专利名称：一种抗转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂的筛选方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂的筛选方法及应用，即涉及一种抗转运蛋白类介导的MDR逆转剂的筛选方法及应用，属肿瘤多药耐药逆转剂筛选的技术领域。
背景技术：
肿瘤多药耐药性(Multidrug resistance，MDR)指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物耐药的同时对其它结构和作用机制相同或不同的抗肿瘤药物也产生了耐药性。肿瘤细胞产生MDR是化疗失败的重要原因，临床上许多肿瘤病患者因此对化疗不敏感，导致化疗效果差和肿瘤的复发或转移。从某种意义上说，90％死于恶性肿瘤的病例都与原发性或获得性耐药有关。
人们已对MDR的发生机制进行了广泛的研究，总体看这是一种受多因素、多机制调控，主要表现为降低化疗药物的内流、减少细胞内的药物积聚、增加能量依赖性的药物主动外排、增强DNA修复活性、加强细胞解毒系统的作用和阻碍药物引起的凋亡等因素(见图1)。临床证实，结肠癌、肾癌、肝癌、非小细胞肺癌、神经角质瘤和kaposis肉瘤等实体瘤是容易产生MDR的恶性肿瘤，甚至在刚确诊时就有耐药性存在。进一步的研究发现这些肿瘤的肿瘤细胞常有P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug relatedprotein，MRP)、乳腺癌抗药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein，LRP)等转运蛋白的高水平表达。有些肿瘤如急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌等的肿瘤细胞常对化疗药物敏感，但一段时间用药后又会产生耐药性，表现为P-gp、MRP等转运蛋白的表达上调。
目前具有代表性的抗P-gp、MRP等转运蛋白类的MDR逆转剂有维拉帕米(Verapamil)、环孢菌素A(CsA)、三氟拉螓、三苯氧胺等。但这些逆转剂在达到有效体内逆转浓度时，存在不同程度的毒副作用，限制了它们的临床应用。因此国内外自1981年以来一直致力于探寻临床有效，但毒副作用小的抗P-gp、MRP等转运蛋白类的MDR逆转剂。
传统筛选MDR逆转剂的方法是通过单独使用化疗药物和联合使用化疗药物与MDR逆转剂，评价MDR逆转剂对化疗药物的增敏作用采用MTT法，比较单独使用化疗药物和联合使用化疗药物与MDR逆转剂时的半数抑制浓度(IC50)，即计算逆转倍数，达到对MDR逆转剂进行筛选的目的。传统筛选MDR逆转剂的方法有以下缺点1.周期长，一次筛选至少3天；2.工作量大，先要确定拟筛选的MDR逆转剂的90％细胞生长抑制浓度(IC90)以上的药物浓度范围，然后加入不同浓度梯度的化疗药物，每一浓度至少设置三个复孔，还要有同样的阳性对照等系列工作；3.重复性差，由于过程繁琐，每一步的误差得到放大，使结果不一致；4.不直观，简单依赖酶标仪测定的OD值。这些缺陷限制了MDR逆转剂的筛选和应用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种抗转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂的筛选方法，转运蛋白指P-gp、MRP、BCRP和LRP。
本发明的技术方案是构建转运蛋白高表达为特征的耐药细胞株，通过检测转运蛋白类底物荧光强度及其变化，确定待筛选的MDR逆转剂对MDR的逆转作用，实现对MDR逆转剂的筛选。
现详细说明本发明的技术方案。一种抗转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂的筛选方法，其特征在于，转运蛋白指P-gp、MRP、BCRP和LRP，包括以下步骤第一步 构建转运蛋白高表达的耐药细胞株
