9-氯-15-脱氧前列腺素衍生物、其制备方法及其作为药物的应用的制作方法

专利名称：：9-氯-15-脱氧前列腺素衍生物、其制备方法及其作为药物的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及9-氯前列腺素衍生物、其制备方法及其作为药物的应用。
背景技术：
：长期以来已知前列腺素是女性生殖生物学过程如控制排卵、受精、着床、脱膜(例如胎盘形成)和月经中的关键分子。前列腺素也在生殖道中的病理学变化包括月经过多、痛经、子宫内膜异位和癌症中具有重要作用。尚未完全阐明前列腺素引起这些变化的机理。近期的结果显示前列腺素、它们的受体及其信号转导途径涉及如血管生成、细胞凋亡和增殖的过程。前列腺素的作用由位于细胞表面的它们的G蛋白-偶联受体介导。前列腺素E2(PGE2)特别受关注，它通过结合至不同功能的受体亚型，即EPj、EP2、EP3和EP4受体而具有广泛的细胞作用。因此，可能显示EP2-剔除(EP2-knockout)小鼠(EP2"'")的生殖功能受损，这些动物具有更小的"窝产仔数(littersize)"(Matsumoto等，2001,BiologyofReproduction64,1557-1565)。还可能显示这些EPr剔除小鼠(Hizaki等，ProcNatlAcadSciU.S.A.1999Aug31;96(18):10501-10506)显示出明显减小的卵丘扩展(cumulusexpansion)和严重的生育能力低下(subfertility)，这证明前列腺素EP2受体对于该过程的重要性。因此EP2受体为开发用于控制女性生育的药物提出了重要的目标。EP2受体的4种子类为选择性活性PGE2化合物的耙向开发提供了可能性。然而，到目前为止，几乎没有已知的选择性EP2受体配体，大多数已知化合物也结合至其它EP2受体亚型，如EP4受体。欧洲专利EP1306087描述了用于治疗勃起功能障碍的EP2受体激动剂。欧洲专利EP860430描述了相同的结构类型，并要求保护它们在制备用于治疗免疫学障碍、哮喘和流产的药物中的应用。申请WO04/32965描述了用于治疗和预防由缺血引起的器官功能障碍所致的疾病的EP2受体激动剂。WO04/009117描述了用于治疗由子宫收縮引起的疾病(如痛经)的EP2和EP4受体激动剂。申请WO03/74483和WO03/09872描述了相等地结合至EP2和EP4受体的激动齐廿(OnoPharmaceuticals)。EP2和EP4受体激动剂常常被描述与治疗骨质疏松(WO99/19300、US2003/0166631、WO03〃7910、WO03/45371、WO03/74483和WO03/09872)和治疗青光眼(WO04/37813、WO04/37786、WO04/19938、WO03/103772、WO03/103664、US6747037、US6410591、WO03/40123、WO03/47513、WO03/47417)相关。专利申请WO04/12656要求保护与炎症有关的EP2受体激动剂。专利申请WO03/77919要求保护用于治疗生育疾病的EP4受体激动剂。到目前为止未描述控制最终引起着床和脱膜并因此促进生育的过程的选择性EP2受体激动剂。因此产生了提供用于开发新型药物的可结合至EP2受体的稳定、选择性和有效的化合物这一目标。OnoPharmaceuticals的上述欧洲专利(EP0030377和EP1306087)公开了在9位具有氯原子的前列腺素衍生物。然而，这些专利中要求保护的化合物在低级侧链中，例如在15或16位包含羟基等。
发明内容目前已出人意料地发现通式I的化合物及其盐和其与生理学可耐受的碱的环糊精包合物克服了已知的缺点，并且通过略去羟基，可以获得对EP2受体的更好的选择性、更好的活性和更长的作用持续时间，其中Ri为CH20H、-COOR2、《01^11112或-(:0>^服3基团，R2为氢，CrCnr烷基，所述垸基为线性或支链垸基，任选为单不饱和至多不饱和烷基，并任选地被卤素、d-C4-烷氧基、取代的C3-d。-芳基或任选取代的C3-do-芳酰基、二-d-C5-垸基氨基或三-CrC5-垸基氨基单取代至多取代，任选地被Q-Cr烷基取代的C3-d(r环垸基，任选地被苯基、l-萘基、2-萘基取代的C3-Cnr芳基，所述苯基、1-萘基、2-萘基又可以在3位和4位被氟、氯、垸氧基或三氯甲基取代，或在4位被羟基、卤素、苯基、一个或多个Q-Cr垸基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、羧基、羟基或CVCr烷氧基取代，或C3-CV杂环烷基，R3为Q-d5-羧酸或d-d5-磺酸，A为顺式-CHNCH-或-CH2-CH2-基团，B为反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基团，W为C2-C6-亚垸基，W为羟基、基团0-W或0-R7，其中RS为四氢吡喃基、四氢呋喃基、三甲基甲硅垸基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三苄基甲硅垸基，W为Q-d5-羧酸，R5为氢、CrCnr烷基或d-Cur烯基，n为1-4的数字。烷基为线性或支链烷基基团，具有1-10个碳原子的饱和和不饱和烷基。可以提及的实例为甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、癸基、丁烯基、异丁烯基、丙烯基、戊烯基、苄基、间氯苄基和对氯苄基。烷基可以任选地被卤素原子如氟、氯或溴单取代或多取代，被烷氧基如甲氧基、乙氧基单取代或多取代，任选地被取代的芳基或芳酰基如苯基，或被二烷基氨基如二甲基氨基、二乙基氨基、二甲基氨基丙基和三烷基铵单取代或多取代，其中优选单取代。合适的芳基是取代和未取代的芳基，如苯基、1-萘基和2-萘基，它们分别可以被1-3个卤素原子、苯基、分别具有1-4个碳原子的1-3个烷基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、羧基、羟基或具有1-4个碳原子的垸氧基取代。环烷基的环中可以包含3-10个碳原子。环可以被具有1-4个碳原子的垸基取代。可以提及的实例为环戊基、环己基、甲基环己基和金刚烷基。合适的杂环基团是包含至少一个杂原子的5-元和6-元杂环，所述杂原子优选氮、氧或硫。可以提及的实例为2-呋喃基、2-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、噁唑基、噻唑基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、3-呋喃基、3-噻吩基、2-四唑基。生理学可耐受的酸残基(acidresidue)适合作为酸残基。优选的酸是具有1-15个碳原子的有机羧酸和磺酸，它们属于脂肪族、脂环族、芳香族和杂环系列。可以提及的取代基的实例为CVd5-烷基、羟基、d-d5-垸氧基、氧代和氨基或卤素原子。可以提及的羧酸的实例如下甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、三甲基乙酸、二乙基乙酸、叔丁基乙酸、环丙基乙酸、环戊基乙酸、环己基乙酸、环丙垸羧酸、环己烷羧酸、苯基乙酸、苯氧基乙酸、甲氧基乙酸、乙氧基乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸和三氯乙酸、氨基乙酸、二乙基氨基乙酸、哌啶子基乙酸(piperidinoaceticacid)、吗啉代乙酸(morpholinoaceticacid)、乳酸、琥珀酸、己二酸、苯甲酸、被卤素、三氟甲基、羟基、垸氧基或羧基取代的苯甲酸、烟酸、异烟酸、呋喃-2-羧酸、环戊基丙酸。