抗草甘磷的i型5－烯醇丙酮酸莽草酸－3－磷酸合酶(epsps)的制作方法

专利名称：抗草甘磷的i型5－烯醇丙酮酸莽草酸－3－磷酸合酶(epsps)的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程学用于抗除草剂，更详细地说，涉及修饰以抗草甘磷的I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。使用植物遗传工程学方法修饰I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶DNA和其编码的蛋白，并将这些分子转入农艺学重要的植物中。更具体地说，本发明包含抗草甘磷的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的DNA和蛋白组合物，以及含有这些组合物的植物。
背景技术：
N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘磷，是熟知的除草剂，对植物物种具有广谱活性。草甘磷是Roundup(Monsanto Co.，StLouis，MO)的有效成分，是一种在环境中具有安全使用长久历史和所需短半衰期的除草剂。当施用在植物表面时，草甘磷在植物中系统性地移动。草甘磷能毒害植物是因为它抑制了莽草酸途径，此途径提供了合成芳香族氨基酸的前体。草甘磷抑制在植物和某些细菌中发现的I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。在植物中草甘磷的抗性可以通过表达与草甘磷具有较低亲和力的修饰I型EPSPS而获得，存在草甘磷时此酶也仍然保持其催化活性(美国专利4,535,060和美国专利6,040,497)。“耐受”或“抗性”是指试剂对生长和发育的效果降低，特别是产生了耐受除草剂、具体地说是草甘磷的植物毒害效应的植物。现已经从天然抗草甘磷的细菌中分离得到了酶如II型EPSPS酶，当将此酶在植物中作为转基因表达时，给植物提供了草甘磷抗性(美国专利5,633,435和美国专利5,094,945)。能在植物组织中降解草甘磷的酶(美国专利5,465,175)也能够赋予植物对草甘磷的抗性。包含表达草甘磷抗性酶或降解酶的必要遗传元件的DNA构建物，在植物中产生了有用的嵌合转基因。这类转基因可以用于产生耐受草甘磷的转基因农作物，因此允许草甘磷有效用于除草而对农作物产生的危害最小。例如，已经将草甘磷抗性遗传工程导入了玉米(美国专利5,554,798)、小麦(Zhou等，Plant Cell Rep.15159-163，1995)、大豆(WO 9200377)和油菜(WO 9204449)。耐受草甘磷的转基因和耐受其他除草剂的转基因，例如bar基因(Sh.Bar)，可以包括在DNA构建物中以用作植物转化的选择标记(本发明pMON81519；Toki等，PlantPhysiol.，1001503-1507，1992；Thompson等，EMBO J.62519-2523，1987；phosphinothricin acetyltransferase DeBlock等，EMBO J.，62513-2522，1987，glufosinate herbicide)，也可以用作选择标记或计分标记(scorable marker)，并且当标记基因与其他农艺学有用性状连接时可以提供有用的表型以选择转基因植物。耐除草剂农作物的开发已经成为农业生物技术的主要突破，为农场主提供了新的杂草防除方法。一种成功被设计为耐受抑制剂除草剂的酶是I型EPSPS。已经分离抗草甘磷的I型EPSPS变体(Pro-Ser，美国专利4,769,061；Gly-Ala，美国专利4,971,908；Gly-Ala，Gly-Asp，美国专利5,310,667；Gly-Ala、Ala-Thr，美国专利5,8866,775)。然而，许多EPSPS变体不能表现对草甘磷有足够高的Ki，或者对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的Km太高而不能有效的作为草甘磷抗性酶在植物中使用(Padgette等，“Herbicide-resistant Crops”中，4章53-83页，Stephen Duke编，Lewis Pub，CRC Press Boca Raton，F11996)。然而，有效地与异源启动子连接的一类I型EPSPS变体，T102I/P106S(TIPS)，显示出为转基因玉米植物提供草甘磷抗性(美国专利6,040,497)。