电子、光、磁、半导体和生物技术应用中作为支架的多功能生物材料的制作方法

专利名称：电子、光、磁、半导体和生物技术应用中作为支架的多功能生物材料的制作方法
电子、光、磁、半导体和生物技术应用中 作为支架的多功能生物材料本申请要求于2003年10月15曰申请的、Belcher等的 编号为60/511,102的临时申请的权益，该临时申请通过引用全部结 合到本文中。本项研究部分获得美国陆军士兵納米技术研究所(Institute for Soldier Nanotechnologies)、 美国陆军研究办室(U.S. Army Research Office,合同号DADA-19-02-D-0002)、国家科学基金会纳 米4支术交叉学一+研究纟且(National Science Foundation Nanotechnologies Interdisciplinary Research Team)和空军一+学研究办公室(Air Force Office of Scientific Research)的资助，资助号(Grant No)。
美国政府在本发明中可享有一定的权利。
引言说明书结尾提供了引言部分所引用的参考文献，本领域 技术人员可使用这些参考文献实施本发明。但并不是承认所有的这 些参考文献都是现有技术。生物自动装配(self-assembly)和生物分子相互作用，不断 产生用于纳米结构材料开发的新方法"。而且，生物分子识别和核 化(nucleate)无机材料(例如半导体、磁性材料和金属)的惊人能力，拓 宽了在纳米电子和纳米技术中的应用可行性M。 Belcher研究小组及 其他研究小组的工作1()-14表明，生物分子，包括基因工程M13噬菌 体(病毒)，可用作分子结构单元，以核化和排列量子点15,作为半导 体纳米线材(nanowire)的模板16' 17并构建多维液晶和薄膜15' 18—2D。已 经使用其它自动装配肽和蛋白质系统，制作掺混无机材料的线材2I、纤维22和其它结构23。然而，对自动装配组分不同结构大小和几何控 制的程序设计方面的困难，部分地限制了这些系统装配装置的潜力。 如果没有费力的化学修饰，对于其它这些系统核化材料、提供多种 材料或结合多个位点并改变这些组合来说，也很困难。因此，对自 动装配多功能病毒中基因编码材料的识别、材料的缩合、大小和形 状信息的研究，是本发明的组成部分。本发明中提供了多个实施方案，证明了结构的一维(1D) 形成，包括M13病毒从1D结构到2D结构(包括环状结构)的转化， 可以经基因工程改造，以展示各末端融合的功能性结合肽。目前，许多用于纳米工程的系统都缺乏结构控制，并且 也缺乏将纳米结构材料与宏观世界相联系的方法。这妨碍了创新， 也阻止人们实现纳米技术的商业应用。本发明研究了可重复的、可 修饰的病毒结构，以克服这些局限性。
发明概述本发明包括在本小节和权利要求书中概述的许多实施方 案。本概述不应视为对本权利要求范围的限制。例如，本发明提供一种制备病毒的方法，该病毒具有多 个选择性结合或核化的识别位点，该方法包括对病毒进行基因工程改造，使该病毒包含能够笫一选择 性结合或核化第 一缀合部分(conjugate moiety)的第 一识别位点，对病毒进行基因工程改造，使该病毒也包含与第一识别 位点位置不同的、且能够第二选择性结合或核化第二缀合部分的第 二识别位点。本发明也提供一种制备缀合病毒材料(conjugated viral material)的方法，该方法包括(A)提供病毒，该病毒具有第一特异 性结合第 一缀合部分的第一识别位点，并且也具有与第一识别位点 位置不同的、且能够第二特异性结合第二缀合部分的第二识别位点，和(B)使该病毒与第一和第二缀合部分特异性结合，形成复合型病毒 材料。本发明也提供一种制备颗粒病毒接头部分的方法，该方 法包括下述步骤(A)提供颗粒，该颗粒具有笫一特异性结合病毒的 第一识别位点的第一缀合部分，和(B)用第二特异性结合病毒上的第 二识别位点的第二缀合部分，使该颗粒官能化，形成病毒接头部分。本发明也提供使病毒颗粒与接头部分结合的方法，该方 法包括(A)提供病毒颗粒，该颗粒具有第一特异性结合第一缀合部 分的笫一识别位点，并且还具有第二特异性结合笫二缀合部分的第 二识别位点；(B)提供病毒接头部分，该部分包含第一缀合部分和第 二缀合部分；(C)使病毒颗粒与病毒接头部分发生反应，从而在病毒 颗粒和接头部分间发生特异性结合。在另一个实施方案中，本发明提供一种使颗粒通过特异 性结合而寡聚化或多聚化的方法，所述方法包括下述步骤(A)提供 颗粒，该颗粒包含分别第一和第二特异性结合第一和第二缀合部分 的至少第一和第二识别位点，(B)提供接头部分，该部分包含能够特 异性结合该颗粒的至少两个缀合部分；(C)特异性结合颗粒，由颗粒 和接头部分形成寡聚体或多聚体。也提供具有多个特异性结合位点的病毒，所述方法包括 对病毒进行基因工程改造，使该病毒具有第一特异性结合或核化第 一缀合部分的第一识别位点，并且具有与第一识别位点位置不同的、 用于第二特异性结合或核化笫二缀合部分的第二识别位点。也提供具有多个识别位点的病毒，所述方法包括对病 毒进行基因工程改造，使该病毒具有用于第 一结合或核化第 一缀合 部分的笫一识别位点，以及具有与第一识别位点位置不同的、且用 于第二结合或核化第二缀合部分的第二识别位点。本发明还提供复合型病毒材料，该材料包含(A)病毒，该病毒具有用于第一特异性结合或核化第一缀合部分的第一识别位点，以及具有与第一识别位点位置不同的、且用 于第二特异性结合或核化第二缀合部分的第二识别位点，和(B)第一 和第二缀合部分，所述部分与病毒特异性结合，形成复合型病毒材料。本发明也提供颗粒病毒接头部分，该部分包含颗粒， 该颗粒具有用于第一特异性结合病毒的第一识别位点的第一缀合部 分、以及用于第二特异性结合病毒上的第二识别位点的第二缀合部分。还提供连接病毒组合物，该组合物通过使病毒颗粒与接 头部分结合的方法而制备，所逸方法包括(A)提供病毒颗粒，该颗 粒具有用于第一特异性结合第一缀合部分的第一识别位点，以及具 有用于第二特异性结合第二缀合部分的第二识别位点；(B)提供病毒 接头部分，该部分包含第一缀合部分和第二缀合部分；(C)使病毒颗 粒与病毒接头部分发生反应，A人而在病毒颗粒与病毒接头部分间发 生特异性结合，形成连接病毒组合物。另一个实施方案是寡聚体组合物或多聚体组合物，该组 合物是通过使颗粒经特异性结合而寡聚化或多聚化的方法而制备， 该方法包括下述步骤(A)提供颗粒，该颗粒包含分别用于第一和第 二特异性结合第一和第二缀合部分的至少第一和第二识别位点，(B) 提供接头部分，该部分包含能够与颗粒特异性结合的至少两个缀合 部分；(C)特异性结合颗粒，由颗粒和接头部分形成寡聚体组合物或 多聚体组合物。本发明也提供一种构建病毒环状结构的方法，该方法包 括(A)提供丝状病毒，该病毒包含用于第一特异性结合第一缀合部 分的第一识别位点，并且具有用于第二特异性结合第二缀合部分的 第二识别位点；(B)提供病毒接头部分，该部分包含第一缀合部分和 第二缀合部分；(C)使丝状病毒与病毒接头部分发生反应，从而在其 间发生特异性结合，形成病毒环状结构。
也可使本发明的组合物施用到基质上形成图案，以及排 列在有图案的基质(patterned substrate)上。发明详述及权利要求书中提供了其它实施方案。
附图简迷

图1: (a)M13工程病毒示意图。Hiss肽展示为pIX融合，
用红色表示，抗链霉抗生物素肽展示为pin融合，用蓝色表示。(b)
蓝色的四聚体链霉抗生物素与4个镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)基团缀合。图2:通过AFM在云母表面观察到的基于M13病毒的
环状结构。图3: (a)单个基于病毒的环状结构的TEM图像，用2% 醋酸双氧铀染色。箭头所指的深色区被认为是接头。(b)基于病毒的 环状结构的TEM图像，图中病毒用缀合抗体的金纳米颗粒标记。图4:工程噬菌体与接头分子以不同化学计量比混合的 AFM图像。在10:1病毒:接头时，观察到(a)放射状聚集的病毒和(b)
线状连接的病毒。图5:按1:1混合的工程噬菌体与接头分子的AFM图像。 (a)观察到基于病毒的环状结构。(b)然而，向相同悬液中加入50mM 咪唑后，仅观察到线状病毒。(c)向悬液中加入5mM生物素后，也观 察到线状病毒。图6:详细图解描绘了蛋白质经改造使无机材料核化和/ 或使病毒进一步装配成复合杂官能阵列定向。(a) M13病毒，具有绿 色pIX区和pVII区，橙色VIII区和蓝色pIII区。(b)位于病毒上的球 体证明多种材料经工程改造成为一种病毒结构的潜力，其长度和形 状可以定制，而且取决于经工程改造的基因组大小。图7:使用具有零维量子点(QD)的一维病毒、 一维纳米 线/纳米管、二维板型装置和三维组分的不同自动装配结构的示意图。
图8: ZnS-CdS杂合納米线的图像和表征，该納米线是 通过在-25。C使用CdS/ZnS纳米晶体合成，由表达A7-pVIII融合蛋白 和J140-pVin融合蛋白随机混合物的病毒而制得。(a)病毒CdS和ZnS 杂合层状结构的HAADF STEM图像。(插图)层状结构的ED图，显 示纤锌矿(wurtzite) CdS和ZnS相共存。(b)在更高放大倍数下层状结 构的HAADF STEM图像。(插图)底图说明由病毒和纳米晶体组成的 层状结构。(c-力层状结构的HAADF STEM图像(c)及其相应的元素S (力、Zn(e)和Cd(f)的EDS作图。图9:在噬菌体pVIII上具有Au特异性结合蛋白、而在 噬菌体pIII上具有CdSe特异性结合蛋白的复合纳米线的AFM图像 和示意图。噬菌体间的连接是CdSe纳米晶体。结果是Au-CdSe-Au 纳米线。图10:噬菌体CdSe量子点噬菌体构建体。由Au和CdSe 制成的复合納米线的AFM图像。Au特异性结合蛋白是在pVIII上， CdSe特异性结合蛋白是在pIII上。图11:显示应用病毒模板制作纳米级装置的示意图。图12:具有经工程改造成为p3蛋白和p9蛋白的金结合 序列的噬菌体图像。该图像显示病毒桥连两个金电极。图13:具有经工程改造成为p3蛋白和p9蛋白的金结合 序列的噬菌体图像。该图像显示病毒桥连两个金电极。图14:多功能病毒跨越金电极的图像。
发明详述
I.引言本领域技术人员也可参考Nam等，Mi"o L故.，2003, 4, 23-27和2003年10月15日申请的、Belcher等的临时申请第60/511,102 号，发明名称为"MULTIFUNCTIONAL BIOMATERIALS AS SCAFFOLDS FOR ELECTRONIC, OPTICAL, MAGNETIC, SEMICONDUCTING, AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS(电子、光、z磁、半导体和生物l支术应用中作为支架的多功能生物材 料)"，该文献，包括附图、权利要求书和工作实施例，全都通过引用 全部结合到本文中。另外，本领域技术人员也可参考以下专利文献，有关病
毒、基因工程方法的选择以及有关与基因工程病毒一起使用的材料
噬菌体展示文库以及在生物淘选(biopanning)中使用它们的实验方法
进一步描述于例如以下Belcher等的美国专利出版物(1) "Biological
Control of Nanoparticle Nucleation, Shape, and Crystal Phase"; 2003/0068900,于2003年4月10日公布；(2) "Nanoscale Ordering of
Hybrid Materials Using Genetically Engineered Mesoscale Virus"; 2003/0073104，于2003年4月17日公布；(3) "Biological Control of
Nanoparticles"; 2003/0113714，于2003年6月19日公布；和(4)
"Molecular Recognition of Materials"; 2003/0148380,于2003年8月7
日/>布；(5) "Composition, method, and use of biftxnctional Biomaterials";