合适的磺酸的实例是甲磺酸、乙磺酸、异丙磺酸、P-氯乙磺酸、丁磺酸、环戊磺酸、环己磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、对氯苯磺酸、N，N-二甲基氨基磺酸、N，N-二乙基氨基磺酸、N,N-双(p-氯乙基)氨基磺酸、N，N-二异丁基氨基磺酸、N，N-二丁基氨基磺酸、吡咯垸基磺酸、哌啶子基磺酸、哌嗪基磺酸、N-甲基哌嗪基磺酸和吗啉代磺酸。羟基可以例如通过醚化或酯化进行官能修饰。合适的醚残基是技术人员已知的残基。优选易于除去的醚残基，例如四氢吡喃基、四氢呋喃基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅垸基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三苄基甲硅垸基。合适的酰基是R"所述的羧酸。可以按名称提及的实例是乙酰基、丙酰基、丁酰基和苯甲酰基。适合形成盐的是技术人员已知可用于形成生理学可耐受的盐的无机碱和有机碱。可以提及的实例是碱金属氢氧化物如氢氧化钠和氢氧化钾，碱土金属氢氧化物如氢氧化钙，氨，胺如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺、吗啉、三(羟基甲基)甲基胺等。已证明特别有效的通式I的化合物是下列化合物，其中R^为CH20H、-COOR2、-(:0,112或-(:0,113基团，w为氢或d-do-烷基，所述烷基为线性或支链烷基，任选为单不饱和至多不饱和垸基，并任选地被氟、氯或溴单取代，被CVC4-垸氧基、取代的C3-Cnr芳基或任选地取代的C3-do-芳酰基、二-CrCV烷基氨基或三-d-C5-烷基氨基单取代，任选地被CrCr烷基取代的C5-C6-环烷基，任选地被苯基取代的C3-Cht芳基，所述苯基可以在3位或4位被氟、氯、烷氧基或三氟甲基取代，或在4位被羟基取代，可以被氮、氧或硫阻断一次或多次的C5-CV杂环垸基，R3为Crd。-羧酸或d-do-磺酸，A为顺式-CH-CH-或-CH2-CH2-基团，B为反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基团，W为C2-Q-亚垸基，W为羟基，W为氢、C广CV垸基或CrCur烯基，且n为1-4的数字。已证明特别有效的通式I的化合物是下列化合物，其中Ri为CH20H、-COOR2、-(:01^112或-(:0,113基团，W为氢或任选被苯基取代的d-Q-烷基，Cs-C6-环垸基，任选被苯基取代的Q-CV芳基，R3为CrC6-羧酸或d-CV磺酸，A为顺式-CH-CH-或-CH2-CH2-基团，B为反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基团，W为CV亚烷基，W为羟基，W为氢、饱和的d-Cr垸基或CrCr烯基，且n为1-4的数字。本发明还涉及制备本发明通式I的前列腺烷(prostane)衍生物的方法，所述方法的特征在于使通式II的醛<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中R1为基团-COOR2、-CONHR3，A和R4的含义如上所述，其中R'中的游离OH基团受到保护，与通式III的砜的碳负离子反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>将所得羟基砜乙酰化，然后还原消除得到烯烃，任选地，随后以任何顺序将受到保护的羟基脱保护，任选地，将双键酯化、醚化和/或氢化，和/或将酯化的羧基(R^COOie)和/或游离羧基(COOR2，其中112=印酯化，和/或将游离羧基(COOR2，其中R2=H)转化为酰胺(R1=CONie)和/或将游离或酯化的羧基(R1=CONHR"还原。使用惰性溶剂如四氢呋喃或乙醚，在-10(TC至24°C，优选-10(TC至-70°。的温度下，以本身已知的方法进行通式II的醛与由砜III产生的碳负离子的反应。以常规方法，用碱产生砜III的碳负离子，所述碱为例如丁基锂、甲基锂、叔丁醇钾、氢化钠、二异丙基酰胺锂、优选丁基锂。碳负离子的形成在-78。C至25°C的温度下进行，优选在-78。C下进行。以已知的方法，任选地，在碱(如吡啶)的存在下，在-78。C至25°C的温度下，用乙酸酐将所产生的羟基进行乙酰化。使用镁粉的甲醇溶液并添加催化量的氯代三甲基硅垸，进行中间产物乙酰氧基砜(acetoxysulphone)的还原消除以得到通式I的反式烯烃。反应在(TC至6(TC的温度下进行，优选在15。C至25。C的温度下进行。或者，还原消除也可以用钠汞齐进行。用适合还原酯或羧酸的还原剂如氢化铝锂、二异丁基氢化铝等进行还原以得到其中W为-CH20H基团的通式I的化合物。合适的溶剂为乙醚、四氢呋喃、二甲氧基乙烷、甲苯等。还原在-30'C至所用溶剂的沸点下进行、优选在(TC至3(TC下进行。通过已知方法释放经过官能修饰的羟基。例如，在有机酸如草酸、乙酸、丙酸等的水溶液中，或在无机酸如盐酸的水溶液中消除羟基保护基团如四氢吡喃基团。添加与水混溶的惰性有机溶剂以改善溶解度是有利的。合适的有机溶剂的实例是醇如甲醇和乙醇，和醚如二甲氧基甲垸、二噁烷和四氢呋喃。优选使用四氢呋喃。优选在2(TC至8(TC的温度下进行消除。在醇或醇的水溶液中，例如用碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物将酰基水解。合适的醇是脂肪醇如甲醇、乙醇、丁醇等。优选甲醇。可以提及的碱金属碳酸盐和氢氧化物是钾盐和钠盐。优选钾盐。合适的碱土金属碳酸盐和氢氧化物的实例是碳酸钙、氢氧化钙和碳酸钡。反应在-10。C至+70。C下进行、优选在+25。C下进行。通过技术人员已知的方法引入I^的酯基团-COOR2，例如其中112为具有l-10个碳原子的烷基。通过本身已知的方法使1-羧基化合物与例如重氮烃(diazohydrocarbon)反应。例如通过将重氮烃在惰性溶剂，优选在乙醚中的溶液与1-羧基化合物在相同或不同的惰性溶剂如二氯甲烷中的溶液混合，而用重氮烃进行酯化。反应在1至30分钟内完成，然后除去溶剂并通过常规方法纯化所述酯。重氮烷是已知的，或者可以通过已知的方法(Org.ReactionsVol,8，第389-394页(1954))制备。通过技术人员已知的方法引入R1的酯基团COOR2，其中W是取代或未取代的芳基。例如，在合适的碱如吡锭、DMAP、三乙胺的存在下，在惰性溶剂中，使1-羧基化合物与适当的芳基羟基化合物和二环己基碳二亚胺反应。合适的溶剂为二氯甲烷、氯化乙烯、氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃，优选为氯仿。反应在-3(TC至+5(TC的温度下进行、优选在1(TC下进行。如果期望还原初始产物中存在的c=c双键，则可以通过本身已知的方法进行氢化。以本身已知的方法，在低温下，优选在约-2(TC下，在氢气氛中，在贵金属催化剂的存在下，进行5,6双键的氢化。合适的催化剂的实例是10%碳载钯。如果将5，6双键和13,14双键两者都氢化，则使用更高的温度，优选为约20°C。通过使用合适量的适当无机碱中和，可以将其中f为氢原子的通式I的前列腺素衍生物转化为盐。