专利名称：核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域中的方法，特别是一种核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法。
背景技术：
核酸聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术，由K.Mullis于1985年发明，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一特异性DNA片段于数小时内扩增至百万倍，可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。尽管PCR反应已发展成为一项成熟技术，常规实验中失误率较小，但实际操作中，进行PCR扩增始终存在一些需要改进的问题。最突出的问题就是PCR扩增存在不同程度的非特异性，PCR作为一种体外模拟的生化反应，机制非常复杂，在链式反应过程中总是会发生一定程度的干扰副反应，如引物模板可能错配、引物结合形成二聚体等引起的扩增等等。这些副反应在常规PCR扩增时对结果的影响不是很明显，因为常规PCR扩增的模板数量大，通常超过103以上，在指数级扩增的过程中模板扩增数远远大于副反应产物的扩增数，非特异性扩增比例很低。但是在以下情况副反应产物的扩增则不能忽略，如从高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA，扩增单分子DNA，超长DNA片段，多重PCR扩增，一次扩增不完美而再扩增等。这些副反应轻则引起非特异性的扩增(在后续电泳检测中表现为的弥散拖尾条带和非特异性条带)，导致扩增效率不高，重则可能导致正常扩增反应失败。提高PCR扩增的特异性不仅取决于引物序列的优化设计，很大程度上也依赖于反应体系和程序的优化。多年以来人们对PCR的反应组分的优化已经做了大量的研究，通过向反应体系中加入甲酰胺、甘油、二甲基亚砜等，可以在一定程度上改善非特异性扩增问题，但在实际实验和应用中，有些效果并不很显著，有些添加组分(比如二甲基亚砜)过多甚至抑制聚合酶的活性。
经对现有技术文献的检索发现，美国专利US PATENT 5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化。由于提取纯化SSB蛋白技术复杂，试剂纯度也要求很高，导致制备成本非常高，商品化试剂盒非常昂贵，价格是常规PCR试剂的6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严格贮存于-20℃，并且其生物活性有较短的时间期限。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法。使其具有优化扩增的效果显著，制备简便，成本低廉，易于保存，应用广泛，优化材料易于从体系中分离的优点。
本发明是通过以下技术方案实现的(见图1)，本发明通过向PCR体系中添加单质金材料来实现对PCR扩增的优化，本发明的方法具体如下1.单质金材料制备1)金属金的制备金箔或金片剪成小于2mm×2mm的小片，厚度不限，金丝剪成2～8mm长，金丝的直径在0.1mm～1mm，浸入稀硝酸溶液中浸洗5min，然后依次用水、无水乙醇漂洗干净，晾干备用；金粉依次用水、无水乙醇清洗，离心取金粉沉淀，烘干备用；2)镀金薄膜的制备以片状或颗粒状任何材料为基底，进行电镀、化学镀、真空蒸镀、离子溅射镀均可制备得到镀金表面，对镀层的厚度没有限制，以覆盖基底为准；新鲜制备的表面可以直接使用，制备后放置1天以上的表面需要浸入稀硝酸溶液中浸洗5min，然后依次用水、无水乙醇漂洗干净，晾干备用；3)胶体金的制备多种方法如白磷还原法、柠檬酸纳还原法、柠檬酸钠-鞣酸还原法等均可用于制备胶体金，例如参照Frens在1973年创立的柠檬酸三钠还原法，先将0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1％柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色即可，所有溶液采用灭菌后纯水配制。也可以采用市购胶体金试剂。对粒径大小没有限制。使用前不需稀释。
2.单质金材料灭菌以上金箔、金丝、金粉、镀金薄膜使用前用干法、湿法或紫外线辐照灭菌；胶体金溶液不再需要灭菌。
3.PCR体系优化将适量的以上任一种材料加入PCR反应体系当中进行PCR扩增，所述的适量是指在25μL的PCR反应体系当中加入的优化材料的用量为金箔、金片、金丝或镀金薄膜总的表面积不少于4mm2；金粉质量不少于2mg；胶体金溶液0.5μL～2.5μL。
常用PCR扩增程序依照已有技术，设定如下首先94℃预热2分钟；接着30～45个循环，每个循环包括94℃变性30秒，58℃退火1～3分钟，72℃延伸45秒～3分钟，其中循环次数、退火时间、延伸时间可以根据待扩增对象和引物而不同。
最后72℃延伸7-10min。
4.PCR产物检测对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查扩增条带，与对照体系进行比较。