现也已经从杂草牛筋草(Eleusine indica)中分离到了耐受草甘磷的EPSPS [WO 01/66704]。在植物分子生物学领域内需要可提供阳性选择标记表型的各种基因。具体地说，草甘磷耐受可在植物中广泛地用作阳性选择标记，并且用在农作物生产中是很有价值的表型。当使用不同的阳性选择标记基因时，扩展了现有的转基因性状与新开发性状的堆积和组合。标记基因提供了不同的表型如抗生素或除草剂耐受，或者通过DNA检测方法可区别的分子区别。通过多重抗生素或除草剂耐受分析，或通过DNA检测方法检测新型DNA分子的存在，可以筛选叠加性状的转基因植物。本发明提供了抗草甘磷变体I型EPSP合酶的DNA和蛋白组合物。本发明也提供了用于植物的DNA构建物和展示草甘磷抗性的转基因植物。
发明概述本发明一方面提供了分离的修饰EPSPS DNA分子，它编码的耐受草甘磷的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸。本发明的另一方面是包含启动子的DNA构建物，此启动子在植物细胞中有功能，有效与修饰EPSPS DNA分子连接，该修饰EPSPS DNA分子编码的耐受草甘磷的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸。本发明的又一方面提供了包含DNA构建物的转基因植物，其中此转基因植物耐受草甘磷除草剂。本发明的另一方面是一个制备能育转基因植物的方法，包括提供具有修饰EPSPS基因的植物表达盒，该修饰EPSPS基因编码的耐受草甘磷的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸；在允许植物表达盒能被受体植物细胞摄取的条件下，将受体植物细胞与植物表达盒接触；选择包含植物表达盒的受体细胞；从选择的受体植物细胞再生植物；鉴定能育的耐受草甘磷的转基因植物。本发明的另一方面是能育的草甘磷耐受的转基因植物，它包含具有修饰植物EPSPS基因的植物表达盒，该修饰植物EPSPS基因编码的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸；将此转基因植物与其他植物杂交，以提供耐受草甘磷的子代。本发明的另一方面提供了在农作物田地中杂草防除的方法，其中农作物田地用有效量的含草甘磷除草剂处理，并且农作物植物包含具有修饰EPSPS基因的植物表达盒，该修饰EPSPS基因编码的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸。
附图简述

图1.玉米EPSPS的多核苷酸和多肽序列。
图2.I型植物和细菌EPSP合酶的多肽的对比。
图3.pMON70461(野生型EPSPS)的DNA构建图。
图4.DNA引物序列。
图5.pMON58452(ZmTIPT变体)的DNA构建图。
图6.pMON30167(CP4EPSPS)的DNA构建图。
图7.pMON70472(ZmTIPT变体)的DNA构建图。
图8.pMON70475(ZmTIPA变体)的DNA构建图。
图9.pMON70467(ZmPT变体)的DNA构建图。
图10.pMON81519(ZmTIPT变体)的DNA构建图。
图11.pMON81548(LsTIPA变体)的DNA构建图。
图12.pMON58491(AtTIPA变体)的DNA构建图。
发明详述本发明部分基于构建草甘磷抗性EPSPS，并利用DNA构建物中编码EPSPS的DNA分子，为在其组织中表达草甘磷抗性EPSPS的转基因植物提供除草剂抗性。提供随后的叙述以更好的定义本发明，并指导本领域中普通技术人员实施本发明。除非另有说明，否则术语按照相关领域内普通技术人员的常规用法理解。分子生物学普通术语的定义也可以发现于Rieger等，Glossary of GeneticsClassical and Molecular，5th edition，Springer-VerlagNew York，(1991)；and Lewin，Genes V，Oxford University Press；New York，(1994)。使用37CFR§1.822所设定的DNA碱基命名法。“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。使用标准一字母和三字母命名氨基酸残基。本发明的方法包括设计给予所引入植物耐受草甘磷性状的EPSPS蛋白。