专利名称：利用鼠李糖乳杆菌生产胞外粘多糖的方法及产品的制作方法
技术领域：
本发明是以一种乳酸菌微生物为出发菌，在发酵条件下能产生分泌于胞外粘性多糖(Lactobacillus rhamnosus EPS)的生产方法，本发明亦关于含有该粘性多糖在食品、饮料、膳食中应用于人的功能食品与药品的产品。
背景技术：
多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物。多糖是一切有生命的有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有抗肿瘤、提高免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒等活性已相继被发现。
多糖的提取和分离大多数采取的是化学提取法，多糖通常用水作溶剂或有机溶剂，根据多糖的溶解性还可以用超滤离心分离法提取多糖，现今市场应用的如香菇多糖、黄芪多糖、甘草多糖、海带多糖、刺参粘多糖等等，还有用菌法提取多糖。如1983年两位美国教授Sherwood Gorbach和BarryGoldin首次从健康人体中分离出了一株新的乳酸菌Lactobacillusrhamnosus(鼠李糖乳杆菌)。
(1)专利“包含鼠李糖乳杆菌的药物制剂”申请号98807017.0，描述了一种用于预防和治疗人和动物中胃肠道疾病的药物制剂，该制剂在至少一种药学上可接受的载体培养基中包含鼠李糖乳杆菌菌株u321和/或其具有基本相似功能的一种或多种变体，其中微生物保持其存活。
(2)专利“上皮粘附性乳杆菌”申请号96194086.7，涉及具有甘露糖特异性粘附素的植物乳杆菌在制备可抑制表达甘露糖特异性粘附素的致病菌对上皮细胞粘附的药用组合物方面的应用。用在本发明中的一种植物乳杆菌菌株可以与D一甘露糖包被的琼脂糖珠结合，并且优选根据REA与植物乳杆菌299有70％以上相似性的植物乳杆菌族。本发明还涉及上述菌株在制备用于预防和/或治疗细菌易位、胃肠炎和其它由表达甘露糖特异性粘附素的致病菌所致疾病的药用组合物方面的应用。
(3)专利“鼠李糖乳酸杆菌菌株及其用途”申请号00131759.8，本案揭露了一种新颖的鼠李糖乳酸杆菌菌株(以下称为Tcell-1菌株)，其在种系上不同于该物种中已经公开的所有菌株，且其能展现出优越的益生性质。本案亦揭露该菌株的药学及营养用途。
(4)专利“增强免疫的乳酸菌”申请号98805171.0，涉及如下新菌株鼠李糖乳杆菌HN001和HN067，嗜酸性乳杆菌HN017以及乳双岐杆菌HN019，当摄入时，每种菌株均具有免疫增强作用。
以上专利未涉及本发明专利技术内容。我国目前还没有关于鼠李糖乳杆菌胞外多糖的学术及产业化报道。
依据本发明，本案发明人已鉴定出一种以天津工业微生物研究所菌种保藏中心分离筛选的鼠李糖乳杆菌(L.R-008菌株)为出发菌种，在一定条件下经进行发酵，同时在培养基中辅以微量元素、利用温度刺激胞外分泌粘多糖而获得成功。
发明内容
本发明的首要目的在于，提供一种以天津工业微生物研究所菌种保藏中心分离筛选的鼠李糖乳杆菌(L.R-008菌株)为出发菌种，该菌种也属于鼠李糖乳杆菌中的一种，在国家保存库中存放的类似菌种为干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus Hansen)编号为AS1.26。利用鼠李糖乳杆菌(L.R-008菌株)为出发菌种，在一定条件下经发酵，同时在培养基中辅以微量元素、利用温度变化刺激胞外分泌粘多糖的生产方法。
本发明的另一个目的在于，提供一种含有本发明粘多糖及适用赋形，可供制造食品、饮料或膳食补充剂的功能保健食品。