例如，将适当的前列腺素酸溶于包含化学计量量的碱的水中，在蒸发除去水或添加与水混溶的溶剂如醇或丙酮后，得到固体有机盐。以常规的方法，通过将前列腺素酸溶于例如合适的溶剂如乙醇、丙酮、乙醚、乙腈或苯中，并向该溶液中添加至少化学计量量的胺，来制备胺盐。这通常生成固体形式的盐，或者在溶剂蒸发后以常规的方法将其分离。通过技术人员已知的方法引入R1的酰胺基团-CONHR3。最初在叔胺如三乙胺的存在下，以氯甲酸异丁酯将通式I的羧酸(R2=H)转化为混合酐。在惰性溶剂或溶剂混合物如四氢呋喃、二甲氧基乙垸、二甲基甲酰胺、六甲基磷酰三胺(hexamethylphosphorictriamide)中，在-30。C至+60。C的温度下、优选在0'C至3(TC的温度下，进行混合酐与适当的胺的碱金属盐或与氨(RS-H)的反应。用于引入R1的酰胺基团-CONHR3的另一种可能的方法包括使通式I的l-羧酸(R2=H)(其中任选地将游离羟基进行中间产物保护)与通式IV的化合物反应O=C=N-R3IV其中W的含义如上所述。，任选地，添加叔胺如三乙胺或吡啶，进行通式I的化合物(R2=H)与通式IV的异氰酸酯的反应。反应可以不用溶剂，或在惰性溶剂中，优选在乙腈、四氢呋喃、丙酮、二甲基乙酰胺、二氯甲烷、乙醚、甲苯中，在-8(TC至100°C，优选在0°C至30°C的温度下进行。如果起始物料在前列腺垸残基中包含OH基团，则这些OH基团也参与反应。如果最后期望最终产物在前列腺烷残基中包含游离羟基，则从被醚或酰基中间产物保护的起始物料开始是有利的，所述醚或酰基保护可以优选是易于消除的。用作起始物料的通式II的醛是已知的，或者可以通过例如以本身已知的方法，在-20'C下，用叔丁基过氧化氢和异丙氧基钛(IV)在二氯甲烷中将通式V的9-卤代前列腺素的13,14双键选择性环氧化，通式V中优选R1为-COOCH3基团。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>然后在乙醚中用高碘酸裂解环氧化物，并且任选地，用例如二氢吡喃将11-羟基保护，从而提供通式II的醛。可以通过用通式VIII的垸基卤化物烷基化，由通式VII的环烷基羧酸制备用作起始物料的通式III的砜，通式VII中n的含义如上所述，通式VIII中RS的含义如上所述，卤素可以是碘、氯或溴。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>在丙酮中用甲基碘和碳酸钾将IX酯化，然后在乙醚中用氢化铝锂将所得的甲酯还原成醇。在三乙胺的存在下，在二甲亚砜和二氯甲烷的混合物中，用S02-吡啶络合物将醇氧化，得到通式X的醛。然后进行Wittig-Homer反应，并且任选地，将双键氢化以得到XI，然后用二异丁基氢化铝还原成通式XII的醇。然而，也可以在将酯XI还原成醇XII之后进行双键的氢化，其中W指双键。通过在甲苯中与苯硫酚反应将中间产物甲苯磺酰化，然后取代羟基。通过这种方法获得的硫醚xm最后在甲醇水溶液中氧化成通式m的砜。与前列腺素E2相比，所述新EP2激动剂具有明显更高的选择性和稳定性。所述EP2型新前列腺素类似物适合例如治疗和预防如下疾病(disorders)，包括生育障碍、传染病、癌症、病毒性感染、心血管障碍、眼内压升高、青光眼、骨骼系统障碍、血管生成障碍、子宫收缩异常、疼痛和肾障碍(nephrologicaldisorder)。生育障碍指导致不排卵、导致排卵的卵母细胞/卵丘细胞复合物不能受精、导致受精的卵母细胞不着床和不脱膜的障碍，传染病指由单细胞寄生物(parasite)引起的疾病，癌症指实体瘤和白血病，病毒性感染指巨细胞病毒感染、肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎以及HIV疾病，心血管障碍指缺血性再灌注损伤、狭窄(restenoses)、动脉粥样硬化(arterioscleroses)和再狭窄(restenoses)，血管生成障碍指例如子宫内膜异位，眼内压升高指青光眼，子宫收缩异常指例如痛经，骨骼系统障碍指骨质疏松，肾障碍指肾小球肾炎。为将本发明的化合物用作药物，将它们转化为药物产品的形式，除了活性成分外，所述药物产品还包含适合肠道或非胃肠道给药的药用有机或无机惰性载体物质，如水、明胶、阿拉伯胶、乳酸盐、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇等。所述药物产品可以是固体形式例如为片剂、包衣片剂、栓剂、胶囊，或者是液体形式例如为溶液剂、混悬剂或乳剂。任选地，它们还包括赋形剂如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂；用于改变渗透压的盐或缓冲剂。本发明还涉及这些药物产品。通过吸入方便地制备气雾剂溶液。特别适合口服的是包含滑石和/或碳水化合物载体或粘合剂如乳糖、玉米淀粉或马铃薯淀粉的片剂、包衣片剂或胶囊剂。也可以以液体形式使用，例如作为任选地向其中添加甜味剂的流体。无菌的可注射的水溶液或油溶液用于非胃肠道给药。注射液或混悬剂是特别合适的，活性化合物在聚乙氧基化蓖麻油中的水溶液是特别合适的。例如栓剂适合并通常用于阴道给药。还可以使用的载体系统是表面活性的赋形剂如胆酸盐或动物或植物磷脂，但也可以是其混合物、及其脂质体或成分。本发明还涉及肠道、非胃肠道、阴道和口服给药。以有效量将本发明的化合物施用至有需要的患者。"有效量"指治疗或预防具体疾病所必需的量或剂量，通过本领域的已知方法，无需过度的试验即可确定所述量或剂量。活性成分的剂量可以根据给药途径、患者的年龄和体重、待治疗的障碍的性质和严重性以及类似因素而变化。每日剂量为0.5-1000mg，优选50-200mg，所述剂量可以作为单次剂量一次给药，或者分成2个或更多个每日剂量给药。本发明还涉及用于治疗上述疾病的药物，所述药物包含至少一种通式I的化合物，和包含合适的制剂物质和载体的药物。本发明还涉及通式(I)的化合物在制备用于治疗和预防以下疾病的药物中的应用，包括生育障碍、传染病、癌症、病毒性感染、心血管障碍、眼内压升高、青光眼、骨骼系统障碍、血管生成障碍、子宫收縮异常、疼痛和肾障碍。生育障碍指导致不排卵、导致排卵的卵母细胞/卵丘细胞复合物不能受精、导致受精的卵母细胞不着床和不脱膜的障碍，传染病指由单细胞寄生物引起的疾病，癌症指实体瘤和白血病，病毒性感染指巨细胞病毒感染、肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎以及HIV障碍，心血管障碍指缺血性再灌注损伤、狭窄、动脉粥样硬化和再狭窄，血管生成障碍指例如子宫内膜异位，眼内压升高指青光眼，子宫收縮异常指例如痛经，骨骼系统障碍指骨质疏松，肾障碍指肾小球肾炎。本发明通式I的化合物与EP2受体结合并具有激动作用。PGE2结合至人PGE2受体的EP2亚型诱导与膜关联的腺苷酸环化酶的激活并导致形成cAMP。图1显示在细胞激动(agonism)实验中的极高活性(EC50<9.5xl0e-10M)，而在拮抗实验中没有任何抑制(IC5(^2xl0e-5M)。本发明还涉及本发明的物质作为EP2受体激动剂的应用。本发明通式I的化合物具有促进受精(profertile)的作用。在排卵前囊状卵泡中，卵母细胞被卵丘细胞包围，卵丘细胞形成了围绕卵母细胞的稠密细胞环。在黄体生成素(lutenisinghormone)峰(LH峰)后，一系列过程被激活并导致包含卵丘细胞的细胞环的巨大形态学变化。在这种情况下，卵丘细胞形成胞外基质，其导致所谓的卵丘扩展(Vanderhyden等DevBiol.1990Aug;140(2):307-317)。