专利名称：：小麦wcor726基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物生物
技术领域：
中一种可被逆境特异诱导表达的植物启动子及其应用，特别涉及一段来源于小麦(Triticmaestivum)冷激活LEA/RAB类蛋白WCOR726基因启动子及其应用。
背景技术：
：在植物生物技术方面，宿主植物中外源基因的表达强度、时期与组织特异性常常取决于所使用的启动子。常用的各种启动子往往具有很高的表达强度，例如花椰菜花叶病毒的35S启动子，这种启动子由于其高效组成型表达特性，广泛用于植物生物
技术领域：
。但是，在某些情况下，如在耐逆植物转基因工程的研究中，耐逆外源基因在35S启动子的调控下，一直高效表达会引起转基因宿主植株生长延缓现象(LiuQ，KasugaM，SakumaY，AbeH，MiuraS，Yamaguchi-ShinozakiK，ShinozakiK.，Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomainseparatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlow-temperature-responsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell.1998Aug；10(8)1391-406)，因此需要一种新型启动子使外源基因的表达受逆境条件的诱导，从而减少对宿主植物生长的不利影响。植物对逆境的感知和应答有ABA相关和非ABA两种途径。ABA相关途径包括受逆境诱导表达的转录因子，以及它们的下游应答基因。如bZIP类转录因子能与ABRE保守框(PyACGTTGGC)结合，调控基因表达。而MYC或MYB类转录因子则识别下游基因启动子区的保守位点CANNTG或PyAACPyPu。非ABA途径包括受逆境诱导表达的DREB转录因子，DREB转录因子首先在拟南芥中被克隆，有DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB1D和DREB2A，DREB2B，它们含有ERF/AP2结构域，能特异性地与DRE保守框(A/GCCGAC)结合，诱导其下游基因如编码亲水性多肽COR(冷激活，cold-regulated)蛋白基因等的表达。这些蛋白在逆境条件下，对细胞膜和蛋白起到保护功能。对拟南芥的冷激活蛋白rd29A启动子的研究表明它能被寒旱盐及脱落酸诱导表达，小麦编码冷激活蛋白WCS120基因启动子在单子叶和双子叶植物中都受寒的诱导表达，在它们的启动子区有DRE保守框。WCOR726是小麦冷激活LEA/RAB类蛋白，共125个氨基酸，是从冷处理一天的小麦cDNA文库中克隆到的(ACCESSION号U73213)，但对其表达特性的研究尚未见报道。发明创造内容本发明的目的是提供一种在植物中能被寒诱导表达的小麦WCOR726基因启动子。本发明所提供的小麦WCOR726基因启动子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的自5｀端第1位-1256位碱基限定的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中的SEQID№1的自5｀端第1位-1256位碱基限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。在高严谨条件下能够与序列表中的SEQID№1的自5｀端第1位-1256位碱基限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，可以是序列表中序列1的核苷酸序列。序列表中序列1的DNA序列由1298个碱基组成，其中包含全长1256bp的WCOR726基因启动子的核酸序列(SEQID№1的自5｀端第1位-1256位碱基)及长度为42bp的WCOR726基因的5’非转译区的一部分(SEQID№1的自5｀端第1257位-1298位碱基)。以推测的转录起始位点(SEQID№1的自5｀端第1257位碱基)为+1，该启动子的TATA框位于序列的-45区(SEQID№1的自5｀端第1212位-第1215位碱基)。在序列的-1130(SEQID№1的自5｀端第127位-第132位碱基)，-972(SEQID№1的自5｀端第285位-第290位碱基)，-913(SEQID№1的自5｀端第344位-第349位碱基)，-102(SEQID№1的自5｀端第1155位-第1160位碱基)，-76(SEQID№1的自5｀端第1181位-第1186位碱基)，-24(SEQID№1的自5｀端第1233位-第1238位碱基)位置有受ABA信号调控的MYC识别位点(CANNTG)，在序列的-1040(SEQID№1的自5｀端第217位-第222位碱基)，-774(SEQID№1的自5｀端第483位-第488位碱基)，-609(SEQID№1的自5｀端第648位-第653位碱基)，-134(SEQID№1的自5｀端第1123位-第1128位碱基)位置有MYB识别位点(PyAACPyPu)。这些保守序列的存在表明WCOR726基因启动子有可能是受逆境诱导表达的启动子。含有小麦WCOR726基因启动子的表达盒，也属于本发明的保护范围，如小麦WCOR726基因启动子以功能性方式连接于编码目的多肽的核酸序列，且所述编码目的多肽的核酸序列连接于一个转录终止核酸序列所构成的表达盒。