用于治疗干扰素耐药性肿瘤的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于治疗干扰素耐药性肿瘤的方法和组合物的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求2003年12月10日提交的美国临时申请No.60/528,525的优先权，该申请被完整纳入本文作为参考。
背景技术：
干扰素蛋白疗法作为许多肿瘤的治疗措施在临床上已得到确认。两种被广泛商业化使用的利用重组DNA技术制备的干扰素是干扰素α-2b重组蛋白(Intron A，Schering Corporation)和干扰素α-2a重组蛋白(Roferon，Hoffman LaRoche，Inc.)。Intron A被证实与手术治疗措施联合可用于治疗恶性黑色素瘤，与蒽环类抗生素化疗联合可用于治疗侵袭性的滤泡性非何杰金氏淋巴瘤，通过损伤部位内注射可用于治疗尖锐湿疣、毛细胞白血病和AIDS相关的卡波西肉瘤。Roferon被证实可用于治疗费城染色体阳性的慢性骨髓性白血病(CML)和AIDS相关的卡波西肉瘤。
另外，还对使用编码干扰素的重组载体进行了调查研究，以评价其抗肿瘤效应，其中包括卵巢癌、肾癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、某些淋巴瘤和白血病、以及卡波西肉瘤的治疗。已有报道证实，通过直接注射，编码干扰素的复制缺陷型腺病毒(Ad-IFNα)的抗肿瘤活性可抑制多种人类肿瘤异种移植物(Ahmed等，CancerGene Therapy，8788-95(2001))，其中包括人移行膀胱癌(TCC)异种移植物(Izawa等，Clin.Cancer Res.，81258-1270(2002))。这些研究表明干扰素既可以直接介导抗肿瘤活性，又可以产生明显的旁观者效应，其特征表现为宿主效应细胞的活化、调亡的增加以及血管发生的抑制。
经过功效评价，重组干扰素蛋白一个特别值得注意的应用是对于膀胱癌的治疗。在美国每年被确诊为浅表膀胱癌的患者人数超过45,000。这种疾病的典型特征是起源于尿路上皮表面移行部位的进展缓慢的恶性病变。虽然这些浅表肿瘤患者中的大多数都能及时进行定期的经尿道切除术(TUR)和定期的监视，但是这远不是最佳的治疗方法，因为有60-70％的浅表肿瘤患者在TUR后复发，有高达30％的患者发展成更具侵袭性的可能致命的肿瘤。这种高复发率和病程进展模式的不可预测性使膀胱内滴注治疗被广泛应用以达到局部控制疾病的目的。免疫治疗联合膀胱内滴注卡介苗(BCG)通常可以使新近被确诊患者的病情得以延缓。不幸的是，这种治疗措施并不能对肿瘤的内在生物学特性产生实质的影响，许多患者依然有最终进化成侵袭性的致命肿瘤的实质风险。实际上，即使密切监视和随访，也有至少50％的患者最终会复发，30％的患者会死于转移的膀胱癌，虽然在最初发现时只有原发癌。见Herr等，J.Urol.，16360-61(2000)和Dalbagni等，Urol.Clin.North Am.，27137-146(2000)。很明显，需要找到更有效的膀胱内滴注治疗措施以提高整体存活率并替代膀胱根治切除术。
膀胱内给予干扰素α-2b(IFN α-2b)重组蛋白(Intron A)作为单独的治疗措施可被浅表膀胱癌患者良好耐受，浅表膀胱癌在许多国家已被批准为这种药物的适应症。研究证实，作为抢救治疗措施Intron A可在BCG治疗无效的情况下产生剂量相关的临床效应，虽然反应的持续时间有限，大多数患者在治疗的头一年内复发。Belldegrun等，J.Urol.，159(6)1793-801(1998)。最近，有人用Intron A和BCG联合试图增强对BCG的细胞免疫反应，提高对治疗措施的反应。O′Donnell等，J.Urol.，1661300-1304(2001)。结果证明联合治疗措施对BCG耐受的TCC是有效的，但是，这些初始反应者中的大多数还是会复发浅表肿瘤，最终还需要进行膀胱切除术。
利用编码干扰素的重组载体进行基因治疗是一种有希望的替代方法以治疗顽固的浅表性膀胱癌。局部给药可使转基因表达集中于尿路上皮，使载体分布于膀胱外的可能性最小。另外，编码分泌蛋白(例如IFNα-2b)的基因可有效转移到尿路上皮的正常细胞和恶性细胞内，产生有效的抗肿瘤旁观者效应，并且可在尿液内维持局部蛋白浓度。
发明概述本发明提供了通过使用编码干扰素的重组载体治疗干扰素耐药性肿瘤的方法。特别需要注意的是，重组载体所编码的干扰素所具有的特性与现有的通过重组制备的干扰素蛋白无关。本发明还提供了可用于治疗干扰素耐药性肿瘤的组合物，其中所述的治疗是通过使用编码干扰素的重组载体来实现的。
附图简述

图1提供了膀胱内注射Ad-IFN-α2α1/Syn3或Ad-IFN-α2b/Syn3所产生的肿瘤抑制效应的数据。左侧的图显示Ad-IFN-α2α1/Syn3或Ad-IFN-α2b/Syn3处理*后21天，与处理前相比肿瘤的大小明显降低，P＝0.0024。其他所有治疗组包括无Syn3的Ad-IFN-α2α1或单独的Ad-IFN-α2α1蛋白的结果显示肿瘤的体积逐渐增大。右侧的图显示的是一系列荧光显微照片，其中包括处理前肿瘤的典型照片和每个处理组的小鼠在治疗后21天的肿瘤显微照片。
图2证明在Ad-IFN/Syn3膀胱内滴注治疗后可使IFN的表达持续时间延长。图A证明无胸腺小鼠用Ad-IFN-α2b/Syn3处理一次后其膀胱匀浆物内的IFN表达水平持续升高，在第二次处理后表达水平进一步升高。然而，用200,000IU的Intron A蛋白单独进行相同的处理却无法达到这么高的IFN表达水平，或者无法维持这样的水平。箭头所指为第一次和第二次处理的时间点。图B所提供的数据表明无胸腺小鼠用Ad-IFN-α2α1/Syn3处理2次后的2天通过免疫组化分析发现在尿路上皮和临近的膀胱肿瘤内有同样高水平的IFN表达。箭头显示在许多细胞内存在很强的核周围IFN染色。图C证明外养的Balb-C小鼠在用Ad-IFN-α2α1/Syn3或Ad-IFN-α2b/Syn3处理后7天其尿路上皮内可检测到同样高水平的IFN表达。通过组织学检测或H&E染色切片未发现尿路上皮有形态学上的改变。
图3提供了Ad-IFN对膀胱癌细胞系的细胞毒性比较，这些细胞系对超过100,000IU的Intron A耐受。图A显示的是对照细胞内的阴性IFN染色(10×放大)和用Ad-IFN-α2α1处理的253J-BV细胞内明显的核周IFN染色(40×放大)。图B是流式细胞术分析数据，说明用50MOI的Ad-IFN-α2α1处理后48小时253JB-V细胞中亚二倍体的细胞数目增多。红色柱代表亚二倍体(subdiploid)群。图C说明经Ad-IFN-α2α1处理后G2/M期的细胞数增加60％以上。图D证实，与Ad-IFN-α2α1相同的50MOI的Ad-IFN-α2α对253JB-V细胞有显著的细胞毒性。50MOI的Ad-βgα1作为对照也用于这些试验中，没有观察到有细胞毒性，当用100,000IU的Intron A处理时也没有观察到这些细胞出现变化。利用KU7细胞或Ad-IFN-α2b得到了相似的结果。
图4说明对IFN蛋白耐受的膀胱癌细胞在Ad-IFN处理后所发生的胱冬酶依赖性细胞死亡，其中包括无IFN染色的那些细胞。图A显示的是用Ad-IFN-α2α1处理的KU7细胞或253J-BV细胞。图像为处理后36小时细胞进行IFN(红色)和DNA(蓝色)(上部)以及胱冬酶-3(绿色)和DNA(蓝色)(下部)三重染色的2×2光学通道合并图像。表达IFN的细胞内可见胱冬酶活化和核浓缩(白色箭头)。但是，在不表达IFN的细胞内也可以见到胱冬酶活化，并且与IFN表达细胞类似(黄色箭头)，这说明IFN表达在两种不同细胞群中的旁观者效应。图B显示的是用相同MOI的Ad-IFN处理后72小时BV和KU7细胞内胱冬酶-3活化的量。