这种卵丘扩展是排卵过程和随后的受精可能性的重要组成部分。其合成由LH峰诱导的前列腺素(在本文指前列腺素E2)在卵丘扩展中是至关重要的。类前列腺素EP2剔除小鼠(Hizaki等，ProcNatlAcadSciUSA.1999Aug31;96(18):10501-6.)显示显著降低的卵丘扩展和严重的生育能力低下，证明类前列腺素EP2受体对该过程的重要性。EP2激动剂导致卵丘复合物浓度依赖性巨大扩展。由浓度为0.5^M和1pM的实验物质诱导的卵丘扩展与由浓度为1的天然EP2受体激动剂PGE2诱导的卵丘扩展相等(n-16卵丘-卵母细胞复合物/组；参见图1)。EP2激动剂导致排卵的卵母细胞浓度依赖性显著增加。在每种情况下，只需给药0.00015mg/动物即可发生排卵的卵母细胞的这种显著增加，并显示即使使用用于排卵的标准剂量的HCG也可能提高排卵的卵母细胞的数目(n=11隱12动物/组；**p<0.005，*p<0.05，图2)。本发明还涉及本发明化合物在治疗生育障碍如排卵受损(impairedovulation)或排卵缺失(absentovulation)、卵母细胞/卵丘细胞复合物受精受损(impairedfertilization)、植入受损(impairedimplantation)禾口脱膜受损(impaireddecidualisation)中的应用。前列腺素在血管生成中具有重要作用(Sales,Jabbour，2003,Reproduction126，559-567)。子宫内膜异位是由血管受损引起的慢性障碍。由于子宫内膜血管的变化，约10%的妇女在经期时经常受到大量出血的困扰。此外，已经观察到血管的结构差异，例如平滑肌细胞层形成不完全(Abberton等，1999,Hum.Reprod.14,1072-1079)。由于经期出血部分地受到血管收縮的控制，因此显然平滑肌的缺陷对出血具有重要的作用。前列腺素和由EP2受体介导的作用还在子宫内膜损伤的激素调节中具有作用(Sun等，2003,Endocrinology144,3934-3942)。越来越多的证据显示子宫内膜异位与显著的炎症响应有关，所述炎症响应可能由激活的巨噬细胞和淋巴细胞以及细胞因子、趋化因子和生长因子的水平上升所介导。已假设这些炎症过程介导某些与子宫内膜异位有关的临床特征。已知患有子宫内膜异位的妇女的腹腔液包含更多的炎症细胞及与其相关的细胞因子、趋化因子和生长因子(MurphyAA.Clinicalaspectsofendometriosis.AnnNYAcadSci.March2002;955:1-10)。其结果是可促进植入和增殖的环境。前列腺素(在本文指前列腺素E2)可减少炎症细胞因子如TNFa自激活的巨噬细胞的表达。类前列腺素EP2剔除小鼠(ShinomiyaS等，RegulationofTNFaandIL-10productionbyprostaglandins12andE2:studieswithprostaglandinreceptor-deficientmiceandprostaglandinE-receptorsubtype-selectivesyntheticagonists.(BiochPhar2001;611153)不能响应EP2激动剂，证明类前列腺素EP2受体对于该过程的重要性。表1显示EP2激动剂导致对在培养物上清液中测量的细胞因子水平的抑制。EP2激动剂还引起TNFa显著减少，如图3所示。本发明涉及通式I的化合物用于治疗子宫内膜异位的应用。前列腺素在子宫收縮中具有重要作用，过度强烈的收縮会引起痛经(Sales,Jabbour,2003，Reproduction126,559-567)。本发明涉及通式I的物质用于治疗痛经的应用。EP2受体激动剂还在控制眼内压中具有重要作用。可能显示眼的小梁网(TM)血管中存在高浓度的尤其是EP2受体。眼泪通过TM和巩膜静脉窦(Schlemm，scanal)离开眼睛，EP2受体激动剂通过刺激泪液流出而影响泪液的动力学，并因此导致眼内压降低(W.Kamphuis等，CurrentEyeRes.2004,29,17-26)。本发明涉及本发明的物质用于治疗与青光眼等有关的眼内压升高的应用。前列腺素还在对抗骨质疏松的过程中具有重要作用。本发明因此涉及本发明的物质用于治疗骨质疏松的应用。前列腺素还在控制血压的过程中具有重要作用。本发明因此涉及本发明的物质用于治疗高血压的应用。前列腺素还影响细胞因子的产生。认为多发性硬化(MS)是全身T淋巴细胞介导的自身免疫疾病，其靶组织是中枢神经系统。T淋巴细胞细胞因子释放曲线可以被倾斜到T辅助细胞1或T辅助细胞2(Th-l或Th-2)谱系(lineage)。Th-1细胞分泌细胞因子如干扰素y(INF-力并诱导细胞介导的免疫响应，而Th-2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-10并诱导体液或抗体介导的响应[Mossman等，1989,AnnualRevImmunol.7:145-173]。INF-y表达与MS有关，使用多因素失能测量，响应PLP肽和MBP肽的INF-y表达与失能显著相关[Hirsch等，1985，J.ClinImmunolNov;5(6):386-389;Moldovan等，2003，J.Neuroimmunol.Aug;141(1-2):132-140]。重要的是，临床研究显示给药IFN-y可引起MS患者恶化[Panitch等，Lancet,Apr18;(8538):893-895]。表2显示在激活的T细胞试验中，EP2激动剂导致抑制INF-y自激活的人供体T细胞表达。表3显示在EP2激动剂的存在下，在源自激活的人供体单核细胞的树突细胞试验中，Th-l相关的细胞因子被下调。因此，通过直接抑制INF-Y表达并通过使树突细胞介导的CD4+T细胞极化偏离表达INF-y的Th-l谱系，预期EP2激动剂可减少INF-y在MS患者中的表达。本发明还涉及本发明的化合物用于治疗自身免疫疾病的应用，所述自身免疫疾病例如多发性硬化、继发进展性多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩病(Crohn，sdisease)和斑秃。在没有描述起始化合物的制备时，它们是己知的或者可以按照与已知化合物类似的方法或本文所述的方法制备。还可以在平行反应器中或通过组合运行(combinatorialoperating)技术的方法进行本文所述的所有反应。可以通过常规方法如结晶、色谱法或形成盐来将异构体的混合物拆分为对映异构体或E/Z异构体。以常规的方法通过将等量或过量的碱或酸(任选地为溶液)添加到式I化合物的溶液中并以常规的方法分离沉淀物或处理溶液而制备盐。本发明因此还涉及基于通式I的化合物和常规的赋形剂或载体的药物。下列实施例将详细解释本发明，而不限制本发明。实施例制备实施例实施例1(5Z，13E)-(9R，11R)-9-氯-ll-[(2H)-四氢吡喃-2-基氧基]-17，17-四亚甲基-20-去甲-5，13-前列腺二烯酸甲酯在-78'C下，在氮气氛下，将0.68ml1.6M丁基锂的己烷溶液滴加到290mg1-苯基磺酰基-4,4-(三亚甲基)己垸的2.4ml四氢呋喃溶液中，将混合物在-78。C下搅拌1.5小时。然后在-10(TC下将该溶液滴加到315mg醛(实施例lc)的2.4ml四氢呋喃溶液中。然后将混合物在-100。C下搅拌30min，在-78°。下搅拌1h。