2004/0127640;于2003年9月4日申请；(6) "Peptide Mediated
Synthesis of Metallic and Magnetic Materials";编号为10/665,721,于
2003年9月22曰申请；和(7) "Fabricated BioFilm Storage Device";
2004/0171139,于2003年9月24日申请，所述各文献通过引用全部结合到本文中。这些参考文献介绍了各种特异性结合修饰，可以进 行这些修饰，用于与缀合结构结合，以及在经特异性结合修饰的材 料的存在下形成缀合结构。具体地讲，多肽和氨基酸寡聚体序列都 可以在病毒颗粒表面表达，包4舌在其两端和沿着细长病毒颗粒(例如
Mi3噬菌体)的长轴表达，包括pin和pvni表达，以及pix、 pvn 和pVI表达，及其组合，所述文献通过引用全部结合到本文中。这 些参考文献介绍了各种特异性结合修饰，可以进行这些修饰，用于 与缀合结构结合，以及在经特异性结合修饰的材料的存在下形成缀 合结构。具体地讲，多肽和氨基酸寡聚体序列可以在病毒颗粒表面
表达，包括在其两端和沿着细长病毒颗粒(例如M13噬菌体)的长轴
表达，包括pin和pvm表达，以及pix、 pvn和pvi表达，及其组合。在本发明中，可以进行遗传程序"i殳计，用丝状M13病毒 等病毒的不同展示肽(不同的展示肽区例如pill,见图6)来改造病毒 结构。除了材料特异性可寻址能力之外，该遗传程序设计方法对材料改造的总体优势是对特定病毒长度和几何结构方面的潜力。丝状 病毒的长度通常与其包装遗传信息大小和静电平衡有关，所述静电
平衡是源于pVIII的病毒粒子核心与DNA之间的静电平衡。[参见例 如B. K. Kay, J. Winter, J. McCafferty,D鄉一 o/ P一血s <3"<i 尸ra^m: J La60rato/7 M2"wa/, Academic Press, San Diego, 1996]。 经 AFM观察到的噬菌体通常约860nm，最短为560nm,这取决于样品 制备中使用的是完整M13基因组还是较小的噬菌粒。[参见例如C. Mao, C. E. Flynn， A. Hayhurst, R. Sweeney, J. Qi, J. Williams, G. Georgiou, B. Iverson， A. M. Belcher,尸麼.脂/. Jcaaf. Sc/. 2003, 100, 6946]。并且，在pVin内側端，将一个赖氨酸变成谷氨酰胺，可产 生比野生型噬菌体长约35%的颗粒。[参见例如J. Greenwood, G. J. Hunter, R. N. Perham，丄Mo/. 5!'o/. 1991, 217, 223〗。另外，病毒颗粒的特异性连接、结合和串联可有助于产 生更长的病毒支架(scaffold),因此产生更长的线。通过将结合基序连 接到一个病毒上，其后它又能精确识别另一病毒上的结合位点，从 而可以控制附加复数(multiplicity of additions)。如前所迷，可以开发 M13病毒至少一端的pill蛋白残基，以展示肽和蛋白质融合物。在 病毒的另一端，pIX蛋白也可^L修饰。例如，Gao及合作者利用pIX 和pVII融合来展示抗体重链和轻链可变区。[参见例如C. Gao, S. Mao, G. Kaufmann, P. Wirsching, R. A. Lemer, K. D. Janda,尸roc. 7Vaf/.爿cfl(i. Sd. 2002, 99, 12612]。本发明包括双端病毒展示，以产生双峰异质结
构(bimodal heterostructure)，用于生产末端官能化线。这些末端连接 可具有相同或不同的结合和/或核化特异性。另外，病毒颗粒在其末 端区之外，也可展示结合和/或核化基序，例如在pVin上展示的氨 基酸寡聚体结合基序。例如，可使pIII和pIX区官能化，以结合和/
或核化一个组分，并且可使pvin官能化，以结合不同组分。图9、
图10和图11显示复合纳米线的图像，所述纳米线是由经过修饰、
以便在pin和pix上表达一个结合基序而在pvm上表达不同结合基 序的病毒颗粒而形成的。两端定向连接能产生其它有趣的几何结构，例如环状、方形和其它阵列(图7)。不使用接头，将病毒的一端与病毒的另一端直接结合， 可形成环状、线状或其它基于病毒的结构。通过将识别位点和相应 缀合部分与单个病毒或多个病毒连接，可以遗传设计出完整系统。此外，病毒可以与一维纳米线/納米管、二维納米电极和 微米级大块装置缀合。 一维材料，例如納米管或納米线，当与M13 病毒的pIII端缀合时，可形成相分离的片层结构，该结构具有无机 纳米管层或纳米线层以及噬菌体结构单元层。可以组构成二维纳米 厚的板型电极。病毒-半导体复合纳米线可通过病毒任一端上的结合 位点连接金属电极。这些结构可以起到納米-FET装置的作用，其因 约5nm直径的门控区而具有增强的性能。与其它已知纳米级装置不 同，当必须随机放置线材时，该方法将单一的线材直接放在正确的 电极位置。将单一线材导向特定位置的能力具有重要的实际应用价 值。 一系列结合位点，包括例如电极位点，可以摹制(pattern)在表面， 而且也允许病毒排列在结合位点之间，这是根据病毒末端结合位点 的识别而进行的。例如，可以形成方形栅格，栅格上各点都通过病 毒进行连接。图11显示应用亲和官能化纳米线制成纳米级装置例如 电子装置的方法的示意图。通过利用病毒的液晶性能，可以根据病毒-病毒结合而诱 导的二级结构和三级结构，构建具有特定设计机械性能的病毒纤维 或纤维样网络。此外，这些材料可具有特殊性能，能通过进一步官 能化病毒而将其包含在内，以结合试剂或信号元件。此外，基于多 功能病毒的阵列可用于组织修复，其中一部分阵列与一种组织类型 选择性结合，而另一部分可使骨或其它结构性生物材料成核。
II.病毒对病毒并没有具体限制，只要它可以被多官能化即可。 官能团可以是识别位点，能提供结合位点、成核位点和催化位点。一般而言，可以使用长形、丝状结构的病毒颗粒。参见例如Ge""/ca/(y 五"g7力ee/^(i P7nwes, Christopher Ring (主编)，Bios Scientific, 2001。 另 外，其它病毒几何结构例如十二面体和二十面体，也可以被多官能 化并用于生产复合材料。可以-f吏用能作为柔性杆状、形成具液晶结 构的病毒颗粒。在一个实施方案中，可以使用未经基因工程改造的病毒 颗粒。然而， 一般而言，当病毒经基因工程改造后，可以得到所需 特性。具体地讲，可使用已进行生物淘选的病毒，使病毒颗粒可特 异性识别作为生物淘选目标的材料并与之结合。材料也可以在特异 性识别位点和结合位点存在下，经核化和合成以呈现颗粒形式，包 括纳米颗粒形式。以下专利文献进一步介绍了丝状病毒在所谓定向进化或 生物淘选中的用途，例如Ladner等的美国专利第5，223,409号和笫 5,571,698号("Directed Evolution of Novel Binding Proteins")。病毒颗粒的大小和容积可以使颗粒能延伸。可以使用两种以上不同的病毒的混合物。可使用病毒颗 粒与非病毒材料的混合物，以制成本发明使用的材料。病毒和病毒颗粒可包括完整病毒和至少包含病毒衣壳的 部分病毒。病毒和病毒颗粒可含有或不含DNA，而且如果病毒或病 毒颗粒含有DNA的话，DNA可以编码或不编码病毒衣壳。病毒这 一术语可指病毒和噬菌体。完整病毒可包含核酸基因组、衣壳，并 可任选包含包膜。本文所述的病毒还可包含天然氨基酸寡聚体和异 源氨基酸寡聚体，例如细胞粘附因子。核酸基因组可以是天然基因 组或工程基因组。"病毒颗粒"还包括至少含有衣壳的病毒部分。 —般而言，病毒颗粒具有天然结构，其中病毒肽和核酸 部分以特定形式排列，当将其转化为固体状态、自我支持形式例如 薄膜和纤维时，所述排列是需要保留的。优选表达肽(包括肽寡聚体和氨基酸寡聚体)作为特异性结合位点的病毒。氨基酸寡聚体可包括任何序列的氨基酸，无论对 病毒来说是天然氨基酸还是异源氨基酸。氨基酸寡聚体可具有任何 长度并且可包含非氨基酸组分。可以使用约5至约100、尤其是约5至约30个氨基酸单位作为特异性结合位点的寡聚体。非氨基酸组分包括但不限于糖、脂质或无机分子。
—般而言，病毒的长径比特征可为至少25、至少50、至 少75、至少100或者甚至至少250或500。
可以使用各种病毒来实施本发明。本发明的组合物和材 料可包括多种单一类型或多种不同类型的病毒。优选本发明包括的 病毒颗粒是螺旋状病毒。螺旋状病毒的实例包括但不限于烟草花叶 病毒(TMV)、噬菌体pfl、噬菌体fdl、 CTX噬菌体和噬菌体M13。 这些病毒通常呈杆状，可以是刚性的或柔性的。本领域技术人员可 根据预期用途和病毒特性来选择病毒。
M13系统是优选的病毒实例。图1(A)显示M13病毒的示 意图。野生型丝状M13病毒的直径约6.5nm,长880nm 24。圆柱体 的长度反映了包装单链DNA基因组大小的长度。在M13病毒的一 端，有各约5个分子的蛋白VII (pVII)和蛋白IX (pIX)。另一端具有 各约5分子的蛋白III (pIII)和蛋白VI (pVI),总长度为10-16nm。野 生型M13病毒外壳由约2800拷贝的主要外壳蛋白VIII (pVin)组成， 该蛋白质以5单位的螺旋阵列堆积而成。
优选将本发明的病毒改造成在病毒表面表达一种或多种肽序列，包括氨基酸寡聚体。该氨基酸寡聚体对病毒来说可以是天然的或者是来自其它生物体的异源序列或者经改造以满足特定要 求。在使用M13系统的实施方案中，不同区域，例如pIII、 pVI、 pVII、pviii和pix,可表达相同或不同的氨基酸寡聚体。例如，pin和pvm 可表达具有不同结合特异性的氨基酸寡聚体。另外，具有不同结合 特异性的氨基酸寡聚体可在同一区域例如pvm上表达。图8显示通过在pVIII上表达对ZnS具有特异性的肽和对CdS具有特异性的肽所形成的碳纳米线。
可以通过以下参考文献24、尤其是第3章，"Vector for Phage D邵lay (噬菌体展示载体)"及其中所引用的参考文献中描述的 方法和载体，制备基因工程病毒。另外，可以通过以下文献及其中 所引用的参考文献中描述的方法，制备基因工程病毒Barbas等(2001) 尸/wge D咏/a乂 ^ La6oraf， Mawwa/, 包括第2章，"Phage Display Vectors (噬菌体展示载体)"。没有具体限制载体的类型。Barbas的表 2.1提供了示例性载体，所述载体可用于不同组合，以提供多功能病 毒。例如，3型、8+8型和噬菌粒型p7/p9可以组合在一起。或者视 需要，8型和3型可以与噬菌粒p7/p9组合。本领域技术人员可根据 具体用途，开发其它组合。可以开发出用于在一些或几乎全部外壳 蛋白拷贝上展示肽的方法。
氨基酸寡聚体的表达可具有许多功能，包括但不限于细 胞粘附因子、营养因子或者与有机分子或无机分子的结合位点或成 核位点。氨基酸寡聚体的表达容许改造病毒以适应特定应用。例如， 包含工程纤维的薄膜或纤维可含有氨基酸寡聚体，所述寡聚体引发 或促进细胞生长，以便用于组织工程应用。在另一个实例中，可以 表达对特定无机分子具有特异性的氨基酸寡聚体，以结合该无机分 子，提高化学反应效率。在又一个实例中，表达的氨基酸寡聚体可 结合有机分子，例如生物战武器(biological warfare agent)。这样的薄 膜或纤维可掺入到军方人员的衣物中或第一应答器(first responder)中 作为传感系统的组成部分。在再一个实例中，表达的氨基酸寡聚体 可与药物化合物或特定组织类型结合。具有这些结合特性的双功能 病毒颗粒可用于给药用途，以将药物传递到靶部位，否则这些药物 对常规系统给药来说毒性太大。这些仅仅是工程病毒所制得的薄膜 和纤维的几个应用实例，其它用途对本领域技术人员来说是显而易 见的。