图5显示的是Ad-IFN和Intron A对膀胱癌细胞产生的效应的比较。图A说明用两种MOI的Ad-IFN处理B-V细胞和KU7细胞，其上清中可产生持续而高水平的IFN表达。两种细胞系的IFN表达水平都可以达到10×106pg/ml(约2.5×106IU IFN)。在每种细胞系的培养基中都加入400,0000pg/ml(100,000IU/ml)的Intron A进行比较，结果发现表达水平可以维持6天。图B显示的是加入2.5×106Intron A或50MOIAd-IFN-α2b后48和72小时亚二倍体细胞所占的百分数。图C说明用与图B相同的浓度并且在相同时间点上用Intron A处理，KU7细胞没有出现形态学的变化或IFN染色。然而，需要注意的是用Ad-IFN-α2b处理后细胞增大，出现很强的核周染色，并且伴随着几个小调亡细胞(箭头)(40×放大)。
发明详述及优选实施方案本发明提供了治疗干扰素耐药性肿瘤的方法，该方法通过使肿瘤与编码干扰素的重组载体接触从而使被载体转导的肿瘤细胞表达载体所编码的干扰素。
本文所用的术语“干扰素耐药性肿瘤”是指按照常规的干扰素治疗方案注射干扰素蛋白进行治疗时肿瘤对这种治疗措施有抵抗性。对于膀胱癌来说，如果进行了为期6周、每周1次、每次约107单位、每次治疗约1小时的Intron A瘤内注射治疗后肿瘤依然没有缩小，那么这个肿瘤就被认为是对干扰素耐受的。对于恶性黑色素瘤来说，如果进行了为期4周、每周连续5天、每次约20MIU/m2的Intron A静脉注射(诱导期)，随后再进行为期48周、每周3次、每次约10MIU/m2的维持期治疗后肿瘤依然没有反应则认为这个肿瘤对干扰素治疗是耐受的。对于弥散性疾病如淋巴瘤和白血病来说，一般没有局部肿瘤组织块，但是却是一种以恶性白细胞为特征的系统疾病。为了本发明之目的，肿瘤性转化细胞也被认为是肿瘤。对于滤泡性淋巴瘤来说，如果进行了为期18个月、每周3次、每次5MIU的Intron A皮下注射治疗后患者依然没有反应则认为这个肿瘤对干扰素治疗是耐受的。对于费城染色体阳性的慢性骨髓性白血病(CML)来说，如果进行了为期5个月、最长可达18个月、每天1次、每次9MIU的Roferon肌肉注射或皮下注射治疗后患者依然没有反应则认为这个肿瘤对干扰素治疗是耐受的。除了临床指标和对常规干扰素蛋白治疗的反应以外，按照常规的体外试验方法进行体外试验也可用于确定肿瘤是否对干扰素蛋白治疗耐受。按照与本文实施例6所描述的MTT试验基本一致的方法使含干扰素耐药性肿瘤细胞的肿瘤与至少100,000单位Intron A接触，如果其生长未受到抑制则可以将这个肿瘤确定为干扰素耐药性肿瘤。
术语“肿瘤”是指肿瘤性细胞的集合体。术语“肿瘤性细胞”是指具有不受正常的细胞生长调控机制调控的具有异常生长表型的细胞。由于肿瘤性细胞不一定在任何时间点上都复制，因此术语“肿瘤性细胞”包括活跃复制的细胞以及临时处于静息状态(G1或G0)不复制的细胞。局灶化的肿瘤性细胞群被称为肿瘤。如上面所提到的，本文所用的术语肿瘤也指弥散性恶性疾病，如白血病，这种疾病就没有局灶化的实质肿瘤块。肿瘤可以是恶性的，也可以是良性的。恶性肿瘤也被称为癌。在优选实施方案中，肿瘤是指上皮癌，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、胃癌、膀胱癌或卵巢癌，或者胃肠道的任何癌。
虽然大多数肿瘤都是单克隆起源的，但是起源于单克隆的肿瘤可能会随着时间而分化。因此，肿瘤(包括弥散性肿瘤)可能会包含对干扰素耐药的个体细胞或细胞亚群，也可能包含对干扰素治疗敏感的细胞或细胞亚群。术语“干扰素耐药性肿瘤”是指根据本文实施例6所描述的MTT试验，一个肿瘤中有相当比例的细胞(如至少20％)被确定为对干扰素耐受。
本文所用的术语“处理”一般是指将编码干扰素的核酸引入到患者体内以使含肿瘤性细胞的日的组织与干扰素接触。因此，“癌性”组织一般是指一种组织内有一个或多个细胞被分类为癌性的、恶性的、肿瘤性的、癌前的、转化的，或者被分类为腺癌或癌，或者本领域内用于描述这些疾病的其他常用类似同义词。如果处理可以使肿瘤患者的生理或心理状况得以改善，则这种处理被认为是治疗性的。状况的改善可用各种方式评价，其中包括肿瘤负荷的减少、肿瘤进展的抑制、肿瘤进展的延缓、存活期的延长、肿瘤缩小、与肿瘤负荷相关的症状改善，其中包括而不限于疲乏、厌食、疼痛、抑郁、中性粒细胞减少和认知功能障碍。
本文所用的术语“干扰素”(缩写为“IFN”)是指1型和2型干扰素的共同体，其中包括缺失、插入或替代突变体，以及生物活性片段和等位基因的形式。本文所用的术语干扰素(缩写为“IFN”)是指1型和2型干扰素的共同体。1型干扰素包括干扰素α、β、ω及其亚型。人干扰素α已被鉴定出有14个亚型，干扰素β有3个亚型。特别需要指出的是，优选的干扰素α包含人干扰素α亚型，其中包括而不限于α-1(GenBank检索号NP 076918)、α-1b(GenBank检索号AAL35223)、α-2、α-2a(GenBank检索号NP 000596)、α-2b(GenBank检索号AAP20099)、α-4(GenBank检索号NP066546)、α-4b(GenBank检索号CAA26701)、α-5(GenBank检索号NP 002160和CAA26702)、α-6(GenBank检索号CAA26704)、α-7(GenBank检索号NP 066401和CAA26706)、α-8(GenBank检索号NP002161和CAA 26903)、α-10(GenBank检索号NP 002162)、α-13(GenBank检索号NP 008831和CAA 53538)、α-14(GenBank检索号NP 002163和CAA 26705)、α-16(GenBank检索号NP 002164和CAA 26703)、α-17(GenBank检索号NP 067091)、α-21(GenBank检索号P01568和NP002166)，以及Stabinsky的美国专利No.5,541,293(
公开日为1996年7月30日)、Stabinsky的美国专利No.4,897,471(
公开日为1990年1月30日)和Stabinsky的美国专利No.4,695,629(
公开日为1987年9月22日)所描述的干扰素同源序列，其内容本文已纳入作为参考，以及Goeddel等的美国专利No.4,414,150(
公开日为1983年11月8日)所描述的杂合干扰素。2型干扰素是指干扰素γ(EP 670A和EP 354A)及其亚型。人干扰素γ至少已鉴定出5个亚型，其中包括干扰素ω1(GenBank检索号NP 002168)。用于表达的干扰素编码DNA序列的构建可根据已知的氨基酸序列通过常规的DNA重组技术完成，其中已知的氨基酸序列见上面的参考文献以及Goeddel等的美国专利No.6,482,613(
公开日为2002年11月19日)的描述，其内容本文已纳入作为参考。
干扰素的“生物活性”片段被定义为利用本领域熟知的技术(见上述的Openakker等，同上；Mossman，J.Immunol.Methods，6555(1983))检测具有抗肿瘤或抗增殖活性的片段，能够通过IFN受体介导的机制活化IFN反应基因。可溶性的IFN-α和IFN-β蛋白通常被认为与I型IFN受体复合物有关(GenBank检索号NP 000865)，活化相似的细胞内信号通路。IFN-γ通常被认为与II型IFN受体有关。配基诱导的两类IFN受体的结合可导致Janus激酶磷酸化受体，随后激活STAT(信号转导子和转录活化子)蛋白和其他的磷酸化事件，导致IFN可诱导转录因子的形成，后者与IFN诱导型基因上的IFN反应元件结合。被鉴定为可活化IFN通路并随后与1型和/或2型IFN受体结合的多肽被认为是可用于本发明的干扰素。
