棉花显性无腺体基因的分子标记的制作方法

专利名称：棉花显性无腺体基因的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种棉花显性无腺体基因的分子标记。具体地，本发明涉及一种利用RAPD技术筛选棉花显性无腺体基因的分子标记的方法，以及公开了所述分子标记的序列。另外，本发明公开了所述分子标记在棉花育种中的应用。
背景技术：
棉花(G.hirsutum)是世界上种植面积最大的工业原料作物。长期以来，各国广泛种植的都是全株密布色素腺体(Pigment glands)的有酚棉(GlandCotton)，棉子中含有的棉酚(gossypol)因为对人和单胃动物有毒而不能直接食用或饲用，因此80％以上的棉子都做了肥料，造成了蛋白质资源的巨大浪费。棉酚虽然可以通过物理或化学加工的方法除去，但成本费用高，而且降低了营养价值，经济效益较低，色素腺体的存在给棉花的综合利用带来了巨大的障碍。因此，培育不含色素腺体的棉花(即低酚棉或无色素腺体棉花)品种并加以综合利用就成为了棉花育种研究中的一个崭新的领域。
低酚棉(Glandless Cotton)是指种子和植株无色素腺体，含酚量极低的棉花品种。低酚棉品种在纤维长度上已优于常规棉品种，在纤维比强度上与常规棉品种总体水平相近，而在纤维细度、纤维整齐度方面，低酚棉资源的总体水平略低于常规棉，但并无大的影响。低酚棉杂种优势利用方面的研究则表明，低酚棉的品种间杂种优势明显，无腺体基因对其它的农艺性状无不良影响，在有些性状上还有常规棉所不及的优势(袁有禄，1997)。
1954年美国育种家McMichael报道了控制无腺体性状的基因gl1。gl1使下胚轴、茎杆、叶柄、铃壳不产生腺体。1960年McMichael又发现了。gl2、gl3部这两对基因控制棉花植株地上部分无腺体。Lee(1962)发现了gl4、gl5，并指出这种基因对无限体性状的表达起修饰作用。Murray(1965)又发现了另一修饰基因gl6，gl6作用与gl1相似，但强度较弱。
上述控制无腺体性状的6个基因中，主要是gl2、gl3。gl2位于第12染色体上，gl3在第26染色体上。当这两对基因都处于纯合隐性状态时，植株不产生腺体。gl2、gl3两个基因以累加方式起作用，表现出明显的剂量效应。通过gl2、gl3以及他们对应的显性基因Gl2和Gl3组合，可以改变植株上腺体的密度，从正常到完全无腺体呈连续分布。
Afifi(1966)年通过诱变海岛棉(G.barbadence L)获得了一个无腺体突变体，定名为巴蒂姆110。Kohel(1994)对巴蒂姆110作了遗传研究，认为其无腺体性状由位于Gl2位点的一个部分显性基因控制，并将其定名为Gl2e。
然而，这些低酚棉品种的无腺体性状通常都是由gl2和gl3两对纯合的隐性基因所控制，容易受天然异交的影响而导致生物学混杂，而且一旦发生异交，F1代便会有大量腺体产生，从而失去了无腺体种质的优势。
为了克服隐性基因控制无腺体性状所带来的育种上的不利影响，中国农业科学院棉花研究所的靖深蓉等于1986年开始了选育显性无腺体陆地棉类型的研究工作。她们首先发放了海岛棉无腺体突变品系海1，并用海1与陆地棉杂交，对无腺体性状进行了转育研究，观察了腺体性状在F1、F2及回交后代的表现，认为海1的无腺体性状是由一对显性基因所控制。接着，通过有腺体陆地棉与显性无腺体海岛棉杂交，再与陆地棉回交和人工选择的方法，于1990年成功地把海岛棉中的显性无腺体基因转育到了陆地棉中，育成了显性无腺体陆地棉种质。通过各种检测，该种质性状稳定，且绝大多数性状接近陆地棉，棉酚的含量为0.009％。
分子标记用于低酚棉育种的研究目前尚未见报道，常规的棉花育种手段是回交转育目的基因，低酚棉的传统育种过程也是如此。利用陆地棉无腺体品种与有腺体品种杂交，在苗期通过无腺体性状的鉴别，拔除假杂苗，保留真杂种，完成选育。这个过程不仅费时、费力，而且带有一定的盲目性，选择效率比较低。生物技术的兴起，尤其是分子标记出现后，利用分子标记进行辅助选择育种，不仅减少了盲目性，而且可以减少连锁累赘，缩短育种年限，大大提高了选择效率，给育种领域带来了革命性的变化。
目前常用的分子标记技术依其所用的分子生物学技术，大致可以分为以Southern杂交技术为核心的分子标记和以PCR技术为核心的分子标记。
常用的标记筛选的方法主要有分离群体分群分析法(Bulked SegregantAnalysis)和近等基因系法(Near-isogenic lines)。