含有小麦WCOR726基因启动子的表达载体，细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体，如pCAMBIA7006726p(物理图谱如图5所示)。用于构建含有所述小麦WCOR726基因启动子的表达载体的出发载体可为pMRT1207、pMRT1177、pMRT1178、pMRT1179、pMRT1180或pMRT1181的双元载体等载体。本发明的小麦WCOR726基因启动子通过与具有特定功能的目的基因进行功能性连接可广泛用于培育耐逆转基因植物。其中，所述转基因植物可为单子叶植物如草坪草、小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米等，或双子叶植物如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油料种子、甜菜或向日葵等。经RT-PCR和植物转基因实验证明，在上述小麦WCOR726基因启动子具有受逆境诱导启动目的基因表达的特性。本发明从小麦(Triticumaestivum)中分离和克隆了逆境诱导表达的小麦冷激活LEA/RAB类蛋白WCOR726基因启动子，该启动子在植物中能被逆境如寒诱导表达。本发明的小麦WCOR726基因启动子将广泛用于培育具有逆境耐性的转基因植物，具有深远的理论意义及广泛的实践意义。图1为WCOR726基因启动子的克隆载体pBlue726p的物理图谱图2A为寒胁迫下不同时间段经RT-PCR检测的WCOR726基因在小麦中的表达特征图2B为不同寒处理条件下小麦ubiquitin的RT-PCR检测图3为阳性对照植物表达载体pCAMBIA2301的物理图谱图4为阴性对照植物表达载体pCAMBIA7006的物理图谱图5为WCOR726基因启动子的植物表达载体pCAMBIA7006726p的物理图谱图6A为pCAMBIA7006726p转基因烟草的PCR验证照片图6B为pCAMBIA2301，pCAMBIA7006转基因烟草的PCR验证照片图7为转基因烟草中寒胁迫下WCOR726基因启动子调控GUS基因表达的照片具体实施方式用于本说明书和权利要求书的术语具有以下含义-术语“核酸”是指DNA或RNA；-术语“核酸序列”是指从5’端读至3’端的单链或双链的核苷酸碱基的寡聚体或聚合物，它包括自我复制型质粒、感染性或非感染性的基因和DNA或RNA聚合物、以及功能性或非功能性DNA或RNA。在用于本申请中的核苷酸符号中，除具体提及的以外，单链或双链核苷酸序列的左端均为5’端；-术语“启动子”或短语“启动子区核酸序列”是指位于翻译起始密码子上游、RNA聚合酶和其它转录蛋白的识别和结合的核酸区；-“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子；-“诱导表达启动子”是指在宿主生物中由特定的外界环境因素诱发表达其下游以功能方式连接的核酸序列的启动子；-短语“以功能方式连接的”或“功能性连接的”是指一段核酸序列(例如一个启动子或一个调节或功能框)与另一段核酸序列(例如另一调节或功能框、或编码待产生的蛋白的待表达的基因)的连接，使得所述序列在已经引入其的细胞、基因组、载体或表达盒中发挥其原始功能，即使得它们在这样的环境中有功能。就启动子而言，启动子序列也包括在转录起始位点和翻译起始位点之间的转录序列；-术语“表达盒”是指这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够在与这种序列相容的宿主生物中指导编码待产生的多肽的核酸序列或基因的表达。这样的盒至少包括一个启动子和一个转录终止信号、以及任选的表达所需要的或可用于表达的其它因子；-术语“载体”是指表达系统，例如DNA包被的轰击粒子、基于核酸的转运载体和已被改变以运送所述核酸的核酸分子、以及自主自我复制型环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等。所述载体能够或者作为整合到宿主基因组中的自主结构通过在有丝分裂期间由所述细胞稳定复制，或者维持在宿主的细胞核或细胞质中；-术语“质粒”是指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括所谓的“表达”质粒和所谓的“非表达”质粒。如果一种重组细胞培养物或微生物被描述为是“表达质粒”的宿主，则该术语既包括染色体外环状DNA分子，又包括已经整合到宿主染色体中的DNA。如果所述质粒被宿主细胞保持，则所述质粒或者在有丝分裂期间作为一种自主结构由所述细胞稳定地复制，或者整合到所述宿主的基因组中；-术语“框”是指负责调节功能的核酸序列；-术语“位于”是指已鉴定元件(例如“框”、限制位点或具有特定功能的密码子)在核酸序列中的位置。以数字给出的位置是指所述元件在所述核酸序列中的起始位置，只是当具体提及时，以所述核苷酸序列的阅读方向即5’--->3’方向提及；-术语“转基因植物”是指通过遗传操作技术获得的植物，并包括通过这些技术所获得的整株植物、在其基因组中已经整合了这类操作或表达这类操作的再生植物、其后代以及植物器官，例如根、茎和叶。按照本发明的转基因植物可以具有不同的倍性水平，可以是多倍体、二倍体或单倍体。实施例1、启动子克隆与序列分析(1)材料处理将小麦种子用2％次氯酸钠消毒20分钟，蒸馏水冲洗3遍后，置于培养皿中湿润的滤纸上，于25℃暗培养，发芽一周。