专利名称：重组人胰蛋白酶原2表达载体的构建、表达及其单克隆抗体的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种质粒表达载体，和由该载体表达的人胰蛋白酶原2蛋白。本发明还涉及该蛋白应用于制备单克隆抗体以及它们在诊断、治疗或预防相关疾病中的应用。
背景技术：
人胰蛋白酶原1、2均由247个氨基酸组成，其中1～15位氨基酸残基为信号肽，16～23位氨基酸为酶原活化成胰蛋白酶时被截去的活化肽(Trypsinogen activation peptide，TAP)。胰蛋白酶原的异位活化是急性胰腺炎的始发环节。近年来重型胰腺炎发病率逐渐增多，其死亡率约为20％，有并发症者可高达50％。在急诊条件下，快速诊断急性胰腺炎显得尤为迫切。目前通常采用检测淀粉酶的水平来诊断胰腺炎，但酶活动与疾病的严重程度未必一致，轻者可能很高，而出血坏死性胰腺炎反而正常，且许多胰外疾患也可使淀粉酶升高。最近有研究资料表明，正常人血清中胰蛋白酶原-1的浓度较酶原-2高，胰腺炎时因炎症导致胰蛋白酶原渗漏到血循环中，同时由于肾小管对酶原-1的重吸收大于酶原-2，这样急性胰腺炎病人血尿中胰蛋白酶原-2的水平显著升高，比正常值高出百倍，其特异性与敏感性都高于淀粉酶，可以更灵敏而特异地作为检测急性胰腺炎的指标。人胰蛋白酶原2单克隆抗体能与人胰蛋白酶原2特异结合，可以作为诊断急性胰腺炎的试剂，具有很强的实用价值与市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的重组质粒载体，该载体含有人胰蛋白酶原2基因，该基因具有SEQ ID NO.1的序列。
本发明的另一目的是提供一种新的人胰蛋白酶原2蛋白以及该蛋白的应用。该蛋白具有SEQ ID NO.2序列特征。
本发明的另一目的在于提供一种抗所述人胰蛋白酶原2蛋白质的单克隆抗体及其制备和应用。
含有目的片段的重组质粒载体的构建从人胰腺噬菌体cDNA文库扩增得到人胰蛋白酶原2基因(记为hTg-2)，其序列为SEQ.ID.NO.1所示；将该基因与pGEM-T载体(Promega公司产品)连接构建成pGEM-Tg2；其中扩增引物为5’-ACA CCA TGA ATC TAC T(C/T)CTGA-3’和3’端引物5’-GTA TAG AGA CTG CAG AGG G-3’；以pGEM-Tg2为模板进行PCR扩增，在引物设计时，在不改变氨基酸序列的情况下，将5’端的碱基序列调整为5’-TGCAATTG T ATG GCA CCA TTC GAC GAT GAT GAC AAG AT-3’，使之成为大肠杆菌中高表达的密码子，并降低5’翻译起始序列中G/C碱基含量；扩增产物经双酶切后与载体pBV220连接，构建得蛋白C端带有6×Histidine亲和标记的pBVTg-2表达质粒载体，并转化入大肠杆菌DH5α中。
人胰蛋白酶原-2蛋白的诱导表达与纯化将含有重组pBVTg-2的大肠杆菌DH5α在37℃培养至OD(600)为0.5～0.6后，经42℃温度诱导获得了占总菌体20％的人胰蛋白酶原-2的高表达。该蛋白具有SEQ.ID.NO.2序列特征。重组人胰蛋白酶原-2用Ni-NTA柱纯化，然后进行Western blot验证。我们对纯化的胰蛋白酶原-2进行复性，经肠激酶活化处理复性的胰蛋白酶原-2检测获得了胰蛋白酶活性，比活性近80个BAEE单位/mg，表明基因工程生产的胰蛋白酶原复性后具有天然构象。
重组产生的hTg-2蛋白质可以用于筛选促进或抗hTg-2蛋白质的抗体，这些抗体可作为检测该蛋白的试剂或对该蛋白进行生物学功能的研究。表达的重组hTg-2蛋白质也可以用于寻找有治疗价值的蛋白质分子，这些分子能抑制或激活hTg-2蛋白。
人胰蛋白酶原-2蛋白质的单克隆抗体及其制备将得到的重组hTg-2蛋白质与佐剂混合免疫小鼠，取脾细胞与sp2/0细胞融合，筛选到3株能分泌抗hTg-2单克隆抗体的杂交瘤细胞等，分别为3A5、5D7、5G4，抗体分型结果均属IgG亚类(分属IgG2a、IgG2b和IgG2b)。该单克隆抗体特异性稳定性高，可以用作开发诊断或治疗急性胰腺炎的试剂或其它与hTg-2蛋白质的异常表达相关的疾病。
图1为hTg-2 cDNA PCR产物凝胶电泳，M为Marker，1、2为空白对照，3～8为目的基因PCR产物。