大量现有技术的参考文献介绍了对病毒进行改造，以表达氨基酸寡聚体，可用于帮助实施本发明。例如，Ladner等的美国 专利第5,403,484号公开了在病毒表面选择和表达异源结合结构域。 Studier等的美国专利第5,766,905号公开了展示栽体，该栽体包含依 次排列的编码至少部分衣壳蛋白的DNA和用于外源DNA序列插入 的克隆位点。该组合物用于产生展示目的的蛋白质或肽的病毒。 Spooner等的美国专利第5,885，808号公开了腺病毒以及用修饰细胞 结合部分修饰腺病毒的方法。Valerio等的美国专利第6,261,554号描 述了工程基因传递载体，所述载体包含目的基因和携带许多特异性 结合对成员的病毒衣壳或包膜。Li的美国公布专利申请2001/0019820 描述了病毒经改造后在其表面表达配体，用于检测例如多肽、细胞、 受体和通道蛋白等分子。m.缀合物
没有具体限制缀合材料。 一般而言，可以为特殊用途来 进行选择。可以这样选择使能够针对缀合材料对病毒颗粒进行生 物淘选，然后使缀合材料与病毒颗粒选择性结合或特异性结合。在 一些应用中，选择性结合就已足够，而在其它应用中，优选更强的 特异性结合。
常规种类的缀合材料的实例包括无机材料、有机材料、 颗粒、纳米颗粒、单晶材料、多晶材料、非晶形材料、金属材料、 贵金属材料、磁性材料、半导体材料、聚合材料、电子导电材料、 旋光材料、导电材料、光发射材料和荧光材料。缀合材料可直接连 接到识别位点上或者可通过连4妻部分连接到识别位点上。在识别部 分存在下，可形成缀合材料，并且当它在形成时，与其偶联并结合。 或者，缀合材料可以预制，然后再与识别位点结合。例如，纳米晶 体可以在识别位点成核，或者可以先预制，再与识别位点结合。可 以使用那些作为有用的电极材料(例如贵金属和金)的缀合材料。缀合 材料进一步描述于例如在本说明书中引用的Angela Belcher及合作者的专利出版物和技术文献。
缀合材料可以是例如预制的量子点，例如得自Quantum Dot公司的量子点。量子点可包括核壳(core shell)结构。核可以是例 如CdS、 CdSe或CdTe。壳可以是例如硫化锌。量子点也可被例如具 有羧酸衍生化的疏水性/亲水性聚合物进一步涂敷。疏水部分可以影 响量子点的无机内部，而亲水部分可影响外部，包括溶剂。
多个病毒可与单一量子点纳米颗粒或纳米晶体结合。一 般而言，多个病毒可以基本对称地排列在量子点周围。描述量子点 的示例性专利包括例如美国专利笫6,322,901号(MT)、美国专利第 6,576，291号(MIT)、专利/>布号US2003/0017264 (QDC)、美国专利 第6,423,551号(UC)、美国专利第6,251,303号(MIT)、第6,319,426 号(MT)、第6,426,513号(MT)和第6,444,143号(MIT)、公布号US 2002/0045045 (QDC)、美国专利第5，990，479号(UC)、第6,207,392号 (UC)、第6,251,303号(MT)、第6,319,426号(MT)、第6,426,513号(MIT) 和第6,444,143号(MIT)、美国专利第5,990,479号(UC)、第6,207,392 号(UC)、第6,423,551号(UC)、第6,251,303号(MIT)、笫6,319,426 号(MIT)、 6,426,513号(MT)、第6,444,143号(MIT)、美国专利第 5,990,479号(UC)、另见美国专利第6,207,392号(UC)、美国专利第笫 5,990,479号(UC)、第6,207,392号(UC)、第6,423,551号(UC)、第 6,306,610号(MT)、第6,326,144号(MIT)、美国专利第5,990,479号 (UC)、第6,207,392号(UC)和笫6,274,323号(MT)、美国专利第 6,207,392号(UC)和美国专利第6，500,622号，所述文献通过引用4^ 结合到本文中。IV.三功能实施方案
可以修饰细长病毒，使其两端分别被修饰。这可被称为 A-B实施方案，其中A代表例如病毒的p3端，B代表病毒的p7/p9 端。另外，可以修饰细长病毒，使介于病毒两端的中间部分也被修饰。这可被称为A-B-C实施方案，其中C代表病毒的p8部分。可独 立修饰A、 B和/或C各区，用于不同缀合材料的结合、成核或识别。 或者可以修饰A、 B和/或C,用于相同缀合材料的结合、成核或识别。
使用三官能化病毒，基于病毒的环状结构可以用作成核 的生物模板并形成金属纳米环、磁性纳米环或半导体纳米环。磁性 环状结构具有独特磁性32，有希望用作磁性数据存储装置33。已经证 明,用核化ZnS、 CdS或FePt納米线的肽对pVIII进行修饰16' 17' 31 。 通过改变病毒扩增条件，将掺入的pVin展示在双功能病毒中，可用 于成核和病毒环的形成。
可使用三功能病毒，形成纳米线。可以修饰pIII和pIX，以结合相同或不同材料。可以修饰pvin,以结合相同或不同材料。 按此方法，可形成納米线。例如，可以使用具有pin和/或pix修饰以结合Au以及具有pVIII修饰以结合Cd的病毒，以形成具有Cd涂 敷和Au连接的纳米线，见图9-11。V.用途
在一个实施方案中，可以用本发明的工程病毒，制备场 效应晶体管(FET),包括硅量子线场效应晶体管(silicon quantum wire field effect transistors, SQWFET)。用标准沉积和电子束平印法，可 以形成基质。可以在納米线沉积之前或納米线沉积之后，采用Si特 异性双功能肽，用磁性纳米晶体来装饰硅纳米线。
也可以进行纯化，包括用本发明的工程病毒进行环境恢 复。例如，p3、 p9和/或p8可以用磁性部分进行修饰并用磁场分离 病毒。
在两端(例如pill和pIX)用识别元件修饰的工程病毒可以发送到两个所需位置之间。这可以结合pvin上的识别元件，以生长 特殊材料，包括颗粒材料和纳米晶体材料。可通过使用病毒可特异 性与之结合的材料，来摹制基质，将病毒以特定位点和/或方向用于 基质。还可用至少一个对第二材料具有特异性的结合基序，对病毒 进行官能化处理。可以在暴露给有图案的基质之前、之后和/或同时， 将病毒暴露给这种第二材料。第二材料可以是无机材料、有机材料 或任何其它所需材料。以该方法官能化的病毒可用于开发线路。
此外，可构建类似系统，其中经遗传方法将结合结构域和结合位点官能直接掺入到病毒中。包含例如杂官能病毒的应用， 允许不同材料在空间不同区域结合或生长，按特定顺序装配多种不 同病毒，并调节特定个体间的相互连接。可以通过开发利用生物分 子识别的多样性和特异性的额外"定向相互连接"组分，达到更复 杂的生物分子装配和"^列。
本发明的另一个实施方案是多组分納米线。本发明纳米线的一个基本的新特征是纳米线末端没有催化颗粒。因此，纳米线 可基本上大部分由纳米线材料组成，其中在其末端不含催化剂颗粒。 纳米线可包含沿纳米线长轴的组成变异。纳米线也可包括壳结构。 在一个实施方案中，组分长度基本上类似于病毒长度。通过将多种 病毒在其末端连接在一起，每种病毒各自用于制备不同组分，可以 沿纳米线的长轴来制备具有不同组分的纳米线。这可称为分节段納米线。例如，A-B纳米线可由材料A (基于第一病毒)和材料B (基于 第二病毒)来制备。纳米线可包含第三、笫四、笫五和更多不同材料。 如有必要，可使用納米颗粒在其末端将不同病毒连接在一起。各节 段的长度可以通过病毒长度来决定，这是可以控制的。示例性长度包括约lOOnm至约1，000nm,或约200nm至约800nm，或约300nm 至约700nm。可以通过本领域已知的热处理除去病毒支架并融合纳米 晶体，制备纳米线。例如，通过热处理对纳米晶体纳米线进行退火，
形成退火纳米线，如有必要，除去基础病毒支架，这些都描述于例 3口以下文献(i) "Peptide Mediated Synthesis of Metallic and Magnetic Materials";编号为10/665,721,于2003年9月22日申请；(ii) Belcher 等的美国临时申请60/534,102,于2004年1月5日申请，"Inorganic Nanowires.";和(iii) Belcher等，Scz'e"ce, 303, 213 (2004);所述文献， 包括附图、权利要求书和工作实施例，分别通过引用全部结合到本 文中。亲和官能化納米线材可用于构建场致发射显示器(field emission display, FED)。这类显示器的目标是为了构成"像素"，这 是由从2-D电极突出的纳米宽的线材组成。理想的是，纳米线材应 具有大的长径比(长度:直径)并且与直径相比应具有大间隔。它们应能 与基础电极具有产生良好的欧姆接触，并且是由具有合适电工功能 的材料制成，以便在合理电压下从纳米线材上"输出"电子。在一 个实施方案中，复合纳米线可以由多功能病毒装配而成，其中一端 指向电极材料上纳米线的有图案位置。pVII的官能化可指导合适金 属材料的装配成直径约30-50nm的圆柱体。远端肽官能可以使适于
稳定电子发射的可能的第三金属材料的装配定向。可替换的阴极结构和阳极结构可用于使燃料电池纳米 化。例如，相互连接的病毒结构可产生阱(well)，该阱限定了精确位 于该基质内的催化性金属颗粒的纳米多孔反应容量。这类整合了催 化性金属纳米颗粒的多孔结构也可用于石油化工催化和其它气相或 液相化学反应。当特异性结合的Ml3病毒与微小物体结合时，这些 微小物体的周期性组构也是可能的。M13病毒的作用将会是特异性 粘附单元，以周期性模式自动装配多种不同物件。M13的不同蛋白质的改造能力在这些基于病毒-无机杂合阵列的开发中是关键因子。图11对装置的制作(包括使用电极和二极管)提供了进一 步指南。第一步，病毒和缀合材料通过结合步骤或成核步骤结合在 一起。也可进行电极沉积。缀合的病毒再排列在电极之间。遗传控 制可为不同材料和异质结构提供合理的程序化合成和装配。生物分 子的特异性可提供对材料性能和装置组织的精确控制。可大量生产 的、自动装配的生物实体可用于大规模、低成本的制造范例。采用以下非限制性工作实施例，进一步描述本发明。
A.病毒制备通过M13病毒的两次遗传修饰和杂双官能接头分子的合 成，构建M13病毒环状结构；该接头分子是"^殳计用来特异性结合各 种经修饰的病毒末端的(图1)。在病毒的一端，通过噬菌体文库筛选 链霉抗生物素结合而鉴定的抗链霉抗生物素肽 (SWDPYSHLLQHPQ-)"展示在pIII的N端。M13病毒基因组编码抗 链霉抗生物素序列。因此，工程病毒上所有拷贝的pIII的小外壳蛋 白都展示抗链霉抗生物素肽。在病毒的另一端，与Ni(II)-次氮基三乙 酸络合物(Ni-NTA)强结合的六组氨酸肽(AHHHHHH-)融合到pIX的 N端25。使用标准细菌扩增方法，容易大量扩增这些双功能病毒。使用噬菌粒系统，产生工程病毒24,所述系统使用从M13 基因组分离的质粒来表达工程His6-pIX融合体。将从大肠杆菌 (Esc/ en'c/2/a co/Z)宿主内的该质粒制备的单链DNA包装到病毒中，称 为噬菌粒，M13基因组也可以这样做。因为病毒长度与其包装DNA 的大小成比例，所以观察到目前所使用的基于噬菌粒的病毒长度通 常为300-600nm，要比野生型M13病毒短。在该噬菌粒表达系统中， 无论野生型还是His6-pIX都可以产生，每个所得病毒可展示0-5个拷 贝24的his-标记的pIX。两端修饰的病毒可通过ER2738大肠杆菌(New England Biolabs)的感染而扩增(所述大肠杆菌带有含抗链霉抗生物素-pill的M13病毒的His6-pIX噬菌粒)，通过PEG分级从离心澄清上清 液中纯化，再重悬于Tris緩沖盐(pH .5)中。 潜在的抗噬菌粒系统
B.接头分子的制备也合成了由缀合Ni-NTA的链霉抗生物素组成的结构分 子(图lb)。在EDC催化剂存在下，带有伯胺的NTA配体(Qiagen)与 链霉抗生物素(New England Biolabs)上的羧基反应，然后加入Ni并纯 化26。接头分子的加入触发了成环反应，因此可以进行程序化和诱导。 因为接头必须连接病毒两端，所以杂双官能性很重要，以便通过结 合多价展示在病毒一端的肽，而阻止接头上结合位点的饱和。用基质辅助激光解吸电离飞行时间(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight, MALDI-TOF)质i瞽，在Voyager DE-Star设备上，以线性方式证实接头的合成，然后观察纳米结构。 链霉抗生物素是四聚体蛋白，由4个相同亚基组成，每个亚基具有 一个生物素结合位点27。所使用的链霉抗生物素的总分子量约为52.8 kDa,相当于成熟截短形式的链霉抗生物素。强度分布表明，链霉抗 生物素完全解离成单体亚基，而且单体、二聚体、三聚体和四聚体 都存在，如其它研究小组所观察到的一样28。就NiNTA-链霉抗生物 素接头分子而论，对应于四聚体的最大峰值位移约为l.2 kDa,单体 约为0.3 kDa (数据未显示)。考虑到单个缀合Ni-NTA的额外301.7 Da，链霉抗生物素的每个单体看来平均含有一个连接的Ni-NTA分 子。然而，如果缀合产物存在随机分布的话，它们在质谱中是无法 分辨出来的。