编码除草剂耐受相关蛋白的多核苷酸分子为本领域所知，包括但不限于编码耐受草甘磷的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，在美国专利5,627,061、5,633,435和6,040,497中描述；Padgette等，Herbicide Resistant Crops，Lewis Publishers，53-85，1996；和Penaloza-Vazquez等，Plant Cell Reports 14482-487，1995；和aroA(美国专利5,094,945)的多核苷酸分子。“草甘磷”是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的盐。草甘磷是Roundup除草剂(Monsanto Co.)的活性成分。除非另有说明，用“草甘磷”处理植物是指用Roundup和Roundup Ultra除草剂制剂处理。作为N-膦酰甲基甘氨酸及其盐的草甘磷(不是配制的Roundup除草剂)是合成培养基组分，用于选择耐受草甘磷的细菌和植物，或者是在体内生化试验中用于测定酶抗性。草甘磷的商业制剂实例包括但不限于由Monsanto公司销售的ROUNDUP、ROUNDUPULTRA、ROUNDUPULTRAMAX、ROUNDUPCT、ROUNDUPEXTRA、ROUNDUPBIACTIVE、ROUNDUPBIOFORCE、RODEO、POLARIS、SPARK和ACCORD除草剂，所有这些除草剂包含草甘磷的异丙基铵盐；由Monsanto公司销售的ROUNDUPDRY和RIVAL除草剂，包含草甘磷的铵盐；由Monsanto公司销售的ROUNDUPGEOFORCE除草剂，包含草甘磷的钠盐；由Zeneca有限公司销售的TOUCHDOWN除草剂，包含草甘磷的三甲基锍盐。通过植物基因工程方法，可通过将导致产生高水平野生型EPSPS的DNA分子插入到植物基因组，从而产生耐受草甘磷的植物(美国专利4,940,835；Shah等，Science 233478-481，1986)。通过表达与草甘磷具有较低亲和力、因此存在草甘磷时仍保持酶催化活性的EPSPS变体，如aroA P-S(美国专利5,094,945)、CP4EPSPS(美国专利5,633,435)、玉米TIPS(美国专利6,040,497)、101/192和101/144变体(美国专利5,866,775和美国专利6,225,112，Howe等，Mol.Breeding 10153-164，2002)，也能获得草甘磷抗性。例如，已经通过遗传工程将草甘磷抗性导入了玉米(美国专利5,554,798和6,040,497)、小麦(Zhou等，Plant Cell Rep.15159-163，1995)、大豆(WO9200377)、棉花(WO 0234946)和油菜(WO 9204449)。现已经分离到了野生型EPSPS酶的变体，它的草甘磷抗性是EPSPS氨基酸编码序列发生改变的结果(Kishore等，Annu.Rev.Biochem.57627-663，1988；Schulz等，Arch.Microbiol.137121-123，1984；Sost等，FEBS Lett.173238-241，1984；Kishore等，“Biotechnologyfor Crop Protection”ACS Symposium Series No.379.eds.Hedlin等，37-48，1988)。这些变体通常比野生型EPSPS酶对草甘磷具有更高的Ki，这就赋予耐受草甘磷的表型，但是这些变体同样对PEP具有高Km的特征，以至使得酶动力学效率较低。例如，来源于大肠杆菌的天然EPSPS对PEP的表观Km和草甘磷的表观Ki为10μM和0.5μM，而在96位发生丙氨酸置换甘氨酸的单个氨基酸置换的抗草甘磷酶分离物，这些值就分别为220μM和4.0μM。美国专利6,040,497报告，已知为TIPS突变体(在氨基酸102位异亮氨酸置换苏氨酸，在氨基酸106位丝氨酸置换脯氨酸)的EPSPS变体包含2个突变，当引入玉米EPSPS的多肽序列时就赋予酶草甘磷抗性。包含这种突变酶的转基因植物是耐受草甘磷的。也可以在其它来源的编码草甘磷敏感酶的基因中进行同一突变，以产生草甘磷抗性酶。体外DNA分子的定点诱变清楚地表现出可用于在基因组DNA序列中引入具体改变，其它发展中的方法也可以提供原位定点诱变方法(美国专利
发明者M·F·阿利布海, C·卡雅各布, 冯寄嘉, G·R·赫克, 祁幼林, S·弗拉辛斯基, W·C·斯塔林斯 申请人:孟山都技术有限公司