①构建含人肿瘤耐药相关的转运蛋白基因的真核表达质粒；②转染人肿瘤细胞，如实体瘤或血癌，获得稳定高表达该转运蛋白的细胞株；③确定获得的转染细胞株具有高表达该转运蛋白，并具有相应的MDR特性；第二步 选择合适的荧光化合物作为转运蛋白的荧光底物第三步 进行MDR逆转剂的筛选用待筛选化合物及荧光底物作用转染的耐药细胞，用荧光显微镜自带荧光度检测软件分析或荧光Elisa读值，如果待筛选化合物使细胞内的荧光增强说明该化合物具有逆转MDR作用。
本发明的第二个目的是提供上述方法的一种应用，确切地说，推出一种以上述方法工作的快速筛选MDR逆转剂的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种以上述方法工作的快速筛选MDR逆转剂的试剂盒，其特征在于，该试剂盒内装有转染细胞株、标准荧光底物、阳性对照药品，即经典的逆转剂、阴性对照药品、MTT、二甲基亚砜。
与背景技术相比，本发明具有直观、快速、准确、高效、经济的优点。适合应用于高通量快速筛选MDR逆转剂。
图1示出了引起肿瘤细胞耐药的多种因素。
图2是酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M分子量标记，A质粒酶切后片断。
图3是RT-PCR的检测基因mdr1表达，其中，A分子标记；BMCF-7；C转染pcDNA3.1(+)/MDR1的MCF-7。
图4是Western bloting检测P-gp表达，其中，AMCF-7；B-D转染pcDNA3.1(+)/MDR1的MCF-7。
图5是罗丹明123的全波长扫描图谱。
图6是60分钟时1uM罗丹明123处理后的耐药细胞和敏感细胞中荧光强调比较，其中，AMCF-7/MDR1；BMCF-7。
图7是阳性对照的荧光强度对比，其中，A对照；B姜黄素；C维拉帕米；D环孢菌素A；所用细胞为MCF-7/MDR1。
图8是阴性对照的荧光强度对比，其中，A对照；B甲氨蝶呤；C人参皂甙Re，所用细胞为MCF-7/MDR1。
具体实施例方式
本发明方法的工作原理，①MDR的产生与肿瘤细胞膜上一种或多种转运蛋白的过量表达有关，在非耐药细胞株中导入耐药相关的转运蛋白基因，能使该细胞株获得多药耐药性；②耐药细胞株与非耐药细胞株相比，表现为细胞内化疗药物的积聚减少，通过检测细胞内药物积聚的变化，反映细胞耐药性的改变，即待筛选化合物作用细胞后，如果使细胞内的药物积聚增加，说明待筛选化合物具有逆转MDR的功能；③一般化疗药物没有或有较弱的荧光，不易被检测到，需加入合适的荧光化合物，该荧光化合物必须是相应转运蛋白的底物，能被转运蛋白泵出细胞外；④当转运蛋白为P-gp时，首选若丹明123作为荧光底物，因为它本身对细胞无毒，而且在常用的488nm激发光作用时，具有较窄的尖锐吸收峰(700-900nm)(见图5)，对样品干扰小。
所有的实施例完全按上述的步骤操作。
实施例1第一步①中，构建含人mdr1基因全长的重组质粒将含人mdr1cDNA全长的质粒pMDRA1用限制性内切酶SacI和XhoI切割，连接到用SacI和XhoI预处理的质粒pET28a(+)上，形成重组质粒pET28a(+)/mdr1，用限制性内切酶BamHI和XhoI消化重组质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，把纯化的序列连接到BamHI和Xhol预处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建成mdr1基因表达的重组质粒pcDNA3.1(+)/mdr1，为检验序列插入的正确性，用EcoRI酶切，经RT-PCR检测(见图2)，结果说明mdr1基因表达的重组质粒构建成功；
第一步②中，转染人乳腺癌MCF-7细胞用第一步所构建的重组质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7，方法见Superfect转染试剂盒说明书，转染48h后，用800μg/ml浓度的G418筛选10天，挑出对G418有抗性的稳定克隆，然后用400μg/ml浓度的G418继续筛选20天，获得稳定克隆MCF-7/mdr1细胞，同时用pcDNA3.1(+)空载体转染人乳腺癌细胞系MCF-7，获得克隆MCF-7/neo细胞，作为对照；第一步③中，检测P-gp的基因转录与蛋白表达，MTT法检测MCF-7/mdr1细胞的耐药性提取转染人乳腺癌细胞MCF-7/mdr1、人乳腺癌细胞MCF-7/neo和野生型人乳腺癌细胞MCF-7的总RNA，方法见TrizolTM试剂盒说明书，通过RT-PCR检测三种细胞的mdr1基因转录水平(见图3)，用含1g/ml