本发明还有一个目的在于，提供一种含有本发明粘多糖的药物，用于预防和治疗人体疾病。
本发明提供的利用鼠李糖乳杆菌生产胞外粘多糖的方法在于，采用鼠李糖乳杆菌为出发菌种，以葡萄糖、乳糖为碳源，经配料、菌种扩培发酵、再经分离、洗涤、脱水、干燥，得到胞外粘多糖产品，其中发酵原料的配比是，采用乳清粉50～10％、葡萄糖1～5％、柠檬酸氢二胺0.02～0.1％、MgSO4·7H2O 0.02～0.1％、MnSO4·H2O 0.01～0.1％、Tween-801～2ml，余量为水；发酵温度维持在32℃～37℃、PH5.5～6.0之间、发酵时间在24～72小时之间、并以80～110r/min间歇搅拌方式。
一种上述方法生产的胞外粘多糖产品，其特征在于胞外粘多糖的组分为丙酮酸1份、D-葡萄糖2份、D-半乳糖1份、L-鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)无色无味的固体，分子量为3.0～6.0×107Da。
一种上述方法生产的胞外粘多糖产品的用途，其特征在于，含有经鼠李糖乳杆菌，经发酵法生产出的胞外粘多糖(EPS)，并配伍相应的赋形剂应用于人的功能食品和药品，用于预防和治疗人体疾病。
图1是本发明工艺流程图。
具体实施例方式本发明的具体实施方法步骤如下(1)工艺流程见附图1。
(2)操作要点①菌种鼠李糖乳杆菌(L.R-008)经斜面培养、三角瓶培养、种子罐扩培后，接入发酵罐进行发酵。
②发酵原料乳清粉、葡萄糖、柠檬酸氢二胺、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、Tween-80。
③配料发酵原料按一定比配料投入发酵罐。具体比例为乳清粉5％～10％、葡萄糖1％～5％、柠檬酸氢二胺0.1％～1％、MgSO4·7H2O0.02％～0.1％、MnSO4·H2O0.01％～0.1％、Tween-80 1ml/L～2ml/L，余量为水；④发酵以葡萄糖和乳糖为碳源，按1％～3％(v/v)接种量，维持pH5.5-6.0于32℃至37℃发酵24小时至72小时。发酵罐以100r/min间歇搅拌，不补充空气。同时在培养基中辅以微量元素和变化发酵温度以刺激胞外多糖分泌。最终发酵液中菌体生物量达2×109CFU/ml，L.rhamnosusEPS得率达950mg/L以上。
⑤分离采用乙醇沉淀法与膜过滤法分离多糖。
⑥洗涤采用无菌水对分离多糖进行洗涤。
⑦脱水采用膜过滤法脱去部分水分。
⑧干燥脱去部分水分的多糖进行常规喷雾干燥，成粉状产品。
⑨包装、成品粉状多糖(鼠李糖乳杆菌胞外多糖)进行包装成为成品。
有益效果鼠李糖乳杆菌胞外粘多糖和其它乳酸菌多糖相比较，发酵得率高；鼠李糖乳杆菌胞外粘多糖在食品、医药、造纸、保藏等领域及特殊场合有着广泛的用途与非常高的应用价值。
鼠李糖乳杆菌胞外粘多糖，在保健食品，生物制药等方面，各种多糖所具有抗肿瘤、提高免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒等生理活性是显而易见的，是一种极具发展潜力的多糖。
鼠李糖乳杆菌胞外多糖的生产原料价格相对低廉，而产品附加值极高，因此，鼠李糖乳杆菌胞外多糖的产业化的实施有着广阔的市场前景和重要意义。
根据鼠李糖乳杆菌EPS各种物理特性，还可作为乳化稳定剂广泛应用于各种发酵乳、干酪、化妆品。其粘液成膜性可作为果蔬保鲜和可食性食品薄膜；其絮凝特性可作为污水的净化剂；其冰晶形成抑制能力可广泛应用于冷冻食品、医药及菌种保护剂。
因此可以看出，鼠李糖乳杆菌EPS作为一种新型、高效、安全的生理功能调节剂和食品添加剂，具有重大理论研究意义和实际应用价值。
实施例下列实施例仅供说明，而不限制本发明的范围。
实施例1.