图2为pGEM-Tg2 Sal I酶切验证，箭头所示为目的基因片断。
图3为PCR验证重组pBVTg-2表达质粒目的片段的插入，M为Marker，1～4为目的基因片段，5为空白对照。
图4为hTg-2复性蛋白的Western Blot验证，目的蛋白在28KD处有一特异条带。
图5为hTg-2蛋白纯化的SDS-PAGE银染分析，FT代表流出液，W3、W4代表洗涤液，e9、e10、e11代表洗脱液。
图6为hTg-2蛋白单克隆抗体的Western Blot验证，M为Marker，1代表hTg-2蛋白，2代表hTg-1蛋白。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
1、目的基因的获得和含有目的基因的克隆载体的构建以人胰腺噬菌体cDNA文库为模板，用5’端引物5’-ACA CCA TGA ATC TAC T(C/T)CTGA-3’和3’端引物5’-GTA TAG AGA CTG CAG AGG G-3’进行PCR扩增人胰蛋白酶原-2基因，扩增产物经1％琼脂糖电泳，显示为一条大小在750bp左右的特异性扩增条带，与预期的778bp相符，用此对引物重复进行多次PCR扩增均显示出特异性条带。将扩增得到的Tg2片段，切胶纯化并定量后，与pGEM-T载体(Promega公司产品)连接构建成pGEM-Tg2，然后转化大肠杆菌JM-109。转化子经质粒快速鉴定试剂盒鉴定大小，电泳观察酶切结果，发现有750bp左右的小片段，初步验证是有目的片段的存在。经测序发现与标准序列一致。该基因序列为SEQ.ID.NO.1所示。
2.含有目的片段的重组表达载体的构建以pGEM-Tg2为模板进行PCR扩增，引物设计时，在不改变氨基酸的情况下，调整5’端的碱基序列为5’-TG CAATTG T ATG GC CC TT GA GAT GAT GAC AAG AT-3’，使之成为大肠杆菌中高表达的密码子，还考虑翻译后mRNA5’端的结构，作碱基的替换，使RNA不形成阻碍翻译的茎环结构，且RNA更为稳定。由于胰蛋白酶原基因内部含有EcoRI切点，因而采取与EcoR I同切的Mun I对PCR产物双酶切后，与EcoR I和Sal I双酶切的pBV220(张智清等，含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，《病毒学报》Vol.6.No.2，1990；111-115)连接，连接后重组载体上Mun I/EcoR I位点为这两个内切酶所均不识别，所以采取PCR验证胰蛋白酶原基因的插入。我们成功克隆到C端含有6×histidine亲和标记的目的片段，连接到表达载体pBV220上构建成pBVTg-2，并转化入大肠杆菌DH5α中。
3.目的蛋白的诱导表达与亲和纯化含有重组pBVTg-2的大肠杆菌DH5α，37℃培养至OD(600)为0.5～0.6后，经42℃温度诱导，取1ml小样诱导菌液裂解进行SDS-PAGE分析。诱导菌株与空白菌株和空载质粒菌株比较发现有31kD左右特异条带的表达。分析其中的原因，可能与大肠杆菌中特异性蛋白酶抑制剂的结合有关。我们克隆的pBVTg-2重组质粒在蛋白C端融合有6×Histidine亲和标记，能与Ni-NTA交联的琼脂糖层析介质以高亲和力结合，这种结合不依赖于蛋白的高级构象。为了进一步验证诱导纯化的蛋白是否是胰蛋白酶原，我们还对其进行了蛋白N-端测序、6×Histidine亲和标记的western blot验证。我们将蛋白经SDS-PAGE后，以CHAPS(乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸盐)缓冲转移体系将蛋白转至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，全自动蛋白测序仪ABI-491测N端起始10个氨基酸，发现N端第一个氨基酸酸为大肠杆菌表达系统的Met，其余与胰蛋白酶原-2蛋白N端的序列(APFDDDDKI)完全一致。Western blot也显示为阳性。
