广发, 谢金镇, 陈启伟 申请人:厦门大学