随着生物技术的发展，棉花的分子标记的研究也日渐受到关注。目前被广泛应用于棉花的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，研究的领域涉及遗传图谱的构建、基因标记和基因定位、亲缘关系分析、品种纯度鉴定、标记辅助选择等多个方面，并取得了重要进展。
几乎所有重要的农作物，包括番茄、玉米、水稻、甜菜、马铃薯等的分子标记图谱均已构成并越来越趋于饱和。而标记技术在棉花上的应用则较晚，始见于1988年。
棉属RFLP图谱的构建为研究棉属的起源和进化，为重要农艺性状的基因定位和克隆，进而利用生物技术改进棉花品质打下了基础。基因在遗传图谱上的定位为基因的分离和克隆提供了条件。利用分子标记进行基因定位，首先必须找到与该基因连锁的分子标记。
在各种分子标记技术中，AFLP具有灵敏度高、重复性好、快速高效等优点，是鉴定品种纯度最为理想的分子标记。
利用DNA标记辅助选择，首先可以通过分析与目标性状基因紧密连锁的分子标记来判断目的基因的存在与否，并进行精细定位。因为分子标记不受基因表达时间、显隐性关系和环境等条件的影响，故可在早期进行选择。这样不仅减少了选择的盲目性，而且缩短了育种年限，大大提高了选择效率。
分子标记辅助选择的一个应用是有利于基因的转移。回交转育目标性状是棉花育种常用的手段，若控制目标性状的基因为显性，选择具有目标性的基因的植株比较容易，但要获得纯合植株，须通过测交来验证。利用共显性的分子标记如RFLP标记，则使这一过程变得简化，只须选择具有分子标记的植株即可获得纯合体。当回交转育的目标性状基因为隐性时，获得纯合植株比较容易，但回交过程中每回交1-2代就须测交以确认目的基因的存在；但是，如果利用分子标记，测交的步骤就可以省去了。
在不同的群体中，标记之间的遗传距离会有所变化，所以要在自己所研究的材料中根据已发表的资料重新对基因定位，使目的基因的两侧各有至少一个标记，它们与基因的遗传距离小于5.0cM。然后以标记的基因型来选择目的基因，这样可以减轻连锁累赘，进一步提高选择的可靠性。
分子标记辅助选择的另一个应用是基因的累加。农作物有许多基因的表型是相同的，那么经典遗传育种就无法鉴定一个性状的产生是由于一个基因还是由于多个具有相同表型的基因的共同作用形成的。采用DNA标记的方法，先在不同的亲本中将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移到一个品种中，通过检测与不同基因连锁的标记的基因型来判断个体是否含有某一基因，以帮助选择。这样，实际上将表型的检测转换成了基因型的检测。
利用分子标记进行辅助选择时，若能在目的基因两侧同时找到紧密连锁的分子标记，则可以进一步提高选择的可靠性。

发明内容
本发明目的是以近等基因系(NILs)中棉所12(以下简称“中12”)-显性无腺体中棉所12(以下简称“显无中12”)以及它们的F2群体为基础，筛选与显性无腺体基因(Gl2e)相连锁的分子标记，以期图谱定位Gl2e基因，为实际生产中低酚棉的育种提供辅助手段，并为进一步分离、克隆Gl2e基因奠定基础。
本发明的另一个目的是提供与显性无腺体基因(Gl2e)相连锁的分子标记；本发明的再一个目的是提供所述的分子标记在棉花育种中的应用。
具体地，本发明利用近等基因系(NILs)中棉所12(以下简称“中12”)-显性无腺体中棉所12(以下简称“显无中12”)以及它们的F2群体为基础筛选与显性无腺体基因(Gl2e)相连锁的分子标记的方法包括步骤a).利用近等基因系显无种12株系棉花(显无中12)，与中棉所12株系(中12)进行杂交，F1代自交产生F2代；b).用CTAB法提取F2(显无中12×中12)分离群体的叶片总DNA；c).RAPD分析，并回收RAPD片段进行克隆和测序；d).将RAPD标记向SCAR标记转化；e).数据分析。
其中利用RAPD技术对显性无腺体近等基因系进行筛选，获得RAPD标记，而后将其转化为SCAR标记，并对F2群体进行分析，从而获得标记与显性无腺体之间的距离。
在用Operon公司的RAPD随机引物(OPA-M、OPS、OPY、OPZ、OPAA-AC共380条)对两个亲本及两个池的DNA样品进行筛选时。结果几乎每条引物在这四个DNA样品之间的扩增带型完全相同，只有OPD06这一个引物在两个亲本的DNA样品间和两个池的DNA样品间的扩增表现出多态性，该引物扩增出的多态性片段的长度大小约为1,530bp。用该引物进行3次重复扩增，得到的结果一致，即1,530bp大小的条带只出现在亲本显无中12和无腺体池的DNA样品的扩增产物中，表明此RAPD片段所揭示的特异DNA序列可能与无腺体基因Gl2e相连锁，将此多态性标记暂命名为OPD06.1531。