然后向反应混合物中添加0.16ml乙酸酐，在1h内将混合物温热到室温。将反应混合物与氯化铵溶液混合并用乙酸乙酯萃取3次，合并的有机相用水洗涤1次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。将中间产物溶于6ml甲醇，在氮气氛下添加160mg镁粉。然后将混合物在室温下搅拌15min。然后向反应混合物中添加1滴氯代三甲基硅烷，将混合物在室温下再搅拌3h。将反应混合物添加到5ml冰冷的氯化铵溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并的有机相用水洗涤1次，用饱和氯化钠溶液洗涤l次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。用己垸/乙酸乙酯(8:2)硅胶色谱法纯化，得到140mg酯。iH-NMR(CDC13):S=0.75(3H)，1.4-2.4(30H)，3.44(1H),3.66(3H)，3,8-4.15(3H),4.63(1H)，5.15-5.65(4H)如下制备起始的醛la)(5Z)-(9R,llR，13RS,14RS,15S)-9-氯-11,15-二羟基-16,16-二甲基-13,14-环氧-5-前列腺烯酸甲酯在-20'C下，在氮气氛下，将4.7ml异丙氧基钛(IV)滴加到6.52g(5Z,13E)-(9R，llR,15R)-9-氯-ll,15-二羟基-16，16-二甲基-5，13-前列腺二烯酸甲酯的33ml二氯甲烷溶液中，将混合物在-20'C下搅拌30min。然后将6ml叔丁基过氧化氢添加到反应混合物中。随后添加10g硫酸铁和20g柠檬酸的100ml水溶液，用二氯甲烷将混合物萃取3次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。用二氯甲烷/乙酸乙酯(0-40%)硅胶色谱法纯化，得到3.55g作为无色油的环氧化物。!H-NMR(CDC13):5=0.75-1.05(9H)，1.1-2.4(18H),2.9-3.0(2H),3.2(1H),3.65(3H)，4.0-4.15(2H)，4.63(1H)，5.3-5.55(2H)1b)(5Z)-(9R，11R)-9-氯-ll-羟基-14，15,16,17，18,19,20-七去甲-12-氧代-5-前列腺烯酸甲酯在氮气氛下，将5g高碘酸在360ml醚中剧烈搅拌1h。将125ml该溶液添加到2g环氧化物的5ml醚溶液中，将混合物在氮气氛下在室温下搅拌。在lh后，向反应混合物中再添加125ml高碘酸溶液，在2h后，添加剩余的高碘酸溶液。在过滤后，滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，用水洗涤1次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。收率:1.9g醛。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>lc)(5Z)-(9R,llR)-9-氯-11-[(2H)-四氢吡卩南-2-基氧基]-14，15,16,17，18,19,20-七去甲-12-氧代-5-前列腺烯酸甲酯将1.9g醛溶于20ml二氯甲垸并与1.6ml二氢吡喃和8.8mgpTsOH混合，搅拌30min。然后用醚稀释混合物，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。在硅胶上经色谱法纯化两次[第l柱二氯甲垸/乙酸乙酯(2-10%)，第2柱己烷/乙酸乙酯(0-20%)]，得到720mg四氢吡喃基醚。iH-R(CDC13):5=1.35-2.7(17H),3.65(3H),3.4-4.1(3H)，4.58(2H),5.3-5.55(2H)，9.75(1H)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>砜的制备ld)2,2-(三亚甲基)丁酸在-10。C下，在氮气氛下，将61.6ml二异丙胺的180ml四氢呋喃溶液滴加到275ml丁基锂(lM己烷溶液)中，将混合物在-10。C下搅拌30min。在-20。C下，向反应混合物中滴加19.1ml环丁垸羧酸，将反应混合物搅拌4小时，在此期间将其温热到室温。将悬浮液倾入300ml冰水中，用2N盐酸调节到pHl，用醚萃取4次，每次300ml，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。产生30.1g羧酸。iH画画R(CDC13):5=0.88(3H)，1.75-1.95(6H)，2.4(2H)。le)2,2-三亚甲基丁-l-醛在室温下，在氮气氛下，将62.2g碳酸钾和28ml甲基碘添加到25.6gld的300ml丙酮溶液中，将混合物搅拌12小时。然后用抽吸滤除沉淀物，滤液在室温下真空浓縮。将粗产物溶于500ml醚，用水洗涤1次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，有机相用硫酸钠干燥并真空浓縮。残余物在85mbar真空和110。C下(沸点85-90。C)蒸馏。产生24.5g酯。将20g酯溶于40ml醚，在0。C下，在氮气氛下，将该溶液滴加到4.8g氢化铝锂的390ml醚悬浮液中，将混合物在Ot:搅拌l小时，在室温下搅拌l小时。在O"C下，用11ml水、11ml15%浓度氢氧化钠溶液，再用30ml水非常小心地分解过量的氢化铝锂。搅拌20分钟，然后过滤，然后用醚充分洗涤，滤液用硫酸钠干燥并真空浓縮。产生16.3g醇。在室温下，在氮气氛下，将481111三乙胺和22.27§803-吡啶络合物添加到8g醇的450ml二氯甲垸和100ml二甲亚砜溶液中。将混合物搅拌1小时，然后与300ml饱和氯化铵溶液混合，再搅拌15min。然后用1.51醚稀释，分离各相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤2次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。产生9.5g醛。1)CH3l,K2CO:2)LialH43)S03-PyDMSO1f)4，4-(三亚甲基)-2-己烯羧酸乙酯在0。C下，在氮气氛下，将18.3ml膦酰基乙酸三乙酯(triethylphosphonoacetate)的20ml四氢呋喃溶液滴加到3.39g氢化钠的60ml四氢呋喃悬浮液中，将混合物在室温下搅拌30min。然后在(TC下将醛(在le中制备)滴加到反应混合物中，将混合物在室温下搅拌3小时。然后用饱和氯化铵溶液使其骤冷，用醚萃取3次，合并的有机相用水洗涤1次，用饱和氯化钠溶液洗涤l次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。用己烷/醚(0-10%)硅胶色谱法纯化，得到9.81g酯。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>lg)4，4-(三亚甲基)己-l-醇在-70'C下，在氮气氛下，将78.5mlDIBAH缓慢滴加到7.8glf)中制备的酯的65ml二氯甲烷溶液中。在30min后，向反应混合物中缓慢滴加20ml异丙醇，然后缓慢滴加36ml水。将混合物在室温下搅拌2小时，用抽吸滤除沉淀物并用二氯甲烷彻底洗涤，将滤液真空浓缩。用己烷/乙酸乙酯(0-40%)硅胶色谱法纯化，得到5.4g烯丙醇。