专利名称：利用共显性标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法
技术领域：
本发明涉及一种草菇共显性标记的方法，更具体涉及一种利用共显性标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
草菇[KohariWh volvacea (Bull. :Fr.) Sing.]，又名稻草菇、兰花菇、秆菇、麻菇、 家生菇、南华菇、草菌、美味苞、脚菇，在欧美国家则称为稻草蘑菇、中国蘑菇。草菇起源于广东韶关的南华寺中，是一种重要的热带亚热带菇类，是世界上第三大栽培食用菌，主要分布在中国广东、广西、福建、湖南、台湾、海南等。近年来，由于技术设施栽培和工厂化栽培的采用，几乎各省、区都开始有草菇的生产，但主产地仍集中华南各地区，其产量占全国的90% 以上。我国是世界上草菇主要产区之一，历年产量都居世界首位。草菇在栽培上产量很低，而且菌种容易变异退化，阻碍了草菇产业的发展，草菇栽培品种改良就成为人们十分关心的课题。而通过草菇杂交育种将比传统的组织分离、多孢分离和单孢分离等选种方法更有希望获得高产又优质的新菌株。杂交是一种遗传物质在细胞水平上的重组过程，杂交菌株有可能把不同类型菌株的优良性状结合在一起，并可通过菌丝体的无性繁殖把这种优良性状稳固下来。草菇单孢菌株是由单个孢子萌发产生的，是减数分裂过程中核基因重组和分离的产物，其遗传变异幅度大，当2种不同类型的单孢菌株(类似植物中的父本与母本)融合时产生异核体菌株，即杂交种，所以单孢菌株是杂交育种的基础材料。然而，草菇被认为是同宗结合真菌，菌丝细胞质多核且无锁状联合，所以草菇的同、异核菌丝或亲本、杂交种在生理形态上难以区分，阻碍了草菇的遗传育种研究。因此，需要建立一种鉴定草菇单孢菌株的可靠方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用共显性标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，该方法利用共显性分子标记可鉴定用于配对的草菇屏优一号单孢菌株，可用于辅助草菇遗传育种研究。本发明的利用共显性标记技术鉴定草菇屏优一号单孢的方法，包括以下步骤
(1)共显性标记引物的设计对已测序的2种可配对的草菇屏优一号单孢菌株的基因组序列进行同源比较，找到同源结构变异位点区域，然后应用引物设计软件设计获得 2种可配对的草菇屏优一号单孢菌株的共显性标记引物，屏优F及屏优R，其中，屏优F 5，-CAATCACTCTTCCGAGGCTC-3，，屏优 R 5，-GGATACGCATGTTAAAGTGG-3’ ；
(2)模板DNA的提取获取2种草菇屏优一号单孢菌株，提取DNA；
(3)共显性标记PCR分子标记的检测建立共显性标记PCR扩增体系为10XPCRbuffer 3.0 μ 1,2. 5 m mol/L dNTP 1.5 μ 1,5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 μ1，10μπιο1/1 的屏优 F 及屏优 R 引物各 1 μ l，80ng 200ng/y 1 模板 DNA 1μ 1，ddH20 22.2 μ 1 ；
共显性标记 PCR 的反应条件为 94 °C Imin ；94 °C 45second, 60 °C 45second，72 °C lmin，30 个循环；72°C 5min ；
(4)共显性标记PCR产物的检测结果根据电泳检测的DNA图谱，若扩增出分子量为500bp的特异DNA条带标记为草菇屏优一号第1种单孢菌株，若扩增出分子量为IOOObp的特异DNA条带标记为草菇屏优一号第2种单孢菌株；只有草菇屏优一号第1种单孢菌株与第2种单孢菌株之间才能配对出菇，草菇屏优一号第1种单孢菌株或第2种单孢菌株自身之间不能配对出菇。本发明提供的利用共显性分子标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，解决了草菇单孢菌株鉴定的问题，具有灵敏度高、检测时间短、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。具体如下
1、检测时间短。2、检测结果可靠、容易判断，而且重复性好目前草菇单孢菌株的鉴定还没有一种比较好且可靠的方法，只能依靠菌株生长速度、菌落形态等表观特征进行初步判断，或是根据分离单孢萌发的菌株进行判定，上述判断方法的主观性较强，判断准确率低。本发明是以 2种可配对单孢菌株的同源结构变异位点区域序列为基础开发的共显性标记方法，基因是遗传的物质基础，不易受外界因素等的影响，同时得到的检测图谱具有特异性条带500bp 和lOOObp，其显性标记判断一目了然。本发明为草菇遗传和育种的研究，提供可靠的鉴定方法，在草菇遗传后代样品的大量分析、分子育种、构建遗传联锁图谱、杂交子鉴定、保护品种的知识产权等方面均有较大的应用价值。