用上述引物OPD06对F2群体的200个单株的DNA分别进行PCR扩增。结果扩增产物中特异条带有无的比例为151∶49，符合3∶1的分离比。其中绝大部分无腺体株都表现为OPD06.1531带型，仅有少数无腺体株表现为零带型，应该是交换类型；绝大部分有腺体株都表现为零带型，仅有少数表现为有带型的交换型。这表明OPD06.1531标记可能与无腺体基因(Gl2e)连锁。
将从低熔点凝胶中回收的上述OPD06.1531片段用引物OPD06进行PCR扩增，电泳检测片段大小与原片段一致后；迅速进行酶连反应，然后转化到感受态细胞(Ecoli DH-5a)中；在含IPTG、X-gal和氨苄青霉素的LB培养基上进行转化子筛选，结果表明连接转化效率为20～40％。随机挑取8个白色菌落进行菌液PCR扩增及快速电泳检测，获得2个能扩增出与原RAPD片段大小一致的菌落；对其进行扩大培养后，取1ml无菌培养液，交由上海博亚生物技术公司进行测序。经过正向测序、反向测序及连接3个反应，测出全部OPD06.1531标记片段的碱基序列，序列为所附序列表中的SEQ ID NO.1。
引物序列5’ACCTGAACGG 3’；RAPD标记序列长度为1,530bp。
从上面的序列可以看出，除RAPD片段引物结合位点外，没有其它任何发夹结构，且序列两端的10bp碱基精确地与RAPD引物OPD06的序列相同根据引物设计的原则及OPD06.1531片段两端的序列，应用引物设计软件Primer 3.0设计了一对18～20bp长度的引物SCOPD06；并且，SCOPD06包含了原RAPD引物序列。其详细序列见表1表1与Gl2e连锁的SCAR标记分析表

用引物SCOPD06并结合其反应条件，对F2群体的200个单株DNA分别进行PCR扩增。结果表明，引物的PCR扩增产物中特异条带的有无情况与其RAPD反应情况相同，表明SCOPD06的扩增片段确实来自原RAPD多态性片段。
将F2群体的200个单株的腺体有无情况及其RAPD和SCAR标记所检测出的特异条带有无的情况输入计算机，运行软件Mapmaker/Exp 3.0。结果表明，无腺体基因(Gl2e)与1个RAPD标记和1个SCAR标记相连锁，且这1个RAPD标记和1个SCAR标记在目的基因(Gl2e)的一侧重合，其遗传图距为6.4cM。
本研究中所用的材料是一个显性无腺体近等基因系(NILs)中棉所12(以下简称“中12”)-显性无腺体中棉所12(以下简称“显无中12”)。近等基因系的遗传背景全为中12，仅仅相差“显性无腺体”的性状。其材料选育情况如下显性无腺体种质来源于一个名为“海1”的海岛棉品系，由中国农科院棉花所杂优课题组自埃及引进的一个海岛棉品种“亚历山大4号”中系选而成。本研究所用的基本材料由杂优课题组提供，显性无腺体近等基因系的母本种质是中12，海1为父本，母本回交4代，显无中12基本育成。引进显无中12后，中棉所分子应用课题组继续回交4代，然后用于本研究实验。
近等基因系显无中12和它原来的中12直接用于RAPD随机引物的筛选实验，它们杂交(中12×显无中12)后F1代自交，F2代为显性无腺体分子标记的分离群体，用于腺体性状的遗传分析和RAPD标记的图距分析及SCAR标记验证实验。
田间主要调查植株腺体性状的分离情况。上述组合的F2种子按照常规方法播种，间苗和定苗均是随机。在现蕾期前后，随机调查200个单株，记载有腺体和无腺体植株的单株数。
在调查单株的同时进行叶片取样，迅速储存于超低温冰柜(-70℃)中，用做提取总DNA用。


P1亲本显无中12；C1显性无腺体池；P2亲本中12；C2有腺体池；1、2、3、4、5、6显性无腺体；7、8、9、10、11、12有腺体；Mλdna/HindIII+EcoR I，箭头标记带。
实施例实施例1总DNA的提取参照宋国立等报道的CTAB法提取叶片总DNA，详细步骤如下(1)自超低温冰柜(-70℃)冰箱中取出材料2g(或适量)，立即放入冰冻过的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml的离心管中，加入在60℃的水浴锅中预热过的提取液和适量的活性炭后，混合均匀，放入60℃水浴锅中水浴40min；(2)取出离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)，盖上盖子，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀；然后，平衡离心管，1300g离心10min；(3)取上清于另一离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)，重新抽提一次；(4)重新取上清于另一离心管中，加入0.6倍体积的冰冷异戊醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止；(5)静止30min(或放入-20℃冰箱中20-40min)，挑出沉淀(或10000g离心5min，倾去上清)，用70％的酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次；(6)将DNA取出，置于另一离心管中，风干；(7)加入2ml