术语“重组载体”是指含有用常规重组DNA技术制备的干扰素表达盒的病毒和非病毒载体。术语“干扰素表达盒”用于本文中是指含有调节元件的核苷酸序列，其中的调节元件可操控地连接到干扰素编码序列上，从而导致干扰素在细胞内转录和表达。术语“调节元件”是指启动子、增强子、转录终止子、多聚腺苷酸位点等。表达盒还可以包含其他序列以促进干扰素基因的表达和分泌。调节元件可进行组合排列以允许、增强或促进干扰素只在某个特定类型的细胞内表达。例如，可以通过设计表达盒使干扰素位于诱导型启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子、或时序启动子的控制之下。一般来说，表达载体内的干扰素基因与下列元件以适当的距离有序相连以利于功能性的表达启动子、转录起始位点、3’非翻译区、5’mRNA先导序列、编码干扰素多肽的核酸序列以及多聚腺苷酸信号。
术语“可操控连接”是指多聚核苷酸元件之间以功能性关系相连接。当一个核酸序列所处的位置与其他核酸序列产生功能性关系时则这个核酸序列被认为是“可操控连接的”。例如，如果一个启动子或增强子能够影响编码序列的转录时则认为这个启动子或增强子与编码序列是可操控连接的。可操控连接通常意味着被连接的核苷酸序列是连续的。但是，由于增强子一般在远离启动子几个kb的情况下才能发挥作用，并且内含子序列的长度变化很大，因此，某些多聚核苷酸元件可能是可操控连接的，但是并不是直接位于两侧，有时甚至从不同的等位基因或染色体上发挥顺式功能。
术语“诱导型启动子”是指在某些条件下和/或受外部化学信号或其他刺激信号的刺激时可促进干扰素目的基因优先(或唯一)转录的启动子。诱导型启动子的例子在许多科学文献上都有报道(见Yoshida等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，230426-430(1997)；Iida等，J.Virol.，70(9)6054-6059(1996)；Hwang等，J.Virol.，71(9)7128-7131(1997)；Lee等，Mol.Cell.Biol.，17(9)5097-5105(1997)；以及Dreher等，J.Biol.Chem.，272(46)29364-29371(1997))。辐射诱导型启动子的例子包括EGR-1启动子。Boothman等，138卷，附页S680-S71(1994)。
组织特异性启动子和肿瘤特异性启动子是本领域所熟知的，其中包括在平滑肌中特异性活化的启动子(α肌动蛋白启动子)，胰腺特异性启动子(Palmiter等，Cell，50435(1987))，肝脏特异性启动子(Rovet等，J.Biol.Chem.，26720765(1992)；Lemaigne等，J.Biol.Chem.，26819896(1993)；Nitsch等，Mol.Cell.Biol.，134494(1993))，胃特异性启动子(Kovarik等，J.Biol.Chem.，2689917(1993))，脑垂体特异性启动子(Rhodes等，Genes Dev.，7913(1993))，前列腺特异性启动子(Henderson等，美国专利No.5,698,443，
公开日为1997年12月16日)等。
术语“时序启动子”是指该启动子在病毒生命周期中驱动干扰素基因表达的时间点相对于控制反应元件表达的启动子来说时间稍晚，用于和病毒载体系统联合。这类时间调节启动子的例子包括腺病毒主要晚期启动子(MLP)和其他晚期启动子。对于单纯疱疹病毒来说，时序启动子的例子包括潜伏活化启动子。
术语“非病毒载体”是指可自我复制的染色体外环状DNA分子，与正常基因组不同，在能影响干扰素编码序列在靶细胞内的表达的非筛选条件下对于细胞的生存来说是非必须的。质粒可在细菌内自我复制，促进细菌的繁殖，但是这种含干扰素编码序列的质粒并不一定要在靶细胞内复制来产生治疗效应。其他的基因，如编码药物耐药性的基因也可以包含在载体内以便于筛选重组载体。这些额外的基因包括编码新霉素耐药性、多药耐药性、胸苷激酶、β半乳糖苷酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)和氯霉素乙酰转移酶的基因。
为了增强干扰素基因向特定组织或器官内的转移，可以将元件插入到非病毒递药系统内以提高其细胞靶向性。例如，包裹表达质粒的脂质可以掺入经修饰的细胞表面受体以增加其靶向性。虽然单纯的脂质体制剂也可以使用，但是用本发明的优选组合物填充或修饰的脂质体可用于全身给药，或者直接运送到目的组织内，这样脂质体就可用于运送所选择的肽组合物。这类配基的例子包括抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体或其功能片段(Fv，Fab，Fab′)。另外，非病毒载体还可以通过多聚赖氨酸基序连接上一个靶向性基序，如Wu等的美国专利No.5,166,320，(
公开日为1992年11月24日)和Wu等的美国专利No.5,635,383(
公开日为1992年2月3日)所描述，其内容已纳入本文作为参考。
术语“病毒载体”和“病毒”在本文中可交互使用，是指无蛋白合成机制和能量产生机制的细胞内寄生物。病毒基因组可以是RNA或DNA，包含在脂质膜蛋白的包被结构之内。术语病毒和病毒载体在本文中可交互使用。可用于实现本发明的病毒包括重组的包膜或非包膜DNA和RNA病毒，优选来自杆状病毒属、细小病毒属、疱疹病毒属、痘病毒属或腺病毒属的病毒。病毒可以是天然的病毒，或者通过重组DNA技术改造其病毒基因组使其包含外源基因的表达，也可以改造成复制缺陷型的病毒，条件复制型病毒或者复制完整型病毒。能充分利用亲本病毒载体每一个优势元件的嵌合病毒也可用于实现本发明(见Feng等，Nature Biotechnology，15866-870(1997)。根据本发明的实践也可以制备微小载体系统，其中病毒骨架只包含病毒载体包装所必须的序列，还可能包含目的基因表达盒。虽然在通常情况下最好使用被处理物种来源的病毒，但是在某些情况下使用具有致病特性的不同物种来源的载体也有其优点。例如，PCT专利WO98/27216(
公开日为1998年8月5日)所描述的用于人类基因治疗的马疱疹病毒载体。上面所描述的可用于治疗人的病毒如马病毒对于人来说是非致病性的。同样，绵羊腺病毒载体也可用于人的基因治疗，因为它们可以避免产生抗人腺病毒载体的抗体。这类载体描述于PCT专利WO97/06826(
公开日为1997年4月10日)中。
术语“复制缺陷型”是指载体在野生型哺乳动物细胞内的复制能力被大大削弱。为了大量制备这类载体，一般需要制备生产细胞，辅助以辅助细胞或者通过基因组改造修补其缺失的功能。例如，HEK293细胞被改造后可修补腺病毒E1缺失，使E1缺失的复制缺陷型腺病毒载体能够在293细胞内繁殖。术语“复制完整型病毒载体”是指能够感染细胞，能够在被感染细胞内进行DNA复制、包装，并且能裂解被感染细胞的病毒载体。本文所用的术语“条件复制型病毒载体”是指被涉及成能在特定类型的细胞内选择性表达的复制感受态载体。这种条件复制特性可通过与组织特异性的、肿瘤特异性的、细胞类型特异性的启动子或早期基因(如腺病毒的E1基因)的其他选择诱导性调控序列可操控地连接来实现。