将5g烯丙醇溶于与混合500mgPd/C的200ml乙酸乙酯中，然后通过Cdlite抽吸过滤并用乙酸乙酯彻底洗漆。将滤液真空浓縮，得到4.5g伯醇。iH-NMR(CDC13):S=0.8(3H)，1.2-1.9(12H)，3.6(2H)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>1h)l-苯硫基-4，4-(三亚甲基)己烷在O"C下，在氮气氛下，将6.19g对甲苯磺酰氯的7.4ml甲苯溶液滴加到4.4g在lg)中制备的醇、25ml甲苯、997mg叔丁基溴化铵和46ml2NNaOH的混合物中，将混合物搅拌2小时。然后分离各相，有机相用水洗涤3次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。用己烷/醚(0-20%)硅胶色谱法纯化，得到4.6g硫醚。化顧R(CDC13):S=0.75(3)，1.39(2H),1.45-1.88(10H),2.88(2H),7.15-7.53(5H)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>1i)l-苯基磺酰基-4,4-(三亚甲基)己烷在0-10'C下，在氮气氛下，将18g臭氧的70ml水溶液滴加到4.6g在lh)中制备的产物的70ml甲醇溶液中，将混合物搅拌2小时。然后用100ml水将其稀释，用乙酸乙酯萃取4次，合并的有机相用水洗涤1次，用饱和硫代硫酸盐溶液洗涤2次，用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓缩。用己烷/乙酸乙酯(0-20%)硅胶色谱法纯化，得到2.55g砜。'H-画R(CDC13):S=0.7(3H)，1.3-1.85(12H)，3.08(2H),7.5-7.7(3H)，7.9(2H)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>实施例2(5Z，13E)-(9R，llR)-9-氯-ll-羟基-17,17-四亚甲基-20-去甲-5,13-前列腺二烯酸甲酯在0t下，在氮气氛下，将2.5mgpTsOH添加到140mg在实施例1制备的产物的1.5ml甲醇溶液中，将混合物搅拌3小时。然后将反应混合物倾入饱和碳酸钠溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤l次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。用己垸/乙酸乙酯(0-50%)硅胶色谱法纯化，得到105mg醇。'H-NMR(CDC13):5=0,75(3H)，1.38-2.4(24H),3.65(3H)，3.9-4.13(2H)，5.2-5.63,实施例3(5Z，13E)-(9R，llR)-9-氯-ll-羟基-17，17-四亚甲基-20-去甲-5,13-前列腺二烯酸在氮气氛下，将0.2ml2N氢氧化钠溶液添加到68mg在实施例2中制备的醇的1ml甲醇溶液中，将混合物搅拌5小时。然后用1ml水将其稀释，用2N盐酸调节到pH3，用乙酸乙酯萃取3次，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤1次，用硫酸钠干燥并真空浓縮。用己烷/乙酸乙酯(50-80%)硅胶色谱法纯化，得到50.3mg羧酸。^-画R(CDC13):S=0.75(3H)，1.38-2.4(24H)，3.9-4.1(2H),5.2-5.62(4H)生物学实施例1.检测对人前列腺素&(亚型EP2)受体信号的拮抗作用l丄检测原理PGE2结合至人PGE2受体的EP2亚型诱导激活膜关联的腺苷酸环化酶并导致形成cAMP。在磷酸二酯酶抑制剂IBMX的存在下，由于这种刺激(stimulation)而累积并通过细胞溶解而释放的cAMP被用于竞争性检测方法。在本试验中，细胞溶解产物中的cAMP与cAMP-XL665竞争结合Eu穴状化合物标记的抗-cAMP抗体。在没有细胞cAMP的情况下，这导致该抗体偶联至cAMP-XL665分子所致的最大的信号。在337nm下激发后，这导致在665nm(和620nm)的基于FRET(荧光共振能量转移)的持久的发射信号。在合适的测量仪器中，以一定的时滞(timelag)，即在消除背景荧光后，测量这两个信号。由加入前列腺素E2所致的低FRET信号的任何增力卩(测量孔变化比(wellratiochange)=发射665鹏/发射62Gnm*10OOO)都显示拮抗剂的作用。1.2.检测方法1.2丄拮抗作用试验(384-孔板的每个孔的数据)将物质的溶液(0.75pl)引入试验板中，将30%DMSO溶于16plKRSB+IBMX刺激溶液(lXKrebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液；Sigma-Aldrich#K-4002;包括750pM3-异丁基-l-甲基黄嘌呤，Sigma-Aldrich#1-7018)中，然后将其中15|al转移到不久前用KRSB洗涤过的无培养基的细胞培养板中。在室温(RT)下预温育30分钟后，添加5(il4xPGE2溶液(11nM)，在激动剂的存在下，在RT下再温育60min(体积~20pl)，然后通过添加5^溶胞缓冲液终止反应，在RT下再温育20min(体积~25pl)。然后将细胞溶解产物转移到测量板中，根据制造商的说明(环形AMP试剂盒，CisbioInternational#62AMPPEC)进行测量。1.2.2.激动作用测量(384-孔板的每个孔的数据)将物质的溶液(0.75pl)引入试验板中，将30%DMSO溶于16KRSB+IBMX刺激溶液(lXKrebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液；Sigma-Aldrich#K-4002;包括750pM3-异丁基-l-甲基黄嘌呤，Sigma-Aldrich#1-7018)中，然后将其中15|al转移到不久前用KRSB洗涤过的无培养基的细胞培养板中。在室温下(RT;体积~15)al)温育60分钟后，然后通过添加5jil溶胞缓冲液终止反应，在RT下再温育20min(体积~20(al)。然后将细胞溶解产物转移到测量板中，根据制造商的说明(环形AMP试剂盒，CisbioInternational弁62AMPPEC)进行测量。在细胞激动作用试验中，试验化合物显示出极高的活性(EC50<9.5xl0e-10M)，在拮抗作用试验中没有任何抑制(IC50>2xl0e-5M)。2.PGE2受体的EP2亚型和排卵前卵丘扩展2丄背景在排卵前囊状卵泡中，卵母细胞被卵丘细胞包围，卵丘细胞形成了围绕卵母细胞的稠密细胞环。在LH峰(黄体生成素)后，一系列过程被激活并导致包含卵丘细胞的该细胞环的巨大形态学变化。在这种情况下，卵丘细胞形成胞外基质，其导致所谓的卵丘扩展(Vanderhyden等DevBiol.1990Aug;140(2):307-317)。这种卵丘扩展是排卵过程和随后的受精可能性的重要组成部分。其合成由LH峰诱导的前列腺素(在本文指前列腺素E2)在卵丘扩展中是至关重要的。类前列腺素EP2剔除小鼠(Hizaki等，ProcNatlAcadSciUSA.1999Aug31;96(18):10501-6.)显示显著降低的卵丘扩展和严重的生育能力低下，证明类前列腺素EP2受体对该过程的重要性。2.2.