5.优化材料从反应结束体系中的分离如果需要回收扩增得到的PCR产物，则可以方便地从反应结束体系中分离出优化材料。对金箔、金丝、镀金薄膜可直接吸取溶液即可达到分离目的，对金粉体系做低速离心，吸取上清液可达到分离目的，对胶体金体系做-20℃速冻处理后离心，吸取上清液可达到分离目的。
所述的PCR扩增是指各种PCR扩增，包括常规PCR、高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA、长片段PCR、多重PCR、单分子PCR、以及一次扩增不完美而需要再扩增等等。
所述的优化材料金属金也适用于与PCR反应原理类似的聚合酶延伸反应以及基于PCR方法基础的其他生化方法的优化。
所述的PCR体系参见各种商业聚合酶说明书。以Takara公司Ex Taq酶为例，PCR体系的组成为
所述的琼脂糖凝胶电泳依照已有技术，包括以下步骤1)制备1.5％的琼脂糖凝胶(含染色剂溴乙锭)；2)吸取不同样本的PCR产物上电泳槽点样，同时点分子量标记作为参照；
3)加以4～5V/cm的电压，电泳；4)凝胶成像系统紫外检测分析结果。
本发明与已有方法相比，本发明具有优化扩增的效果显著，制备简便，成本低廉，易于保存，应用广泛，优化材料易于从体系中分离的优点。单质金不会对聚合酶产生抑制作用，可以长期保存在4℃，并且没有失去活性的担心。本发明发展的PCR扩增优化方法可以应用于各种PCR扩增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基础的其他生化方法，尤其适用于一些较难扩增类型的PCR方法诸如低拷贝模板DNA的PCR、单分子PCR、多重PCR、长片段PCR、以及一次扩增不完美而需要再扩增等等。对基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片以及新材料等领域有着潜在而巨大的应用价值。
图1本发明结构示意2金箔对PCR反应的优化扩增效果3镀金薄膜表面对倍比稀释低拷贝模板PCR反应的优化扩增效果4胶体金对单分子PCR扩增的优化扩增效果5胶体金对多重PCR扩增的优化扩增效果6胶体金对长片段PCR扩增的优化扩增效果7胶体金对PCR再扩增的优化扩增效果图具体实施方式
实施例1金箔对PCR反应的优化针对一些形成非特异性扩增的PCR扩增的优化改进，包括下列步骤1、制备PCR体系，组成如下表
其中，模板为λDNA，购自华美生物工程公司，Ex Taq酶购自Takara公司，扩增片段长度为283bp。
2、向以上PCR体系中加入处理过的优化材料金箔，金箔剪为2mm×2mm，每个25μL反应体系中加入至少1片，同时做不加优化介质的相应对照实验；3、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件为94。预热2分钟；30个循环，每个循环包括94℃变性30秒，58℃退火1分钟，72℃延伸45秒；最后72℃延伸7min。
4、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图2所示。从左至右依次为1分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；2，3，4加入优化材料金箔的体系，为三个平行样；5，6，7常规PCR体系，也为三个平行样。可以看出加入优化材料金箔的体系PCR扩增结果中非特异性扩增极少，而相应的未加入金箔的常规PCR体系扩增结果显示严重的后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明的优化方法效果显著。
实施例2镀金薄膜表面对倍比稀释低拷贝模板PCR反应的优化针对倍比稀释低拷贝模板PCR扩增的优化改进，包括下列步骤1、对质粒pBR322 DNA分子(购自华美生物工程公司)进行倍比稀释，得到一系列拷贝数的模板，最低稀释到理论上接近单拷贝；2、制备PCR体系，组成如实施例1，不同之处在于模板改为不同稀释倍数的pBR322模板，扩增片段长度为342bp。
3、向以上PCR体系中模板数为单拷贝的体系中加入处理过的优化材料镀金薄膜，基底为硅材料，单面镀金，镀金表面大小为1.5mm×4mm，25μL的体系中加入1片，其他PCR体系均不加优化材料，作相应对照实验；4、利用PCR技术分别对模板分子进行扩增，扩增条件为94℃预热2分钟；45个循环，每个循环包括94℃变性30秒，58℃退火1分钟，72℃延伸45秒；最后72℃延伸7min。
5、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图3所示。从左至右依次为，1分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；2摸板拷贝数为105个的PCR体系；3摸板拷贝数为104个的PCR体系；4摸板拷贝数为103个的PCR体系；5摸板拷贝数为102个的PCR体系；6摸板拷贝数为101个的PCR体系；7摸板拷贝数为1个的PCR体系；8，9，10为空白阴性对照。其中2，3，4，5，6，中均未加本专利优化材料，7，8，9，10中加入本专利优化材料镀金薄膜。实验设计为模板较多的样品不加优化材料，而较少模板的样品加入优化材料，作为对照。因为从原理分析，模板拷贝数越少越容易形成非特异性扩增。从图中可以看出，未加优化材料的体系2，3，4，5，6均有较严重的拖尾现象，而加入专利介质镀金薄膜的体系即使是接近单拷贝的模板也可以消除非特异性扩增，显示明显的单目标条带。该PCR扩增结果显示了本发明的优化方法效果显著。