具有广谱感染性的病毒来源的病毒载体也可以通过修饰其包膜蛋白使其具有细胞类型特异性或细胞类型靶向性。例如，通过选择性地修饰病毒基因组的节(knob)和纤维(fiber)编码序列使经修饰的节和纤维结构域的表达具有与特定细胞表面受体特异性相互作用的特性，从而使病毒载体拥有细胞靶向性。这类修饰的例子有Wickham等，J.Virol.，71(11)8221-8229(1997)(将RGD肽插入到腺病毒纤维蛋白内)；Arnberg等，Virology，227239-244(1997)(修饰腺病毒的纤维基因使其对眼和生殖道具有趋向性)；Harris等，TIG，12(10)400-405(1996)；Stevenson等，J.Virol.，714782-4790(1997)；Michael等，Gene Therapy，2660-668(1995)(将促胃液素释放肽插入到腺病毒纤维蛋白内)；以及Ohno等，Nature Biotechnology，15763-767(1997)(将蛋白结合区插入到新培斯病毒内)。使载体具有细胞特异靶向性的其他方法包括将抗体或抗体片段连接到包膜蛋白上(见Michael等，J.Biol.Chem.，2686866-6869(1993)，Watkins等，Gene Therapy，41004-1012(1997)；Douglas等，Nature Biotechnology，141574-1578(1996)。另外，还可以通过将特定的基序连接到病毒表面来达到靶向性的目的(见Nilson等，Gene Therapy，3280-286(1996)(将EGF连接到逆转录病毒蛋白上)。载体的靶向性还可以通过Murphy的美国专利No.6,635,476(
公开日为2003年10月21日)所描述的方法来实现，其内容本文已纳入作为参考。这些靶向性的修饰加上或联合其他的病毒基因组修饰可用于本发明的病毒载体上。靶向性修饰可用于复制缺陷型、复制完整型或条件复制型病毒的制备。
另外，还可以通过使用控制病毒复制抑制子的通路反应性启动子使病毒载体具有细胞类型靶向性。术语“通路反应性启动子”是指在正常细胞内能与特定蛋白结合从而导致临近基因因蛋白的结合而发生转录反应的DNA序列。这类启动子可通过插入与转录因子结合的反应元件来制备。这类反应通常是诱导性的，尽管在某些情况下蛋白水平的升高也会抑制转录。通路反应性启动子可以是天然的，也可以是合成的。一般来说，需要参考所靶向的功能蛋白的通路来构建通路反应性启动子。例如，天然的p53通路反应性启动子包含可被功能性p53活化的转录控制元件，如p21或bax启动子。另外，含p53结合位点的合成启动子就是一种合成的通路反应性启动子。合成的通路反应性启动子通常是用一个或多个拷贝的与共有结合基序相匹配的序列构建的。这种共有DNA结合基序很容易确定。这种共有序列通常以同一个方向排列，或者以头-尾重复方式排列，中间被几个碱基对分开。包含头-头重复单元的元件被称为回文序列或反向重复序列，含有尾-尾重复单元的元件被称为翻转重复序列。
在本发明的优选实施方案中，病毒载体是腺病毒。术语“腺病毒”是术语“腺病毒载体”是同义词，是指腺病毒属的病毒。术语腺病毒属是指乳腺病毒属中所有动物病毒的集合，其中包括而不限于人、牛、羊、马、犬、猪、小鼠和猿腺病毒亚属。特别需要指出的是，人的腺病毒包括A-F亚属及其不同的血清型，其中包括而不限于1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad 11A和Ad 11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型人腺病毒。术语牛腺病毒包括而不限于1、2、3、4、7和10型牛腺病毒。术语犬腺病毒包括而不限于1型(CLL、Galxo、RI261、Utrect、Toronto 26-61株)和2型犬腺病毒。术语马腺病毒包括而不限于1型和2型马腺病毒。术语猪腺病毒包括而不限于3型和4型猪腺病毒。术语病毒载体包括复制缺陷型、复制完整型和条件复制型病毒载体。
更优选的是来源于人2型和5型腺病毒的载体。这些载体含有特殊的修饰以提高其治疗潜能。例如，可以包含E1a和E1b基因的缺失。其他某些区可以被加强或缺失以使其具有某些特殊的特征。例如，有研究表明E3区的上调可降低给人使用时所产生的与人腺病毒载体相关的免疫原性。E4区被认为对CMV启动子控制下的目的基因的表达有重要影响，而E4或f6蛋白被认为在E1b大蛋白存在的情况下可导致p53在靶细胞内的降解。Steegenga等，Oncogene，16345-347(1998)。因此，最好删除腺病毒载体的这些序列。
在本发明的一个实施方案中，当利用复制感受态载体转移干扰素基因时，所使用的腺病毒载体优选E1A区发生特异性缺失的，这样就可以降低E1a基因产物与p300和Rb蛋白的结合能力，但是保留E1a CR3区的反式激活功能。本发明的载体在E1a编码序列上有缺失以删除13S编码序列上的p300和p105-Rb结合位点。在本发明的一个优选实施方案中，p300结合位点的缺失是指约4到25位或约36到49位氨基酸的缺失。在本发明的一个优选实施方案中，Rb结合位点的缺失是指约111-127位氨基酸的缺失，优选的是约111-123位氨基酸的缺失。更优选的是载体E1a-p300结合区的缺失包括腺病毒E1a基因产物的4-25位氨基酸密码子的缺失。更优选的是载体E1a-Rb结合区的缺失包括腺病毒E1a基因产物的111-123位氨基酸密码子的缺失。另外，还可以通过引入突变来删除289R和243R蛋白的124-127位氨基酸从而达到删除pRb结合位点的目的。在如本文实施例所描述的本发明的最优选实施方案中，载体包含E1a 13S基因产物的4-25和111-123位氨基酸的缺失。
另外，可以引入的氨基酸缺失还有E1a 289R蛋白上的约219-289位氨基酸和E1A243R蛋白上的约173-243位氨基酸。例如，在人Ad5基因组1131位点相应的位置上引入点突变(即胞嘧啶1131变成鸟嘌呤)就可以产生一个终止密码子。这种突变可导致E1a 289R蛋白上的219-289位氨基酸和E1A 243R蛋白上的173-243位氨基酸的缺失。这种突变可选择性地与上面所描述的Rb和p300结合区上的缺失联合使用。
本发明的实施包括肿瘤与编码干扰素的重组载体“接触”。肿瘤细胞的接触是通过肿瘤细胞暴露于重组载体而实现的，这样肿瘤细胞就可以被表达干扰素的载体所转导，其中的干扰素是由载体编码的。肿瘤与载体接触的特定方式因载体所要转导的肿瘤的性质不同而不同。在本发明的某些实施方案中，本发明的组合物被直接注射到组织内，或者被注射到供应目的组织的血管内。在本发明的其他实施方案中，优选局部给药，但是如果达到物理接近肿瘤位点有困难，就需要通过导管或其他装置来运送组合物以使其接近远处的目的组织，如内脏。本发明的组合物还可以储存型装置、泵、植入物或允许组合物缓慢或持续释放的制剂的方式给药。在本发明的其他实施方案中，本发明的组合物可通过“局部区域”给药，即膀胱内滴注、损伤部位内给药和/或局部给药。在本发明的其他实施方案中，特别是治疗弥散性肿瘤(如白血病)或转移疾病时，本发明的组合物可以通过静脉注射或动脉注射的方式全身给药。
为了证明本发明的实用性，人5型腺病毒来源的重组载体用于编码干扰素。用以下这些试验来评价含IFNα的两个腺病毒载体。一个载体含有人干扰素α2b基因(Ad-IFNα2b)，另一个载体含有嵌合的人“杂合”干扰素基因，该基因由人α2 N-末端连接人α1 C-末端组成(Ad-IFNα2α1)。虽然IFN活性通常都有种属限制性，但是杂合的干扰素(“通用的”或IFN A/D)对各种哺乳动物来源的细胞是有活性的，其中包括小鼠和人。这两个载体可用于评价重组IFNα载体对人肿瘤的效应以及杂合干扰素更广谱的效应，后者在小鼠细胞和小鼠模型内的人肿瘤异种移植细胞内都能激发反应。