操作要点工艺流程参见图1①菌种扩大培养鼠李糖乳杆菌L.R-008斜面培养，三角瓶培养、继续种子罐扩培后，接入发酵罐进行发酵。
②发酵原料乳清粉、葡萄糖、柠檬酸氢二胺、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O。Tween-80。
③配料发酵原料按一定比配料投入发酵罐。具体比例为乳清粉5％、葡萄糖1.5％、柠檬酸氢二胺0.2％、MgSO4·7H2O0.04％、MnSO4·H2O0.04％、Tween-80 1ml/L，余量为水；④发酵上述原料配好后，按3％(v/v)接种量，维持pH5.5-6.0于34℃至37℃发酵50小时。发酵罐以100r/min间歇搅拌，不补充空气。同时在培养基中辅以微量元素和变化发酵温度以刺激胞外多糖分泌。最终发酵液中菌体生物量达2×109CFU/ml。
⑤分离采用乙醇沉淀法与膜过滤法分离多糖。
⑥洗涤采用无菌水对分离多糖进行洗涤。
⑦脱水采用膜过滤法脱去部分水分。
⑧干燥脱去部分水分的多糖进行常规喷雾干燥，成粉状产品。
L.rhamnosusEPS得率达964mg/L。
⑨包装、成品粉状多糖进行包装成为成品。
其成品胞外粘多糖的组分为丙酮酸1份、D-葡萄糖2份、D-半乳糖1份、L-鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)无色无味的固体，分子量为3.0～6.0×107Da。
实施例2.
操作要点工艺流程参见图1①菌种扩大培养鼠李糖乳杆菌L.R-008斜面培养，三角瓶培养、继续种子罐扩培后，接入发酵罐进行发酵。
②发酵原料乳清粉、葡萄糖、柠檬酸氢二胺、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O。Tween-80。
③配料发酵原料按一定比配料投入发酵罐。具体比例为乳清粉8％、葡萄糖0.5％、柠檬酸氢二胺0.5％、MgSO4·7H2O0.06％、MnSO4·H2O0.02％、Tween-80 1.5ml/L，余量为水；④发酵上述原料配好后，按3％(v/v)接种量，维持pH5.5-6.0于32℃至35℃发酵68小时。发酵罐以100r/min间歇搅拌，不补充空气。同时在培养基中辅以微量元素和变化发酵温度以刺激胞外多糖分泌。最终发酵液中菌体生物量达2×109CFU/ml。
⑤分离采用乙醇沉淀法与膜过滤法分离多糖。
⑥洗涤采用无菌水对分离多糖进行洗涤。
⑦脱水采用膜过滤法脱去部分水分。
⑧干燥脱去部分水分的多糖进行常规喷雾干燥，成粉状产品。
L.rhamnosusEPS得率达982mg/L。
⑨包装、成品粉状多糖进行包装成为成品。
权利要求
1.一种利用鼠李糖乳杆菌生产胞外粘多糖的方法，其特征在于，采用鼠李糖乳杆菌为出发菌种，以葡萄糖、乳糖为碳源，经配料、菌种扩培发酵、再经分离、洗涤、脱水、干燥，得到胞外粘多糖产品，其中发酵原料的配比是，采用乳清粉50～10％、葡萄糖1～5％、柠檬酸氢二胺0.02～0.1％、MgSO4·7H2O 0.02～0.1％、MnSO4·H2O 0.01～0.1％、Tween-80 1～2ml，余量为水；发酵温度维持在32℃～37℃、PH5.5～6.0之间、发酵时间在24～72小时之间、并以80～110r/min间歇搅拌方式。
2.一种权利要求1所述方法生产的胞外粘多糖产品，其特征在于胞外粘多糖的组分为丙酮酸1份、D-葡萄糖2份、D-半乳糖1份、L-鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)无色无味的固体，分子量为3.0～6.0×107Da。
全文摘要
利用鼠李糖乳杆菌生产胞外粘多糖的方法及产品。本发明采用鼠李糖乳杆菌为出发菌种，以葡萄糖、乳糖为碳源，经配料、菌种扩培发酵、再经分离、洗涤、脱水、干燥，而获得胞外粘多糖的生产方法，其胞外粘多糖的组分为丙酮酸1份、D－葡萄糖2份、D－半乳糖1份、L－鼠李糖4份，(Lactobacillus rhamnosus EPS胞外粘多糖)无色无味的固体，分子量为3.0～6.0×10
文档编号C12P19/00GK1781950SQ20051001506
公开日2006年6月7日 申请日期2005年9月9日 优先权日2005年9月9日
发明者张刚, 奚震, 叶樱, 孙凤雄 申请人:天津市工业微生物研究所