Triton X-100的蛋白提取液抽提三种细胞总蛋白，Western blot检测P-gp蛋白表达量(见图4)，结果表明转染MCF-7/mdr1细胞的mdr1基因转录和P-gp转运蛋白表达均显著增加(见图3、4)，说明转染的MCF-7/mdr1细胞株获得了高转录人mdr1基因的特性；用不同浓度的抗癌药物阿霉素和长春新碱作用MCF-7/mdr1及MCF-7细胞，用MTT法获得两种细胞对抗肿瘤药物阿霉素和长春新碱的IC50，结果可见转染人乳腺癌细胞MCF-7/mdr1与野生型人乳腺癌细胞MCF-7相比，对阿霉素和长春新碱的IC50分别增加39倍和17倍(见表1)，说明转染人乳腺癌细胞MCF-7/mdr1获得了对抗蒽醌类抗癌药阿霉素的抗性，对抗微管类药长春新碱也具有明显的交叉耐药性；第二步中，选择罗丹明123作为标准荧光底物(见图5、6)；第三步中，加待筛选的MDR逆转剂是经典逆转剂，维拉帕米(verapamil)、环孢菌素A(CsA)、姜黄素(curcumin)，作用时间60min，比较加药组和不加药组的荧光变化，荧光显微镜下镜检发现加入阳性对照的孔荧光亮度很强，其中CsA组最强，姜黄素组最弱，而不加药组的荧光几乎没有(见图7)，经荧光显微镜自带荧光度检测软件分析和荧光Elisa读值发现加药组是不加药组荧光强度的3～5倍，维拉帕米(verapamil)、环孢菌素A(CsA)、姜黄素(curcumin)均列为候选样品，所得结果与已知情况基本相符。
实施例2第一、二步与实施例1同；第三步中，加待筛选的MDR逆转剂是阴性对照药物甲氨蝶呤、人参皂甙Re，所用药物浓度为不引起细胞致死浓度。结果发现加药组与不加药组相比，无明显荧光增强现象(见图8)，说明这些药物不能抑制P-gp的药物外排作用，结果与已知相符。
实施例3第一、二步与实施例1同；第三步中，加待筛选的MDR逆转剂是用随机抽出的50种中药单体。用MTT检测待筛药物与抗癌药物联用和不联用时的IC50比较法，共花费3个多月的时间，为防止漏筛，每个样品重复3次，同时还需要排除药物本身毒性的影响，结果是仅有两个化合物具有一定效果(见表2)。同样用上述单体复筛，采用本发明所述的荧光底物积聚法，仅花费2周的时间，筛选出的四个有效药物，其中三个效果不强，有一个与已知临床用药verapamil近似，与MTT法重复的有两个。随后进一步的验证了荧光底物积聚法所获结果，没有出现MTT法的漏筛(见表2)。
综上所述，以构建的MCF-7/mdr1耐药细胞株为模型，通过荧光底物的积聚，反映P-gp功能抑制情况的方法是有效且简便的，特别当可供筛选的物质量少时，可采用荧光显微镜镜检的方法比较荧光强度，方法直观、快速、准确。需要定量检测时可采用荧光Elisa或流式细胞仪等方法，大批量可采用药物筛选工作台的自动荧光定量检测来完成。应用本发明的原理，制成能用于特异筛选逆转肿瘤细胞膜上转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂(或抑制剂)的高通量筛选试剂盒。
表1MCF-7和MCF7/MDR1对两种药物敏感性的MTT检测
表250种中药单体用传统MTT法进行初筛的结果(RI＝未加筛选物的IC50/加筛选物IC50；ver维拉帕米)
权利要求
1.一种抗转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂的筛选方法，其特征在于，转运蛋白指P-gp、MRP、BCRP和LRP，包括以下步骤第一步构建转运蛋白高表达的耐药细胞株①构建含人肿瘤耐药相关的转运蛋白基因的真核表达质粒；②转染人肿瘤细胞，如实体瘤或血癌，获得稳定高表达该转运蛋白的细胞株；③确定获得的转染细胞株具有高表达该转运蛋白，并具有相应的MDR特性；第二步选择合适的荧光化合物作为转运蛋白的荧光底物第三步进行MDR逆转剂的筛选用待筛选化合物及荧光底物作用转染的耐药细胞，用荧光显微镜自带荧光度检测软件分析或荧光Elisa读值，如果待筛选化合物使细胞内的荧光增强说明该化合物具有逆转MDR作用。