(2)基因组DNA的抽提用CTAB法(SteinerJJ，PoklembaCJ，FjellstromRG，ElliottLF.，Arapidone-tubegenomicDNAextractionprocessforPCRandRAPDanalyses.NucleicAcidsRes.1995Jul11；23(13)2569-70.)提取小麦基因组DNA，具体方法如下取发芽一周的小麦幼叶，以液氮研磨，每1克的植物材料中加入5毫升经68℃预热的CTAB溶液(用前加10mM巯基乙醇)，60℃加热30分钟。然后加入等体积氯仿异戊醇，15000g离心15分钟，取上清。在上清液中加入2/3倍体积的异丙醇，混匀，用注射针针尖将DNA丝搅出置于新管中，再加入75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁，然后将乙醇吸干，空气烘干剩余的乙醇，加入TE溶解DNA。并于-20℃保存。(3)WCOR726基因DNA片段的克隆与序列分析以PCR(聚合酶链反应)方法扩增WCOR726基因DNA片段。PCR反应液含有1μg基因组DNA、1.5mMMgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物、1μM5’引物和1μM3’引物，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。引物序列如下5’引物726-15’CAACCAAACAGCAGAACCAGTG3’3’引物726-25’CCTCCAACGACCAAGTGAGC3’按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增WCOR726基因DNA片段先94℃5分钟；再94℃1分钟，62.5℃1分钟，72℃1分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增得到的约0.54kbDNA片段用凝胶回收试剂盒(北京北京天纬时代科技有限公司科技有限公司)按供应商提供的方案回收该片段，用pGEM-Teasyvector系统(Promega公司，美国)按供应商提供的方案克隆该片段，测序(上海申友生物技术公司)，通过与WCOR726的cDNA序列(GenBankaccessionnumberU73213)比较，证实克隆到WCOR726基因序列片段。(4)WCOR726基因启动子的核酸序列的克隆与分析用TAIL-PCR法(LiuYG，WhittierRF.，ThermalasymmetricinterlacedPCRautomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995Feb10；25(3)674-81)扩增WCOR726基因启动子核酸序列。PCR反应液含有1μg小麦基因组DNA，1.5mMMgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物、2.5μM5’引物AD1和0.25μM3’特异引物726-A，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。引物序列如下AD15’AGWGNAGWANCAWAGG3’726-A5’CGTGTCCCTGCTGCCCGTAT3’按照下列方案在PCR仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环扩增反应94℃4分钟，62℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，25℃3分钟，用3分钟时间缓慢升到72℃，在72℃反应2分，以上共1个循环；之后94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，62℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，60℃1分钟，72℃2分30秒，以上共15个循环；72℃5分钟之后结束反应。将上述PCR产物稀释2000倍后作为摸板，继续新一轮PCR反应，3’特异引物改为0.25μM的726-B，序列为5’CCCTGGTGCTCCATCTTGCG3’。反应条件如下94℃2分钟；之后94℃30秒，62℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，62℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分30秒以上共15个循环；72℃5分钟之后结束反应。将上述PCR产物稀释2000倍后作为摸板，进一步继续新一轮PCR反应，3’特异引物改为0.25μM的726-C，序列为5’CTCGGGAAATCTGACACTGGTTC3’。反应条件如下94℃2分钟；之后94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分，以上共20个循环；72℃7分钟之后结束反应。经过上述三轮PCR反应后得到一条长为721bp的DNA条带，用凝胶回收试剂盒(北京北京天纬时代科技有限公司科技有限公司)按供应商提供的方案回收该片段，用pGEM-Teasyvector系统(Promega公司，美国)按供应商提供的方案克隆该片段，并测序(上海申友生物技术公司)。