TE于离心管中，在65℃水浴锅中水浴20min，使DNA完全溶解；(8)再次加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，重提DNA；
(9)取上清，加入0.1倍体积的NaAc(3mol/L，PH5.2)，混匀后，缓慢加入2倍体积的冰无水乙醇，静止5min后，缓慢水平转动离心管，直到界面处出现一团粘稠透明富含气泡的絮状沉淀；挑出沉淀，转到1.5ml的eppendorf管中，用70％酒精洗1-2次，无水乙醇洗1次，风干，溶解于适量的TE中，于-20℃冰箱中保存备用。
注100ml提取液配方Tris0.01mol；EDTA0.002mol；PvP40 2g；CTAB2g；NaCl0.15mol；巯基乙醇2ml(用前加入)。
实施例2RAPD分析PCR反应体系的建立及热循环程序反应体系的建立主要参照涂金星(1997)的方法。PCR反应体系包括ddH2O、Buffer、Mg2+、dNTPs、TaqE、Primer、模板DNA。在确定Buffer、Primer、模板DNA的用量的情况下，进行Mg2+及dNTPs的优化组合。实验设计如下实验1反应总体积20ul10×buffer 2.0ulTaqE(2U/ul)0.5ulDNA(10ng/ul) 5.0ul引物(10pM) 1.0uldNTPs(2.5mM)分三个浓度梯度0.8ul，1.2ul，1.6ul；每组加Mg2+(15mM)0～5.0ul，以0.2ul递增。
实验2反应总体积20ul10×buffer2.0ulTaqE(2U/ul) 0.5ulDNA(10ng/ul) 5.0ul引物(10pM)1.0ulMg2+(15mM)分三个浓度梯度1.5ul，2.0ul，2.5ul；每组加dNTPs(2.5mM)0～3.0ul，以0.2ul递增。
根据优化实验的结果，选择主带清晰，弱带少的反应体系为本实验的标准反应体系，反应体系如下(共20ul)10×Buffer(含Mg2+1.5mmol/L)2.0ul；dNTPs(2.5mmol/L)1.2ul；TaqE(2u/ul) 0.5ul；Primer(10pM)1.0ul；模板DNA(10ng/ul)5.0ul；ddH2O 10.3ul；PCR扩增于Crocodile III型热循环仪上进行。
3.1.2热循环程序为如下95℃(3min)，50℃(1min)，72℃(2min)1个循环；94℃(1min)，37℃(1min)，72℃(1min)38个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
扩增产物用1.4％(W/V)的西班牙琼脂糖凝胶进行电泳，缓冲液为0.5×TBE，2V/cm电泳，持续电泳时间为3-4h；接着用0.01％EB染色15-20min，在Pharmacia一次成像仪上观察，照相。
亲本间多态性的检测苗期从亲本中12和显无中12中随机选取典型株各5株，分别提取叶片总DNA，在DU-650分光光度计上测定浓度后等量混合，构成两个亲本的DNA样本，以这两个DNA样本为模板进行引物的筛选。所筛选的引物是Operon公司的RAPD随机引物，根据PCR产物的凝胶电泳的情况，筛选出多态性引物。引物的筛选本研究所用的材料是近等基因系(NILs)中12-显无中12以及它们的F2群体。理论上中12与显无中12之间的遗传背景除了提供的目的基因及附近区域有所不同之外，其它性状是完全相同的，故用两个亲本的DNA样品筛选出的多态性标记就可能是与目的基因相连锁的分子标记。
本研究中进一步用分离群体分群分析法(BSA)进行引物筛选的验证。方法是在F2群体的苗期根据田间腺体性状分离的情况，随机选取典型的有腺体植株及无腺体植株各10株，分单株提取DNA后等量混合，构成两个DNA池，再次用检测亲本多态性的引物对两个池的DNA样品进行筛选。
F2分离群体的RAPD分析用在两个亲本和两个池的筛选中均表现出多态性的引物对F2群体的200个单株进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，以检测F2群体中各单株的多态性。