实施例3胶体金对PCR扩增的优化对单分子PCR扩增的优化改进，包括下列步骤1、对质粒pBR322 DNA分子(购自华美生物工程公司)利用原子力显微镜操纵进行单分子精确拾取，拾取后的单分子制备为单拷贝模板溶液；2、制备PCR体系，组成如实施例1，不同之处在于模板改为单拷贝的模板溶液。扩增片段长度均与实施例2相同。
3、向以上PCR体系中加入处理过的优化材料胶体金，每个25μL的体系中加入1μL，同时做不加优化材料的相应对照实验；4、利用PCR技术分别对模板分子进行扩增，扩增条件为94℃预热2分钟；50个循环，分三步第一步10个循环，每个循环包括94℃变性30秒，65℃退火3分钟，72℃延伸45秒；第二步10个循环，每个循环包括94℃变性30秒，65℃降落至58℃退火1分钟，72℃延伸45秒；第三步30个循环，94℃变性30秒，58℃退火1分钟，72℃延伸45秒，最后72℃延伸7分钟。
5、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图4所示。从左至右依次为，1分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；2，3，4加入本专利优化材料胶体金的单分子PCR扩增体系；5不加入本专利优化材料的倍比稀释10个分子的PCR扩增体系；6不加入本专利优化材料的单分子PCR扩增体系；7，8不加入本专利优化材料的空白阴性对照。从图中可以看出，未加优化材料的体系5，6均有较严重的拖尾现象，而加入专利介质镀金薄膜的体系2，3，4均消除了非特异性扩增，显示明显的单目标条带。该PCR扩增结果显示了本发明的优化方法效果显著。
实施例4胶体金对多重PCR扩增的优化针对多重PCR扩增的优化改进，包括下列步骤1、制备PCR体系，组成如实施例1，不同之处在于采用了8对引物进行多重PCR扩增，分别扩增长度为159bp，283bp，485bp，573bp，660bp，785bp，942bp and 1240bp的DNA分子。
2、加入处理过的本专利优化介质材料胶体金，同时做不加优化介质的相应对照实验；3、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件同实施例1。
4、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见附图5。从左至右1，2，3为常规PCR体系扩增结果，是三个平行样；4，5，6为加入本专利优化材料胶体金的PCR体系扩增结果，也是三个平行样。7为分子量标记(从下至上为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、100bp、2,000bp)。可以看出1，2，3样本扩增结果中有多条带出现非特异性扩增或者产物拖尾等，4，5，6样本条带清晰，得到明显优化。
实施例5胶体金对长片段PCR扩增的优化针对长片段PCR扩增的优化改进，包括下列步骤1、制备PCR体系，组成如实施例1，扩增长度为4200bp的长片段。
2、加入处理过的本专利优化介质材料胶体金，同时做不加优化介质的相应对照实验；3、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件为40个循环，95℃预热2分钟，94℃变性30秒，58℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，最后72℃延伸10分钟。
4、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见附图6。目的片段4.2kb，以上从左至右1为分子量标记DL15,000(Takara公司，由DNA片段由上至下为15,000bp、10,000bp、7,500bp、5,000bp、2,500bp、1,000bp以及250bp而构成)2、3、4为普通反应体系结果，5为普通反应体系加入胶体金的结果，6、7为阴性空白对照。以上反应条件相同，可以看出2，3，4样本扩增条带出现较宽的非特异性扩增产物弥散等，5样本只有单一的清晰条带，明显改观。
实施例6胶体金对PCR再扩增的优化根据实验要求，有时需要扩大PCR产量，或者第一次扩增不完美而需要从扩增不太好的杂带中纯化特定条带，这就需要对前一批次的PCR产物进行再扩增。针对PCR再扩增的优化改进，包括下列步骤1、制备PCR体系，组成如实施例1，不同之处在于模板为前一批次的PCR扩增产物，扩增长度为283bp的片段。