所得序列与编码WCOR726的基因序列比较分析后确定是该基因的上游启动子区核酸序列。根据所得序列，重新设计引物，开始第二轮TAIL-PCR反应，继续扩增WCOR726基因启动子核酸序列。PCR反应液含有1μg小麦基因组DNA，1.5mMMgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物、2.5μM5’引物AD2和0.25μM3’特异引物726P-A，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。引物序列如下AD25’NTCGASTWTSGWGTT3’726P-A5’CACTGTCGATCTTCTCACCGGCTAT3’按照下列方案在PCR仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环扩增反应94℃4分钟，62.5℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，25℃3分钟，用3分钟时间缓慢升到72℃，在72℃反应2分，以上共1个循环；之后94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，62.5℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，62.5℃1分钟，72℃2分30秒，以上共15个循环；72℃5分钟之后结束反应。将上述PCR产物稀释2000倍后作为摸板，继续新一轮PCR反应，3’特异引物改为0.25μM的726P-B，序列为5’GCTCAGGGATCTGCATGAACAG3’。反应条件如下94℃2分钟，之后94℃30秒，60℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，60℃1分钟，72℃2分30秒，94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分30秒，以上共15个循环；72℃5分钟之后结束反应。将上述PCR产物稀释2000倍后作为摸板，进一部步继续新一轮PCR反应，3’特异引物换为0.25μM的726P-C，序列为5’CAGAGCCATGACAAAAGCC3’。反应条件如下94℃2分钟；之后94℃30秒，44℃1分钟，72℃2分钟，以上共20个循环；72℃7分钟之后结束反应。经过上述两轮PCR反应后得到一条长约为0.8kb的DNA条带，用凝胶回收试剂盒(北京北京天纬时代科技有限公司科技有限公司)按供应商提供的方案回收该片段，用pGEM-Teasyvector系统(Promega公司，美国)按供应商提供的方案克隆该片段，并测序(上海申友生物技术公司)。所得序列与上一轮PCR产物序列比较后确认为是其5’上游序列。根据所得序列，设计引物以PCR(聚合酶链反应)方法扩增WCOR726基因启动子的核酸序列。PCR反应液含有1μg小麦基因组DNA作为模板DNA、1.5mMMgCl2、20mMTris-HCL(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物、1μM5’引物和1μM3’引物，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)，1个单位的pfu聚合酶(上海申能博彩生物科技有限公司)。引物序列如下5’引物726PT5’TATGAAGATGCCAGCACGAAAG3’3’引物726-D5’CTCTCACCAACAAACACGAACTG3’按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环先94℃5分钟；再94℃30秒，55℃1分钟，72℃3分钟，共30个循环；最后72℃5分钟。将扩增得到的1298bpDNA片段用凝胶回收试剂盒(北京北京天纬时代科技有限公司科技有限公司)按供应商提供的方案回收该片段，，并与经EcoRV(宝生物工程(大连)有限公司工程(大连)有限公司)消化的pBluescriptII片段连接，得到克隆载体pBlue726p(图1)。WCOR726基因启动子的核酸序列测定结果(上海申能博彩生物科技有限公司)表明WCOR726基因启动子具有SEQIDNo.1的核酸序列，全长1298bp，其中包含全长1256bp的WCOR726基因启动子的核酸序列(SEQID№1的自5｀端第1位-1256位碱基)及长度为42bp的WCOR726基因的5’非转译区的一部分(SEQID№1的自5｀端第1257位-1298位碱基)。以推测的转录起始位点(SEQID№1的自5｀端第1257位碱基)为+1，该启动子的TATA框位于序列的-45区(SEQID№1的自5｀端第1212位-第1215位碱基)。在序列的-1130(SEQID№1的自5｀端第127位-第132位碱基)，-972(SEQID№1的自5｀端第285位-第290位碱基)，-913(SEQID№1的自5｀端第344位-第349位碱基)，-102(SEQID№1的自5｀端第1155位-第1160位碱基)，-76(SEQID№1的自5｀端第1181位-第1186位碱基)，-24(SEQID№1的自5｀端第1233位-第1238位碱基)位置有受ABA信号调控的MYC识别位点(CANNTG)，在序列的-1040(SEQID№1的自5｀端第217位-第222位碱基)，-774(SEQID№1的自5｀端第483位-第488位碱基)，-609(SEQID№1的自5｀端第648位-第653位碱基)，-134(SEQID№1的自5｀端第1123位-第1128位碱基)位置有MYB识别位点(PyAACPyPu)。