实施例3RAPD标记向SCAR标记的转化RAPD片段的回收、克隆和测序RAPD片段的回收PCR产物经0.8％的低熔点凝胶电泳分离后，在长紫外灯下精确切取待回收的目的片段，置于0.5ml的离心管中，用无菌枪头捣碎，加入50ul ddH2O于4℃浸泡一天；然后离心以沉淀琼脂糖块，取1ul上清液作模板进行PCR扩增；扩增后取10ul PCR产物电泳检测片段大小是否与原片段一致；若一致，则迅速取留存的同一PCR产物进行酶连反应。
酶连反应酶连反应参照Promega的pGEM-T Easy Vector试剂盒进行。具体步骤如下短暂离心pGEM-T Easy Vector和control insult DNA试管，以使其中的内容物聚集在试管底部。建立酶连反应体系如下表2，把各种试剂小心混合后，置于14℃酶连16小时。
表2克隆RAPD片段的酶连反应体系表

E.coil感受态细胞的制备及纯化取存于-70℃的E.coil DH-5a菌液，划线于LB固体培养基上，37℃培养过夜；挑选一单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃240rpm/min培养过夜；取0.5ml菌液转接于装有45ml LB液体培养基的150ml三角瓶中，37℃240rpm/min培养2.5-3h后，转移至冰预冷的50ml离心管中，冰浴10min；4℃4000rpm/min离心10min收集菌体，去上清，倒立，晾干，加入2ml冰冷0.1M CaCl2重悬细胞，分装于冰浴的无菌微量离心管中，取1管存于4℃12-24h备用，其余的可加入甘油后混匀，放入-70℃冰箱中封存。
为每个连接反应准备两个LB平板(含氨苄青霉素、IPTG和X-gal)，平铺前置平板于室温。离心含连接反应液的试管以使其内容物聚集在底部，转化前将其放在68℃水浴锅中水浴10min，然后让其自然冷却待用。从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰浴中使其刚好融化(约15min)，轻弹试管混匀细胞，小心转移60ul细胞于每个已准备好的置于冰上的1.5ml离心管中，立刻加入2ul-巯基乙醇和30ul连接产物。小心混匀，冰上静置30min(不能摇动)；然后在44℃水浴中热激45sec(不能摇动)；再迅速置于冰上。加入300ul SOC(用前置于37℃中保温)培养基于被转化的含连接反应液的试管中，37℃250rpm/min培养1h。取每种转化培养液100ul/个平铺于已制备好的平板上。正置平板于室温至液体全部被吸收后，倒置平板于37℃培养16-20h，使蓝斑充分显现。挑选白色菌落于1.5ml离心管中进一步培养分析。
重组子筛选在上述离心管中加入50ul无菌ddH2O，取出25ul，置于100℃水浴中5min；离心，取上清，用原RAPD引物进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，检测扩增片段大小是否与原RAPD特异片段一致；若一致，则对产生片段大小一致的菌落再进行扩大培养。
克隆片段的测序将扩大培养的含有目的片段的菌液取1ml装入无菌的试管中，交由上海博亚生物技术有限公司进行测序。
SCAR引物的设计及分析SCAR引物的设计引物遵循设计原则设计后，检查引物是否符合以下几条(1)能否形成发夹结构；(2)两个片段之间是否存在大于6bp的同源序列；(3)G-C含量是否超过60％；(4)退火温度是否超过60℃；
(5)引物3’端是否由C或G结尾；引物交由上海生工生物工程公司合成。
PCR扩增此PCR反应体系基本与前面的RAPD反应的PCR体系相同，只是把RAPD引物换为一对SCAR引物，每个引物的量为5pmol；反应在Crocodile III型热循环仪上进行。
热循环程序为95℃(2min)，60℃(1min)，72℃(2min)32个循环；72℃(10min)延伸1个循环；4℃保存。
多态性验证和群体分析调整PCR扩增的复性温度和变性时间，以重现原RAPD分析的多态性片段。如果SCAR引物的扩增片段在两个亲本和两池之间都表现出多态性，则进一步用F2群体的200个单株DNA样品逐个进行PCR扩增和电泳检测。
实施例4.数据分析遗传分析田间随机调查F1群体各单株的腺体情况，发现所有单株均表现为无腺体的性状；调查F2群体的腺体性状分离情况时，田间随机抽取200个单株，发现无腺体植株与有腺体植株的比例为154∶46，卡平方运算P＜0.01，符合3∶1的分离比，证实了前人研究得出的无腺体性状是质量性状，且无腺体基因Gl2e受一对显性基因所控制的结论。