图1为使用引物屏优F/R检测草菇屏优一号单孢菌株扩增的DNA图谱。其中1 M为泳道编号；右侧的数字表示DNA片段的分子量，泳道1、6、8、9、12、15、16、19、23、M的标记片段为500bp，是第1种单孢菌株，泳道2 5、7、10、11、13、14、17、18、20 23的标记片段为 lOOObp，是第2种单孢菌株。
具体实施例方式为了充分公开本发明的利用共显性标记技术鉴定草菇屏优一号单孢的方法，以下结合实施例加以说明。实施例1 一种利用共显性标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法一种利用共显性标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，包括以下步骤 一、草菇屏优一号2种单孢菌株的基因组测序
从福建屏南县购得草菇屏优一号菌株，经出菇试验，弹射单孢得到单孢菌株，经配对再次出菇试验获得2种单孢菌株。提取2种单孢菌株的总DNA，委托深圳华大基因科技有限公司进行全基因组测序。二、共显性标记引物设计
对已测序的2种草菇屏优一号单孢菌株基因组进行同源性分析，找到同源结构变异位点区域，应用I^rimerS或其它引物设计软件，得到与2种可配对的草菇屏优一号单孢菌株的基因型一致的的共显性标记引物。该引物的特点是对2种草菇屏优一号单孢菌株基因组都有扩增位点，但扩增的片段大小有差异。共显性标记引物如下 屏优 F 5，-CAATCACTCTTCCGAGGCTC-3，， 屏优 R 5，-GGATACGCATGTTAAAGTGG-3，。
三、模板DNA的提取
从福建屏南草菇栽培农户采集屏优一号，进行单孢弹射得到单孢菌株，并进入单孢菌株的培养与DNA提取。(1)单孢菌株的获得
1、取刚开伞的草菇子实体，菌盖朝下放在经灭菌的牛皮纸上；
2、过夜弹射单孢；
3、在无菌超净工作，用接种环轻轻刮一环弹射的单孢；
4、将刮取的单孢放入装有5mL无菌水的IOmL离心管，混勻； 5,8000 r/min，4°C离心15min，弃掉上清液，加入5mL无菌水，混勻；
6、重复步骤5—次；
7、取150μ 1混勻液于直径9cm的PDA平板中，使混勻液均勻分布，放置35°C培养1 3天，至孢子萌发；
8、用接种针挑起萌发孢子于PDA试管中，放置35°C培养5天，即得单孢菌株，共得到M 株单孢菌株。(2)单孢菌丝培养
1、用接种耙耙碎含草菇单孢菌株的PDA培养基，转接入250 ml三角瓶，含100 ml PDA 液体培养基中；
3、放置在:35°C摇床上，转速90 120r/min培养5 7 d；
4、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；
5、称取0.5 1. 3g菌丝，用滤纸包好，保存于_20°C备用。(3) CTAB法提取基因组DNA
1、取保存备用的草菇单孢菌丝0. 5 1. 3g放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入 7ml的离心管；
余下步骤参考文献(刘新锐，邓优锦，谢宝贵等.鲍鱼菇的ITS-RFLP分析[J].菌物学报，2007二6 (增刊):185 191.) 四、共显性标记PCR检测建立
共显性标记PCR扩增体系10XPCR buffer 3. 0 μ 1,2. 5 m mol/L dNTP 1. 5μ 1， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0. 3 μ 1，10 μ mol/L 共显性标记引物屏优F/R各 1 μ 1，80ng 200ng/ μ 1 模板 DNA 1 μ 1，ddH20 22. 2 μ 1。共显性标记PCR 反应条件94 °C Imin ；94°C 45second, 60 °C 45second，72 °C lmin，30 个循环；72°C 5min。五、PCR扩增产物检测