这些保守序列的存在表明WCOR726基因启动子有可能是受逆境诱导表达的启动子。实施例2、不同逆境胁迫下WCOR726基因在小麦中表达特征的RT-PCR检测(1)材料处理取小麦种子用2％次氯酸钠消毒20分钟，蒸馏水冲洗3遍后，至于培养皿里湿润的滤纸上，于4℃暗培养1天，25℃发芽3天后移至蛭石中，25℃继续萌发约一星期。置于4℃，冷处理，并分别在0、4、14小时取出，-70℃保存。(2)小麦RNA的抽提以液氮研碎-70℃保存的小麦材料，每0.1g的植物材料中加入1mlTRIZOLRNA提取液(鼎国生物技术公司)，并按供应商提供的方案进行总RNA的提取。将得到的RNA用DNase酶(Prmega，America)按供应商提供的方案进行消化，以去除残存的DNA，以分光光度计(Eppendorf公司，德国)检测各样品中RNA的浓度，并用TE调整至浓度一致。(3)RT-PCR检测WCOR726基因的表达取1μg总RNA用反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)以oligo(dT)20为反转录引物按供应商提供的方案进行RT反应。所得产物10倍稀释后取1μl进行PCR反应。PCR反应液含有1.5mMMgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物、1μM5’引物726-1和1μM3’引物726-2，以及1个单位的Taq聚合酶(上海上海生工生物工程技术服务有限公司)。引物序列如下5’引物726-15’CAACCAAACAGCAGAACCAGTG3’3’引物726-25’CCTCCAACGACCAAGTGAGC3’按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增WCOR726cDNA片段先94℃5分钟；再94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。同时，扩增ubiquitin作为定量标准，PCR反应液同上，引物换为1μM5’引物U-5和1μM3’引物U-3，引物序列如下5’引物U-55’TATTTGTGAAGACCCTCACC3’3’引物U-35’GTTCACCAAAGCTGCTCC3’PCR反应条件如下先94℃5分钟；再94℃1分钟，50℃30秒，72℃1分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。结果如图2A和图2B所示，在未寒处理及寒处理4小时的小麦叶片中WCOR726基因有少量表达，寒处理14小时后小麦WCOR726基因的RNA含量明显升高，同时，作为定量对照的ubiquitin的RNA水平一直保持不变。实验结果说明WCOR726基因表达水平受寒诱导，在小麦中WCOR726基因启动子有可能是寒诱导启动子。图2A和图2B中，1.寒处理14小时，2.寒处理4小时，3.未经任何处理，M.100bpDNAladder。实施例3、在转基因烟草中WCOR726基因启动子受逆境诱导调控GUS基因表达A.植物表达载体构建(1)阳性对照质粒的选择以质粒pCAMBIA2301(CAMBIA公司，澳大利亚)作为阳性对照，如图3所示，在该质粒中编码β-葡糖醛酸糖苷酶(JeffersonRA，TheGUSreportergenesystem.Nature.1989Dec14；342(6251)837-8)的GUS基因在CaMV35S启动子和根农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的胭脂碱合酶基因终止子的控制之下，且带有内含子，只在真核生物细胞中表达。(2)阴性对照pCAMBIA7006的构建植物表达载体的构建按常规方法进行。缺乏任何启动子序列但带有GUS基因序列的质粒pCAMBIA7006用作阴性对照。它衍生自质粒pCAMBIA1301(CAMBIA生物技术公司，澳大利亚)，而去除了CaMV35S启动子。以1ng的pCAMBIA1301质粒DNA为模板，0.25μM的5’引物和0.25μM3’引物进行PCR反应，引物序列如下5’引物5’-TTCCTGCAGACTAGTAAGCTTCACGGGGGACTCTTGACCAT-3’3’引物5’-AGCAGCGGAGGGGTTGGA-3’反应液中还含有1.5mMMgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物，以及0.5个单位的pfu聚合酶(上海生工生物工程技术服务有限公司)。按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环先95℃2分钟；再94℃30秒，56℃45秒，72℃2分30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增得到的2552bpDNA片段，经常规的酚氯仿抽提和乙醇沉淀后，用限制性内切酶PstI(宝生物工程(大连)有限公司工程(大连)有限公司)和SphI(宝生物工程(大连)有限公司工程(大连)有限公司)于37℃消化1小时。