4.变性重组蛋白pBVTg2的复性与生物学活性测定采用300ug/ml的重组胰蛋白酶原-2(rTg2)复性起始浓度，首先加10mM DTT使之还原，重复打开二硫键，然后以1∶10比例快速稀释复性缓冲液，再对不同的缓冲液透析。复性后的蛋白用pEG6000或Sephadex G50浓缩，浓缩后蛋白浓度约为110ng/ul。复性后的重组胰蛋白酶原-2(rTg2)能与天然尿胰蛋白酶原制备的单克隆抗体(anti-hTrypsinogen-2 mAb)在Western Blot检测显示清晰的单一条带。我们还进行了复性胰蛋白酶原的生物学活性测定。首先用肠激酶对复性胰蛋白酶原进行特异性的切割，去除掉N-端的活化肽(TAP)，从而成为胰蛋白酶。通过与特异性胰蛋白酶底物苯甲酰L-精氨酸乙酯(benzoyl L-arginine ethylester，BAEE)反应，在紫外分光光度计于253nm处测量OD值随时间的增加量来检测肠激酶切割后复性蛋白的胰蛋白酶活性，计算复性重组胰蛋白酶原肠激酶活化后的胰蛋白酶比活力为74 BAEE单位/mg。
5.抗人胰蛋白酶原2单克隆抗体的制备(1)小鼠免疫用纯化的人胰蛋白酶原2蛋白免疫BALB/c小鼠，每只每次50到100μg，间隔两周，腹腔注射，用ELISA测血清抗体滴度，达到一定值后，取免疫小鼠的脾细胞以备融合。
(2)细胞融合及筛选细胞融合7-10天前复苏SP2/0肿瘤细胞，保证细胞在融合时正处于对数生长期，活力最好。在融合前一天，取6-8周大的BALB/c小鼠拉颈处死，按照无菌操作规程取腹腔巨噬细胞和脾细胞作为滋养细胞。一天后，取免疫小鼠的脾脏获得脾细胞，与上述培养的骨髓瘤细胞SP2/0混合，加入浓度为50％的聚乙二醇PEG1000进行细胞融合。当培养基在2-3天内变黄时，取培养上清液，用ELISA测抗人胰蛋白酶原2抗体滴度。将抗人胰蛋白酶原2抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆。对抗体滴度高的孔继续进行克隆3次，直至所有克隆孔均成阳性。通过单抗间增值反应的测定，共筛选到3株能分泌针对hTg2蛋白不同抗原表位的单克隆抗体杂交瘤细胞系，分别为3A5、5D7、5G4，抗体分型结果均属IgG亚类(分别属IgG2a、IgG2b和IgG2b)。
(3)单克隆抗体大量制备使用同系小鼠体内诱生法大量生产单克隆抗体。将一定杂交瘤细胞注入小鼠腹腔中，在注射一周前，用石蜡油注射该小鼠，这样杂交瘤细胞就在小鼠腹腔中繁殖，大量分泌抗人胰蛋白酶原2抗体，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗人胰蛋白酶原2单克隆抗体。通过硫酸铵沉淀法对上清抗体进一步纯化。
(4)单克隆抗体特异性与稳定性鉴定ELISA杂交瘤细胞株培养上清能与重组表达的hTg2反应，不与重组表达的hTg1反应。说明该单克隆抗体是针对hTg2蛋白的单克隆抗体。
Western blotting分别用hTg1和hTg2蛋白做抗原进行蛋白免疫印迹，结果hTg2蛋白在相对分子量为28KD处有一特异条带而hTg1没有。进一步证明该单克隆抗体是特异结合hTg2蛋白。
病人尿液检测应用抗体夹心法检测病人尿液。使用5G4与5D7两株能特异结合hTg2蛋白的单克隆抗体，一株包被酶标板，加入急性胰腺炎病人尿液与正常人对照，再加入第二株酶标单克隆抗体，显色，统计结果见下表。急性胰腺炎病人尿液中hTg2蛋白的含量远高于正常人对照。直接证明了该单克隆抗体是特异结合hTg2蛋白。
稳定性检测冻存的杂交瘤细胞株半年后复苏，经检测仍能大量分泌特异的hTg2单克隆抗体。经纯化的单克隆抗体以液体形式4℃放置3个月效价还能保持90％以上。
序列表SEQ ID NO.11 gcaccattcg acgatgatga caagatcgtt gggggctaca tctgtgagga51 gaattctgtc ccctaccagg tgtccttgaa ttctggctac cacttctgcg101 gtggctccct catcagcgaa cagtgggtgg tgtcagcagg tcactgctac151 aagtcccgca tccaggtgag actgggagag cacaacatcg aagtcctgga201 ggggaatgaa cagttcatca atgcagccaa gatcatccgc caccccaaat251 acaacagccg