为了评价IFN基因和IFN蛋白膀胱内滴注治疗措施的反应，我们使用了裸鼠的原位膀胱癌模型。该模型描述于Watanabe第Cancer Gene Therapy，71575-1580(2000)和Zhou等，Cancer Gene Therapy，9681-686(2002)中。在治疗后21天所取的膀胱组织切片中所发现的肿瘤数量与通过造影所发现的肿瘤负荷高度相关。在进行膀胱内滴注治疗前，按照Watanabe等描述的方法通过造影定量测定癌细胞注入后2周每只小鼠膀胱内的KU7癌细胞负荷。为了进行膀胱内滴注，载体与Syn3混合给药(实施例1)。然后对小鼠进行各种膀胱内滴注治疗措施，连续两天，每天1小时，如本文实施例所描述。3周后再次通过造影检查膀胱，观察肿瘤负荷的变化。如附图的图1所示，无论使用Ad-IFNα2α1/Syn3或者Ad-IFNα2b/Syn3，都可以观察到肿瘤明显缩小(P＜0.0024)。与此相对应的是，用对照的Ad-βgal/Syn3、单独的Ad-IFNα2α1或Syn3治疗后肿瘤都快速生长。这些结果说明Syn3可明显增强IFNα编码腺病毒载体的效应。
由于在临床试验中膀胱内单独滴注IFNα蛋白或与BCG联合滴注是用于治疗浅表膀胱癌的，因此需要用试验来进一步分析Ad-IFN活性与干扰素蛋白治疗之间的差异。用上述的原位肿瘤模型来比较杂合干扰素蛋白与Ad-IFNα2α1之间的疗效差异。当用200,000单位(2MIU/ml)的蛋白进行连续2天、每天1小时的膀胱内滴注后，没有观察到明显的肿瘤缩小。在进行蛋白滴注的第1、7和14天以及首次治疗后21天评价肿瘤负荷时都没有检测到抗肿瘤效应的出现。这些结果与图1所证明的治疗后所观察到的疗效正好相反。各治疗组的尿路上皮表现都类似，发现有轻度的组织增生，这与开始时胰酶消化尿路上皮有关，因为需要促进起始的肿瘤细胞粘附。
为了评价膀胱内滴注Ad-IFNα/Syn后干扰素表达的水平和持续时间，我们利用非荷瘤无胸腺小鼠进行了一系列试验，所使用的Ad-IFNα2b/Syn3浓度与上述疗效试验一样，并且比较了单次膀胱内滴注治疗和连续2天、每天1小时滴注治疗的效果。在治疗后的不同时间点上收集小鼠的膀胱来分析膀胱组织内的IFN蛋白表达水平，通过ELISA试验来测定组织匀浆物内的IFN蛋白含量。如图2A所示，治疗后1天膀胱所含的Intron A约为50,000pg/mg，到7天时缓慢下降到5,000-10,000pg/mg。对于接受二次Ad-IFNα2b/Syn3治疗的小鼠来说，组织浓度可以达到100,000pg/mg，与单次治疗的小鼠相比，过了7天依然能保持较高的水平。与此相对应的是，当用200,000IU的IFN蛋白滴注时，治疗后1小时组织匀浆物内的IFN浓度就下降到＜1000pg/mg，然后就检测不到IFN蛋白了。通过免疫组化分析发现，无论是Ad-IFNα2α1/Syn3还是Ad-IFNα2b/Syn3，治疗后2天都可以在大多数尿路上皮细胞内发现高浓度的IFN蛋白(图2B)。在临近的许多人肿瘤细胞内都可以见到相似的染色(图2B)。对于外养的Balb-C小鼠来说，在用Ad-IFN-α2α1/Syn3或Ad-IFN-α2b/Syn3处理两天后的第5天，许多尿路上皮细胞也可以观察到很强的IFN染色(图2C)。另外，通过组织学检测没有发现膀胱上有局部毒性变化的出现(图2C)。这对于用Ad-IFNα2α1/Syn3治疗的小鼠来说是特别重要的，因为杂合的IFN对小鼠细胞是有活性的。
为了更全面地阐释干扰素编码载体在治疗干扰素耐药性肿瘤中的疗效，我们进行了一系列的试验来评价干扰素编码载体对干扰素耐药性肿瘤细胞的影响。根据本文所描述的MTT试验结果，某些人膀胱癌细胞系对干扰素诱导的细胞死亡是耐受的，即使是用100,000IU/ml以上的IFNα或IFNα蛋白在体外处理。干扰素耐药性肿瘤细胞系包括KU7细胞(被用于上述的疗效试验)和253J B-V细胞。当暴露于编码干扰素的重组载体时，这些干扰素耐药性肿瘤细胞系被证明对处理是敏感的。例如，用50MOI的Ad-IFNα2α1或Ad-IFNα2b转染KU7或253J B-V细胞，通过IFN蛋白的免疫组化染色发现细胞内的IFNα表达水平可上升约50％。通常可见很强的核周IFN染色(图3A)，并伴随着形态学的改变，细胞增大以及处于有丝分裂的细胞数明显下降。这可导致细胞明显地静止于G2/M期(图3B和3C)、出现调亡的DNA片段化特征(图3B和3C)以及增殖抑制(图3D)。
为了更全面地阐明这些干扰素耐药性肿瘤细胞系接触Ad-IFN后诱导细胞死亡的机制，我们以胱冬酶-3活化为调亡的独立指标评价了Ad-IFNα对胱冬酶-3活化的影响。Ad-IFNα的转导在两株细胞系内都能刺激明显的胱冬酶-3活化(图4A和4B)。具有高水平IFNα表达的细胞及其临近无IFNα表达迹象的许多细胞内都可以见到胱冬酶-3染色(图4a)。另外，用同样50MOI的Ad-IFN处理253J-BV和KU7细胞后72小时计算胱冬酶-3阳性细胞所占的百分数，结果发现有超过70％的细胞是胱冬酶-3阳性的(图4B)。与Ad-IFNα接触可导致明显的细胞毒作用，因为进一步培养后发现没有细胞再出现增长迹象。这些结果与用膀胱癌细胞系，其中包括所有IFNα蛋白耐药性的细胞系，所观察到的结果类似。用高达100,000IU/ml的IFNα蛋白或相同MOI的Ad-βga1处理后在所有细胞中都没有观察到这样的改变。由于只有不到50％的细胞是用这个MOI的载体转导的，因此这些结果也进一步说明Ad-IFN可诱导很强的旁观者效应。
为了测定培养基中由Ad-IFN所产生的IFN蛋白量，KU7和253JB-V细胞用50和100MOI的Ad-IFNα2b或100,000/ml的Intron A处理2.5小时。虽然用Intron A(约4pg/IU)处理后上清中的IFN蛋白浓度可维持在约400,000pg/ml左右，但是用50MOI的Ad-IFNα2b处理后6天，上清中IFN蛋白的浓度几乎可以达到10,000,000pg/ml(约2,500,000IU)，用100MOI的Ad-IFNα2b转梁后2天就可以达到这样的水平(图5A)。
基于这些结果，将添加的Intron A浓度增加到2,500,000IU/ml，比较其与50MOI的Ad-IFNα2b在48和72小时的效果。结果发现，和上面所提到的一样，在Ad-IFN处理的细胞中亚二倍体细胞的数目增多，特别是在感染后72小时，而用如此高浓度的Intron A处理也没有发现亚二倍体细胞数目出现增多的情况(图5B)。同样，用IntronA处理后的细胞与对照细胞一样在48和72小时后没有发生形态学的改变或IFN染色，用Ad-IFN处理的细胞出现了典型的形态学改变和IFN染色(图5C)。但是，用Intron A处理后48和72小时，处于G2/M期的细胞数明显增加，这与Ad-IFN处理后所观察到的结果一致。例如，处理后48小时对照组、Intron A组和Ad-IFN组的KU7细胞中G2/M群分别为9.7、23.4和33.4，72小时时分别为7.4、21.3和19.5。
编码IFNα2b和杂合干扰素的载体试验结果都清楚地表明膀胱内滴注的Ad-IFNα具有很强的抗肿瘤活性。比较处理前和处理后的肿瘤负荷发现，无论是用含Ad-IFNα2α1或是含Ad-IFNα2b的Syn制剂处理，都可以观察到肿瘤明显缩小，而用Ad-βga1/Syn以及Ad-IFNα2α1、Syn或蛋白单独治疗的小鼠其膀胱肿瘤都快速生长。各治疗组所观察到的局部毒性效应都很微小。
虽然用于本发明体内试验的各种膀胱癌细胞系，包括KU7细胞，都对培养基中高水平的IFNα蛋白本身耐受，但是这些细胞无一例外地都被极低浓度的Ad-IFNα以胱冬酶依赖的方式杀死，导致只有50％或更少的细胞被转导。这些结果证明编码干扰素的载体如Ad-IFNα具有极强的旁观者效应，能够克服细胞对IFN蛋白的耐药性。