用DNA凝胶回收试剂盒(北京北京天纬时代科技有限公司科技有限公司)按供应商提供的方案在0.8％琼脂糖凝胶上分离并回收长为2469bp的DNA片段，此为带有胭脂碱合酶终止子的GUS基因序列。在平行实验中，取5μg质粒pCAMBIA1301用限制性内切酶PstI(宝生物工程(大连)有限公司工程(大连)有限公司)和SphI(宝生物工程(大连)有限公司工程(大连)有限公司)于37℃消化1小时。用DNA凝胶回收试剂盒(北京北京天纬时代科技有限公司科技有限公司)按供应商提供的方案在0.8％琼脂糖凝胶上分离并回收长为8619bp的DNA片段，此为已去除了LacZ报告基因，CaMV35S启动子和GUS基因的原pCAMBIA1301质粒的骨架结构。取上述两种凝胶回收片段各约0.2μg，用T4连接酶于16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，经克隆筛选和酶切鉴定，得到质粒pCAMBIA7006(图4)。(3)WCOR726基因启动子的植物表达载体的构建取5μg质粒pCAMBIA7006用限制性内切酶EcoRI(宝生物工程(大连)有限公司)和HindIII(宝生物工程(大连)有限公司)于37℃消化1小时。与此同时，取pBlue726p质粒5μg也用同样的限制性内切酶于37℃消化1小时，用DNA凝胶回收试剂盒(北京天纬时代科技有限公司)按供应商提供的方案在0.8％琼脂糖凝胶上分离并回收长为1.3kb的DNA片段，此为WCOR726基因启动子序列。将此片段与经EcoRI和HindIII消化的pC7006质粒片段用T4连接酶于16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，经克隆筛选和酶切鉴定，得到质粒pCAMBIA7006726p(图5)，在此质粒中，WCOR726基因启动子控制GUS基因的表达。B.农杆菌介导转化烟草(1)根农杆菌的培养将阳性质粒对照pCAMBIA2301和构建的阴性对照质粒pCAMBIA7006、WCOR726基因启动子的植物表达载体pCAMBIA7006726p分别转化农杆菌，农杆菌菌种为LBA4404。将得到的农杆菌转化菌株在YEB培养基上培养2天，用小勺将菌刮下在液体共培养培养基中打散，静置2小时，摇匀后调整菌液浓度至OD600为0.1。每升YEB培养基成分如下牛肉膏(北京双旋微生物培养基制品厂)5g、蛋白胨(Oxoid公司)5g、酵母提取物(Oxoid公司)10g、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)5g、硫酸镁0.5g(北京益利精细化学品有限公司)和琼脂(北京益利精细化学品有限公司)15g，pH7.2。(2)叶盘法转化烟草用无菌刀片将烟草无菌苗叶片切成四边长约1cm的叶盘，在菌液中浸泡10分钟后取出，吸干菌液，转接入含有液体共培养培养基1.5mL的无菌滤纸上，于25℃暗培养3天，再转入继代培养基中光照培养三天，转入筛选培养基。继续培养7天，再转入再生培养基。20天后可观察到叶片边缘长出丛生再生芽，一个月左右可长至1-2cm，转入新的再生培养基中，待长到3-4cm时，用解剖刀将再生芽切下，并转入生根培养基中。待根充分发育后，将幼苗转至温室栽培。每升共培养培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1.0mg、吲哚乙酸(Gibco，美国)0.1mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g，pH5.2。每升继代培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1.0mg、吲哚乙酸(Gibco，美国)0.1mg、羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g，pH5.8。每升筛选培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1.0mg、吲哚乙酸(Gibco，美国)0.1mg、羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg、潮霉素(罗氏制药有限公司，瑞士)30mg或卡那霉素(北京欣经科生物技术有限公司)75mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g，pH5.8。每升再生培养基成分如下MS基本培养基加6-苄氨基嘌呤(Sigma，美国)1.0mg、羧苄青霉素(北京欣经科生物技术有限公司)250mg、潮霉素(罗氏制药有限公司，瑞士)30mg或卡那霉素(北京欣经科生物技术有限公司)75mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)30g，pH5.8。每升生根培养基成分如下MS基本培养基加潮霉素(罗氏制药有限公司，瑞士)20mg或卡那霉素(北京欣经科生物技术有限公司)50mg、蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)20g，pH5.8。C.转化植株的PCR鉴定如实施例1(2)所述方法提取转化植株的基因组DNA，并以100ng基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增WCOR726启动子及GUS基因的一部分以确认pCAMBIA7006726p的转化。