C.环状结构的制备当溶液中每个M13病毒相互间的距离比病毒长度大几 倍、且M13病毒与NiNTA-链霉抗生物素的相对浓度为1:1 (IO"噬菌体/ml:1011分子/ml)时，观察到病毒形成环状结构。双功能病毒(溶于 lmMTrisHCl、 1.5mMNaCl， pH 7.5)和接头分子(溶于1120)以化学计 量化合，通过涡旋混合，再在23。C温育一天。图2显示云母基质上 病毒环状结构的原子力显微镜术(atomic Force Microscopy, AFM)图 像，用轻打式NanoscopeIV (Digital Instruments)进行观测。发现基于 病毒的环散布在样品的大区域中。环半径的主要范围介于60nm和 90nm之间。所观察到的圆周范围相当于来自噬菌粒质粒和病毒基因 组的可包装DNA的大小。对噬菌粒系统额外的改造(以包装单条 DNA)，或者是对病毒基因组的额外的改造(以掺入修饰His6-pIX基 因)，应导致环状结构较大的单分散性。环的形成证实了 pill和pIX 的成功改造并产生双功能M13病毒。就我们所知，这是第一个工程 双功能噬菌体。已经进行了其它实验，以证实需要工程组分来形成环。 在pill上仅展示抗链霉抗生物素肽的单官能化病毒，与接头按1:1的 化学计量混合(1011噬菌体/ml:1011分子/ml)。并且，双功能病毒也与 缺乏NiNTA修饰的链霉抗生物素按1:1混合。通过AFM，观察到这 两种对照样品都没有形成环，仅观察到线状病毒(数据未显示)。因此， 病毒上的修饰pIX和接头上的NiNTA官能化，对环的形成来说是必 不可少的。早期实验鉴定的抗链霉抗生物素肽展示在pIII病毒上， 将链霉抗生物素缀合物与所述病毒连接，已证明展示肽对结合链霉 抗生物素的重要性19，29。 通过透射电子显孩史4竟术(Transmission Electron Microscopy, TEM),在JEOL 200CX仪器上，在200 kV进行操作， 也观察到了环的形成，见图3a。约5nm的深色区(环上部的箭头所指) 据信是接头。通过TEM所观察到的环的大小类似于AFM图像中的 环状结构。使用抗体标记来增加TEM图像中病毒环的反差(图3b)。 使用多克隆pVIII第一抗体，以结合病毒主要外壳；并使用与10nm 金纳米颗粒缀合的抗兔IgG笫二抗体作为标记3Q。缀合抗体的金颗粒的大有效直径可能会使所观察到的病毒环的大小失真。然而，样品 中可观察到用金纳米颗粒装配成型的环。为了形成环，病毒两端相遇并通过接头分子连接在一起。 该过程将伴随着应变能的增加和熵的减少。热波动、涡旋引起的机 械力或流体动力的液体运动包括布朗运动，可克服所需活化能以迫 使病毒成环。 一旦成环后，据信环状结构是稳定的，因为展示肽与 接头之间结合特别强。事实上，经测定，在pH8时，HiSs对Ni-NTA 的离解常数(Kd)为10-13M34。这比大多数抗体结合强，抗体结合的Kd 范围为IO'7 M至10-1QM。链霉抗生物素与抗链霉抗生物素肽(具有其 HPQ生物素样基序)的结合，预期比链霉抗生物素与生物素的结合稍 微弱一点，后者结合的IQ为10-15M35。此外，亲和效应将会增强相 互作用，因为多拷贝结合肽在病毒两端展示，而且接头分子对每个 肽平均具有4个结合位点。
D.非环状结构当病毒浓度对于多个病毒与接头碰撞来说足够高时，可 观察到病毒的线状或放射状连接。病毒与接头按10:1 (10u单位/ml:1011 单位/ml)的比例混合，用AFM成像，见图4。所得结构(图4a)可以用 接头上存在多个结合位点来解释。NiNTA-链霉抗生物素预期具有4 个抗链霉抗生物素肽的结合位点，推测是来自已知的生物素-链霉抗 生物素复合物的四聚体结构36。另外，通过质谱测定(数据未显示)并 示例于图lb,每个天然接头平均具有总共4个Ni-NTA配体，因此 具有多个Hise肽的结合位点。 一个病毒的抗链霉抗生物素或Hiss肽 和另一个病毒的抗链霉抗生物素或HiS6与同一接头分子连接，使得 M13病毒排列成线状，见图4b。当病毒浓度(10。噬菌体/ml)比接头(1013 分子/ml)低得多时，展示结合肽的所有噬菌体似乎都被接头钝化，使 得病毒保持独立(数据未显示)。结果，通过简单控制该系统中病毒和 接头浓度，即可获得不同自动装配结构。E. 环形成的可逆性另外，希望环的形成是可逆的，即通过控制游离咪唑浓 度，调节ffis6-NiNTA的结合37。制备1:1的病毒与接头的样品，见 图2,然后加入咪唑，终浓度为50mM (5|il病毒悬液+ 5pl lOOmM 咪哇氾20),再通过AFM进行样品成像(图5)。确实，当咪唑加入到 成环样品(图5a)中时，没有看到环(图5b)。此外，向图5所示样品中 加入终浓度为5mM的生物素(5pl病毒悬液+ 5pl 10mM生物素 /H20)，也仅产生线状病毒(图5c)。总的来说，这些结果证明，环的 形成取决于病毒展示肽与聚组氨酸和接头上的生物素结合位点的高 特异性结合。这和其它可逆性生物分子相互作用，使得工程病毒能 起到基于生物分子开关的作用，类似于超分子开关的概念38。
F. 异质结构病毒(Heterostructured Virus)用双肽病毒实现异质结构的成核和结合，所述病毒经改 造以在同一病毒衣壳中表达两种不同的肽。这对半导体纳米级异质 结构提供了遗传控制生物合成途径。以下实例进一步描述于Mao, Flynn等，PNAS, 2003年6月10日，第100巻，笫12期，6946-6951，
所述文献，包括附图、工作实施例、材料和方法以及补充材料和支 持性文本，都通过引用结合到本文中。用双肽病毒制备异质结构病毒，所述病毒经改造以在同 一病毒衣壳中同时表达Zn特异性肽和Cd特异性肽。首先，制备展 示A7 (ZnS)肽或Z8 (CdS)肽的病毒构建体。使用编码A7肽和Z8肽 的引物，通过PCR,从pfdisplay8衍生物扩增主要外壳pVIII基因(参 见Malik等，(19%) Gene, 171, 49-51) (Richard Perham惠赠，University of Cambridge, Cambridge, U.K.),使得Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头将所
述肽与成熟pvm序列的Asp"分开。延伸的pvin基因单独克隆到
pAK400中(参见Krebber等，(1997) J. /mmw"o/. M"/w浙201， 35-65)(Andreas Pliickthun惠赠，University of Zurich, Zurich),使得融合蛋白 处于/ac启动子控制之下并且通过使用戸氾前导序列而靶向内膜。 通过使用Applied Biosystems循环测序，证实ORF。通过使大肠杆菌 TG-l被M13K07超感染，使栽体pAK展示.A7和pAK展示.Z8被 独立拯救，并用ImM异丙基-(3-D-硫代半乳糖苦/无葡萄糖极端肉汤， 在25。C过夜，诱导肽展示，并用氯霉素和卡那霉素选择。离心并通 过0.22拜滤器过滤，澄清培养物，所得噬菌体用聚乙二醇沉淀两次。 用展示最小FLAG肽Asp-Tyr-Lys-Asp的对照载体，用抗FLAG Ml/ 抗M13 HRP捕获ELISA，证实肽展示。对101()转化单位的17% Laemmli PAGE凝胶进行考马斯蓝染色表明，当与WT噬菌体比较时，A7肽 和Z8肽都通过阻止pVin迁移并且增加染色倾向而被尿示。CdS肽 以类似方式展示。pVIII-J140融合肽，与接头Gly-Ala-Ser-Gly-Ala — 起，克隆到pMoPac32 (pAK400的抗氨苄青霉素衍生物)中，以产生 pMoPac32.J140。其次，使用上述方法，制备同时展示A7 (ZnS)肽和J140 (CdS)肽的病毒构建体，除了上述超感染方案用于同时带有pAK展示 A7和pMoPac32.J130的TG-1细胞之外。虽然栽体都具有pUC起点， 但是不同抗生素选择标记的存在，确保两者都会在短期维持，以便 在氯霉素和氨苄青霉素选择下双重展示。该方法避免了病毒基因组 工程，并且可使用适于在同一病毒构建体上多重展示的大量不同抗 性标记来进行(参见例如Malik等，(19%) 171, 49-51; Malik等,
油c/dd油to., 25, 915-916; Enshell-Seijffers等，AWe/c Zc油to.， 29, e50/l-e50/13)。
G.异质结构纳米线用双肽病毒可得到异质结构纳米线，所述病毒经改造以 在同 一病毒衣壳中同时表达ZnS特异性肽和CdS特异性肽。当具有双特异性展示的病毒与Zn(II)、 Cd(II)和S^阴离子(摩尔比:Zn/Cd/S = 1:1:2)在-25。C一起孵育时，病毒以随机分布核化 CdS纳米晶体和ZnS纳米晶体。CdS纳米晶体和ZnS纳米晶体看来 在同一噬菌体构建体上，见图8。HAADF STEM图像(图8(B)和图8(C)) 表明，纳米晶体大小均一(5nm)。按照HAADF STEM Z相差成像原 理，较亮的纳米晶体经测定是CdS，而较暗的纳米晶体经测定是ZnS (图8(B)和图8(C))。以互补方法，不同大小的预制ZnS (3-5nm)納米晶体和 CdS (-20nm)纳米晶体受到噬菌体模板影响，从而形成同时含有两种 半导体纳米晶体的异质结构纳来线，见图8。 Z相差、ZnS纳米晶体 与CdS纳米晶体之间的不同大小差异、PL、 EDS和ED，全都表明 这两种材料随机结合在同 一病毒线上。
H.附加实施例进行附加实施例，其中制备多功能病毒，见图9-14。在 图9-11中，使用Sl噬菌体。针对链審抗生物素来选择pIII噬菌体展 示。在pVIII上，将结合金的肽进行改造，所述肽是针对金膜覆盖的 基质选自pVin噬菌体展示。序列是VSGSSPDS。同时用这两种展示 的肽，构建噬菌体。噬菌体受到链霉抗生物素-涂层ZnS涂层CdSe (Quantum Dot Corp.)的影响，将ZnSe/CdSe与病毒构建体的一端结合。 在室温下，在30分钟内，来自AuCl2水溶液的金在pVIII上核化2 小时，再加入过量还原剂(硼氢化钠)，生成金属。反应混合物再进行 透析，除去过量盐和任何副产物。图12-13中，针对金基质筛选pIII噬菌体展示。序列为 LKAHLPPSRLPS。用噬菌粒载体改造同一金结合序列，该序列有待 展示在病毒的pIX蛋白上。病毒跨越电极。所述电极通过国家纳米 制作用户网络(National Nanofabrication Users Network, NNUN)的处 理，然后在MT的材料科学和工程中心(Center for Materials Science and Engineering, CMSE)进4亍反独刻(back etch)并抛光。
在图14中，对pIII噬菌体展示筛选中发现的相同的金序
列进行进一步改造，使用噬菌粒载体，以引起在病毒pvni蛋白上的 表达。图像显示病毒通过金电极结合，是在金颗粒成核之前。
以下文献通过引用全部结合到本文中，并且可用于实施本发明。 但并不是承认这些参考文献都是现有技术。
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(25) 通过PCR克隆技术，将遗传编码的六组氨酸肽和柔性氨基酸间 隔序列融合在M13病毒pIX基因(来自pAK的噬菌粒，参考文 献14， Mao 2003)的上游。在切除大肠杆菌pelB前导序列后， 表达的 His6-pIX 的成熟蛋白质序列为 AHHHHHHGQGGGVDMSVLVYSFASFVLGWCLRSGITYFTRL METSS (SEQ. ID NO. 1),经DNA测序证实。