体外卵丘扩展试验通过单剂量(腹腔内)7.5I.U.PMSG(怀孕母马血清促性腺激素；SigmaG-4877，Lot68H0909)，在20-24日龄不成熟雌性小鼠(种类CD1(ICR),获自CharlesRiver)体内诱导卵泡生成。在注射47-50小时后，取出卵巢并取出卵丘-卵母细胞复合物。卵丘复合物在该阶段还没有扩展。然后用前列腺素E2(PGE2)(1^M)、载体对照(乙醇)或实验物质将卵丘-卵母细胞复合物温育20-24小时。培养基a-MEM培养基，包含0.1mMIBMX，丙酮酸盐(0.23mM)，谷氨酸盐(2mM)，pen/strep100IU/mlpen.和100pg/mlstrep.)和HSA(8mg/ml))。然后通过分成四个阶段来建立卵丘扩展(根据Vanderhyden等DevBiol.19卯Aug;140(2):307画317)。实验物质导致卵丘复合物浓度依赖性巨大扩展。由浓度为0.5pM和lpM的实验物质诱导的卵丘扩展与浓度为1^M的天然EP2受体激动剂PGE2诱导的卵丘扩展相等(11=16卵丘-卵母细胞复合物/组；参见图1)。2.3.体内排卵试验通过单剂量(腹腔内)IOI.U.PMSG(怀孕母马血清促性腺激素；SigmaG-4877,Lot68H0卯9)，在16-20日龄的不成熟雌性小鼠(种类(B6D2F1)，获自CharlesRiver)体内诱导卵泡生成。在PMSG刺激47-50小时后，使用剂量为10IU的HCG(人绒毛膜促性腺激素)诱导最终卵泡成熟和排卵。在给药HCG(s.c在苯甲酸苄酯/蓖麻油l+4(体积比)中)前10小时、5小时和0小时给药实验物质。在给药HCG14小时后，进行尸体解剖，并测定输卵管中排卵的卵母细胞的数目。EP2激动剂导致排卵的卵母细胞浓度依赖性显著增加。在每种情况下，仅给药0.00015mg/动物即可发生排卵的卵母细胞的这种显著增加，显示即使使用用于排卵的标准剂量的HCG也可能提高排卵的卵母细胞的数目(n二11-12动物/组；**p<0.005，*p<0.05))。3.PGE2受体的EP2亚型和细胞因子释放试验3.1.背景越来越多的证据显示子宫内膜异位与显著的炎症响应有关，所述炎症响应可能由激活的巨噬细胞和淋巴细胞以及细胞因子、趋化因子和生长因子的水平上升所介导。已假设这些炎症过程介导某些与子宫内膜异位有关的临床特征。已知患有子宫内膜异位的妇女的腹腔液包含更多的炎症细胞及其相关的细胞因子、趋化因子和生长因子(MurphyAA.Clinicalaspectsofendometriosis.AnnNYAcadSci.March2002;955:1-10)。其结果是可促进植入和增殖的环境。前列腺素(在本文指前列腺素E2)可减少炎症细胞因子如TNFa自激活的巨噬细胞表达。类前列腺素EP2剔除小鼠(ShinomiyaS等，BiochPhar2001;611153)不能响应EP2激动剂，证明类前列腺素EP2受体对于该过程的重要性。3.2.体外细胞因子释放试验在10ng/mlIL-4和200ng/mlGM-CSF的存在下，将源自人供体单核细胞的树突细胞在包含10%胎牛血清的RPMI-1640中培养6天。在前列腺素E2(PGE2)(1pM)、载体对照(DMSO)或实验物质(lpM)的存在下，用各种激活刺激物将细胞激活18小时10ng/mlLPS(Sigma),5(xg/ml重组人CD-40配体(R&DSystems),或5|iM人CpG-DNA(HyCultBiotechnology)。通过市售ELISA试剂盒测量个体供体的细胞培养物上清液的TNFa水平。实验物质导致对在培养物上清液中测量的细胞因子水平的抑制，如表1所示。3.3.离体细胞因子释放试验给体重分别为30-35克的治疗组CD-I小鼠(1!=5)腹腔内给药实验物质或载体对照。20分钟后，对小鼠实行安乐死，取出脾脏，在RPMI+10。/。胎牛血清中培育脾细胞。在没有实验物质的情况下，用PHA和ConA激活细胞并培养18小时。通过市售ELISA试剂盒测量个体小鼠的细胞培养物上清液的TNFa水平。EP2激动剂引起TNFa的显著降低，如图3所示。4.证明对T淋巴细胞Th-l细胞因子释放的抑制4丄原理在试验条件下，用凝集素伴刀豆球蛋白A(lectinconcanavilinA)(ConA)模拟通过T细胞受体由抗原呈递细胞(antigenpresentingcell)和抗原来激活人T淋巴细胞。已知ConA与T细胞受体结合并刺激细胞释放各种细胞因子。Th-l释放的细胞因子之一是INF-Y。已经大量综述了INF-Y的生物化学和生物学活性。4.2.检测方法INF-Y是表达的143氨基酸蛋白质的二聚体。基于INF-Y特异性抗体的酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA)是可商购的。将标准物和样品吸移到微板的孔中。将人INF-Y特异性抗体添加到孔中。将底物添加到孔中，颜色的显色与结合的INF-Y的量成比例。测量颜色的强度。4.3.步骤使用Ficoll密度梯度由人供体分离外周血淋巴细胞，并通过选择性溶胞除去残余的红细胞。以大约106细胞/1111在包含另外10%胎牛血清的RPMI1640中培养淋巴细胞。如上所述用2pg/mlConA激活细胞培养物。在ConA的激活过程中，以各种稀释倍数添加实验物质。在37"C下将细胞温育大约18hr。通过ELISA测量激活过程中释放的INF-Y。5.证明对源自人单核细胞的树突细胞细胞因子释放的抑制5丄原理树突细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞，并且在免疫响应中具有核心的作用。在通过toll-样受体(TLR)刺激后，DC表达并释放促炎细胞因子和趋化因子，并可以诱导幼稚T细胞的激活和增殖。EP2激动剂结合至DCEP受体可抑制TLR4配体(LPS)刺激的白细胞介素12(IL-12)释放。EP2激动剂结合至DCEP受体不会抑制TLR4配体(LPS)刺激的白细胞介素10(IL-10)释放。因此，EP2激动剂使CD4T细胞分化偏离Th-谱系。5.2.检测方法IL-12是包含通过二硫键连接的两种基因不相关的亚基的75kDa糖蛋白异二聚体(p70)。基于IL-12p70特异性抗体的酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA)是可商购的。将标准物和样品吸移到微板的孔中。将人IL-12特异性抗体添加到孔中。将底物添加到孔中，颜色的显色与结合的IL-12的量成比例。测量颜色的强度。IL-10最初被称为细胞因子合成抑制因子(CSIF)，起初被认为是Th-2克隆的产物，在抗原呈递细胞的存在下，通过抗原响应刺激的Th-l克隆抑制细胞因子的产生。IL-10是包含两个相同的160氨基酸子单元的二聚体。基于IL-10特异性抗体的酶联免疫吸附试验试剂盒(ELISA)是可商购的。将标准物和样品吸移到微板的孔中。将人IL-10特异性抗体添加到孔中。将底物添加到孔中，颜色的显色与结合的IL-10的量成比例。测量颜色的强度。5.3.步骤使用Ficoll密度梯度由人供体分离源自人单核细胞的树突细胞，并通过选择性溶胞除去残余的红细胞。基于CD14抗原的表达，使用CD14MicroBead分离人细胞。以大约1.5x106细胞/ml在包含胎牛血清、200ng/mlGM-CSF(Leukine)和10ng/mlIL-4的RPMI1640中培养树突细胞。细胞生长3天，然后改变培养基。用10ng/mlLPS激活细胞。在LPS刺激过程中，添加1^M物质(EP2激动剂)和1^MPGE2。在37t:下将细胞温育大约18hr。