总之，上述试验证明编码干扰素的重组载体具有与市售重组IFN蛋白不同的独特特性，编码IFN的载体能够克服对IFN蛋白的耐药性。对于膀胱癌来说，这些研究清楚地说明，每天一次连续滴注Ad-IFNα2α1/Syn3或Ad-IFNα2b/Syn3后3周测定肿瘤负荷时可以观察到无胸腺小鼠体内的人浅表膀胱癌的生长受到明显抑制。用200,000IU/天的IFNα2α1蛋白进行相似的处理却没有产生任何长期的IFN组织表达，对肿瘤的生长也没有任何影响。由于Ad-IFNα2α1/Syn3和Ad-IFNα2b/Syn3所产生的体外细胞毒效应和体内肿瘤抑制效应是相似的，因此，抑制肿瘤的实质因素是持续表达的IFN所产生的直接效应，而不是其对这个模型中的肿瘤微环境所产生的影响，因为尽管小鼠和人细胞都能产生IFNα2b，但是IFNα2b只能活化人细胞内的干扰素信号通路。这些数据还说明Ad-IFNα可在高浓度IFN蛋白耐药的膀胱癌细胞内激发胱冬酶依赖的细胞毒效应。调亡现象不仅在具有高水平细胞内IFNα表达的膀胱癌细胞内是明显的，而且在无IFNα表达的临近细胞内也是很明显的。这些结果证明用Ad-IFNα治疗可对临近细胞产生很强的旁观者效应，这样就可以使那些逃脱Ad-IFNα感染的肿瘤细胞也成为攻击的靶位。
任何药物用于临床时需要考虑的一个重要问题就是其毒副作用。但是，这些研究清楚地表明没有出现与干扰素编码重组载体给药相关的毒性效应，即使是在载体产生持续高水平干扰素的情况下。上述试验的结果表明用Ad-IFNα2α1/Syn3处理3周后无胸腺小鼠的正常尿路上皮没有出现明显的形态学变化。另外，用Ad-IFNα2α1/Syn3对非荷瘤的正常外养小鼠进行同样的处理，21天后进行膀胱的急性病理学检测也没有发现膀胱出现明显的组织学改变。另外，用大鼠进行的预试验表明，虽然在大鼠的尿液中有干扰素基因的高水平表达，但是其血清浓度是很低的，这说明进行Ad-IFN膀胱内滴注治疗后系统的干扰素水平很低。这些初步疗效和毒性结果说明Ad-IFNα2b/Syn3是可以被良好耐受的。
本发明还提供了含本发明载体的药物制剂。本发明的组合物作为制剂可通过本领域熟知的方式用于哺乳动物受体的治疗，优选人。特别需要指出的是，给药系统可制备成适于肌肉注射、静脉注射、可注射的储存型装置或局部给药的制剂。
在使用非病毒基因递药系统的情况下，含有干扰素基因的表达质粒可以包裹在脂质体内。脂质体包括乳剂、泡沫、微胶粒、可溶性单层、脂质结晶、磷脂分散剂、板层结构等。利用脂质体载体将DNA序列运送到靶细胞的方法是本领域所熟知的。现在有多种方法可用于制备脂质体，如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng，9467(1980)；Szoka等，美国专利No 4,394,448(
公开日为1983年7月19日)以及美国专利Nos.4,235,871；4,501,728；4,837,028和5,019,369，本文已纳入作为参考。用于实现本发明的脂质体可用一种或多种标准的囊泡形成脂质制备，囊泡形成脂质一般包括中性的和带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。这类囊泡形成脂质包括DC-chol、DOGS、DOTMA、DOPE、DOSPA、DMRIE、DOPC、DOTAP、DORIE、DMRIE-HP、胆固醇氨基甲酸酯和如美国专利No.5,650,096所描述的其他阳离子脂质。选择脂质时一般要考虑的因素有脂质体大小、酸性条件下的稳定性和脂质体在血流中的稳定性。其他组分也可以加到脂质体制剂中以延长其血清半衰期，如聚乙二醇包被(如美国专利Nos.5,013,556(
公开日为1991年5月7日)和5,213,804(
公开日为193年5月25日))。
本发明的组合物作为制剂可通过本领域熟知的方式用于哺乳动物受体的治疗，优选人。在本发明的某些实施方案中，本发明的组合物可以通过注射直接进入到组织或供应目的组织的血管内。在本发明的其他实施方案中，本发明的组合物可用于局部给药，如膀胱内滴注、损伤部位内注射和/或局部给药。在本发明的其他实施方案中，本发明的组合物可通过注射、吸入、导管、透皮给药等方式全身给药。在本发明的其他实施方案中，本发明的组合物可通过导管或其他装置给药，使组合物能够接近远处的目的组织，如内部器官。
本发明的组合物还可以局部制剂或聚合物基质、水凝胶基质、聚合物植入物或包裹制剂的形式给药，从而使组合物缓慢或持续释放。如果给药系统是溶液或悬液的形式，给药系统一般位于药用载体内，优选水性载体。许多水性载体都可以使用，如水、缓冲水、0.8％的盐溶液、0.3％的甘油、透明质酸等。这些组合物可利用常规的已知灭菌技术灭菌，或通过过滤除菌。所得到的水性溶液可以包装起来备用，或者进行低压冷冻干燥，冷冻干燥的制剂在使用前与无菌溶液混合。
组合物根据接近生理条件的要求可以包含药用辅助物质，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
药物制剂中所含的本发明组合物的浓度范围可以很宽，即按重量计算从低于约0.1％、通常为约2％或至少约2％到20-50％或更高，或者根据所选择的特定给药模式主要根据液体体积、粘滞度来选择。
在某些用途中，我们希望重组载体和增强剂一起给药以促进干扰素编码核酸向靶细胞内转移。这类转移增强剂的例子包括去污剂、醇、甘醇、表面活性剂、胆汁酸盐、肝素拮抗剂、环氧合酶抑制剂、高渗盐溶液和乙酸盐。醇包括脂肪醇如乙醇、N-丙醇、异丙醇、丁醇、乙酰乙醇。甘醇包括乙二醇、甲基乙二醇、聚乙烯二醇和其他低分子量的甘醇如丙三醇和硫代甘油。乙酸盐如乙酸、葡萄糖酸和乙酸钠也是转移增强剂的例子。高渗盐溶液如1M的NaCl也可以作为转移增强剂。胆汁酸盐如牛磺胆酸盐、去氧胆酸钠、鹅去氧胆酸盐、甘胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸以及其他收敛剂如硝酸银也可使用。肝素拮抗剂样季胺如硫酸鱼精蛋白也可以使用。阴离子、阳离子、两性离子和非离子去污剂也可用于促进基因的转移。典型的去污剂包括而不限于牛磺胆酸盐、脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、十六烷基吡啶鎓、苯扎氯铵(benalkonium chloride)、Zwittergent 3-14去污剂、CHAPS(水合3-[(3-胆氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyl ammoniol]-1-propanesulfonatehydrate))、Big CHAP、Deoxy Big CHAP、Triton-X-100去污剂、CE 12E8、辛基-B-D-吡喃葡糖苷、PLURONIC-F68去污剂、Tween 20去污剂和TWEEN 80去污剂(CalBiochem Biochemicals)。特别优选的增强剂和方法见于下列文献的描述Engler等，美国专利No.6,312,681(
公开日为2001年11月6日)，Engler等，美国专利No.6,165,779(
公开日为2000年12月26日)，以及Engler等，美国专利No.6,392,069(
公开日为2002年5月21日)，其完整内容已纳入本文作为参考。一种特别优选的适用于实现本发明的增强剂是具有结构式I、被称为Syn3的化合物 其他可用于实现本发明的增强剂包括而不限于下列具有结构式II、III、IV和V的化合物及其药用盐