具体检测方法为，取PCR扩增产物8 μ 1加上1.5 μ 1 6 X溴酚蓝上样缓冲液，混勻， 在1. 0%琼脂糖凝胶，含GoldviewTMDNA染料进行电泳，5V/cm恒压电泳50 min,通过紫外凝胶成像系统观察并照像。或者，取PCR扩增产物8 μ ，与1.5 μ 6Χ溴酚蓝上样缓冲液混勻，点样于1%的琼醋糖凝胶上，于0. 5 X TBE缓冲液中，5V/cm恒压电泳0. 5 lh，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。PCR扩增产物检测结果采用共显性标记引物屏优F/R对草菇屏优单孢菌株进行共显性标记PCR扩增，草菇屏优单孢菌株有2种，第1种单孢菌株能扩增出分子量为IOOObp的DNA条带，第2种单孢菌株能扩增出分子量为500bp的DNA条带。试验结果证明，只有草菇屏优一号第1种单孢菌株与第2种单孢菌株之间才能配对出菇，草菇屏优一号第1种单孢菌株或第2种单孢菌株自身之间不能配对出菇。本发明的利用共显性分子标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，其检测时间短、灵敏度高、检测结果可靠、容易判断。本发明所使用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)
1、CTAB抽提液100mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB，20 mmol/L EDTA, 1. 4 mol/L NaCl, pH 8. 0;
2、CTAB沉淀液50 mmol/L Tris-HCl, 1. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA, pH 8.0;
3、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
4、TE缓冲液10 mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA ；
5、0·5XTBE :44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3U mmol/L EDTA ；
6、上样缓冲液0.1%溴酚蓝，40%蔗糖；
7、EB 10 mg/ml 溴化乙锭；
8、PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。
权利要求
1. 一种利用共显性标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，其特征在于包括以下步骤(1)共显性标记引物的设计对已测序的2种可配对的草菇屏优一号单孢菌株的基因组序列进行同源比较，找到同源结构变异位点区域，然后应用引物设计软件设计获得 2种可配对的草菇屏优一号单孢菌株的共显性标记引物，屏优F及屏优R，其中，屏优F 5，-CAATCACTCTTCCGAGGCTC-3，，屏优 R 5，-GGATACGCATGTTAAAGTGG-3’ ；(2)模板DNA的提取获取2种草菇屏优一号单孢菌株，提取DNA；(3)共显性标记PCR分子标记的检测建立共显性标记PCR扩增体系为10XPCRbuffer 3.0 μ 1,2. 5 m mol/L dNTP 1.5 μ 1,5 U/ul Taq DNA Polymerase 0. 3 μ1，10μπιο1/1 的屏优 F 及屏优 R 引物各 1 μ 1，80ng 200ng/ μ 1 模板 DNA 1 μ 1，ddH20 22. 2 μ 1 ；共显性标记 PCR 的反应条件为 94 °C Imin ；94 °C 45second, 60 °C 45second，72 °C lmin，30 个循环；72°C 5min ；(4)共显性标记PCR产物的检测结果根据电泳检测的DNA图谱，若扩增出分子量为 500bp的特异DNA条带标记为草菇屏优一号第1种单孢菌株，若扩增出分子量为IOOObp的特异DNA条带标记为草菇屏优一号第2种单孢菌株；只有草菇屏优一号第1种单孢菌株与第2种单孢菌株之间才能配对出菇，草菇屏优一号第1种单孢菌株或第2种单孢菌株自身之间不能配对出菇。
全文摘要
本发明提供了一种利用共显性标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，该方法包括对已测序的草菇屏优一号2种单孢基因组序列分析、设计2种单孢的共显性标记引物、菌丝培养与收集、基因组DNA的提取、草菇屏优共显性分子标记的检测建立和共显性标记PCR产物的检测；所述共显性标记引物为屏优F5'-CAATCACTCTTCCGAGGCTC-3’，屏优R5'-GGATACGCATGTTAAAGTGG-3'。本发明提供的利用共显性分子标记鉴定草菇屏优一号单孢菌株的方法，解决了草菇单孢菌株鉴定的问题，具有灵敏度高、检测时间短、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。
文档编号C12Q1/68GK102191330SQ20111011345
公开日2011年9月21日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者刘新锐, 刘朋虎, 朱坚, 江玉姬, 章小寅, 谢宝贵, 邓优锦 申请人:福建农林大学