(26) 溶于lml 0.1M MES [2-(N-吗啉代)乙烷磺酸]和0.5M NaCl (pH 6.0) 的链霉抗生物素(1.5mg/ml)，经加入0.01MEDC [l-乙基-3-(3-二 甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐]和0.01M磺基-NHS (N-羟磺基琥賴 酰亚胺)而活化。室温下15分钟后，EDC用2pL 2-巯基乙醇猝 灭。将緩冲液更换成磷酸钠緩冲液(0.3ml， 0.1M, pH 7.5)，用10kDa截止离心体积(Microcon)。力口入NTA配体，在室温过3小时后， 将緩冲液更换成Tris緩沖盐水(pH 8.0)。缀合的NTA-链霉抗生 物素在NiSO4(5mM0.5mlTBS)孵育5小时，再次离心纯化，溶 于蒸馏水。
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(30) 通过将lOjaL 1:100稀释的抗fd噬菌体抗体(Sigma-Aldrich, 7mg/ml)与10pL抗兔10腿金缀合物(Sigma-Aldrich, 1.4xl0"颗 粒/ml)混合1小时，然后加入10|iL 1:1病毒-接头悬液，来标记病毒。
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权利要求
1.一种制备病毒的方法，所述病毒具有多个用于选择性结合或成核的识别位点，所述方法包括对病毒进行基因工程改造，使所述病毒包含能够第一选择性结合或核化第一缀合部分的第一识别位点，对所述病毒进行基因工程改造，使所述病毒也包含与第一识别位点位置不同的、且能够第二选择性结合或核化第二缀合部分的第二识别位点。
2. 权利要求1的方法，所述方法还包括下述步骤对所述病毒 进行基因工程改造，使所述病毒还包含与第一和第二识别位点位置 不同的、用于第三选择性结合或核化笫三缀合部分的笫三识别位点。
3. 权利要求l的方法，其中所述病毒是丝状病毒。
4. 权利要求1的方法，其中所述病毒是噬菌体病毒。
5. 权利要求1的方法，其中所述病毒是丝状病毒，第一识别位 点在所述病毒的一端，而第二识别位点在所述病毒的另一端。
6. 权利要求2的方法，其中所迷病毒是丝状病毒，第一识别位 点在所述病毒的一端，第二识别位点在所述病毒的另一端，而第三 识别位点沿着丝状病毒的长轴。
7. 权利要求1的方法，其中第一识别位点包含表达的蛋白质或肽。
8. 权利要求l的方法，其中第一识别位点包含表达的肽寡聚体。
9. 权利要求1的方法，其中第二识别位点包含表达的蛋白质或肽。
10. 权利要求1的方法，其中第二识别位点包含表达的肽寡聚体。
11. 权利要求2的方法，其中第三识别位点包含表达的蛋白质或肽。
12.权利要求2的方法，其中第三识别位点包含表达的肽寡聚其中第一和第二识别位点包含表达的蛋 其中第一、第二和第三识别位点包含表 其中第 一识别位点用于结合或核化包舍 其中第一识别位点用于结合或核化包含 其中第 一 识别位点用于结合或核化包含 其中第 一识别位点用于结合或核化包含 其中第一识别位点用于结合或核化包含 其中第一识别位点用于结合或核化包含其中第 一识别位点用于结合或核化包含玻璃或陶瓷部分的笫一缀合部分。
13. 权利要求1的方法， 白质或肽。
14. ^又利要求2的方法， 达的肽寡聚体。
15. 权利要求1的方法， 无机材料的缀合部分。
16. 权利要求1的方法， 有机材料的第 一缀合部分。
17. 权利要求1的方法， 半导体部分的第一缀合部分。
18. 权利要求1的方法, 金属部分的笫一缀合部分。
19. 权利要求1的方法， 磁性部分的第 一缀合部分。
20. 权利要求1的方法， 聚合部分的第一缀合部分。
21. 权利要求1的方法,
22. 权利要求1的方法，其中第一识别位点用于结合或核化包含 生物分子部分的第一缀合部分。
23. 权利要求l的方法，其中第一识别位点用于结合或核化包含 病毒部分的第一缀合部分。
24. 权利要求1的方法，其中笫二识别位点用于结合或核化包含 无机材料的第二缀合部分。
25. 权利要求l的方法，其中第二识别位点用于结合或核化包含 有机材料的第二缀合部分。
26. 权利要求l的方法，其中第二识别位点用于结合或核化包含半导体部分的第二缀合部分。
27. 权利要求l的方法，其中第二识别位点用于结合或核化包舍 金属部分的第二缀合部分。
28. 权利要求l的方法，其中第二识别位点用于结合或核化包含 磁性部分的第二缀合部分。
29. 权利要求l的方法，其中第二识别位点用于结合或核化包含 聚合部分的第二缀合部分。
30. 权利要求l的方法，其中第二识别位点用于结合或核化包含 玻璃或陶瓷部分的第二缀合部分。
31. 权利要求l的方法，其中第二识别位点用于结合或核化包含 生物分子部分的第二缀合部分。
32. 权利要求l的方法，其中笫二识别位点用于结合或核化包含 病毒部分的第二缀合部分。
33. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合或核化包舍 无机材料的第三缀合部分。
34. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合包含有机材 料的笫三缀合部分。
35. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合或核化包含 半导体部分的第三缀合部分。
36. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合或核化包含金属部分的第三缀合部分。
37. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合或核化包含 磁性部分的第三缀合部分。
38. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合或核化包含聚合部分的第三缀合部分。
39. 权利要求2的方法，其中笫三识别位点用于结合或核化包含玻璃或陶瓷部分的第三缀合部分。
40. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合或核化包含生物分子部分的第三缀合部分。
41. 权利要求2的方法，其中第三识别位点用于结合或核化包含 病毒部分的第三缀合部分。
42. 权利要求1的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离至 少约为5nm。
43. 权利要求l的方法，其中第一和笫二识别位点之间的距离至 少约为25nm。
44. 权利要求l的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离至 少约为50nm。
45. 权利要求l的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离至 少约为100nm。
46. 权利要求l的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离至 少约为500nm。
47. 权利要求l的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离为 约5nm至约5,。
48. 权利要求l的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离为 约50nm至约l)am。
49. 权利要求2的方法，所述方法还包括纳米颗粒材料在第三识别位点成核的步骤。
50. 权利要求2的方法，所述方法还包括无机纳米颗粒材料在第三识别位点成核的步骤。
51. 权利要求2的方法，所述方法还包括金属納米颗粒材料在第三识别位点成核的步骤。
52. 权利要求2的方法，所述方法还包括磁性納米颗粒材料在笫三识别位点成核的步骤。
53. 权利要求2的方法，所述方法还包括半导体纳米颗粒材料在 第三识别位点成核的步骤。
54. 权利要求l的方法，其中对第一和笫二识别位点进行基因工 程改造，用于选择性结合或核化相同的第一和第二缀合部分。
55. 权利要求l的方法，其中对第一和第二识别位点进行基因工 程改造，用于逸择性结合或核化不同的第一和第二缀合部分。
56. 权利要求l的方法，其中第一和第二选择性结合是特异性结合。
57. 权利要求1的方法，其中笫三选择性结合是特异性结合。
58. 权利要求2的方法，所述方法还包括对所述病毒进行基因工 程改造的步骤，使其具有与第一、第二和第三识别位点位置不同的 第四识别位点，用于第四选择性结合或核化第四缀合部分。
59. 权利要求l的方法，其中所述病毒是丝状病毒，其中第一识 别位点包含表达的蛋白质或肽，其中第二识别位点包含表达的蛋白 质或肽。
60. 权利要求l的方法，其中所述病毒是丝状噬菌体病毒，其中 第一识别位点包含表达的肽寡聚体，其中第二识别位点包含表达的 肽寡聚体。
61. 权利要求60的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离 为约5nm至约5jam。
62. 权利要求60的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离 为约50nm至约lpm。
63. 权利要求62的方法，其中第一识别位点在所述病毒的一端， 而第二识别位点在所述病毒的另一端。
64. 权利要求63的方法，其中对第一和第二识别位点进行基因 工程改造，用于与不同的第一和第二缀合部分特异性结合。
65. —种用于制备缀合病毒材料的方法，所述方法包括 提供病毒，所述病毒包含能够笫一选择性结合或核化第一缀合部分的第一识别位点，并且还包含与第一识别位点位置不同的、且 能够第二选择性结合或识别第二缀合部分的第二识别位点；使所述病毒与第一和笫二缀合部分结合或成核，以形成缀合病 毒材料。
66. 权利要求65的方法，其中所迷病毒具有与第一和第二识别 位点位置不同的、用于第三选择性结合或核化第三缀合部分的第三 识别位点。
67. 权利要求66的方法，所述方法还包括所述病毒与第三缀合 部分的病毒结合或成核的步骤。
68. 权利要求65的方法，其中所述病毒是基因工程病毒。
69. 权利要求65的方法，其中所述病毒是丝状病毒。
70. 权利要求65的方法，其中所述病毒是噬菌体病毒。
71. 权利要求65的方法，其中所述病毒是丝状病毒，第一识别 位点和第二识别位点在所述病毒的相反的两端。
72. 权利要求65的方法，其中所述病毒是丝状病毒，第一识别 位点在所述病毒的一端，第二识别位点在所述病毒的另一端，而第 三识别位点沿着丝状病毒的长轴。
73. 权利要求65的方法，其中第一识别位点包含表达的肽或蛋 白质。
74. 权利要求65的方法，其中第一识别位点包含表达的肽寡聚体。
75. 权利要求65的方法，其中第二识别位点包含表达的肽或蛋白质。
76. 权利要求65的方法，其中第二识别位点包含表达的肽寡聚体。
77. 权利要求66的方法，其中第三识别位点包含表达的肽。
78. 权利要求66的方法，其中笫三识别位点包含表达肽的寡聚体。
79. 权利要求65的方法，其中第一和第二识别位点包含表达的 肽或蛋白质。
80. 权利要求66的方法，其中第一、第二和第三识别位点包含 表达的肽寡聚体。
81. 权利要求65的方法，其中第一缀合部分包含无机材料。
82. 权利要求65的方法，其中笫一缀合部分包含有机材料。
83. 权利要求65的方法，其中第一缀合部分包含半导体部分。
84. 权利要求65的方法，其中第一缀合部分包含金属部分。
85. 权利要求65的方法，其中笫一缀合部分包含磁性部分。
86. 权利要求65的方法，其中第一缀合部分包含聚合部分。
87. 权利要求65的方法，其中第一缀合部分包含玻璃或陶瓷部分。
88. 权利要求65的方法，其中第一缀合部分包含生物分子部分。
89. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含无机材料。
90. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含有机材料。
91. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含半导体部分。
92. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含金属部分。
93. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含磁性部分。
94. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含聚合部分。
95. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含玻璃或陶瓷部分。
96. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含生物分子部分。
97. 权利要求66的方法，其中第三缀合部分包含无机材料。
98. 权利要求66的方法，其中第三缀合部分包含有机材料。
99. 权利要求66的方法，其中笫三缀合部分包含半导体部分。
100. 权利要求66的方法，其中第三缀合部分包含金属部分。
101.权利要求66的方法，其中笫三缀合部分包含磁性部分。
102. 权利要求66的方法，其中第三缀合部分包含聚合部分。
103. 权利要求66的方法，其中第三缀合部分包含玻璃或陶瓷部
104. 权利要求66的方法，其中第三缀合部分包含生物分子部分。
105. 权利要求65的方法，其中第一缀合部分包含将材料与第一 识别位点特异性结合的中间接头。
106. 权利要求65的方法，其中第二缀合部分包含将材料与第二 识别位点特异性结合的中间接头。
107. 权利要求65的方法，其中第三缀合部分包含将材料与笫三 识别位点特异性结合的中间接头。
108. 权利要求65的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离 至少约为50nm。
109. 权利要求65的方法，其中笫一和第二识别位点之间的距离 至少约为100nm。
110. 权利要求65的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离 至少约为500mn。
111. 权利要求65的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离 为约5nm至约5pm。
112. 权利要求65的方法，其中第一和第二识别位点之间的距离 为约50nm至约l)im。
113. 权利要求65的方法，其中对第一和第二识别位点进行基因 工程改造，用于选择性结合或选择性识别相同的第 一和第二缀合部 分。
114. 权利要求65的方法，其中笫一和第二选择性结合是特异性 结合。
115. 权利要求65的方法，其中笫三选择性结合是特异性结合。
116. 权利要求65的方法，其中所述病毒具有与第一、第二和第 三识别位点位置不同的第四识别位点，用于第四选择性结合或核化 第四缀合部分。
117. 权利要求65的方法，其中所述病毒是丝状病毒，其中第一识别位点包含表达的肽，其中第二识别位点包含表达的肽。
118. 权利要求65的方法，其中所述病毒是丝状病毒，其中第一识别位点包含表达的肽寡聚体，其中第二识别位点包含表达的肽寡聚体。
119. 权利要求118的方法，其中笫一和笫二识别位点之间的距 离为约5nm至约5fim。
120. 权利要求118的方法，其中第一和第二识别位点之间的距 离为约50nm至约lfim。
121. 权利要求118的方法，其中第一识别位点在所述病毒的一 端，而第二识别位点在所述病毒的另一端。
122. 权利要求121的方法，其中对第一和笫二识别位点进行基 因工程改造，用于与不同的第一和第二缀M分特异性结合。
123. —种制备病毒的方法，所述病毒具有多个用于选择性结合 和核化缀合材料的识别位点，所述方法包括对病毒进行基因工程改造，使所述病毒包含能够第一选择性结 合第 一缀合部分的第 一识别位点，对所述病毒进行基因工程改造，使所述病毒也包含与第一识别 位点位置不同的、且能够第二选择性结合第二缀合部分的笫二识别 位点，任选对所述病毒进行基因工程改造，使所述病毒也包含与第一 或第二识别位点位置不同的、且能够笫三选择性结合第三缀合部分 的第三识别位点，使缀合部分成核，使得成核材料排列在第一、笫二或第三识别位点上。
124. —种用于制备缀合病毒材料的方法，所述方法包括 提供病毒，所述病毒包含能够第一选择性结合第一缀合部分的第一识别位点，并且还包含与第一识别位点位置不同的、且能够第 二选择性结合第二缀合部分的第二识别位点，并且任选能够第三选择性结合第三缀合部分的第三识别位点；材料在所述病毒存在下成核，使得成核材料排列在第一、笫二 或第三识别位点上。
125. —种用于装配病毒的方法，所述方法包括下述步骤 提供具有能够第一特异性结合第一缀合部分的第一识别位点的第 一病毒,提供具有第一缀合部分的第二病毒，通过第一识别位点和第一缀合部分，将笫一与第二病毒特异性 结合。
126. 权利要求125的方法，其中第一病毒也具有能够第二特异 性结合第二缀合部分的第二识别位点。
127. 权利要求125的方法，其中第二病毒也具有笫二缀合部分。
128. —种病毒阵列的装配方法，所述方法包括通过病毒颗粒上 的一个或多个识别位点和病毒颗粒上的一个或多个缀合部分，使多 个病毒颗粒彼此特异性结合的步骤。
129. —种用于装配病毒环的方法，所述方法包括下述步骤 提供病毒颗粒，所述病毒颗粒具有特异性结合第一缀合部分的第一识别位点，并且具有第一缀合部分，和通过识别位点和第一缀合部分，将所述病毒颗粒结与其自身特 异性结合。
130. —种制备颗粒病毒接头部分的方法，所述方法包括下述步骤提供颗粒，所述颗粒具有笫一特异性结合病毒的第一识别位点 的第一缀合部分，和用第二特异性结合病毒上的第二识别位点的第二缀合部分，使 所述颗粒官能化，以生成病毒接头部分。
131. 权利要求130的方法，其中所述官能化是共价官能化。
132. 权利要求130的方法，所述方法还包括将所述病毒接头部分与所述病毒结合的步骤。
133. 权利要求130的方法，其中所述颗粒是纳米颗粒。
134. 权利要求130的方法，其中所迷颗粒是蛋白质。
135. 权利要求130的方法，其中所迷颗粒是具有多个第一缀合 部分的蛋白质。
136. 权利要求130的方法，其中所述颗粒是具有多个亚基的蛋 白质。
137. 权利要求130的方法，其中所述每个亚基都具有第一缀合部分。
138. —种使病毒颗粒与接头部分结合的方法，所述方法包括 提供病毒颗粒，所述颗粒具有第一特异性结合第一缀合部分的第一识别位点，并且具有第二特异性结合第二缀合部分的第二识别位点j提供包含第 一缀合部分和第二缀合部分的病毒接头部分； 使所述病毒颗粒与所述病毒接头部分进行反应，使得特异性结合发生在所述病毒颗粒与所述接头部分之间。
139. 权利要求138的方法，其中所述接头部分在反应步骤中仅 与一个病毒颗粒结合。
140. 权利要求138的方法，其中所述反应步骤导致形成环，所 述环包含病毒颗粒和病毒接头部分。
141. 权利要求138的方法，其中所述接头部分在反应步骤中与 多个病毒颗粒结合。
142. 权利要求138的方法，其中所述接头部分在反应步骤中与 多个病毒颗粒结合，形成放射状聚集的病毒颗粒。
143. 权利要求138的方法，其中所述接头部分在反应步骤中与 多个病毒颗粒结合，形成线状连接的病毒颗粒。
144. 权利要求138的方法，所述方法还包括逆转所述病毒颗粒 与所述病毒接头部分之间的特异性结合的步骤。
145. 权利要求138的方法，所述方法还包括改变所述病毒接头 部分和所述病毒颗粒的相对量，以改变由特异性结合所产生的结构。
146. 权利要求138的方法，其中所迷病毒颗粒是丝状病毒颗粒。
147. 权利要求138的方法，其中所述病毒颗粒是噬菌体病毒颗粒。
148. 权利要求138的方法，其中所述病毒颗粒是丝状噬菌体病毒颗粒。
149. 权利要求138的方法，其中所述病毒颗粒具有第三特异性结合第三缀合部分的第三识别位点。
150. 权利要求138的方法，其中所述病毒颗粒具有第三特异性 结合第三缀合部分的第三识别位点，而且其中所述病毒颗粒是丝状 病毒颗粒。
151. 权利要求138的方法，其中第一和第二识别位点在所述丝 状病毒颗粒的相反的两端。
152. 权利要求138的方法，其中第一识别位点包含表达的肽或蛋白质。
153. 权利要求138的方法，其中第一识别位点包含表达的肽寡聚体。
154. 权利要求138的方法，其中第二识别位点包含表达的肽或 蛋白质。
155. 权利要求138的方法，其中第二识别位点包含表达的肽寡聚体。
156. 权利要求139的方法，其中第三识别位点包含表达的肽或 蛋白质。
157. 权利要求139的方法，其中第三识别位点包含表达的肽寡聚体。
158. 权利要求138的方法，其中第一和第二识别位点包含表达 的肽或蛋白质。
159. 权利要求的方法，其中笫一、第二和第三识别位点包 含表达的肽寡聚体。
160. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合包含无机材料的第三缀合部分。
161. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合 包含有机材料的第三缀合部分。
162. 权利要求139的方法，其中笫三识别位点用于特异性结合 包含半导体部分的笫三缀合部分。
163. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合 包含金属部分的第三缀合部分。
164. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合 包含磁性部分的第三缀合部分。
165. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合包含聚合部分的第三缀合部分。
166. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合包含玻璃或陶瓷部分的第三缀合部分。
167. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合包含生物分子部分的第三缀合部分。
168. 权利要求139的方法，其中第三识别位点用于特异性结合 包含药物或酶的第三缀合部分。
169. 权利要求138的方法，其中第一和第二识别位点之间的距 离至少约为50nm。
170. ^又利要求138的方法，其中第一和第二识别位点之间的距 离至少约为100nm。
171. 权利要求138的方法，其中第一和第二识别位点之间的距 离至少约为500nm。
172. 权利要求138的方法，其中第一和第二识别位点之间的距 离为约5nm至约5pm。
173. 权利要求138的方法，其中第一和第二识别位点之间的距 离为约50nm至约ljam。
174. 权利要求138的方法，其中所述病毒颗粒是丝状病毒颗粒， 其中第一和第二识别位点在所迷丝状病毒颗粒的相反的两端。
175. 权利要求174的方法，其中第一和第二识别位点包含表达 的肽或蛋白质。
176. 权利要求174的方法，其中第一和第二识别位点包含表达 的肽寡聚体。
177. 权利要求176的方法，其中所述病毒颗粒是噬菌体颗粒。
178. 权利要求138的方法，其中所述病毒颗粒的长径比至少为25。
179. 权利要求138的方法，其中所述病毒颗粒的长径比至少为100。
180. —种颗粒通过特异性结合而寡聚化或多聚化的方法，所述 方法包括下述步骤提供颗粒，所述颗粒包含分别用于第 一和第二特异性结合第一 和第二缀合部分的至少第 一和第二识别位点，提供接头部分，所述接头部分包含至少两个能够与所述颗粒特 异性结合的缀合部分；使所述颗粒特异性结合，由所述颗粒和接头部分形成寡聚体或 多聚体。
181. 权利要求180的方法，其中形成寡聚体。
182. 权利要求180的方法，其中形成多聚体。
183. 权利要求180的方法，其中所述寡聚体或多聚体包含至少 两个颗粒。