最初用腺病毒载体转导尿路上皮很少能够获得成功，部分原因是尿路上皮存在防止感染的抗粘附屏障。Pagliaro等，J.Clin.Oncol.，152247-2253(2003)。试验证明赋形剂Syn3可显著提高腺病毒对尿路上皮的转导效率。Conner等，Gene Ther.，841-8(2001)；Yamashita等，Cancer Gene Therapy，9687-691(2002)。在动物模型中，膀胱内滴注混于Syn3制剂中的腺病毒载体可显著提高正常尿路上皮和浅表膀胱肿瘤内的目的基因表达水平。Syn3的增强效应持续的时间窗约为1小时。因此，本发明的重组载体在与Syn3联合使用时，重组载体最好与Syn3同时给药，一般情况下是在Syn3接触膀胱约1小时内给药。
本发明还提供了通过给予哺乳动物含干扰素编码重组载体的药物制剂来治疗患有肿瘤的哺乳动物的方法。术语“哺乳动物”包括而不限于人、猪、马、牛、狗和猫。如果所用的载体是重组腺病毒载体，那么所用的腺病毒载体对于需要治疗的哺乳动物来说最好是内源性的。虽然在一般情况下最好使用被治疗物种来源的病毒，但是在某些情况下利用来源于其他物种的、具有适宜致病特性的载体可能更好。例如，有文献(PCT国际专利No.WO 97/06826，
公开日为1997年4月10日)报道牛腺病毒载体可用于人类的基因治疗以使人腺病毒载体所激发的免疫反应降到最低。通过初始免疫反应的最小化可以避免载体被系统快速清除，从而使载体的作用时间延长。通过多种给药途径系统给予病毒载体但疗效消失与体内原有的免疫反应或由于病毒载体的重复体内给药而被诱导的免疫反应有关。这种情况可通过调整给药剂量来克服，同时我们也可以使用免疫抑制剂与本发明的载体联合给药。免疫抑制剂的例子包括而不限于环孢霉素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、环磷酰胺、淋巴细胞免疫球蛋白、抗CD3复合物的抗体、肾上腺皮质类固醇、柳氮磺吡啶(sulfasalzaine)、FK-506、甲氧沙林和沙利度胺。另外，根据La Face等，美国专利No.6,464,976(
公开日为2002年12月15日)所描述的方法可以暂时去除抗病毒抗体，其内容已纳入本文作为参考。
疾病治疗的最佳给药方案需要主治医师根据各种因素来确定，比如治疗期间疾病的进展情况，年龄、体重、性别、所使用的载体类型、制剂内是否含有转移增强剂、给药的频率等。但是，试验证实利用腺病毒载体对人进行长达数周的多次治疗、每次给予1×105到1×1012病毒颗粒都是安全有效的。因此，编码干扰素的腺病毒载体可使用这样的剂量范围。
在本发明治疗人浅表膀胱癌的一个优选实施例中，治疗方案包括在约1小时的时间里内膀胱内滴注约100ml含1×1010-1×1012病毒颗粒/ml(最优选的是1×1011病毒颗粒/ml)的编码干扰素α2b的重组腺病毒颗粒。另一种治疗方案包括在约1小时的时间里内膀胱内滴注约100ml含1×1010-1×1012病毒颗粒/ml(最优选的是1×1011病毒颗粒/ml)的编码干扰素α2b的重组腺病毒颗粒，然后在首次治疗后的7、5、4、3、2天内或者在首次治疗后的第2天进行相同剂量的二次治疗。根据疾病的进展情况，每次的治疗过程都是可重复的。在利用膀胱内滴注重组载体治疗膀胱癌时，干扰素基因表达的最佳水平一般发生在治疗后的至少14天，更优选的是约30天，最优选的是约90天。
在本发明治疗人肝细胞癌的一个优选实施例中，给药方案为约1×1010-1×1012能在细胞内表达干扰素的复制缺陷型腺病毒载体颗粒通过瘤内注射或肝动脉给予患者，治疗周期为连续的5到7天。这种治疗方案可在约3到6周的治疗期内重复进行。治疗肝细胞癌患者的更优选方案是连续5天肝内动脉注射约1×1010-1×1012复制缺陷型重组腺病毒载体颗粒，该载体表达AFP启动子控制下的干扰素α2b。最优选的给药方案是与其他化疗方案联合使用。
如果载体是复制完整型的，给药剂量可以相应减少。例如，可以构建复制完整型的腺病毒载体，上述载体通过使用AFP启动子(比如)代替天然的E1启动子来控制E1蛋白的表达从而使病毒只限于在肝癌细胞内复制。这种载体优先在肿瘤细胞内复制和表达干扰素，并且能够扩散到周围细胞内，从而可以扩大治疗效果，有利于降低给药剂量或缩短治疗周期。
本发明的组合物和方法可单独使用，也可以和常规的化疗药或治疗措施联合使用。这类化疗药的例子包括而不限于嘌呤合成抑制剂(喷司他丁、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、氨甲蝶呤)或嘧啶合成抑制剂(如Pala、阿扎立平)，核糖核苷酸到脱氧核糖核苷酸的转化(如羟基脲)，dTMP合成抑制剂(5-氟尿嘧啶)、DNA损伤剂(如辐射、博来霉素、依托泊甙、替尼泊甙、更生霉素(dactinomycine)、阿霉素、米托蒽醌、烷化剂、丝裂霉素、顺铂、丙卡巴肼)以及微管功能抑制剂(如长春花生物碱和秋水仙碱)。化学治疗方案主要是指能够杀死肿瘤性细胞的非化学过程，如放射治疗。这些化疗药可以单独使用，也可以混入本发明的制剂中共同给药。本发明还可以联合常规的免疫治疗措施如治疗浅表膀胱癌时所用的BCG而得以实现。
实施例下面的实施例是为了说明如何实现本发明，不应该被认为是对本发明范围的限制。
实施例1.细胞系、载体和试剂膀胱癌细胞系KU7/GFU的6号克隆和253J-B-V用于这些研究中。KU7/GFP的6号克隆用绿色荧光蛋白稳定转染，用于所有的体内试验。这些细胞系可见于Watanabe等，Cancer Gene Therapy，71575-1580(2000)的描述。这些细胞用含10％FCS的MMEM培养基培养，在5％CO2和95％空气中培育。
按照Ahmed等，Interferon Cytokine Res.，21(6)399-408(2001)所描述的方法制备表达干扰素α2α1的重组腺病毒载体。按照Ahmed等，Hum.Gene Ther.，10(1)77-8(1999)所描述的方法制备表达干扰素α2b和β-半乳糖苷酶(β-gal)的重组腺病毒载体，这种方法还可见于Gregory等的美国专利No.6,210,939(
公开日为2001年4月3日)的描述，其完整内容本文已纳入作为参考。
Intron A蛋白(干扰素α2b重组蛋白)是从Schering Corporation购买的。
Syn3是根据上述Engler等的美国专利No.6,392,069所描述的方法制备的，本文已纳入作为参考。
实施例2.浅表肿瘤的形成、治疗和造影在无胸腺小鼠体内种植KU7-GFP人膀胱肿瘤的方法及其造影方法在Izawa等，Clin.Cancer Res.，81258-1270(2002)和Zhou等，Cancer Gene Therapy，9681-686(2002)中已有描述。简言之，肿瘤细胞种植后两周，通过膀胱造影检测是否存在含GFP的肿瘤。然后在1小时内向小鼠膀胱内滴注10μl Ad-IFNα2α1/Syn3、Ad-IFN-α2b/Syn3、Ad-IFNα2α1、Ad-β-gal/Syn3、Syn3或IFN-α2α1蛋白。在尿道周围进行荷包缝合术给尿道打结以确保在试验过程中产生尿潴留。病毒、Syn3和干扰素蛋白的浓度分别为1×1011P/ml、1mg/ml和2×105IU/100μl。除Ad-IFNα2α1/Syn3和Ad-IFNα2α1组之外每组有6到8只小鼠，Ad-IFNα2α1/Syn3和Ad-IFNα2α1组分别有14和16只小鼠。
首次处理后3周对膀胱进行再次处理和造影。小鼠麻醉后在每个膀胱内滴注100μl10％的甲醛，并缝合尿道。然后去除膀胱，用10％的甲醛固定并包埋于石蜡块内。对整个膀胱进行组织切片，H&E染色，检查是否存在肿瘤，以及分析肿瘤造影和肿瘤组织学检测结果之间的相关性。