通过ELISA测量激活过程中释放的IL-12和IL-IO。表格表1显示实验物质对激活的单核细胞释放的TNFa的体外作用。以18的浓度给药实验物质。将细胞激活18小时。实验物质显示出对T淋巴细胞Th-l细胞因子释放呈剂量响应性地极高的抑制活性。表2证明实验物质对T淋巴细胞Th-l细胞因子释放抑制的作用。在细胞被ConA激活的过程中，向其中剂量依赖性地(0-20nM)添加实验物质，将细胞温育18小时。表3a)和b)证明实验物质对源自人单核细胞的树突细胞的细胞因子释放的抑制的作用。在用LPS刺激细胞的过程中，以lpM的浓度添加实验物质或PGE2。将细胞温育18小时。在源自人单核细胞的树突细胞(DC)的细胞因子释放试验中，实验物质显示出高度的免疫调节活性，并且在不抑制Th-2促进细胞因子IL-10(3b)的同时却抑制Th-l促进细胞因子IL-12(3a)，实际上增加了Th-2促进细胞因子IL-IO。附图图1显示由浓度为0.5^M和1pM的实验物质诱导的卵丘扩展。该扩展与由浓度为1laM的天然EP2受体激动剂PGE2诱导的卵丘扩展相等(t^16卵丘-卵母细胞复合物/组)。图2显示由实验物质诱导的体内排卵。在HCG之前IO、5和0小时以0.00015、0.0015和0.015mg/动物的浓度给药实验物质。图3显示实验物质对离体小鼠脾细胞激活的作用。用PHA或ConA激活细胞。在处死前20min，以1和2吗/动物的浓度腹腔内给药实验物质。表1:对由激活的单核细胞释放的TNFoi的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2:对T淋巴细胞Th-l细胞因子释放的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表3b:对源自人单核细胞的树突细胞细胞因子释放的抑制，<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>权利要求1.通式I的化合物，及其盐和其与生理学可耐受的碱的环糊精包合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>R'为CH20H、画COOR2、《0^^2或-(:0腿113基团，R2为氢，Q-Cur烷基，所述烷基为线性或支链垸基，任选为单不饱和至多不饱和烷基，并任选地被卤素、d-Q-烷氧基、取代的C3-Cur芳基或任选取代的C3-d。-芳酰基、二-d-C5-垸基氨基或三-C,-C5-烷基氨基单取代至多取代，任选地被Q-Cr垸基取代的C3-do-环烷基，任选地被苯基、l-萘基、2-萘基取代的C3-d。-芳基，所述苯基、1-萘基、2-萘基又可以在3位和4位被氟、氯、烷氧基或三氯甲基取代，或在4位被羟基、卤素、苯基、一个或多个C广Cr烷基、氯甲基、氟甲基、三氟甲基、羧基、羟基或CVCr垸氧基取代，或C3-CV杂环烷基，R3为Q-d5-羧酸或d-d5-磺酸，A为顺式-CH:CH-或-CH2-CH2-基团，B为反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基团，W为C2-C6-亚烷基，R"为羟基、基团0-RS或0-R7，其中W为四氢吡喃基、四氢呋喃基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三节基甲硅烷基，并且W为d-d5-羧酸，R5为氢、Crd(r垸基或d-do-烯基，n为1-4的数字。2.如权利要求1所述的化合物，其中R^为CH20H、-COOR2、-CONHR2或-CONHR3基团，W为氢或CrCur垸基，所述垸基为线性或支链垸基，任选为单不饱和至多不饱和烷基，并任选地被氟、氯或溴单取代，被C,-Cr烷氧基、取代的C3-do-芳基或任选地取代的C3-Cur芳酰基、二-d-C5-烷基氨基或三-d-C5-垸基氨基单取代，任选地被CrCV烷基取代的CVC6-环垸基，任选地被苯基取代的C3-d。-芳基，所述苯基可以在3位或4位被氟、氯、烷氧基或三氟甲基取代，或在4位被羟基取代，可以被氮、氧或硫阻断一次或多次的C5-Q-杂环烷基，R3为Crd。-羧酸或d-d。-磺酸，A为顺式-CHK^H-或-CH2-CH2-基团，B为反式-CH-CH-或-CH2-CH2-基团，W为C2-C6-亚烷基，w为羟基，R5为氢、CrC6-烷基或d-Cnr烯基，且n为1-4的数字。3.如权利要求1或2所述的化合物其中F^为CH20H、-COOR2、-03顺112或-(:0丽113基团，W为氢或任选被苯基取代的d-Cr垸基，C5-CV环垸基，任选被苯基取代的C3-CV芳基，R3为-d-Q-羧酸或d-Q-磺酸，A为顺式-CHK:H-或-CH2-CH2-基团，B为反式-CHK:H-或-CHrCH2-基团，W为C2-亚烷基，W为羟基，W为氢、饱和的CrC4-烷基或d-Cr烯基，且n为1-4的数字。4.包含至少一种如权利要求1-3所述的式I化合物的药物。5.如权利要求4所述的药物，其特征在于通式I的前列腺素衍生物以有效量存在。6.如权利要求1-3所述的化合物和如权利要求4和5所述的药物与合适的制剂物质和载体。7.如权利要求1-3所述的通式I的前列腺素衍生物作为药物的应用。8.如权利要求7所述的药物用于促进生育。9.如权利要求7所述的药物用于体外受精。10.如权利要求7所述的药物用于促进排卵。11.如权利要求7所述的药物用于消除受损的卵丘扩展及其后遗症。12.如权利要求7所述的药物用于治疗疾病。13.如权利要求12所述的药物，其特征在于所述疾病包括生育障碍。14.如权利要求12所述的药物，其特征在于所述疾病包括痛经。15.如权利要求12所述的药物，其特征在于所述疾病包括子宫内膜异16.如权利要求12所述的药物，其特征在于所述疾病包括眼内压升高。17.如权利要求12所述的药物，其特征在于所述疾病包括骨质疏松。18.如权利要求12所述的药物，其特征在于所述疾病包括血压升高。19.如权利要求12所述的药物，其特征在于所述疾病包括自身免疫疾病。20.如权利要求19所述的药物，其中所述自身免疫疾病选自多发性硬化、继发进展性多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩病和斑秃。21.如权利要求19所述的药物，其中所述自身免疫疾病是多发性硬化。22.如权利要求1-3所述的通式I的前列腺素衍生物，其为用于肠道、非胃肠道、阴道和口服给药的药物产品的形式。23.用于制备如权利要求l-3所述的化合物的方法，其特征在于使通式II的醛其中R1为基团-COOR2、-CONHR3，A和R4的意义如上所述，其中R"中的游离OH基团受到保护，与通式III的砜的碳负离子反应，并且将所得羟基砜乙酰化，然后还原消除得到烯烃，任选地，随后以任何顺序将受到保护的羟基脱保护，任选地，将双键酯化、醚化和/或氢化，和/或将酯化的羧基(R、COOR2)和/或游离羧基(COOR2，其中R2-H)酯化，禾口/或将游离羧基(COOR2，其中R2=H)转化为酰胺(R1=CONI^)和/或将游离或酯化的羧基(R1=CONHR"还原。全文摘要本发明涉及通式(I)的9-氯前列腺素衍生物，所述化合物可以有利地治疗生育问题。文档编号A61K31/557GK101312946SQ200680043508公开日2008年11月26日申请日期2006年11月20日优先权日2005年11月21日发明者B·布赫曼,B·林登塔尔,D·福尔兹,G·郎格尔,J·李,L·托斯基,W·J·吉尔福德,W·斯库巴拉申请人:拜耳先灵医药股份有限公司