2、加入处理过的本专利优化介质材料胶体金，同时做不加优化介质的相应对照实验；3、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件同实施例1。
4、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见附图7。从左至右依次为1分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；2，3，4，5常规PCR体系再扩增，为四个平行样；6，7，8，9加入优化材料胶体金的再扩增体系，也为四个平行样；10阴性对照。可以看出加入优化材料胶体金的再扩增体系PCR结果中非特异性扩增极少，而相应的未加入胶体金PCR体系扩增结果显示严重的后续拖尾和非特异性杂带，如2和3样本，4，5样本甚至扩增不出目的条带，表明非特异性扩增极其严重。该结果显示了本发明的优化方法效果显著。
权利要求
1.一种核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征在于，通过向PCR体系中添加单质金材料来实现对PCR扩增的优化，具体如下(1)单质金材料制备，是指①金属金的制备金箔或金片或金丝依次在稀硝酸、水、无水乙醇中清洗，晾干备用，金粉依次在水、无水乙醇中清洗、沉淀，烘干备用，②镀金薄膜的制备以片状或颗粒状任何材料为基底，制备得到镀金表面，备用，③胶体金试剂利用现有技术制备；(2)单质金材料灭菌，所述的金箔、金丝、金粉、镀金薄膜使用前用干法、湿法或紫外线辐照灭菌；(3)PCR体系优化，将适量的以上任一种材料加入PCR反应体系当中进行PCR扩增；(4)PCR产物检测，对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查扩增条带，与对照体系进行比较；(5)优化材料从反应结束体系中的分离，需要回收扩增得到的PCR产物，则可从反应结束体系中分离出优化材料。
2.根据权利要求1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征是，所述的金属金的制备，是指金箔或金片剪成小于2mm×2mm的小片，厚度不限，金丝剪成2～8mm长，金丝的直径在0.1mm～1mm，浸入稀硝酸溶液中浸洗5min，然后依次用水、无水乙醇漂洗干净，晾干备用；金粉依次用水、无水乙醇清洗，离心取金粉沉淀，烘干备用。
3.根据权利要求1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征是，所述的镀金薄膜的制备，是指对基底进行电镀、化学镀、真空蒸镀或者离子溅射镀得到镀金表面，新鲜制备的表面直接使用，制备后放置1天以上的表面需要浸入稀硝酸溶液中浸洗5min，然后依次用水、无水乙醇漂洗干净，晾干备用。
4.根据权利要求1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征是，所述的PCR体系优化，其中适量是指在25μL的PCR反应体系当中加入的优化材料的用量为金箔、金片、金丝或镀金薄膜总的表面积大于等于4mm2；金粉质量大于等于2mg；胶体金溶液0.5μL～2.5μL。
5.根据权利要求1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征是，所述的优化材料从反应结束体系中的分离，对金箔、金丝、镀金薄膜直接吸取溶液即可达到分离目的；对金粉体系做低速离心，吸取上清液可达到分离目的；对胶体金体系做-20℃速冻处理后离心，吸取上清液可达到分离目的。
6.根据权利要求1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，其特征是，所述的PCR扩增，是指各种PCR扩增，包括常规PCR、高度复杂的基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数DNA、长片段PCR、多重PCR、单分子PCR、以及一次扩增不完美而需要再扩增。
全文摘要
一种核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，通过向PCR体系中添加单质金材料来实现对PCR扩增的优化，具体如下(1)单质金材料制备，①金箔、金片、金丝或金粉的制备，②镀金薄膜的制备，③胶体金制备；(2)单质金材料灭菌；(3)PCR体系优化；(4)PCR产物检测；(5)优化材料从反应结束体系中的分离，需要回收扩增得到的PCR产物，则可从反应结束体系中分离出优化材料。本发明具有优化扩增的效果显著，制备简便，成本低廉，易于保存，应用广泛，优化材料易于从体系中分离的优点。对基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片以及新材料等领域有着潜在而巨大的应用价值。
文档编号C12P19/34GK1661029SQ20041009918
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者李海阔, 黄洁欢, 吕军鸿, 张晓东, 张治洲, 胡钧 申请人:上海交通大学