实施例3.组织匀浆物基因表达研究雌性无胸腺小鼠麻醉后膀胱内插入导管，单次膀胱内给予100μl Intron A(2×106IU/ml)或者按照上面所描述的用Ad-IFN/Syn3(1×1011P/ml1mg/ml)处理1-2天，每次1小时。以不同的时间间隔收获膀胱并冷冻储存。随后解冻膀胱并转移到溶解缓冲液(Promega)内。样品匀浆20秒(Fast Prep，Q-BIOgene)。然后通过ELISA(Endogen)分析组织匀浆物内人干扰素α蛋白的浓度。干扰素蛋白的浓度以pg IFN/mg膀胱组织表示。
实施例4.免疫组化分析为了进行体内研究，按照上述Izawa等所描述的方法进行干扰素的免疫组化分析。阳性反应显示为棕色染色。同样，培养细胞的干扰素染色分析是基本按照Xu等，Oncogene，4807-812(1989)所描述的方法进行的，只是其中的一抗为1∶500稀释的兔抗人干扰素α多克隆抗体(Hu-IFN-α，PBL)。
实施例5.统计学分析用供Windows使用的软件Image-ProPlus 4.0版本(购自Media Cybernetics Inc.，8484 Georgia Avenue，Suite 200，Silver Spring，MD 20910-5611 USA)完成统计学分析，计算处理前膀胱区、处理前GFP区、处理后膀胱区和处理后GFP区的象素数。然后计算处理前GFP区占处理前膀胱区的百分数和处理后GFP区占处理后膀胱区的百分数。我们利用非参数检验(Kruskal-Wallis检验)评价7个治疗组之间肿瘤大小百分变化率之间差异，该方法描述于Kruskal和Wallis，Journal of the American StatisticalAssociation，47583-621，Conover WJ，Practical Nonparametric Statistics。第3版，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1952)。我们利用模拟来确定检验的p值。由于我们进行了多次试验以比较各种治疗之间的差异，因此需要校正，我们使用Bonferroni校正方法来检验这些试验结果之间差异的显著水平(0.05/21＝0.0024)。对于MTT试验结果，统计学分析用的是Statistica软件(购自StatSoft，Inc.，2300 East 14thStreet，Tulsa，OK 74104)的一般线性模型(General Lineal Model)。
实施例6.MTT、流式细胞术、胱冬酶活性和上清中IFN的测定MTT试验按照Zhang等，Cancer Res.，63760-765(2003)所描述的方法进行。简言之，膀胱癌细胞以50和100MOI的给定腺病毒感染2.5小时。在不同的时间点去掉培养基，然后加入含1mg/ml MTT的培养基。3小时后用200μl N，N-二甲基甲酰胺裂解缓冲液终止反应，所得到的溶液用微板计数仪在A595处扫描。另外一块60mm的培养皿进行相似的处理或者用Intron A处理，收获细胞后用流式细胞仪检测，分析其中的胱冬酶活性。每天收集副本培养皿内的上清，以测定用Ad-IFNα2b或IntronA处理的细胞所分泌的IFN浓度。基本按照Williams等，Mol.Cancer 2835-843(2003)所描述的方法进行细胞周期分析、亚二倍体细胞数分析和胱冬酶活性分析。按照Fujisawa等，Interferon Cytokine Research，16555-559(19996)所描述的方法通过ELISA测定Intron A的浓度，所用的试剂为Endogen牌Human IFNαELISA试剂盒，购白Pierce Biotechnology，Inc.，P.O.Box 117，3747 N.Meridian Road，Rockford，IL 61105，产品编号为No.EHIFNA，基本是按照厂家的说明书进行操作。
实施例7.共聚焦显微镜分析活化的胱冬酶及IFN□的分布以及它们与细胞核形态学变化的关系用含10％胎牛血清的DMEM在盖玻片上培养人膀胱癌细胞系，然后用50和100MOI的Ad-α-gal、Ad-IFNα2α1或Ad-IFNα2b感染。感染36小时后用冰甲醇固定，然后用含10％羊血清的PBS封闭，分别与1∶1000和1∶500稀释的抗活化胱冬酶-3的兔单克隆抗体(购自Research Diagnostics Inc.，Pleasant Hill Road，Flanders NJ 07836，产品号为RDI-CASP3ACTabRm)和抗IFN-α鼠单克隆抗体(购自PBL BiomedicalLaboratories，131 Ethel Road West，Suite 6，Piscataway，NJ 08854，产品号为No.31101-1)共培育。然后加入Alexa-488标记的羊抗兔抗体和Alexa-546标记的羊抗鼠抗体(购自Molecular Probes，29851 Willow Creek Road，Eugene，OR 97402，产品号分别为11101和11010)以及DNA染料633-Topro-3(购自Molecular Probes)，再培育1小时。用共聚焦显微镜(Zeiss型号LSM-510)拍照固定的载玻片，利用装配有合适光学过滤器的Argon和He/Ne激光仪分析每个通道上的象素数。图像至少代表每种条件下的10个显微镜视野。每个试验都设双复孔，至少重复3次。
权利要求
1.一种治疗干扰素耐药性肿瘤的方法，该方法包括使所述肿瘤与编码干扰素的重组载体接触。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组载体是腺病毒。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述腺病毒是复制缺陷型的。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述干扰素是干扰素α。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述干扰素α选自干扰素α2b、干扰素α2a和干扰素α2α1。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肿瘤包括肿瘤性膀胱细胞。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，已将所述肿瘤细胞暴露于增强剂。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述增强剂是Syn3。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述载体和所述增强剂膀胱内滴注至尿路上皮。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于，所述干扰素是干扰素α2b。
全文摘要
本发明提供了一种通过使用编码干扰素的重组载体治疗干扰素耐药性肿瘤的方法。特别需要注意的是，重组载体所编码的干扰素所具有的特性与现有的通过重组制备的干扰素蛋白无关。本发明还提供了可用于治疗干扰素耐药性肿瘤的组合物，其中所述的治疗是通过使用编码干扰素的重组载体来实现的。
文档编号C12N15/861GK1893981SQ200480037124
公开日2007年1月10日 申请日期2004年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者W·F·本尼迪克特 申请人:坎基股份有限公司