反应液含有100ng基因组DNA、1.5mMMgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物、1μM5’引物和1μM3’引物，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。引物序列如下5’引物5’-TCACCTGCCCATCCACTC-3’3’引物5’-GTGCGGATTCACCACTTGC-3’按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增WCOR726启动子及GUS基因的一部分DNA片段先94℃5分钟；再94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增产物进行电泳，结果图6A所示，在预计的1100bp处有清晰的条带。图中，1.未转基因烟草的PCR，2.质粒pCAMBIA7006726p的PCR，3.pCAMBIA7006726p转基因烟草的PCR，M.DNAmarker(100bpDNAladder)如实施例1(2)所述方法提取转化植株的基因组DNA，并以100ng基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增GUS基因的一部分，以确认pCAMBIA2301和pCAMBIA7006的转化。反应液含有100ng基因组DNA、1.5mMMgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mMdNTP混合物、1μM5’引物和1μM3’引物，以及1个单位的Taq聚合酶(上海申友生物技术公司)。引物序列如下5’引物5’GGTCAGTGGCAGTGAAGGG3’3’引物5’AATCGCCGCTTTGGACATA3’按照下列方案在PCR-热循环仪(Eppendorf公司，德国)中进行PCR循环以扩增GUS基因DNA片段先94℃5分钟；再94℃1分钟，54℃1分钟，72℃1分，共30个循环；最后72℃10分钟。将扩增产物进行电泳，结果如图6B所示，表明在预计的约620bp处有清晰的条带。图中，1.未转基因烟草的PCR，2.质粒pCAMBIA2301的PCR，3.pCAMBIA2301转基因烟草的PCR，4.质粒pCAMBIA7006的PCR，5.pCAMBIA7006转基因烟草的PCR，M.100bpDNAladder。D.葡糖醛酸糖苷酶活性的定性检测取PCR阳性的转化植株进行葡糖醛酸糖苷酶活性检测。在常温取叶片浸泡于染色液中，并置于37℃暗培养过夜。以50mM磷酸钠缓冲液清洗染色叶片，然后将叶片浸泡于固定液(无水乙醇冰醋酸)1小时，并用25％，50％，70％，90％，100％乙醇各脱色1小时，直接目测结果，转pCAMBIA2301表达载体的植株的叶片被染成蓝色，其余的转化植株叶片未被染成蓝色(图7)。再将转化植株置于4℃，16小时后取出，按上述方法染色，固定，脱色，直接目测结果，可见转pCAMBIA7006726p表达载体的植株片被染成蓝色，转pCAMBIA7006植株未被染成蓝色(图7)。这些实验结果表明小麦WCOR726基因启动子是寒诱导启动子，它在转基因植物中能调控外源基因在宿主植物中受寒诱导表达。染色液组成如下0.1M的Na2HPO4/KH2PO4(pH7.0，Sigma，America)，10mMEDTA(pH8.0，Promega公司，美国)，5mM铁氰化钾(北京化工厂)，5mM亚铁氰化钾(北京化工厂)，1mMX-Gluc(5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucuronide，Sigma公司，美国)和0.1％曲拉通X-100(上海生工生物工程技术服务有限公司)。序列表<160>1<210>1<211>1298<212>DNA<213>小麦属小麦(TriticumaestivumL.)<400>1tatgaagatgccagcacgaaagccattttcactcctaagatctggagcaaataaaactag60ttttccaaatcagtatgtaatcacatttttatccactaacctcctcaatcaaatgtaatg120attaaacaggtgtgcagagacaacccatgcattggctacctctagctagtttgacaagga180ggtcaagcctaacagaacaatgattaactttctacataaccgtgcgagtacaacaagcaa240atcatgcgcctaatggcaacataaaataaaatacttgggcttaccagttgatcagatagt300tggttcccgtaacaccggtgggaagctaaagtatgggagggcacacttgccattgaagaa360gggcaccaacctggaacagaccttggtcatttcataagtctttacctccattgagtaaca420ttcctcatcgtcaacatgactacctacaggagcgccttggaagaacaagaatccttcggc480tgcaaccaacacggaaatgtaacagtcatgatactgctcaggcagccgtatgatcttctc540cagctcccattcttgggaattatgctgcagagaggtatggtagagagcaaaggacccgtg600ttgacggacaagagaaaacatcccgagggctccttgtgtacccgcaacaactgcaatcag660acgtggacgaacaaggcttttgtcatggctctgttcatgcagatccctgagctccagatg720atagccggtgagaagatcgacagtggagaacctcatggtgcgcatgtccagcaccatcaa780atggtcactccagtcataacgatctgtccagtagaagcagccgtgcacgcagttaaaact840gaacatgagttccaaacatgggaagatgggagactcggccatagacatacaccattgcct900cgttgtggatgaaaagacaaagaggatgagctgtgtcgcgtattttgcaaagcatatcac960cttaaagggctcctcctcgccatcgtccccggtggagggagcgagcacgggctcgaatgc1020cgaaaggggatcttgtggctgggtggcaagggtatagttggaagccaatcacgcgagcac1080acgtcgcgccctgcactgcaatgccacggcgattcgtccatctaaccaccccactttatg1140agctagtcggcagtcacctgcccatccactcacaagagcacacgtggtgctttctccacc1200ctccaacggcctataaatagtgcctcgtgatgcacttgctttacacagccaccttcctca1260cacaaccaaacagcagaaccagtgtcagatttcccgag1298权利要求1.小麦WCOR726基因启动子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDNo1的自5`端第1位-1256位碱基限定的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中的SEQIDNo1的自5`端第1位-1256位碱基限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于所述小麦WCOR726基因启动子具有序列表中SEQIDNo1的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的启动子，其特征在于SEQIDNo1的自5`端第1212位-第1215位碱基为TATA框；SEQIDNo1的自5`端第127位-第132位碱基，SEQIDNo1的自5`端第285位-第290位碱基，SEQIDNo1的自5`端第344位-第349位碱基，SEQIDNo1的自5`端第1155位-第1160位碱基，SEQIDNo1的自5`端第1181位-第1186位碱基，SEQIDNo1的自5`端第1233位-第1238位碱基分别为MYC识别位点；SEQIDNo1的自5`端第217位-第222位碱基，SEQIDNo1的自5`端第483位-第488位碱基，SEQIDNo1的自5`端第648位-第653位碱基，SEQIDNo1的自5`端第1123位-第1128位碱基分别有MYB识别位点。4.含有权利要求1或2或3所述的小麦WCOR726基因启动子的表达盒。5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于所述表达盒为由所述小麦WCOR726基因启动子、编码目的多肽的核酸序列和一个转录终止核酸序列构成；所述小麦WCOR726基因启动子以功能性方式与编码目的多肽的核酸序列连接，且所述编码目的多肽的核酸序列与一个转录终止核酸序列连接。6.含有权利要求1或2或3所述的小麦WCOR726基因启动子的表达载体，细胞系及宿主菌。7.根据权利要求6所述的表达载体，细胞系及宿主菌，其特征在于含有所述小麦WCOR726基因启动子的表达载体为pCAMBIA7006726p。8.根据权利要求6所述的表达载体，细胞系及宿主菌，其特征在于用于构建含有所述小麦WCOR726基因启动子的表达载体的出发载体为pMRT1207、pMRT1177、pMRT1178、pMRT1179、pMRT1180或pMRT1181的双元载体。9.权利要求1或2或3所述的小麦WCOR726基因启动子在培育转基因植物中的应用。全文摘要本发明公开了小麦WCOR726基因启动子及其应用。其目的是提供一种在植物中特别是单子叶植物中能被逆境如寒诱导表达的小麦WCOR726基因启动子。本发明所提供的小麦WCOR726基因启动子，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的自5｀端第1位－1256位碱基限定的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中的SEQID№1的自5｀端第1位－1256位碱基限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的小麦WCOR726基因启动子将广泛用于耐逆转基因植物的培育中。文档编号C12N15/63GK1789420SQ200410098748公开日2006年6月21日申请日期2004年12月15日优先权日2004年12月15日发明者陈蕾,徐建勇申请人:北京北方杰士生物科技有限责任公司