F2群体中各单株RAPD分析用上述引物OPD06对F2群体的200个单株的DNA分别进行PCR扩增。结果扩增产物中特异条带有无的比例为151∶49，符合3∶1的分离比。其中绝大部分无腺体株都表现为OPD06.1531带型，仅有少数无腺体株表现为零带型，应该是交换类型；绝大部分有腺体株都表现为零带型，仅有少数表现为有带型的交换型。这表明OPD06.1531标记可能与无腺体基因(Gl2e)连锁(表3)表3.无腺体基因Gl2e与RAPD标记的连锁关系


+/-有/无特异带SCAR分析用引物SCOPD06并结合其反应条件，对F2群体的200个单株DNA分别进行PCR扩增。结果表明，引物的PCR扩增产物中特异条带的有无情况与其RAPD反应情况相同，表明SCOPD06的扩增片段确实来自原RAPD多态性片段遗传连锁分析将F2群体的200个单株的腺体有无情况及其RAPD和SCAR标记所检测出的特异条带有无的情况输入计算机，运行软件Mapmaker/Exp 3.0。结果表明，无腺体基因(Gl2e)与1个RAPD标记和1个SCAR标记相连锁，且这1个RAPD标记和1个SCAR标记在目的基因(Gl2e)的一侧重合，其遗传图距为6.4cM。
序列表<110>中国农业科学院棉花研究所<120>棉花显性无腺体基因的分子标记<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1531<212>DNA<213>G.hirsutum<400>1acctgaacgg agagggatct gcgtgttttc ttccctaaaa gggatattta catatttggt60cccttcgatt ttttcttctt tttgatttaa tcctattttc ttttttttta attttgcccc120ataattttgg atttcgtttc attttaatcc tctgactatt ggggcctctt ggaatggtgc180gttttaaaaa ggaagtctgg ggataatttc ccatttgacc cctgttcttt tccacgcgtt240catattcagt cccttagtct gattttttat tattttacag gttattccct ctaattttat300ttcagtttcg aatcaatcct tattttatta taatttagat ttgaaattcc gttttatttc360agatttagtc ttttacttaa ttttagtttt tttttgttat tctttggtat tattctttat420tatatatatt tatttcttat tgtctcatat ttcatcttaa aatttatatg gttcatattt480agacattttg ctctatcggc attattacat atatatttta gcatgtgttt atttacctac540ttgctatttt ttatgtatac gttgtttttt tattattgtt gcttttatca tttttaaata600ttcacgattt gtttacttat tttattatta tgtactttcc attttacttt gtttttagtt660tcctttattt tactatttat ttagttatat cttttttata atttcaaaac tttagatttt720attattatta ttattattaa tctttacatt tttatcgtat tattattatt gttgttgttt780gttgatgatt atcattattt acattattgt ttccattatc attatcatta ttatccatgc840atattaatat tttagtttat cgatatcaat gttatatatt atattgcatt atgtatgtta900tgttattatt acgccaaatt tgtcacacta ccattattcg tcaagtataa tcccattcat960gtttcaaatg atttttcttt aaaacataat caattaaacg tatatcattt ttaaactatt1020tcataaattt tatccaaatt caccaaaaaa aaactgttaa atatgatttc tattttcagt1080caaatttgag aaataatctt tcagttaaac tctgtttact tgtttcaatc aaacactgat1140tagtttagat tattttatta ttatttgacc tatgaattta