gactctggac aatgacatcc tgctgatcaa gctctcctca301 cctgccgtca tcaattcccg cgtgtccgcc atctctctgc ccactgcccc351 tccagctgct ggcaccgagt ccctcatctc cggctggggc aacactctga401 gttctggtgc cgactaccca gacgagctgc agtgcctgga tgctcctgtg451 ctgagccagg ctgagtgtga agcctcctac cctggaaaga ttaccaacaa501 catgttctgt gtgggcttcc tcgagggagg caaggattcc tgccagggtg551 attctggtgg ccctgtggtc tccaatggag agctccaagg aattgtctcc601 tggggctatg gctgtgccca gaagaacagg cctggagtct acaccaaggt651 ctacaactat gtggactgga ttaaggacac catagctgcc aacagcggat701 cccgatctca tcaccatcac catcactaaSEQ ID NO.21 APFDDDDKIV GGYICEENSV PYQVSLNSGY HFCGGSLISE QWVVSAGHCY51 KSRIQVRLGE HNIEVLEGNE QFINAAKIIR HPKYNSRTLD NDILLIKLSS101 PAVINSRVSA ISLPTAPPAA GTESLISGWG NTLSSGADYP DELQCLDAPV151 LSQAECEASY PGKITNNMFC VGFLEGGKDS CQGDSGGPVV SNGELQGIVS201 WGYGCAQKNR PGVYTKVYNY VDWIKNTIAA NSGSRSHHHH HH
权利要求
1.一种重组质粒载体，其特征在于含有人胰蛋白酶原2基因，该基因序列为SEQ.ID.NO.1。
2.一种如权利要求1所述重组质粒表达载体的构建方法，其特征在于从人胰腺噬菌体cDNA文库扩增得到人胰蛋白酶原2基因，其序列为SEQ.ID.NO.1所示；将该基因与pGEM-T载体连接构建成pGEM-Tg2；其中扩增引物为5’-ACA CCA TGA ATC TAC T(C/T)C TGA-3’和3’端引物5’-GTA TAG AGA CTG CAG AGG G-3’；以pGEM-Tg2为模板进行PCR扩增，在引物设计时，在不改变氨基酸序列的情况下，将5’端的碱基序列调整为5’-TG CAATTG T ATG GCA CCA TTC GAC GAT GAT GAC AAG AT-3’，使之成为大肠杆菌中高表达的密码子，并降低5’翻译起始序列中G/C碱基含量；扩增产物经双酶切后与载体pBV220连接，构建得蛋白C端带有6×Histidine亲和标记的pBVTg-2表达质粒载体。
3.一种载体转化的大肠杆菌，其特征在于该大肠杆菌具有如权利要求1所述的载体。
4.一种分离纯化的人胰蛋白酶原2蛋白，其特征在于序列为SEQ.ID.NO.2。
5.如权利要求4所述的蛋白在制备抗人胰蛋白酶原2单克隆抗体中的应用。
6.一种产生权利要求5所述的抗人胰蛋白酶原2单克隆抗体的杂交瘤细胞系3A5、5D7、5G4，分别属IgG2a、IgG2b和IgG2b。
7.如权利要求6所述的单克隆抗体在制备诊断、治疗或预防与人胰蛋白酶原2蛋白质的异常表达相关的疾病的试剂或药物中的应用。
全文摘要
本发明属基因工程技术领域，具体为一种重组质粒载体，该载体含有人胰蛋白酶原2(hTg－2)基因。本发明还公开了上述该表达载体的构建、表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体特异性稳定性高，可用于制备诊断、治疗或预防与hTg－2蛋白质的异常表达相关的疾病的试剂和药物。
文档编号C12N15/63GK1654661SQ20041009927
公开日2005年8月17日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者朱乃硕, 涂艳, 欧西军 申请人:复旦大学