2.根据权利要求1所述的抗转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂的筛选方法，其特征在于，第一步①中，构建含人mdr1基因全长的重组质粒将含人mdr1 cDNA全长的质粒pMDRA1用限制性内切酶SacI和XhoI切割，连接到用SacI和XhoI预处理的质粒pET28a(+)上，形成重组质粒pET28a(+)/mdr1，用限制性内切酶BamHI和XhoI消化重组质粒，用0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，把纯化的序列连接到BamHI和Xhol预处理的真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建成mdr1基因表达的重组质粒pcDNA3.1(+)/mdr1，为检验序列插入的正确性，用EcoRI酶切，经RT-PCR检测，结果说明mdr1基因表达的重组质粒构建成功；第一步②中，转染人乳腺癌MCF-7细胞用第一步所构建的重组质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7，方法见Superfect转染试剂盒说明书，转染48h后，用800μg/ml浓度的G418筛选10天，挑出对G418有抗性的稳定克隆，然后用400μg/ml浓度的G418继续筛选20天，获得稳定克隆MCF-7/mdr1细胞，同时用pcDNA3.1(+)空载体转染人乳腺癌细胞系MCF-7，获得克隆MCF-7/neo细胞，作为对照；第一步③中，检测P-gp的基因转录与蛋白表达，MTT法检测MCF-7/mdr1细胞的耐药性提取转染人乳腺癌细胞MCF-7/mdr1、人乳腺癌细胞MCF-7/neo和野生型人乳腺癌细胞MCF-7的总RNA，方法见TrizolTM试剂盒说明书，通过RT-PCR检测三种细胞的mdr1基因转录水平，用含1g/ml Triton X-100的蛋白提取液抽提三种细胞总蛋白，Western blot检测P-gp蛋白表达量，结果表明转染MCF-7/mdr1细胞的mdr1基因转录和P-gp转运蛋白表达均显著增加，说明转染的MCF-7/mdr1细胞株获得了高转录人mdr1基因的特性；用不同浓度的抗癌药物阿霉素和长春新碱作用MCF-7/mdr1及MCF-7细胞，用MTT法获得两种细胞对抗肿瘤药物阿霉素和长春新碱的IC50，结果可见转染人乳腺癌细胞MCF-7/mdr1与野生型人乳腺癌细胞MCF-7相比，对阿霉素和长春新碱的IC50分别增加39倍和17倍，说明转染人乳腺癌细胞MCF-7/mdr1获得了对抗蒽醌类抗癌药阿霉素的抗性，对抗微管类药长春新碱也具有明显的交叉耐药性；第二步中，选择罗丹明123作为标准荧光底物；第三步中，加待筛选的MDR逆转剂是经典逆转剂，维拉帕米(verapamil)、环孢菌素A(CsA)、姜黄素(curcumin)，作用时间60min，比较加药组和不加药组的荧光变化，荧光显微镜下镜检发现加入阳性对照的孔荧光亮度很强，其中CsA组最强，姜黄素组最弱，而不加药组的荧光几乎没有，经荧光显微镜自带荧光度检测软件分析和荧光Elisa读值发现加药组是不加药组荧光强度的3～5倍，维拉帕米(verapamil)、环孢菌素A(CsA)、姜黄素(curcumin)均列为候选样品，所得结果与已知情况基本相符。
3.一种以权利要求1或2的方法工作的快速筛选MDR逆转剂的试剂盒，其特征在于，该试剂盒内装有转染细胞株、标准荧光底物、阳性对照药品，即经典的逆转剂、阴性对照药品、MTT、二甲基亚砜。
全文摘要
一种抗转运蛋白类介导的肿瘤多药耐药逆转剂的筛选方法及应用，属肿瘤多药耐药逆转剂筛选的技术领域。本发明的技术方案是构建转运蛋白高表达为特征的耐药细胞株，通过检测转运蛋白类底物荧光强度及其变化，确定待筛选的MDR逆转剂对MDR的逆转作用，实现对MDR逆转剂的筛选。用上述方法工作的原理，可制成快速筛选MDR逆转剂的试剂盒。本发明具有直观、快速、准确、高效、经济的优点。适合应用于高通量快速筛选MDR逆转剂。
文档编号C12N15/79GK1661040SQ200410099290
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者陈菲, 王弢, 周捷 申请人:华东师范大学