gcctataaat aggctttttt1200acaaccttag aaaaatactc ccattagaga ttagaactca taatacattt agagaatttt1260gcgtttacgt tttgtgggtt ctttgctttc gggtttttgg ggtttagttt ttatctccat1320cttttgtact cttcgttctt ttgtcattat agtaaaatta tctttactcg tgatttttta1380tcctctttgg agggattttt ccacgttaaa tttgtgtgtt caatttctca atttattacg1440ctattttact tgttcgctgc ttaatcaggt cgaaatccta acaagtggta ttagagctag1500ttcaattttc atagatcagc tccgttcagg t 1531<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<400>2acctgaacgg 10<210>3
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3acctgaacgg agagggat18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4acctgaacgg gctgatcta 19
权利要求
1.一种筛选与棉花显性无腺体基因连锁的分子标记的方法，包括步骤a).利用近等基因系显无种12株系棉花(显无中12)，与中棉所12株系(中12)进行杂交，F1代自交产生F2代；b).用CTAB法提取F2(显无中12×中12)分离群体的叶片总DNA；c).RAPD分析，并回收RAPD片段进行克隆和测序；d).将RAPD标记向SCAR标记转化；e).数据分析。
2.一种棉花显性无腺体基因的分子标记，其通过下述步骤制备a).利用近等基因系显无种12株系棉花(显无中12)，与中棉所12株系(中12)进行杂交，F1代自交产生F2代；b).用CTAB法提取F2(显无中12×中12)分离群体的叶片和亲本叶片总DNA；c).RAPD分析，并回收RAPD片段进行克隆和测序；d).将RAPD标记向SCAR标记转化；e).数据分析。
3.根据权利要求2的分子标记，其特征在于具有SEQ ID No.1的核苷酸序列。
4.根据权利要求2或3的分子标记，其中用RAPD技术筛选与棉花显性无腺体基因连锁的引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列。
5.根据权利要求2或3的分子标记，其中用RAPD技术筛选与棉花显性无腺体基因连锁的引物对具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。
6.权利要求2所述的棉花显性无腺体基因的分子标记在育种中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的分子标记具有SEQ IDNo.1的核苷酸序列。
8.用于SCAR分析来获得棉花显性无腺体基因的分子标记的引物对，其特征在于具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的用于SCAR分析来获得棉花显性无腺体基因的分子标记的引物对，其特征在于所获得的分子标记具有SEQ ID No.1的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种利用RAPD技术筛选棉花显性无腺体基因的分子标记的方法，包括步骤a)利用近等基因系显无种12株系棉花(显无中12)，与中棉所12株系(中12)进行杂交，F1代自交产生F2代；b)用CTAB法提取F2(显无中12×中12)分离群体的叶片总DNA；c)RAPD分析，并回收RAPD片段进行克隆和测序；d)将RAPD标记向SCAR标记转化；e)数据分析。本发明公开了一种棉花显性无腺体基因的分子标记，所述分子标记具有SEQ ID No.1的核苷酸序列。另外，本发明也公开了所述棉花显性无腺体基因的分子标记在育种中的应用。
文档编号C12N15/29GK1796573SQ20041009898
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月22日 优先权日2004年12月22日
发明者王坤波, 宋国立, 黎绍惠, 刘方, 王春英, 张香娣, 蒋晓燕 申请人:中国农业科学院棉花研究所