184. 权利要求180的方法，其中所述寡聚体或多聚体包含至少 三个颗粒。
185. 权利要求180的方法，其中所述寡聚体或多聚体包含至少四个颗粒。
186. 权利要求180的方法，其中所述颗粒是病毒颗粒。
187. 权利要求180的方法，其中所述颗粒是丝状病毒颗粒。
188. 权利要求180的方法，其中所述颗粒是丝状噬菌体病毒颗粒。
189. 权利要求180的方法，其中第一和第二识别位点是表达的 肽或蛋白质。
190. 权利要求180的方法，其中第一和第二识别位点是表达的 肽寡聚体。
191. 一种具有多个用于选择性结合的识别位点的病毒，所述病 毒包括至少一种病毒，所述病毒包含能够第一选择性结合笫一缀合部 分的第一识别位点，以及与第一识别位点位置不同的、且能够第二 选择性结合第二缀合部分的第二识别位点。
192. 权利要求191的病毒，所述病毒还包含与第一和第二识别 位点位置不同的、且能够第三选择性结合第三缀合部分的第三识别 位点。
193. 权利要求191的病毒，其中第一和第二选择性结合是特异 性结合。
194. 权利要求191的病毒，其中笫三选择性结合是特异性结合。
195. 权利要求191的病毒，其中所述病毒是丝状病毒。
196.权利要求191的病毒，其中所述病毒是噬菌体病毒。
197. 权利要求191的病毒，其中所述病毒是丝状病毒，笫一识 别位点在所述病毒的一端，而第二识别位点在所述病毒的另一端。
198. 权利要求191的病毒，其中所述病毒是丝状病毒，第一识 别位点在所述病毒的一端，第二识别位点在所述病毒的另一端，而 第三识别位点沿着丝状病毒的长轴。
199. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点包含表达的肽或蛋白质。
200. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点包含表达的肽寡聚体。
201. 权利要求191的病毒，其中第二识别位点包含表达的肽或 蛋白质。
202.权利要求的病毒，其中第二识别位点包含表达的肽寡聚体。
203. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点包含表达的肽或 蛋白质。
204. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点包含表达的肽寡聚体。
205. 权利要求191的病毒，其中第一和笫二识别位点包含表达 的肽或蛋白质。
206. 权利要求192的病毒，其中第一、第二和第三识别位点包 含表达的肽寡聚体。
207. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点用于与包含无机材料的第一缀合部分结合。
208. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含无机材料 的缀合部分结合。
209. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点用于与包含有机 材料的第一缀合部分结合。
210. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含有机材料 的第一缀合部分结合。
211. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点用于与包含半导 体部分的第 一缀合部分结合。
212. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含半导体部 分的第一缀合部分结合。
213. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点用于与包含金属部分的第一缀合部分结合。
214. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含金属部分 的第一缀合部分结合。
215. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点用于与包含磁性 部分的第一缀合部分结合。
216. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含磁性部分 的第一缀合部分结合。
217. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点用于与包含聚合 部分的第一缀合部分结合。
218. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含聚合部分 的第一缀合部分结合。
219. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点用于与包含玻璃 或陶瓷部分的第 一缀合部分结合。
220. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含玻璃或陶 瓷部分的第 一缀合部分结合。
221. 权利要求191的病毒，其中笫一识别位点用于与包含生物分子部分的第一缀合部分结合。
222. 权利要求191的病毒，其中第一识别位点与包含生物分子 部分的第一缀合部分结合。
223. 权利要求192的病毒，其中成核材料排列在第一或第二或 笫三识别位点上。
224. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点用于与包含无机 材料的第三缀合部分结合。
225. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点与包含无机材料 的笫三缀合部分结合。
226. 权利要求192的病毒，其中笫三识别位点用于与包含有机 材料的第三缀合部分结合。
227. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点与包含有机材料的第三缀合部分结合。
228.权利要求192的病毒，其中第三识别位点用于与包含半导 体部分的第三缀合部分结合。
229.权利要求的病毒，其中第三识别位点与包含半导体部 分的第三缀合部分结合。
230. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点用于与包含金属 部分的第三缀合部分结合。
231. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点与包含金属部分 的第三缀合部分结合。
232. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点用于与包含磁性 部分的第三缀合部分结合。
233. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点与包含磁性部分 的第三缀合部分结合。
234. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点用于与包含聚合 部分的第三缀合部分结合。
235. 权利要求192的病毒，其中笫三识别位点与包含聚合部分 的第三缀合部分结合。
236. 权利要求192的病毒，其中笫三识别位点用于与包含玻璃 或陶瓷部分的第三缀合部分结合。
237. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点与包含玻璃或陶瓷部分的第三缀合部分结合。
238. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点用于与包含生物分子部分的第三缀合部分结合。
239. 权利要求192的病毒，其中第三识别位点与包含生物分子部分的第三缀合部分结合。
240. 权利要求191的病毒，其中第一和第二识别位点之间的距 离至少约为50nm。
241. 权利要求191的病毒，其中第一和笫二识别位点之间的距离至少约为100nm。
242. 权利要求191的病毒，其中第一和第二识别位点之间的距 离至少约为500nm。
243. 权利要求191的病毒，其中第一和第二识别位点之间的距 离为约5nm至约5jjm。
244. 权利要求191的病毒，其中第一和第二识别位点之间的距 离为约50nm至约1^im。
245. 权利要求191的病毒，其中对第一和第二识别位点进行基 因工程改造，用于与相同的第 一和第二缀合部分特异性结合。
246. 权利要求191的病毒，所述病毒还包含与第一、笫二和第 三识别位点位置不同的第四识别位点，用于第四选择性结合笫四缀 合部分。
247. 权利要求191的病毒，其中所述病毒是丝状病毒，其中第 一识别位点包含表达的肽，其中笫二识别位点包含表达的肽。
248. 权利要求191的病毒，其中所述病毒是丝状病毒，其中笫 一识别位点包含表达的肽寡聚体，其中第二识别位点包含表达的肽 寡聚体。
249. 权利要求248的病毒，其中第一和第二识别位点之间的距 离为约5nm至约5(im。
250. 权利要求248的病毒，其中第一和笫二识别位点之间的距 离为约50nm至约l|am。
251. 权利要求248的病毒，其中第一识别位点在所述病毒的一 端，而第二识别位点在所述病毒的另一端。
252. 权利要求251的病毒，其中对第一和笫二识别位点进行基 因工程改造，用于结合不同的第一和第二缀合部分。
253. —种复合型病毒材料，所述材料包含病毒，所述病毒具有第一选择性结合第一缀合部分的笫一识别 位点并且还具有与第 一识别位点位置不同的、且能够第二选择性结合第二缀合部分的笫二识别位点，和第一和第二缀合部分，所述部分与所述病毒结合，形成所述复 合型病毒材料。
254. 权利要求2"的材料，其中所迷病毒与第一和第二识别位 点位置不同的、用于第三特异性结合第三缀合部分的第三识别位点。
255. 权利要求253的材料，其中第三缀合部分与第三识别位点 特异性结合。
256. 权利要求253的材料，其中所述病毒是基因工程病毒。
257. 权利要求253的材料，其中所述病毒是丝状病毒。
258. 权利要求253的材料，其中所述病毒是噬菌体病毒。
259. 权利要求253的材料，其中所述病毒是丝状病毒，第一识 别位点和第二识别位点在所述病毒的相反的两端。
260. 权利要求253的材料，其中所述病毒是丝状病毒，第一识 别位点在所述病毒的一端，第二识别位点在所述病毒的另一端，而 第三识别位点沿着丝状病毒的长轴。
261. 权利要求253的材料，其中所述病毒是丝状病毒，第一识 别位点在所述病毒一端的p3位点，第二识别位点在所述病毒相反一 端的p9位点，而第三识别位点沿着丝状病毒的长轴在p8位点。
262. 权利要求253的材料，其中第一识别位点包含表达的肽。
263. 权利要求253的材料，其中第一识别位点包含表达的肽寡 聚体。
264. 权利要求253的材料，其中第二识别位点包含表达的肽。
265. 权利要求253的材料，其中第二识别位点包含表达的肽寡聚体。
266. 权利要求253的材料，其中第三识别位点包含表达的肽。
267. 权利要求253的材料，其中第三识别位点包含表达的肽寡聚体。
268. 权利要求253的材料，其中第一和笫二识别位点包含表达的肽。
269. 权利要求253的材料，其中第一、第二和第三识别位点包 含表达的肽寡聚体。
270. 权利要求253的材料，其中第一缀合部分包含无机材料。
271. 权利要求253的材料，其中笫一缀合部分包含有机材料。
272. 权利要求253的材料，其中第一缀合部分包含半导体部分。
273. 权利要求253的材料，其中第一缀合部分包含金属部分。
274. 权利要求253的材料，其中第一缀合部分包含磁性部分。
275. 权利要求253的材料，其中第一缀合部分包含聚合部分。
276. 权利要求253的材料，其中第一缀合部分包含玻璃或陶瓷 部分。
277. 权利要求253的材料，其中笫一缀合部分包含生物分子部分。
278. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含无机材料。
279. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含有机材料。
280. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含半导体部分。
281. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含金属部分。
282. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含磁性部分。
283. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含聚合部分。
284. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含玻璃或陶瓷 部分。
285. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含生物分子部分。
286. 权利要求254的材料，其中第三缀合部分包含无机材料。
287. 权利要求254的材料，其中第三缀合部分包含有机材料。
288. 权利要求254的材料，其中笫三缀合部分包含半导体部分。
289. 权利要求254的材料，其中第三缀合部分包含金属部分。
290. 权利要求254的材料，其中第三缀合部分包含磁性部分。
291. 权利要求254的材料，其中第三缀合部分包含聚合部分。
292. 权利要求254的材料，其中第三缀合部分包含玻璃或陶瓷部分。
293. 权利要求254的材料，其中第三缀合部分包含生物分子部分。
294. 权利要求253的材料，其中第一缀合部分包含将材料与第 一识别位点特异性结合的中间接头。
295. 权利要求253的材料，其中第二缀合部分包含将材料与第 二识别位点特异性结合的中间接头。
296. 权利要求254的材料，其中笫三缀合部分包含将材料与第 三识别位点特异性结合的中间接头。
297. 权利要求253的材料，其中笫一和第二识别位点之间的距 离至少约为50nm。
298. 权利要求253的材料，其中第一和第二识别位点之间的距 离至少约为100nm。
299. 权利要求253的材料，其中第一和第二识别位点之间的距 离至少约为500nm。
300. 权利要求253的材料，其中第一和第二识别位点之间的距 离为约5nm至约5|iim。
301. 权利要求253的材料，其中第一和笫二识别位点之间的距 离为约50nm至约lpim。
302. 权利要求253的材料，其中对第一和第二识别位点进行基 因工程改造，用于与相同的第一和笫二缀合部分特异性结合。
303. 权利要求254的材料，其中所述病毒具有与第一、第二和 第三识别位点位置不同的第四识别位点，用于第四特异性结合第四 缀合部分。
304. 权利要求253的材料，其中所述病毒是丝状病毒，其中第 一识别位点包括表达的肽，其中第二识别位点包括表达的肽。
305. 权利要求254的材料，其中所述病毒是丝状病毒，其中第 一识别位点包含表达的肽寡聚体，其中第二识别位点包含表达的肽寡聚体。
306. 权利要求305的材料，其中第一和笫二识别位点之间的距 离为约5nm至约5jxm。
307. 权利要求305的材料，其中第一和笫二识别位点之间的距 离为约50nm至约lpm。
308. 权利要求307的材料，其中第一识别位点在所述病毒的一 端，而第二识别位点在所述病毒的另一端。
309. 权利要求308的材料，其中对第一和第二识别位点进行基 因工程改造，用于与不同的第一和第二缀合部分特异性结合。
310. —种颗粒病毒接头部分，所述部分包含具有笫一特异性结合病毒的第一识别位点的第一缀合部分以及具有第二特异性结合 病毒第二识别位点的第二缀合部分的颗粒。
311. —种通过将病毒颗粒与接头部分结合的方法而制备的连接 病毒组合物，所述方法包括提供病毒颗粒，所述颗粒具有第一特异性结合第一缀合部分的 第一识别位点，以及具有第二特异性结合第二缀合部分的第二识别位点5提供包括第一缀合部分和第二缀合部分的病毒接头部分； 使所述病毒颗粒与所述病毒接头部分发生反应，使得特异性结 合发生在所述病毒颗粒和接头部分之间，形成连接病毒组合物。
312. —种通过特异性结合使颗粒寡聚化或多聚化的方法所制备 的寡聚体组合物和多聚体组合物，所述方法包括下述步骤提供颗粒，所述颗粒包含分别用于第 一和第二特异性结合第一 和第二缀合部分的至少第 一和第二识别位点，提供接头部分，所述接头部分包含至少两个能够与所迷颗粒特 异性结合的缀合部分；特异性结合所迷颗粒，由所述颗粒和接头部分形成寡聚体组合 物或多聚体组合物。
313. —种构建病毒环状结构的方法，所述方法包括 提供丝状病毒，所述病毒包含第一特异性结合第一缀合部分的第一识别位点，并且还具有第二特异性结合第二缀合部分的第二识 别位点；提供包含第 一缀合部分和第二缀合部分的病毒接头部分； 使所述丝状病毒与所述病毒接头部分发生反应，使得特异性结 合发生在其间，形成病毒环状结构。
314. 权利要求313的方法，其中进行所述反应步骤，使得第一 识别位点与第一缀合部分结合，笫二识别位点与第二缀合部分结合， 所述丝状病毒与接头部分一起形成环。
315. 权利要求313的方法，其中在丝状病毒和连接部分的浓度 足够稀的i^液中进行所述反应步骤，以促进环的形成。
316. 权利要求313的方法，其中将所述反应条件调节到每一接头分子能提供一个丝状病毒的反应产物。
317. 权利要求313的方法，其中反应步骤中所述丝状病毒和接头部分的相对浓度使得发生环的形成。
318. 权利要求313的方法，其中所述反应步骤导致环的半径为 约25mn至约125nm。
319. 权利要求313的方法，其中所述丝状病毒是双功能的。
320. 权利要求313的方法，其中所述丝状病毒是三功能的，其 中包含特异性结合笫三缀合部分的第三识别位点。
321. 权利要求313的方法，其中第一识别位点和第二识别位点 是肽识别位点。
322. 权利要求313的方法，其中第一识别位点和第二识别位点 是寡肽识别位点。
323. 权利要求313的方法，其中所述丝状病毒经基因工程改造，以在两端展示融合的功能性结合肽，所述肽在各端形成彼此不同的 第一和第二识别位点。
324. 权利要求313的方法部分特异性结合的第三识别位点
325. 权利要求324的方法 的特异性结合。
326. 权利要求324的方法 的特异性结合。
327. 权利要求324的方法构的特异性结合。
328. 权利要求324的方法的特异性结合。
329. 权利要求324的方法的结合。
330. 权利要求324的方法，其中第三识别位点排列在丝状病毒 的长轴上。
331. 权利要求324的方法，其中第三识别位点是肽。
332. 权利要求324的方法，其中第三识别位点是寡肽。
333. 权利要求316的方法，其中形成环的反应步骤是可逆的。
334. 权利要求316的方法，其中所述环还包含结合对比剂。
335. 权利要求316的方法，其中所述接头部分包含蛋白质。
336. —种病毒组合物，所述组合物包含大量彼此特异性结合或与接头部分特异性结合的病毒颗粒。
337. 权利要求336的病毒组合物，其中所述病毒颗粒彼此特异性结合，没有接头部分。
338. 权利要求336的病毒组合物，其中所述病毒颗粒彼此特异 性结合，没有病毒接头部分。
339. 权利要求310的病毒组合物，其中所述病毒颗粒彼此特异,其中所述丝状病毒包含与第三缀合 ,其中所述识别部分提供对金属结构 ，其中所述识别部分提供对磁性结构 ，其中第三识别部分提供对半导体结 ,其中第三识别部分提供对无机结构 ，其中第三识别部分提供对有机结构性结合，有接头部分。
340. —种病毒组合物，所述组合物包含大量彼此特异性结合的 病毒颗丰立。
341. 权利要求314的病毒组合物，其中所述病毒颗粒是丝状的， 并且在各端特异性结合。
342. 权利要求314的病毒组合物，其中所述颗粒形成环状结构。
343. 权利要求314的病毒组合物，其中所述颗粒形成方形结构。
344. 权利要求314的病毒组合物，其中所述颗粒是末端官能化 的，用于特异性结合。
345. —种具有多个用于特异性结合的识别位点的病毒，所述病 毒包括包含能够笫一特异性结合第一缀合部分的笫一识别位点、能够 第二特异性结合第二缀合部分的第二识别位点以及能够第三特异性 结合第三缀合部分的第三识别位点的病毒，其中所述病毒还包含在 第三缀合部分成核的纳米晶体。
346. 权利要求345的病毒，其中所述纳米晶体是无机纳米晶体。
347. 权利要求345的病毒，其中所述纳米晶体是金属纳米晶体。
348. 权利要求345的病毒，其中所述纳米晶体是半导体纳米晶体。
349. 权利要求345的病毒，其中所述纳米晶体是磁性纳米晶体。
350. 权利要求345的病毒，其中所述納米晶体融合形成纳米线。
351. 权利要求345的病毒，其中所述病毒是丝状病毒，第一识 别部分在一端，第二识别部分在另一端，第三识别部分沿着所述丝 状病毒的长轴。
352. —种具有特异性结合的多个识别位点的病毒，所述病毒包含包含能够笫一特异性结合第一缀合部分的第一识别位点、能够 第二特异性结合第二缀合部分的第二识别位点的病毒，其中第一和第二识别位点的间隔距离至少约5nm。
353. 权利要求"2的病毒，其中第一和第二识别位点间隔至少 约25nm。
354. 权利要求"2的病毒，其中第一和第二识别位点间隔至少 约50nm。
355. 权利要求352的病毒，其中所述病毒是丝状病毒，所述病 毒还包含沿着丝状病毒长轴、且能够第三特异性结合第三缀合部分 的第三识别位点，其中所述病毒还包含在沿着丝状病毒长轴的第三 缀合部分成核的納米晶体。
356. —种多功能病毒颗粒的摹制方法，所述方法包括 提供基质，其上包含一个或多个缀合部分，提供病毒，具有多个用于与一个或多个缀合部分结合的识别位点，使病毒排列在基质上，使得病毒识别位点与 一个或多个缀合部 分结合。
357. 权利要求356的方法，其中所述病毒经摹制形成线。
358. 权利要求356的方法，其中所述病毒经摹制形成线路。
359. 权利要求356的方法，其中所述病毒经摹制在具有缀合部 分的纳米结构与其它结构之间形成连接物。
360. 权利要求356的方法，其中所迷基质是微芯片。
361. 权利要求356的方法，其中所述结合控制所述病毒的位置。
362. 权利要求356的方法，其中所迷结合控制所述病毒的取向。
363. 权利要求356的方法，其中病毒具有缀合部分的识别位点，
364. —种产品，所述产品包含按照权利要求356的方法制作的 微芯片。
365. FET装置，所述装置包括至少一种具有多个选择性结合的 识别位点的病毒结构。
366. FET装置，所述装置包括使用至少一种具有多个选择性结 合的识别位点的病毒结构而制作的至少 一个组件。
367. —种具有多个选择性结合的识别位点以使纳米线的位置定 向的病毒的用途。
368. ;k利要求2的方法，所述方法还包括纳米颗粒材料在第一 或第二识别位点成核的步骤。
369. 权利要求2的方法，所迷方法还包括无机纳米颗粒材料在 第 一或第二识别位点成核的步骤。
370. 权利要求2的方法，所述方法还包括金属纳米颗粒材料在 第 一或第二识别位点成核的步骤。
371. 权利要求2的方法，所述方法还包括磁性纳米颗粒材料在 笫 一或第二识别位点成核的步骤。
372. 权利要求2的方法，所述方法还包括半导体纳米颗粒材料 在第一或第二识别位点成核的步骤。
全文摘要
通过两次遗传修饰编码结合肽和合成杂双官能接头分子，构建来自M13病毒的一维环状结构。该双功能病毒能展示抗链霉抗生物素肽并在该病毒相反的两端展示六组氨酸肽，作为pIII和pIX融合体。按化学计量加入链霉抗生物素-NiNTA接头分子，导致基于病毒的纳米环的可逆形成，其周长相当于可包装DNA的长度。使用三官能化病毒，这些基于病毒的环状结构还可以经工程改造使无机材料成核并形成金属纳米环、磁性纳米环或半导体纳米环。
文档编号C12N7/00GK101300026SQ200480037083
公开日2008年11月5日 申请日期2004年10月15日 优先权日2003年10月15日
发明者A·M·贝尔彻尔, B·皮尔, K·T·南 申请人:得克萨斯系统大学评议会;麻省理工学院